INSTITUT D'ÉLEVAGE VÉTÉRINAIRE DES REVUE...
INSTITUT
D'ÉLEVAGE
VÉTÉRINAIRE DES
REVUE D’ÉLEVAGE
ET DE
. MÉDECINE VÉT
DES PAYS TRO
0
Adaptation d’une souche de virus boyipestique
à la culture cellulaire
-1
Premiers résultats
‘1
par Y. GILBERT et J. MONNIER
c
‘S
Tome XV (nouvelle série)
No 4 - 1962
== VIGOT FRÈRES, ÉDITEUR
23, rue de l’École-de-Médecine,
ARIS-VI”
c
Adaptation d’une souche de vi rus bovipestique
à la culture CdlUli Sire
Premiers résultats
par Y. GILBERT ef J. MONNIER
Depuis 1959 sont effectuées à Dakar des expé-
temps, I~CI SUS~ :nsion cellulaire, filtrée sur gaze
riences sur la culture du virus bovipestique en
(4 épaisseurs) pt centrifugée à 900 tours/minute,
cultures cellulaires. La souche jusqu’ici utilisée
nutes. Le surnageant est éliminé
était celle adaptée par PLOWRIGHT et FERRIS,
re lavé avec de la solution saline
(1) qui avait permis de réaliser quelques essais
nnéedelOp.100desérum bovin.
d’immunisation de bovins et, surtout, de dispo-
re centrifugation, le culot cellu-
ser d’un matériel bon marché pour les expérien-
uspension à raison de 1 volume
ces de séroneutralisation.
e u nutritif composé de solution
II a paru intéressant de tenter l’adaptation aux
nnée de 0,5 p. 100 d’hydrolysat
cultures cellulaires de la souche sauvage d’épreu-
et 0,l p. 100 d’extrait de levure,
ve utilisée au Laboratoire de Dakar, dans le but
10 p, 100 de sérum de veau (im-
d’étudier son comportement en culture cellulaire
e) ainsi que des antibiotiques :
et sur bovins, et de comparer les résultats obtenus
Uljml et Streptomycine 0,l mg
à ceux publiés précédemment.
MATÉRIEL ET MÉTHODES
2 ou 3 jours à l’aide du même
roportion de sérum est ramenée
Matériel.
m de bovin (importé de France)
10 Préparafian des suspensions cef/ulaires.
nt, et à 2 p. 100 pour les chan-
rs, qui s’effectuent lorsque le
Toutes les expériences ont été réalisées à l’aide
ateur coloré indique un pH net-
de ceflules épithéliales de reins d’embryons bo-
vins en provenance de l’abattoir de Dakar.
L’âge des embryons n’a pas été pris en consi-
dération.
cellulaire est répartie soit en
Les reins sont décapsulés, la zone corticale est
eutre ou de Pyrex de 18 x 180
prélevée en petits fragments à l’aide d’un bis-
1, soit en tubes de Leighton à la
touri ; ces fragments sont hachés, lavés 3 fois
en flacons plats pharmacie de
au PBS*, soumis à l’action d’une solution de tryp-
se de 15 ml, soit en flacons de
sine Difco (1 : 250) à3 p.1000 pendant 20minutes
neutre à la dose de 22,5 mi.
à la température du laboratoire, sur agitateur
ction de grandes quantités de
magnétique. La trypsine est éliminée par décan-
es boîtes de Roux de 1 1. recevant
tation et remplacée par une solution fraîche de
trypsine. La trypsination est poursuivie pendant
5 à 6 heures au réfrigérateur. Au bout de ce
tubes sont placés après réparti-
sion, en position stationnaire pen-
* P B S = Phosphate buffer solution (Dulbecco).
Rev. Elev. Méd. vét. Pays trop. 1962, 15, no 4.
Reçu pour publication : août 1962.
tubes sont placés sur un tambour tournant (sys-
tif du passage précédent, au moment de la répar-
tème roller-tubes).
tition en flacons ou en tubes.
La température d’incubation est, selon les cas,
Un certain nombre de passages ont dCi être
de 370 ou 400 C.
effectués, lorsque des suspensions cellulaires ne
40 Souche de virus bovieestique.
pouvaient être obtenues, sur des couches cellu-
laires déjà constituées, âgées de 2 à 5 jours.
La souche de virus bovipestique utilisée est la
Dans ce cas, après avoir vidé les tubes ou fla-
souche sauvage conservée à Dakar en vue des
cons et renouvelé le milieu, on ajoute une quan-
épreuves. II s’agit d’une souche isolée en 1957
tité de milieu du passage précédent égale au
dans un foyer et passée chaque année sur bovin,
dixième du volume total du milieu contenu dans
conservée sous forme de suspension lyophilisée
les tubes ou flacons.
de rate et ganglions dans du sang infecfé. Elle est
désignée sous le nom de souche DK.
Titrages du virus.
En vue de l’adaptation de la souche aux cul-
tures cellulaires, un veau réceptif est inoculé
Dans les titrages, le virus est dilué en série déci-
avec une ampoule de virus lyophilisé. La réaction
male dans du liquide de Hanks (dilution IO-là
thermique débute le 4e jour suivant l’inoculation,
10-G).
atteint son maximum le 7e jour. Les lésions bucca-
On porte alors 1 ml de chacune des dilutions
les apparaissent et le veau est sacrifié le 81! jour.
dans un tube contenant 10 ml de suspension cel-
Rate et ganglions sont prélevés et servent de
lulaire. Après le mélange, le contenu de chaque
matériel de dépai-t.
tube de suspension infecté est réparti à la dose de
2 ml dans 5 tubes en verre neutre ou Pyrex de
Méthode de passage du virus.
18 x 180.
A) Premier passage.
Chaque tube reçoit donc 0,2 ml de la dilution
considérée.
Des suspensions à 10 p. 100 en milieu de Hanks
Pour les titrages plus précis, on recourt à
sont préparées avec la rate et des ganglions, par
10 tubes par dilution.
broyage dans un micro-broyeur du type mixer.
Les suspensions sont centrifugées à 2.000 tours
Identification du virus par séroneutralisation.
par minute pendant 10 minutes et le surnageant
constitue I’inoculum.
Le virus à identifier est dilué en une série de
Quatre modes d’infection ont été essayés sur
dilutions décimales de 10-l à 10-6.
des cultures de cellules âgées de 2 jours, obtenues
Deux séries de 6 tubes sont préparées.
par trypsinafion d’un tapis cellulaire provenant
Chaque série reçoit 1 ml des différentes dilu-
de cellules de lece explantation.
tions de virus.
CJ) Le flacon est vidé. La suspension de rate
A chacun des tubes d’une série on ajoute 1 ml
est introduite à la dose de 5 ml pour un flacon
de sérum antibovipestique préparé soit sur lapin,
de 250 ml. Le flacon est placé pendant 4 heures à
soit sur bcwf.
l’étuve à 370 C. il est alors vidé et le tapis cellu-
Les tubes de l’autre série reçoivent 1 ml de
laire est lavé 3 fois avec de la solution de tianks.
sérum de bovin réceptif.
On renouvelle alors le milieu nutritif (22.,5 ml).
Après agitation, les tubes sont incubés 1 h. au
b) La même technique est employée pour la
bain-marie, à 37”.
suspension de ganglion.
Les différents mélanges sont répartis à la dose
de 0,2 cc par tube contenant 2 ml de suspension
c) Le flacon est vidé. On y introduit 2,5 ml
cellulaire.
de suspension de rate, on complète avec 20 ml
On utilise 2 à 5 tubes par mélange.
de milieu nutritif et l’on incube à l’étuve à 370 C.
Le virus est considéré comme neutralisé s’il
d) La même technique est employée pour la
existe une différence d’au moins 2 log* entre les
suspension de ganglion.
titres des virus respectivement en présence de
B) Passages suivants.
sérum normal et de sérum antibovipestique.
Ils sont effectués en principe en ajoutant à une
suspension cellulaire 10 p. 100 du milieu nufri-
* Logarithme à base 10.
312
Inoculation aux bovins.
e cellulaire des cellules géantes
Seul a été recherché jusqu’ici le pouvoir patho-
us l’aspect de plaques arrondies
gène du virus pour le bceuf. En raison des diffi-
dimensions variables, résultant
cultés à se procurer des bovins réceptifs, et du
asmes des cellules.
coût de l’expérimentation, il n’a pas encore été
issent et se creusent
effectué de recherches sur le titre du virus obtenu
ours après l’infection, la
par culture en utilisant le bœuf comme animai
du tapis cellulaire semble lésé.
d’épreuve.
s l’infection initiale, un second
Les bovins reçoivent 1 ml du milieu non dilué
ué en mélangeant du milieu nu-
du passage considéré par voie sous cutanée.
s cellules infectées du premier
uspension cellulaire lors de sa
Préparations colorées.
érie des passages ultérieurs de la
Elles sont réalisées à l’aide de tubes de Leigh-
nt du virus en cul-
ton recevant 2 ml de suspension cellulaire, infec-
tée ou non.
Pour la coloration, les tubes sont vidés, lavés
chnique mais utilisation
3 fois au PBS, la couche cellulaire est fixée 3 à
ssu ganglionnaire).
5 minutes au Bovin alcoolique, puis colorée par
se traduisant par la ré-
I’hémalun de Mayer et I’éosine. Montage au
décollement, s’ob-
baume du Canada.
e la couche cellulaire
l’infection. 48 heures plus tard
RÉSULTATS
es modifications cytopathogènes
is continu de cellules jointives,
a) Croissance des cellules à 370 et à 400 C.
formé de cellules de type
nt un léger renflement
Aucune différence n’a été notée dans le com-
e s prolongements cytoplas-
portement des cultures cellulaires incubées soit
fins qui s’anastomosent avec
à 370 soit à 400 C.
voisines. La paroi des flacons
Un léger avantage peut même, semble-t-il,
‘un filet à mailles assez lâches.
être reconnu à la température de 400 C, en ce qui
ne couche de cellules âgées de
concerne la rapidité de croissance.
milieu nutritif provenant du Ier
Au delà de 410 C, des signes de souffrance
ue l’apparition, en Sjours envi-
apparaissent chez les cellules aspect : granuleux,
pathogène plus ménagé. En-
retard de croissance, rétraction. La destruction
filet s’observent des nappes
des cellules s’observe à partir de 4205 ; elle est
mées par des cellules géantes,
totale si cette température est maintenue plusieurs
‘état frais, on peut distinguer les
heures.
I’E. C. P.* pouvait faire
b) Adaptation de la souche DK aux cultures
e d’un virus latent dans la sus-
cellulaires.
aire, Une épreuve de séro-
A la suite de l’infection par des suspensions de
à l’aide de sérum hyperim-
rate ou ganglions infectés, les effets suivants sont
in, assure l’identité du virus.
observés sur le tapis cellulaire :
le mélange sérum normal-
Méthode a) (suspension de rate en contact pen-
ceux ayant reçu du virus seul,
dant 4 heures avec les cellules, puis lavage).
plus tard, un ECP net, alors que
Après 24 heures, un effet toxique limité est ob-
ant le mélange sérum antibovi-
servé sur certaines zones de la couche monocel-
nt aucune modification
lulaire : cellules rétractées, réfringentes qui se
détachent du verre. Après trois jours, la proli-
fération des cellules intactes avoisinantes a com-
blé les vides. 11 jours plus tard, apparaissent au
* Effet cytopat bogène.
313
f
Après cette démonstration de l’effet cytopa-
jours abouli à la neutralisation
de l’effet cytopa-
thogène du viru:;, les passages ont été aban-
thogène par le sérum contre la peste bovine, quel-
donnés,
l’effet cytopathogène se manilestant
le que soit l’origine (bceuf ou lapin) decelui-ci.
dans le même laps de temps que celui observé
Titres du virus.
pour les passages à partir de la rate.
Méfhode c ef d) 2.. suspension de rate ou gan-
Un certain nombre de titrages a été effectué
glion mélangée au milieu nutritif: un effettoxique
i
sur cultures cellulaires au fut- et à mesure de la
intense attribué aux extraits d’organes présents
succession des passages. Ils ont porté surtout
dans le milieu est observé sur les couches cellu-
sur la S;érie maintenue à 400 C. Les titrages du
laires après 24 heures d’incubation. La quasi-
virus contenu dans le milieu nutritif ont été exé-
totalité des cellules ayant été détruite, les fla-
cutés lorsque l’effet cytopathogène était maxi-
cons ont été éliminés.
mum, c’est-à-dire 6 à 7 jours après l’infection -
Passages suivants.
A37(‘C:
au 3e passage =- titre 105,3 DICT par ml.
Les passages suivants ont été effectués & par-
au 17e passage = titre 106,2 DICT par ml.
tir de la série a). Trois passages Suc:cessifs ont
au 23~: passage -= titre 105,G DICT par ml. (après
ainsi été effectués ; l’effet cytopathogène (E. C. P.)
congélation)
se manifeste au 2e passage au bout de 6 jours, et
au 7e passage après 3 jours seulement.
A40’jC:
A partir du 3e passage à 370 C, deux séries de
au 6” passage = titre 105,s DICT par ml.
passages ont été effectuées : l’une par passage en
au IOe passage -= titre lo”,s DICT par ml.
série du virus à 370 C, l’autre par passage en série
au 21” passage = titre loti,” DICT par ml.
à 400 c.
Une courbe de croissance est établie pour le
Que les transferts aient été effectués par addi-
virus maintenu à 400 C au 23” passage (Fig. 1).
a
tion de milieu du passage précédent à une sus-
pension fraîche de cellules lors desa répartition,
Persistance du virus.
ou qu’ils aient été effectués par addition de ce
virus au milieu de renouvellement sur une cou-
Du virus peut être mis en évidence dans le mi-
*
che déjà constituée, il n’a pas été constaté de
lieu nutritif provenant de tubes infectés 28 jours
différences dans la rapidité d’apparition de I’E.
plus tô:.
C. P. Dans le dernier cas cependant, il est à noter
que les lésions apparaissent sur les bords de la
Effet cytopathogène.
culture, là où la prolifération cellulaire se pour-
10 Infection d’une couche cellulaire par une sus-
suit ainsi que l’ont noté PLOWRIGHT et FERRIS
pension de rate de bovin infecté.
(2).
Au 12” jour après l’infection, on commence à
A partir du 151~ passage, l’effet cytopathogène
observer, au sein de la couche cellulaire, des cel-
se manifeste dès le 3~ jour par l’apparition de
lules multinucléées dont les noyaux sont, soit
masses arrondies, réfringentes, pourvues de fi-
groupés en amas de 3 à 20, soit disposés en ligne.
laments qui s’anastomosent à ceux émis par les
II existe dans le cytoplasme des masses irré-
cellules voisines. Les multiplications cellulaires
gulières fortement colorées par I’éosine. Par con-
sont stoppées, le plus souvent avant qu’une cou-
tre, les noyaux ne montrent aucune inclusion.
che cellulaire continue ait été obtenue. C’est
pourquoi, il est envisagé de n’inoculer les cellules
20 Irtfecfion d’une couche cellulo,re par une SUS-
que 2 jours après leur mise en culture, afin de
pensIon de ganglIon de bovin infecté.
permettre au tapis cellulaire d’être continu avant
48 heures après l’infection, la couche cellulaire
qu’intervienne l’action cytopathogène du virus. :i est dissociée. La paroi du flacon est tapissée d’une
I sorte de filet formé par des prolongements cyto-
Identification du virus.
/
plasmiques de cellules très allongées, présentant
Les tests de séro-neutralisation effectués après I un renflement au niveau du noyau. Au sein de
chaque série de 5 passages successifs ont tou- i certaines « mailles » se renwntrent des cellules
314
mult~nucléées, de petite taille renfermant quel-
sont assez diffuses, qui occu-
ques noyaux dont certains sont pycnotiques.
sont moins nombreuses, moins
30 Effet cyfopofhogène après 20 passages en cul-
petites dimensions que celles ob-
ture.
cultures maintenues à + 400 C.
a) Cullure à 370 C.
Ces lésions rappellent celles décrites par PL0 W-
res maintenues à 400 C, dans un
RIGHT et FERRIS (1). Dès le 3e jour après I’in-
i va du 3eau 5e jour, des cellules
fection de la suspension cellulaire lors de sa mise
ntes apparaissent en même temps
en culture, on peut voir les limites du cytoplasme
t des amas de noyaux ; dès le 5e-
s’estomper et disparaître entre des cellules adja-
degrande tailleseforment;
centes ; il se forme de petites cellules multinu-
nombreux noyaux qui, dans
cléées dont les noyaux en nombre variant de 2 à
géantes, se groupent en cou-
10 sont groupés en amas ou disposés selon une
utres se rassemblent au centre ou
ligne.
parties de cytoplasme qui
Quelques inclusions éosinophiles intra-cyto-
plasmiques de petite taille s’observent également.
toutes ces cellules renferme
Au 4e jour, apparaissent des cellules arrondies
philes importantes.
ou ovalaires, réfringentes, pourvues de prolon-
nucléaires sont précoces (5 à
gements cytoplasmiques d’épaisseur et longueur
elles n’ont pu être
variable, qui s’anastomosent avec ceux de cellules
é qu’avec l’hémalun
voisines. Ces cellules sont souvent multinucléées.
n’étaient pas décelées avec I’hé-
Leur cytoplasme est fortement éosinophile.
Les cellules multinucléées s’accroissent en nom-
ntent sous différentes formes, Un
bre et en volume. Certaines renferment des va-
coloré par I’éosine, entouré d’un
cuoles. Le cytoplasme se charge de masses éosi-
aines cellules en possèdent plu-
nophiles.
Au 5e jour, la majeure partie de la surface de la
culture est occupée par des cellules multinucléées
groupant au maximum 15 à 20 noyaux ; beau-
r après l’infection la proportion
coup en contiennent moins de 10. De nombreu-
sentant ces inclusions n’est pas
ses cellules isolées montrent dans leur cytoplasme
des granulations éosinophiles. La croissance cel-
lulaire est déjà arrêtée, et les cellules arrondies
diminuent en nombre.
d’autres l a presque totalité en
Dans les jours suivants, les syncytiums aug-
mentent en volume par fusion des éléments
suivants, les altérations nuclé-
mitoyens. Ils ont peu de tendance à se vacuoler.
t ; certains noyaux présentent
Ils se détachent peu à peu de la paroi de verre,
mogène, bordé par un liseré de
et vers le 20e jour il ne reste que quelques cellules
mono ou multinucléées, souvent pycnotiques et au
cytoplasme lâche, adhérentes au flacon.
Les modifications du noyau se traduisent dès
e du halo clair, bordé d’une
le 5-6e jour par la présence d’une tache rose,
souvent peu visible sous le réseau de chromatine.
Vers le 8e jour, une grande proportion des cellu-
les présente des inclusions nucléaires de type
variable : soit une ou plusieurs taches incolores
circulaires qui renferment au centre un point for-
verre, et on les retrouve sans
tement coloré par I’éosine, soit une tache rose
315
Cependant, au delà du 17e jour, de nombreux
levé 14 jours après l’infection neutralise le virus
.
noyaux ne montrent plus qu’un liseré basophile
bovipestique de culture à la dilution 1 : 300.
entourant une zone centrale rose vif, homogène,
b) Au 2Oe’ passage en culture, seul le virus pro-
:
le nucléole apparemment intact étant refoulé
pagé à 370 C est inoculé à deux bovins.
vers la périphérie.
L’incubation dure 3 jours pour l’un, 4 jours
Un autre type d’effet cytopathogène s’observe
pour l’autre. La température demeure élevée
assez souvent dans les cultures en flacons, plus
(supérieure à 400 C le matin) pendant 4 à 5 jours
i
rarement dans les cultures en tube. La couche
respectivement.
cellulaire prend un aspect réticulé dès le 4e jour
L’un des animaux meurt le 13e jour après
après l’infection. II semble que les cellules se ras-
inoculation et présente tous les signes nécrop-
semblent en traînées anastomosées, laissant entre
siques de la peste bovine.
les mailles de larges plages vides. Au sein des
Le second se rétablit et survit.
traînées, les cellules sont comprimées, rétrac-
tées, il est difficile de distinguer leurs limites. On
peut noter la présence, au sein des traînees, et
DISCUSSION
surtout en bordure, de cellules mujtinucjéées
contenant des inclusions intracytoplasmiques
L’adaptatron
aux cultures cellulaires de rein
éosinophiles.
d’embryon bovin de la souche sauvage d’épreuve
Cet aspect rappelle celui décrit par ODDO et
n’a présenté aucune difficulté. La mise au con-
Coll. (1961) comme « strand forming cytopathic
tact des cellules d’une suspension de ganglions
effect », et celui observé lors de l’infection de
infectes, pendant quelques heures a 370 C, suivie
couches cellulaires par une suspension de gan-
d’un lavage. n’a provoqué qu’un effet toxique
glions infectés de peste bovine.
limité. ILes lésions cytopathogènes intenses appa-
rues en 48 heures ont d’abord fait penser à I’in-
Pouvoir pathogène pour les bovrns.
terventjon d’un virus latent autre que celui de la
peste bovine, mais les épreuves de séroneutra-
a) Au IOe passage en culture, les souches pro-
lisation ont montré que l’effet cytopathogène
pagées à 37 et 40: C sont inoculées chacune à
était complètement inhibé par le sérum contre la
deux bouvillons.
peste bovine. Cependant, it a paru préférable
de poursuivre les passages à partir du virus obte-
10 Virus 0 37O C.
nu par infection des cellules par la suspension
L’un des bouvillons dont le sérum neutralisait
de rate. Ce court délai d’apparition des lésions
le virus PB à la dilution 1 : 20e n’a présenté
cellulaires contraste avec les résultats publiés par
aucune réaction.
PLOWRIGHT et FERRIS (1) pour la souche Ka-
Le second, après une incubation de 3 jours
bete «O», par DE BOER (5) pour les souches de
montre une médiocre ascension thermique au
PAKCHONG et PENDIKetparPROVOST(3) qui
4e jour. La température redescend dès le 5e jour
observent les lésions après 15 à 21 jours de cul-
mais des lésions buccales discrètes apparaissent
ture. Le premier effet cytopathogène observé
au 7e jour. L’animal est sacrifié agonisant ce jour
sans coloration a consisté en l’apparition de
même, et, à l’autopsie présente les lésions carac-
cellules géantes de grandes dimensions qui se
téristiques de la peste bovine.
sont creusées de vacuoles et ont persisté pendant
une très longue période.
2O Virus 0 40° C.
Les passages ultérieurs n’ont pas présenté de
Après une incubation de 3 jours I’hyperthermie
difficulté. On a seulement observé un raccour-
augmente progressivement jusqu’au 5” jour.
cissement progressif du délai d’apparition de
La température demeure en plateau jusqu’au
l’effet cytopathogène, et après le 15~’ passage la
9e jour.
multiplication des cellules était arrêtée avant que
Les lésions buccales se manifestent au 8ejour.
la couche en soit continue.
L’un des deux animaux inoculés meurt le 9e
A l’état frais, l’effet cytopathogène observé
jour, et montre les lésions caractéristiques de la
ressemble étroitement à celui que provoque la
peste bovine. Le second survit, son sérum pré-
souche adaptée par PLOWRIGHT et FERRIS :
316
t
apparition de foyers constitués par des cellules
II est regret lble que la pénurie de bovins ré-
arrondies, réfringentes, munies de prolonge-
ceptifs à. la pe te n’ait pas permis d’effectuer des
ments filamenteux.
titrages compc ratifs sur bovins.
La différence la plus notable observée entre la
Les titres dc s fluides des cultures maintenues
souche adaptée à Dakar et celle adaptée à Mu-
respectivemen
à 370 et 400 C sont comparables.
guga porte sur la fréquence et l’importance des
En ce qui cc ]Cerne le pouvoir pathogène pour
inclusions intra-nucléaires. A Muguga, PLOW-
le boeuf, la SU( :ession des passages à 370 n’a pas
RIGHT et FERRIS observent en de rares occa-
encore entraî lé au 19” passage d’atténuation
sions des inclusions du type B de COWDRY,
sensible. D’ai eurs DE BOER (5) observe que
alors que les inclusions provoquées par la souche
la souche Penc k au 16e passage provoque encore
sauvage de Dakar sont constantes, de grandes
des lésions bl :Cales, la diarrhée et la mort, et
dimensions et peuvent être rattachées au groupe
PLOWRIGHT et FERRIS, constatent que 3 bovins
A de COWDRY.
sur 5 inoculés avec le 16e passage de la souche
II semble que le maintien à 40” C des cultures
Kabete « 0 » succombent ; cette souche ne se
conserve à ces inclusions le caractère qu’elles
révèle atténué : qu’après le 21 e passage.
présentaient aux premiers passages, alors que
La seconde série de passage à 400 C a été
l’incubation à 370 C conduit à une modification
effectuée dan! le but de rechercher l’influence
de leur aspect : les inclusions sont plus petites,
éventuelle de la température d’incubation sur
s’apparentent davantage au type B de COWDRY
l’évolution d
pouvoir pathogène. Celui-ci
et leur fréquence est moins nombreuse.
n’ayant pas er tore été sensiblement réduit à 370,
Les inclusions observées à 400 C rappellent
les essais con paratifs entre les deux séries de
la disposition « en cocarde tricolore » fréquente
passages dev ont être repris lorsque le virus
dans I’herpès, mais d’autres types d’inclusions
aura subi un 1lus grand nombre de passages en
sont aussi remarqués.
cultures.
En ce qui concerne les cellules multinucléées,
malgré une recherche portant sur plusieurs cen-
CONCLUSIONS
taines de lames colorées à différents stades de
culture, il n’a jamais été possible de noter la
1. - Une s juche de virus bovipestique a été
présence de cellules en voie de division dans les
adaptée à la r ultiplication en cultures cellulaires
syncytiums (8). Ceux-ci semblent, à notre avis,
de rein d’emt -yon bovin.
se constituer par la fusion du cytoplasme de
2. - Deux séries de passages parallèles ont
cellules adjacentes et non par division répétée du
été effectuées en maintenant respectivement les
noyau d’une unique cellule d’origine. II n’aurait
cultures à 370 !t 400 c.
d’ailleurs pas été impossible qu’une cellule en
3. - Les CI Itures infectées présentent des Ié-
voie de division participe à la formation d’un
sions analogu
IS dans l’ensemble à celles décrites
syncytium et que la division nucléaire ait été
par PLOWRIl ;HT et FERRIS, mais en outre des
stoppée par l’infection ainsi que le suggère
inclusions nu Iéaires particulières ont été ob-
ROIZMAN (6).
servées,
Les titres de virus obtenus correspondent à
4. - Vingt passages en série n’ont pas sen-
ceux publiés par PLOWRIGHT et FERRIS (1)
siblement atté iué le pouvoir pathogène du virus
mais sont inférieurs de 1 à 2 log à ceux qu’an-
pour les bovir s.
nonce DE BOER (5). La teneur maxima du fluide
baignant les cultures est atteinte au 8e jour, de
.oborotoire de recherches vétérinaires
même que pour la souche Kabete « 0 » en cul-
je Dakar-Honn (Rép. du Sénégal)
ture.
Service de Virologie.
SUMMARY
Adaptation of a strain of Rinderpest virus to tissue-culture
1. - A strain of rinderpest virus of bovine origin has bec n adapted to culture on embryo
bovine kidney cells on which it multiplies.
311
Photo no 1. - Culture de cellules épithéliales deyrein
d’embryon bovin -- 5“ jour ~ ,X 750
318
Photo no 2. - Culture de
infecté par le virus bovipestique 3e jour,
22e passage -
Photo no 3. - Culture de cellules épithéliales de rein
bovin infectées
par le virus bovipestique - 6e jour, incubation 370
Cellules multinucléées, X 500.
319
i
2. - Two parallel series of passages have been made maintaining the culture at 370 C and
400 C (98.60 F and 1040 F) respectively.
a
3. - The infected cultures present lesions analogue in general to those described by Plowright
_
and Ferris, but in addition certain nuclear inclusion bodies have been observed.
4. - Twenty passages in series have not noticeably reduced the pathogenicity of the virus for
cattle.
1
RESUMEN
Adaptation de una estirpe de virus bovipéstico al cultiva celular
1. - Una estirpe de virus bovipéstico ha sido adaptada a la multiplicaci0n en cultivas celu-
lares de riiïon de embribn bovino.
2. - Dos series de pasadas paralelas han sido Ilevadas a cabo, manteniendo respectiva-
mente 10s cultivas a 37 y 400 C.
3. - Los cultivas infectados presentan lesiones anklogas, en su conjunto, a aquellas descritas
por Plowring y Ferris, pero, ademks, se ha podido comprobar la existencia de cierias inclusiones
nucleares particulares.
4. - Veinte pasadas en serie no ban Ilegado a atenuar de forma apreciable el poder patogeno
del virus por 10 que respecta a 10s bovinos.
BIBLIOGRAPHIE
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.
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mitosis. 1. Observations on the recruitment of
2. PLOWRIGHT (W.) et FERRIS (R. D.). - Stu-
cells in Karyo kinesis into giant cells indu-
dies with rinderpest virus in tissue culture.
ced by herpes virus and bearing on the site
A technic for detection and titration of viru-
of virus antigen formation. Virology 13, 1961.
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dies with rinderpest virus in tissue culture. i
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in virus neutralization tests. Arch. fiir virus
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t
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8. PROVOST (A.) et VILLEMOT (1. M.). - Note
tissue culture. 1. Méthodeforvirus production.
sur les plasmodes multinucléés rencontrés
Brit.Vet. J. (1962) 118,107. II. Serum neutra- !
dans les cultures cellulaires infectées de virus
‘1
lization tests. ibid : 133. III, Use of attenuated
bovipestique. Ann. Inst. Past. 1961, 101 (2) :
strain as a vaccine for cattle, ibid. 141.
276.
320
D'ÉLEVAGE
VÉTÉRINAIRE DES
REVUE D’ÉLEVAGE
ET DE
. MÉDECINE VÉT
DES PAYS TRO
0
Adaptation d’une souche de virus boyipestique
à la culture cellulaire
-1
Premiers résultats
‘1
par Y. GILBERT et J. MONNIER
c
‘S
Tome XV (nouvelle série)
No 4 - 1962
== VIGOT FRÈRES, ÉDITEUR
23, rue de l’École-de-Médecine,
ARIS-VI”
c
Adaptation d’une souche de vi rus bovipestique
à la culture CdlUli Sire
Premiers résultats
par Y. GILBERT ef J. MONNIER
Depuis 1959 sont effectuées à Dakar des expé-
temps, I~CI SUS~ :nsion cellulaire, filtrée sur gaze
riences sur la culture du virus bovipestique en
(4 épaisseurs) pt centrifugée à 900 tours/minute,
cultures cellulaires. La souche jusqu’ici utilisée
nutes. Le surnageant est éliminé
était celle adaptée par PLOWRIGHT et FERRIS,
re lavé avec de la solution saline
(1) qui avait permis de réaliser quelques essais
nnéedelOp.100desérum bovin.
d’immunisation de bovins et, surtout, de dispo-
re centrifugation, le culot cellu-
ser d’un matériel bon marché pour les expérien-
uspension à raison de 1 volume
ces de séroneutralisation.
e u nutritif composé de solution
II a paru intéressant de tenter l’adaptation aux
nnée de 0,5 p. 100 d’hydrolysat
cultures cellulaires de la souche sauvage d’épreu-
et 0,l p. 100 d’extrait de levure,
ve utilisée au Laboratoire de Dakar, dans le but
10 p, 100 de sérum de veau (im-
d’étudier son comportement en culture cellulaire
e) ainsi que des antibiotiques :
et sur bovins, et de comparer les résultats obtenus
Uljml et Streptomycine 0,l mg
à ceux publiés précédemment.
MATÉRIEL ET MÉTHODES
2 ou 3 jours à l’aide du même
roportion de sérum est ramenée
Matériel.
m de bovin (importé de France)
10 Préparafian des suspensions cef/ulaires.
nt, et à 2 p. 100 pour les chan-
rs, qui s’effectuent lorsque le
Toutes les expériences ont été réalisées à l’aide
ateur coloré indique un pH net-
de ceflules épithéliales de reins d’embryons bo-
vins en provenance de l’abattoir de Dakar.
L’âge des embryons n’a pas été pris en consi-
dération.
cellulaire est répartie soit en
Les reins sont décapsulés, la zone corticale est
eutre ou de Pyrex de 18 x 180
prélevée en petits fragments à l’aide d’un bis-
1, soit en tubes de Leighton à la
touri ; ces fragments sont hachés, lavés 3 fois
en flacons plats pharmacie de
au PBS*, soumis à l’action d’une solution de tryp-
se de 15 ml, soit en flacons de
sine Difco (1 : 250) à3 p.1000 pendant 20minutes
neutre à la dose de 22,5 mi.
à la température du laboratoire, sur agitateur
ction de grandes quantités de
magnétique. La trypsine est éliminée par décan-
es boîtes de Roux de 1 1. recevant
tation et remplacée par une solution fraîche de
trypsine. La trypsination est poursuivie pendant
5 à 6 heures au réfrigérateur. Au bout de ce
tubes sont placés après réparti-
sion, en position stationnaire pen-
* P B S = Phosphate buffer solution (Dulbecco).
Rev. Elev. Méd. vét. Pays trop. 1962, 15, no 4.
Reçu pour publication : août 1962.
tubes sont placés sur un tambour tournant (sys-
tif du passage précédent, au moment de la répar-
tème roller-tubes).
tition en flacons ou en tubes.
La température d’incubation est, selon les cas,
Un certain nombre de passages ont dCi être
de 370 ou 400 C.
effectués, lorsque des suspensions cellulaires ne
40 Souche de virus bovieestique.
pouvaient être obtenues, sur des couches cellu-
laires déjà constituées, âgées de 2 à 5 jours.
La souche de virus bovipestique utilisée est la
Dans ce cas, après avoir vidé les tubes ou fla-
souche sauvage conservée à Dakar en vue des
cons et renouvelé le milieu, on ajoute une quan-
épreuves. II s’agit d’une souche isolée en 1957
tité de milieu du passage précédent égale au
dans un foyer et passée chaque année sur bovin,
dixième du volume total du milieu contenu dans
conservée sous forme de suspension lyophilisée
les tubes ou flacons.
de rate et ganglions dans du sang infecfé. Elle est
désignée sous le nom de souche DK.
Titrages du virus.
En vue de l’adaptation de la souche aux cul-
tures cellulaires, un veau réceptif est inoculé
Dans les titrages, le virus est dilué en série déci-
avec une ampoule de virus lyophilisé. La réaction
male dans du liquide de Hanks (dilution IO-là
thermique débute le 4e jour suivant l’inoculation,
10-G).
atteint son maximum le 7e jour. Les lésions bucca-
On porte alors 1 ml de chacune des dilutions
les apparaissent et le veau est sacrifié le 81! jour.
dans un tube contenant 10 ml de suspension cel-
Rate et ganglions sont prélevés et servent de
lulaire. Après le mélange, le contenu de chaque
matériel de dépai-t.
tube de suspension infecté est réparti à la dose de
2 ml dans 5 tubes en verre neutre ou Pyrex de
Méthode de passage du virus.
18 x 180.
A) Premier passage.
Chaque tube reçoit donc 0,2 ml de la dilution
considérée.
Des suspensions à 10 p. 100 en milieu de Hanks
Pour les titrages plus précis, on recourt à
sont préparées avec la rate et des ganglions, par
10 tubes par dilution.
broyage dans un micro-broyeur du type mixer.
Les suspensions sont centrifugées à 2.000 tours
Identification du virus par séroneutralisation.
par minute pendant 10 minutes et le surnageant
constitue I’inoculum.
Le virus à identifier est dilué en une série de
Quatre modes d’infection ont été essayés sur
dilutions décimales de 10-l à 10-6.
des cultures de cellules âgées de 2 jours, obtenues
Deux séries de 6 tubes sont préparées.
par trypsinafion d’un tapis cellulaire provenant
Chaque série reçoit 1 ml des différentes dilu-
de cellules de lece explantation.
tions de virus.
CJ) Le flacon est vidé. La suspension de rate
A chacun des tubes d’une série on ajoute 1 ml
est introduite à la dose de 5 ml pour un flacon
de sérum antibovipestique préparé soit sur lapin,
de 250 ml. Le flacon est placé pendant 4 heures à
soit sur bcwf.
l’étuve à 370 C. il est alors vidé et le tapis cellu-
Les tubes de l’autre série reçoivent 1 ml de
laire est lavé 3 fois avec de la solution de tianks.
sérum de bovin réceptif.
On renouvelle alors le milieu nutritif (22.,5 ml).
Après agitation, les tubes sont incubés 1 h. au
b) La même technique est employée pour la
bain-marie, à 37”.
suspension de ganglion.
Les différents mélanges sont répartis à la dose
de 0,2 cc par tube contenant 2 ml de suspension
c) Le flacon est vidé. On y introduit 2,5 ml
cellulaire.
de suspension de rate, on complète avec 20 ml
On utilise 2 à 5 tubes par mélange.
de milieu nutritif et l’on incube à l’étuve à 370 C.
Le virus est considéré comme neutralisé s’il
d) La même technique est employée pour la
existe une différence d’au moins 2 log* entre les
suspension de ganglion.
titres des virus respectivement en présence de
B) Passages suivants.
sérum normal et de sérum antibovipestique.
Ils sont effectués en principe en ajoutant à une
suspension cellulaire 10 p. 100 du milieu nufri-
* Logarithme à base 10.
312
Inoculation aux bovins.
e cellulaire des cellules géantes
Seul a été recherché jusqu’ici le pouvoir patho-
us l’aspect de plaques arrondies
gène du virus pour le bceuf. En raison des diffi-
dimensions variables, résultant
cultés à se procurer des bovins réceptifs, et du
asmes des cellules.
coût de l’expérimentation, il n’a pas encore été
issent et se creusent
effectué de recherches sur le titre du virus obtenu
ours après l’infection, la
par culture en utilisant le bœuf comme animai
du tapis cellulaire semble lésé.
d’épreuve.
s l’infection initiale, un second
Les bovins reçoivent 1 ml du milieu non dilué
ué en mélangeant du milieu nu-
du passage considéré par voie sous cutanée.
s cellules infectées du premier
uspension cellulaire lors de sa
Préparations colorées.
érie des passages ultérieurs de la
Elles sont réalisées à l’aide de tubes de Leigh-
nt du virus en cul-
ton recevant 2 ml de suspension cellulaire, infec-
tée ou non.
Pour la coloration, les tubes sont vidés, lavés
chnique mais utilisation
3 fois au PBS, la couche cellulaire est fixée 3 à
ssu ganglionnaire).
5 minutes au Bovin alcoolique, puis colorée par
se traduisant par la ré-
I’hémalun de Mayer et I’éosine. Montage au
décollement, s’ob-
baume du Canada.
e la couche cellulaire
l’infection. 48 heures plus tard
RÉSULTATS
es modifications cytopathogènes
is continu de cellules jointives,
a) Croissance des cellules à 370 et à 400 C.
formé de cellules de type
nt un léger renflement
Aucune différence n’a été notée dans le com-
e s prolongements cytoplas-
portement des cultures cellulaires incubées soit
fins qui s’anastomosent avec
à 370 soit à 400 C.
voisines. La paroi des flacons
Un léger avantage peut même, semble-t-il,
‘un filet à mailles assez lâches.
être reconnu à la température de 400 C, en ce qui
ne couche de cellules âgées de
concerne la rapidité de croissance.
milieu nutritif provenant du Ier
Au delà de 410 C, des signes de souffrance
ue l’apparition, en Sjours envi-
apparaissent chez les cellules aspect : granuleux,
pathogène plus ménagé. En-
retard de croissance, rétraction. La destruction
filet s’observent des nappes
des cellules s’observe à partir de 4205 ; elle est
mées par des cellules géantes,
totale si cette température est maintenue plusieurs
‘état frais, on peut distinguer les
heures.
I’E. C. P.* pouvait faire
b) Adaptation de la souche DK aux cultures
e d’un virus latent dans la sus-
cellulaires.
aire, Une épreuve de séro-
A la suite de l’infection par des suspensions de
à l’aide de sérum hyperim-
rate ou ganglions infectés, les effets suivants sont
in, assure l’identité du virus.
observés sur le tapis cellulaire :
le mélange sérum normal-
Méthode a) (suspension de rate en contact pen-
ceux ayant reçu du virus seul,
dant 4 heures avec les cellules, puis lavage).
plus tard, un ECP net, alors que
Après 24 heures, un effet toxique limité est ob-
ant le mélange sérum antibovi-
servé sur certaines zones de la couche monocel-
nt aucune modification
lulaire : cellules rétractées, réfringentes qui se
détachent du verre. Après trois jours, la proli-
fération des cellules intactes avoisinantes a com-
blé les vides. 11 jours plus tard, apparaissent au
* Effet cytopat bogène.
313
f
Après cette démonstration de l’effet cytopa-
jours abouli à la neutralisation
de l’effet cytopa-
thogène du viru:;, les passages ont été aban-
thogène par le sérum contre la peste bovine, quel-
donnés,
l’effet cytopathogène se manilestant
le que soit l’origine (bceuf ou lapin) decelui-ci.
dans le même laps de temps que celui observé
Titres du virus.
pour les passages à partir de la rate.
Méfhode c ef d) 2.. suspension de rate ou gan-
Un certain nombre de titrages a été effectué
glion mélangée au milieu nutritif: un effettoxique
i
sur cultures cellulaires au fut- et à mesure de la
intense attribué aux extraits d’organes présents
succession des passages. Ils ont porté surtout
dans le milieu est observé sur les couches cellu-
sur la S;érie maintenue à 400 C. Les titrages du
laires après 24 heures d’incubation. La quasi-
virus contenu dans le milieu nutritif ont été exé-
totalité des cellules ayant été détruite, les fla-
cutés lorsque l’effet cytopathogène était maxi-
cons ont été éliminés.
mum, c’est-à-dire 6 à 7 jours après l’infection -
Passages suivants.
A37(‘C:
au 3e passage =- titre 105,3 DICT par ml.
Les passages suivants ont été effectués & par-
au 17e passage = titre 106,2 DICT par ml.
tir de la série a). Trois passages Suc:cessifs ont
au 23~: passage -= titre 105,G DICT par ml. (après
ainsi été effectués ; l’effet cytopathogène (E. C. P.)
congélation)
se manifeste au 2e passage au bout de 6 jours, et
au 7e passage après 3 jours seulement.
A40’jC:
A partir du 3e passage à 370 C, deux séries de
au 6” passage = titre 105,s DICT par ml.
passages ont été effectuées : l’une par passage en
au IOe passage -= titre lo”,s DICT par ml.
série du virus à 370 C, l’autre par passage en série
au 21” passage = titre loti,” DICT par ml.
à 400 c.
Une courbe de croissance est établie pour le
Que les transferts aient été effectués par addi-
virus maintenu à 400 C au 23” passage (Fig. 1).
a
tion de milieu du passage précédent à une sus-
pension fraîche de cellules lors desa répartition,
Persistance du virus.
ou qu’ils aient été effectués par addition de ce
virus au milieu de renouvellement sur une cou-
Du virus peut être mis en évidence dans le mi-
*
che déjà constituée, il n’a pas été constaté de
lieu nutritif provenant de tubes infectés 28 jours
différences dans la rapidité d’apparition de I’E.
plus tô:.
C. P. Dans le dernier cas cependant, il est à noter
que les lésions apparaissent sur les bords de la
Effet cytopathogène.
culture, là où la prolifération cellulaire se pour-
10 Infection d’une couche cellulaire par une sus-
suit ainsi que l’ont noté PLOWRIGHT et FERRIS
pension de rate de bovin infecté.
(2).
Au 12” jour après l’infection, on commence à
A partir du 151~ passage, l’effet cytopathogène
observer, au sein de la couche cellulaire, des cel-
se manifeste dès le 3~ jour par l’apparition de
lules multinucléées dont les noyaux sont, soit
masses arrondies, réfringentes, pourvues de fi-
groupés en amas de 3 à 20, soit disposés en ligne.
laments qui s’anastomosent à ceux émis par les
II existe dans le cytoplasme des masses irré-
cellules voisines. Les multiplications cellulaires
gulières fortement colorées par I’éosine. Par con-
sont stoppées, le plus souvent avant qu’une cou-
tre, les noyaux ne montrent aucune inclusion.
che cellulaire continue ait été obtenue. C’est
pourquoi, il est envisagé de n’inoculer les cellules
20 Irtfecfion d’une couche cellulo,re par une SUS-
que 2 jours après leur mise en culture, afin de
pensIon de ganglIon de bovin infecté.
permettre au tapis cellulaire d’être continu avant
48 heures après l’infection, la couche cellulaire
qu’intervienne l’action cytopathogène du virus. :i est dissociée. La paroi du flacon est tapissée d’une
I sorte de filet formé par des prolongements cyto-
Identification du virus.
/
plasmiques de cellules très allongées, présentant
Les tests de séro-neutralisation effectués après I un renflement au niveau du noyau. Au sein de
chaque série de 5 passages successifs ont tou- i certaines « mailles » se renwntrent des cellules
314
mult~nucléées, de petite taille renfermant quel-
sont assez diffuses, qui occu-
ques noyaux dont certains sont pycnotiques.
sont moins nombreuses, moins
30 Effet cyfopofhogène après 20 passages en cul-
petites dimensions que celles ob-
ture.
cultures maintenues à + 400 C.
a) Cullure à 370 C.
Ces lésions rappellent celles décrites par PL0 W-
res maintenues à 400 C, dans un
RIGHT et FERRIS (1). Dès le 3e jour après I’in-
i va du 3eau 5e jour, des cellules
fection de la suspension cellulaire lors de sa mise
ntes apparaissent en même temps
en culture, on peut voir les limites du cytoplasme
t des amas de noyaux ; dès le 5e-
s’estomper et disparaître entre des cellules adja-
degrande tailleseforment;
centes ; il se forme de petites cellules multinu-
nombreux noyaux qui, dans
cléées dont les noyaux en nombre variant de 2 à
géantes, se groupent en cou-
10 sont groupés en amas ou disposés selon une
utres se rassemblent au centre ou
ligne.
parties de cytoplasme qui
Quelques inclusions éosinophiles intra-cyto-
plasmiques de petite taille s’observent également.
toutes ces cellules renferme
Au 4e jour, apparaissent des cellules arrondies
philes importantes.
ou ovalaires, réfringentes, pourvues de prolon-
nucléaires sont précoces (5 à
gements cytoplasmiques d’épaisseur et longueur
elles n’ont pu être
variable, qui s’anastomosent avec ceux de cellules
é qu’avec l’hémalun
voisines. Ces cellules sont souvent multinucléées.
n’étaient pas décelées avec I’hé-
Leur cytoplasme est fortement éosinophile.
Les cellules multinucléées s’accroissent en nom-
ntent sous différentes formes, Un
bre et en volume. Certaines renferment des va-
coloré par I’éosine, entouré d’un
cuoles. Le cytoplasme se charge de masses éosi-
aines cellules en possèdent plu-
nophiles.
Au 5e jour, la majeure partie de la surface de la
culture est occupée par des cellules multinucléées
groupant au maximum 15 à 20 noyaux ; beau-
r après l’infection la proportion
coup en contiennent moins de 10. De nombreu-
sentant ces inclusions n’est pas
ses cellules isolées montrent dans leur cytoplasme
des granulations éosinophiles. La croissance cel-
lulaire est déjà arrêtée, et les cellules arrondies
diminuent en nombre.
d’autres l a presque totalité en
Dans les jours suivants, les syncytiums aug-
mentent en volume par fusion des éléments
suivants, les altérations nuclé-
mitoyens. Ils ont peu de tendance à se vacuoler.
t ; certains noyaux présentent
Ils se détachent peu à peu de la paroi de verre,
mogène, bordé par un liseré de
et vers le 20e jour il ne reste que quelques cellules
mono ou multinucléées, souvent pycnotiques et au
cytoplasme lâche, adhérentes au flacon.
Les modifications du noyau se traduisent dès
e du halo clair, bordé d’une
le 5-6e jour par la présence d’une tache rose,
souvent peu visible sous le réseau de chromatine.
Vers le 8e jour, une grande proportion des cellu-
les présente des inclusions nucléaires de type
variable : soit une ou plusieurs taches incolores
circulaires qui renferment au centre un point for-
verre, et on les retrouve sans
tement coloré par I’éosine, soit une tache rose
315
Cependant, au delà du 17e jour, de nombreux
levé 14 jours après l’infection neutralise le virus
.
noyaux ne montrent plus qu’un liseré basophile
bovipestique de culture à la dilution 1 : 300.
entourant une zone centrale rose vif, homogène,
b) Au 2Oe’ passage en culture, seul le virus pro-
:
le nucléole apparemment intact étant refoulé
pagé à 370 C est inoculé à deux bovins.
vers la périphérie.
L’incubation dure 3 jours pour l’un, 4 jours
Un autre type d’effet cytopathogène s’observe
pour l’autre. La température demeure élevée
assez souvent dans les cultures en flacons, plus
(supérieure à 400 C le matin) pendant 4 à 5 jours
i
rarement dans les cultures en tube. La couche
respectivement.
cellulaire prend un aspect réticulé dès le 4e jour
L’un des animaux meurt le 13e jour après
après l’infection. II semble que les cellules se ras-
inoculation et présente tous les signes nécrop-
semblent en traînées anastomosées, laissant entre
siques de la peste bovine.
les mailles de larges plages vides. Au sein des
Le second se rétablit et survit.
traînées, les cellules sont comprimées, rétrac-
tées, il est difficile de distinguer leurs limites. On
peut noter la présence, au sein des traînees, et
DISCUSSION
surtout en bordure, de cellules mujtinucjéées
contenant des inclusions intracytoplasmiques
L’adaptatron
aux cultures cellulaires de rein
éosinophiles.
d’embryon bovin de la souche sauvage d’épreuve
Cet aspect rappelle celui décrit par ODDO et
n’a présenté aucune difficulté. La mise au con-
Coll. (1961) comme « strand forming cytopathic
tact des cellules d’une suspension de ganglions
effect », et celui observé lors de l’infection de
infectes, pendant quelques heures a 370 C, suivie
couches cellulaires par une suspension de gan-
d’un lavage. n’a provoqué qu’un effet toxique
glions infectés de peste bovine.
limité. ILes lésions cytopathogènes intenses appa-
rues en 48 heures ont d’abord fait penser à I’in-
Pouvoir pathogène pour les bovrns.
terventjon d’un virus latent autre que celui de la
peste bovine, mais les épreuves de séroneutra-
a) Au IOe passage en culture, les souches pro-
lisation ont montré que l’effet cytopathogène
pagées à 37 et 40: C sont inoculées chacune à
était complètement inhibé par le sérum contre la
deux bouvillons.
peste bovine. Cependant, it a paru préférable
de poursuivre les passages à partir du virus obte-
10 Virus 0 37O C.
nu par infection des cellules par la suspension
L’un des bouvillons dont le sérum neutralisait
de rate. Ce court délai d’apparition des lésions
le virus PB à la dilution 1 : 20e n’a présenté
cellulaires contraste avec les résultats publiés par
aucune réaction.
PLOWRIGHT et FERRIS (1) pour la souche Ka-
Le second, après une incubation de 3 jours
bete «O», par DE BOER (5) pour les souches de
montre une médiocre ascension thermique au
PAKCHONG et PENDIKetparPROVOST(3) qui
4e jour. La température redescend dès le 5e jour
observent les lésions après 15 à 21 jours de cul-
mais des lésions buccales discrètes apparaissent
ture. Le premier effet cytopathogène observé
au 7e jour. L’animal est sacrifié agonisant ce jour
sans coloration a consisté en l’apparition de
même, et, à l’autopsie présente les lésions carac-
cellules géantes de grandes dimensions qui se
téristiques de la peste bovine.
sont creusées de vacuoles et ont persisté pendant
une très longue période.
2O Virus 0 40° C.
Les passages ultérieurs n’ont pas présenté de
Après une incubation de 3 jours I’hyperthermie
difficulté. On a seulement observé un raccour-
augmente progressivement jusqu’au 5” jour.
cissement progressif du délai d’apparition de
La température demeure en plateau jusqu’au
l’effet cytopathogène, et après le 15~’ passage la
9e jour.
multiplication des cellules était arrêtée avant que
Les lésions buccales se manifestent au 8ejour.
la couche en soit continue.
L’un des deux animaux inoculés meurt le 9e
A l’état frais, l’effet cytopathogène observé
jour, et montre les lésions caractéristiques de la
ressemble étroitement à celui que provoque la
peste bovine. Le second survit, son sérum pré-
souche adaptée par PLOWRIGHT et FERRIS :
316
t
apparition de foyers constitués par des cellules
II est regret lble que la pénurie de bovins ré-
arrondies, réfringentes, munies de prolonge-
ceptifs à. la pe te n’ait pas permis d’effectuer des
ments filamenteux.
titrages compc ratifs sur bovins.
La différence la plus notable observée entre la
Les titres dc s fluides des cultures maintenues
souche adaptée à Dakar et celle adaptée à Mu-
respectivemen
à 370 et 400 C sont comparables.
guga porte sur la fréquence et l’importance des
En ce qui cc ]Cerne le pouvoir pathogène pour
inclusions intra-nucléaires. A Muguga, PLOW-
le boeuf, la SU( :ession des passages à 370 n’a pas
RIGHT et FERRIS observent en de rares occa-
encore entraî lé au 19” passage d’atténuation
sions des inclusions du type B de COWDRY,
sensible. D’ai eurs DE BOER (5) observe que
alors que les inclusions provoquées par la souche
la souche Penc k au 16e passage provoque encore
sauvage de Dakar sont constantes, de grandes
des lésions bl :Cales, la diarrhée et la mort, et
dimensions et peuvent être rattachées au groupe
PLOWRIGHT et FERRIS, constatent que 3 bovins
A de COWDRY.
sur 5 inoculés avec le 16e passage de la souche
II semble que le maintien à 40” C des cultures
Kabete « 0 » succombent ; cette souche ne se
conserve à ces inclusions le caractère qu’elles
révèle atténué : qu’après le 21 e passage.
présentaient aux premiers passages, alors que
La seconde série de passage à 400 C a été
l’incubation à 370 C conduit à une modification
effectuée dan! le but de rechercher l’influence
de leur aspect : les inclusions sont plus petites,
éventuelle de la température d’incubation sur
s’apparentent davantage au type B de COWDRY
l’évolution d
pouvoir pathogène. Celui-ci
et leur fréquence est moins nombreuse.
n’ayant pas er tore été sensiblement réduit à 370,
Les inclusions observées à 400 C rappellent
les essais con paratifs entre les deux séries de
la disposition « en cocarde tricolore » fréquente
passages dev ont être repris lorsque le virus
dans I’herpès, mais d’autres types d’inclusions
aura subi un 1lus grand nombre de passages en
sont aussi remarqués.
cultures.
En ce qui concerne les cellules multinucléées,
malgré une recherche portant sur plusieurs cen-
CONCLUSIONS
taines de lames colorées à différents stades de
culture, il n’a jamais été possible de noter la
1. - Une s juche de virus bovipestique a été
présence de cellules en voie de division dans les
adaptée à la r ultiplication en cultures cellulaires
syncytiums (8). Ceux-ci semblent, à notre avis,
de rein d’emt -yon bovin.
se constituer par la fusion du cytoplasme de
2. - Deux séries de passages parallèles ont
cellules adjacentes et non par division répétée du
été effectuées en maintenant respectivement les
noyau d’une unique cellule d’origine. II n’aurait
cultures à 370 !t 400 c.
d’ailleurs pas été impossible qu’une cellule en
3. - Les CI Itures infectées présentent des Ié-
voie de division participe à la formation d’un
sions analogu
IS dans l’ensemble à celles décrites
syncytium et que la division nucléaire ait été
par PLOWRIl ;HT et FERRIS, mais en outre des
stoppée par l’infection ainsi que le suggère
inclusions nu Iéaires particulières ont été ob-
ROIZMAN (6).
servées,
Les titres de virus obtenus correspondent à
4. - Vingt passages en série n’ont pas sen-
ceux publiés par PLOWRIGHT et FERRIS (1)
siblement atté iué le pouvoir pathogène du virus
mais sont inférieurs de 1 à 2 log à ceux qu’an-
pour les bovir s.
nonce DE BOER (5). La teneur maxima du fluide
baignant les cultures est atteinte au 8e jour, de
.oborotoire de recherches vétérinaires
même que pour la souche Kabete « 0 » en cul-
je Dakar-Honn (Rép. du Sénégal)
ture.
Service de Virologie.
SUMMARY
Adaptation of a strain of Rinderpest virus to tissue-culture
1. - A strain of rinderpest virus of bovine origin has bec n adapted to culture on embryo
bovine kidney cells on which it multiplies.
311
Photo no 1. - Culture de cellules épithéliales deyrein
d’embryon bovin -- 5“ jour ~ ,X 750
318
Photo no 2. - Culture de
infecté par le virus bovipestique 3e jour,
22e passage -
Photo no 3. - Culture de cellules épithéliales de rein
bovin infectées
par le virus bovipestique - 6e jour, incubation 370
Cellules multinucléées, X 500.
319
i
2. - Two parallel series of passages have been made maintaining the culture at 370 C and
400 C (98.60 F and 1040 F) respectively.
a
3. - The infected cultures present lesions analogue in general to those described by Plowright
_
and Ferris, but in addition certain nuclear inclusion bodies have been observed.
4. - Twenty passages in series have not noticeably reduced the pathogenicity of the virus for
cattle.
1
RESUMEN
Adaptation de una estirpe de virus bovipéstico al cultiva celular
1. - Una estirpe de virus bovipéstico ha sido adaptada a la multiplicaci0n en cultivas celu-
lares de riiïon de embribn bovino.
2. - Dos series de pasadas paralelas han sido Ilevadas a cabo, manteniendo respectiva-
mente 10s cultivas a 37 y 400 C.
3. - Los cultivas infectados presentan lesiones anklogas, en su conjunto, a aquellas descritas
por Plowring y Ferris, pero, ademks, se ha podido comprobar la existencia de cierias inclusiones
nucleares particulares.
4. - Veinte pasadas en serie no ban Ilegado a atenuar de forma apreciable el poder patogeno
del virus por 10 que respecta a 10s bovinos.
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‘1
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276.
320