INSTITUT D’ELEVAGE ET DE MEDECINE VETERINAIRE DES...
INSTITUT D’ELEVAGE ET DE MEDECINE
VETERINAIRE DES PAYS TROPICAUX
‘bI
REVUE D'ÉLEVAGE
I
ET DE
MÉDECINE VÉ ÉRINAIRE
. . "_._,., “-"
DES PAYS TROPICAUX
Adaptation de la microtechnique
de fixation du complément
au diagnostic de la peste équine
par G. BERNARD
Tome XXVIII (nouvelle skie)
No 4 - 1975
,VIGOT FRERES, EDITEURS
23, rue de I’Ecole-de-Médecine, Paris-VI’
Rev. Elev. Med. vét. Pays trop., 1975, 28 (4) : 451-457
Adaptation de la microtechnique de fixation
du complément au diagnostic de la peste équine
par G. BERNARD (*)
RESUME
Adaptation de la microtechnique de fixation du complément
au diagnostic de la peste équine
Afin de déterminer rapidement l’immunité d’une population équine,
il était nécessaire de posséder une méthode simple. L’auteur a fait une
adaptation à la peste équine de la microtechnique de fixation du com-
plément, en précisant les différents paramètres. Cette épreuve doit être
utilisée pour une recherche statistique uniquement et pour des cas d’im-
munisation récente.
INTRODUCTION
1. MATERIEL ET METHODE
La peste équine sévit toujours à l’état endé-
A) Les milieux
mique en Afrique. 11 est même vraisemblable
Les suspensions virulentes utilisées pour les
qu’elle diffuse vers le Nord à partir de foyers
silencieux centre-africains mis en évidence par
inoculations intracérébrales de souris sont réa-
lisées dans un tampon phosphaté pH 7,4 dont
MAURICE et PROVOST (6). D’autre part,
la formule est la suivante (1) :
BOURDIN, BERNARD et LAURENT (1974)
ont montré l’existence d’une forte proportion
- phosphate disodique
d’anticorps parmi les équins du Sénégal. Les
(NazHPOr) anhydre . . . 3,20 g
échanges entre l’Afrique et l’Europe s’accen-
- Phosphate monosodique
tuant, un marché des chevaux africains est en
NaH2P04, 2 H20) cristallisé 0,33 g
train de se développer.
- Chlorure de sodium. . . 6 g
Aussi, il a paru nécessaire de mettre au
- Eau bidistillée Q.S.P. . .
1000 ml
point une méthode rapide et commode de re-
cherche des anticorps dans le serum.
Stériliser à l’autoclave à 1200 C pendant
20 minutes.
Il existe 8 types principaux d’antigène Peste
equine, il fallait donc s’adresser à une épreuve
Les hématies sont récoltées dans du citrate
de groupe telle la fixation du complément (5).
de soude ou dans une solution de Alsever.
La microméthode a été retenue car elle pré-
Les sérums, antigènes et complément sont
sente une commodité d’emploi appréciab]e et
dilués dans une solution de Veronal Gela-
permet de faire un grand nombre d’examens
tine (VG) :
simultanément.
- 10 comprimés « Complement fixa-
tion test diluent tablets » (oxoïd) .
(*) Laboratoire National de I’Elevage et de Recher-
- Gelatine (Di£co) . . . . . 1 g
ches Vétérinaires, B.P. 2057, Dakar-Hann. Répu-
blique du Sénégal.
- Eau bidistillée Q.S.P. . . . 1 000 ml
- 451 -
Dissoudre au bain-marie à chaud.
mouton. Le sang est prélevé dans une quantité
Lorsqu’on prépare une gamme d’hémolyse,
égale de citrate de soude ou de Alsever. On le
on utilise une solution de Veronal 5 fois con-
conserve 4 à 5 jours à + 4” C avant l’utilisa-
centrée (V5) préparée en dissolvant à chaud
tion. Les hématies sont alors lavées trois fois
un comprimé « Oxoïd » dans 20 ml d’eau bi-
après centrifugation, avec la solution VG. Le
distillée.
culot du dernier lavage est remis en suspension
dans un volume égal de VG. Conservation
Tous ces milieux sont conservés à + 4” C.
d’une semaine à + 40 C.
B) Le matériel spécial
3. Le sérum hémolytique : on utilise Ie sé-
rum de lapin anti-hématies de mouton.
A côté du matériel habituel, on utilise des
microdilueurs de 0,025 ml, des pipettes comp-
Dans toutes les épreuves, on utilise une solu-
te-gouttes des 0,025 ml, des microplaques en U,
tion d’hémolysine (SH) diluée au 1/500 (2 mi-
des porte-plaques pour centrifugation et du pa-
crogouttes de SH dans 12 ml de VG) réalisant
pier GO.NO.GO pour contrôle des microdi-
ainsi les conditions d’excès d’hémolysine.
lueurs.
4. Préparation du stock d’hématies sensibi-
Ces instruments font partie du Microtiterkit
lisées (SS-SH) : on prépare une suspension à 3
produit par Cooke Instruments.
p. 100 d’hématies (SS) dans la solution de VG
à laquelle on ajoute, en effectuant un mouve-
C) Préparation des différents constituants :
ment rotatif, un volume identique de SH (au
1/500). Après incubation de 15 mn à tempéra-
1. L’antigène : la fixation du complément
ture ambiante, la suspension de SS-SH peut
peste équine étant une épreuve de groupe, on
être conservée 24 h à + 4” C.
pourra utiliser l’un quelconque des types.
Néanmoins, le type 9-S2 convient particulière-
5. Préparation de la gamme d’hémolyse :
ment.
suivant BARME et Collaborateurs (1) il est
nécessaire de disposer d’une échelle étalon d’hé-
L’antigène est préparé sur cerveaux de souris
molyse avec laquelle des comparaisons pour-
âgées de trois semaines environ.
ront être faites. On prépare :
On inocule, à chaque animal, 0,03 ml par
u) une solution d’hémoglobine (solution A)
voie intracérébrale, d’une dilution au 1/20
contenant 1 ml de SS + 7 ml d’eau bidistillée.
dans du tampon phosphaté pH 7,4 de la souche
Après agitation, on ajoute 2 ml de solution
neurotrope conservée lyophilisée à - 2.50 C.
de V5.
Au bout de 3 à 5 jours, les souris présentant
b) Une suspension d’hématies (suspension
des symptômes nerveux très importants et
B) en ajoutant 9 ml de VG à 1 ml de SS. On
une paralysie presque complète sont anesthé-
répartit dans 11 tubes à hémolyse :
siées, Après découpage de la boîte crânienne,
les cerveaux seront récoltés et congelés. Après
Solution A : 0,O - 0,l - 0,2 - 0,3 - 0,4 - 0,5 -
décongélation, ils sont lavés trois fois dans du
0,6 - 0,7 - 0,8 - 0,9 - 1,00 ml
VG. On prépare une suspension au 1/20 (10
Solution B : 1,OO - 0,9 - 0,8 - 0,7 - 0,6 - 0,5 -
cerveaux + 12 ml de VG) que l’on broie dans
0,4 - 0,3 - 0,2 - 0,l - 0 ml
un mixer. La suspension est centrifugée 1. h à
Pourcentage d’hémolyse : 0 - 30 - 20 - 30 - 40 -
10 000 t/mn à + 4” C. Le surnageant repré-
50 - 60 - 70 - 80 - 90 - 100
sente l’antigène. II peut être utilisé tel quel
(le conserver à + 4” C) ou bien inactivé par
Après agitation on reporte 5 gouttes à 0,025
0,l ml de solution de betapropiolactone à
ml de chaque pourcentage dans les cupules
0,l p. 100 dans de l’eau distillée pour 0,9 ml
d’une micro-plaque. On centrifuge 5 à 1 500
d’antigène (agitation de 3 h à température am-
t/mn à + 4” C. On recouvre de cellophane
biante puis 18 h à + 4” C).
adhésive et l’on peut conserver plusieurs jours
Les antigènes préparés de cette manière ne
à -t 4” c.
présentent aucun pouvoir anticomplémentaire
s’ils sont utilisés dans un délai de 1 mois.
D) Titrage des différents constituants
2. Les hématies : on utilise des hématies de
1. Le complément : on utilise dans la réac-
- 4 5 2 -
SCHEMA no 1
0,1
092 0,3 0,4 0,6 0,a 1
2 3
4
Rapport p.100 d’hématies lysées/p.lOO non lysées.
Schéma II” 1. - Recherche de l’unité de complément hémolyse 50 p. 100.
tion 5 unités de complément hémolyse 50
Abscisses : 0,111 - 0,25 - 0,43 - 0,67 - 1,00 -
p. 100. On prépare deux solutions mères dans
1,50 - 2,33 - 4,00 - 9,00.
du VG : l’une au 1/250 (solution A) et l’autre
suivant les valeurs données par WORK et
au 1/300 (solution B). Si le complément est
HAMMON (9). Puis on joint d’une part AB et
très actif, préparer les solutions mères au
d’autre part CD. On trace la droite passant
1/400 et 1/450. On fait les dilutions suivantes
par le milieu de AB et de CD. Elle coupe la
en tubes à hémolyse :
ligne logarithmique 1,OO en un point dont l’or-
Tube
No1
2
3
4
donnée Y sert au calcul suivant :
VG
0,60
0,55
0,50
0,40
5Y
0,4
Solution A
0,20
0,25
0,30
0,40
250 (ou 300) = x
0,05 ml d’une dilution à 1/X contiendront les
Tube
N”5
6
7
8
5 unités 50 p. 100.
VG
0,60
0,55
0,50
0,40
2 . L’antigène : On recherche l’optimum anti-
Solution B
0,20
0,25
0,30
0,40
génique, on prépare, d’une part 6 tubes à hémo-
lyse contenant les dilutions d’un sérum positif
On effectue le titrage en quadruple sur une
connu décomplémenté à 60” C pendant 30 mn
plaque. On reporte 4 gouttes de 0,025 ml de
(dilutions du 1/4 au 1/128) et d’autre part 6
chacun des tubes 1 à 8 et on ajoute 0,025 ml
tubes contenant les dilutions de l’antigène (du
de SS-SH dans chaque cupule. Après agitation,
1/2 au 1/64). On utilise une microplaque
on met 30 mn à l’étuve à 37” C avec agitation
(schéma no 2) dans laquelle on distribue dans
à la 15” minute. On centrifuge alors 5 mn à 6 rangées verticales les dilutions du sérum, à
1 500 t/mn à + 4” C.
raison de 0,025 ml par cupule et dans 7 cupules
Les quatre titrages doivent donner des résul-
par rangée (la dernière qui est le témoin sérum
tats identiques, sinon l’on prend la moyenne.
sert à contrôler un éventuel pouvoir anticomplé-
On établit les courbes d’hémolyse sur papier
mentaire dans chaque dilution).
logarithmique pour 1/250 et 1/300 (schéma
Dans 6 rangées horizontales, on distribue les
no 1). Les points A, B, C, D de la courbe auront
dilutions de l’antigène à raison de 7 cupules par
pour ordonnée le volume de complément dans
dilution et 0,025 ml par cupule (la dernière
les tubes 1. à 4 (pour 1/250 et 5 à 8 (pour
étant le témoin antigène). Dans les 2 rangées
1/300). Les abscisses seront données par les
témoins antigène et sérum, on ajoute 0,025 ml
valeurs suivantes correspondant aux pourcen-
de solution de VG par cupule. On distribue
tages d’hémolyse :
0,05 ml de VG dans 3 cupules qui serviront de
Pourcentage d’hémolyse : 10 - 20 - 30 - 40 -
contrôle complément et 0,l ml dans une cupule
50 - 60 - 70 - 80 - 90.
qui sera le témoin hématies.
- 453 -
SCHEMA no 2
d i l u t i o n s é r u m
contrôle complément
114 118 1/16 1132 1164 m8T Ag
5
2.5 1.25
T
sérum
contrôle hématies
Schéma no 2. - Recherche de l’optimum antigénique:
disposition des différents constituants sur la microplaque.
On agite et on laisse 15 mn à température
- contrôle complément 1,25 unités : 40 -
ambiante, temps pendant lequel on prépare
75 p. 300
les dilutions du complément :
- témoins Antigène : 100 p. 100
a) à 5 unités - 6 ml selon la dilution déter-
- témoins Sérums : 100 p. 100
minée par le titrage.
- témoins Hématie : 0 p. 100
b) à 2,5 unités - 1 ml à 5 unités + 1 ml
Le titre sera donné par la dilution de l’anti-
de VG.
gène ayant fourni le plus haut titre au sérum
c) à 1,25 unités - 0,5 ml à 5 unités +
(courbe à 30 p. 100 d’hémolyse).
1,5 ml de VG.
Le complément est alors distribué dans toutes
E. Exécution de la réaction de fixation du
les cupules (0,05 ml par cupule) sauf dans le
complément (photo’ no 1)
témoin hématies :
Les sérums à examiner sont dilués au 1/4
- à 5 unités dans toutes les cupules réaction.
dans la solution de VG et décomplémentés à
- à 5, à 2,5 et à 1,25 unités dans les trois
60’) C pendant 30 mn. Pendant ce temps les
cupules témoins complément.
micro-dilueurs sont contrôlés sur papier GO.
Après agitation, on place à + 40 C pendant
NO.GO.
18 heures.
On distribue pour chaque sérum 0,025 ml
La plaque est ensuite remise à température
de VG dans 4 cupules d’une rangée verticale
ambiante pendant 15 mn puis on distribue dans
(les trois premières contiendront des dilutions
toutes les cupules 0,025 ml de SS-SH. Après
du sérum allant du 1/8 au 1/32 et la 4’ servira
30 mn à 37” C (agitation à 15 mn) on centri-
de témoin sérum au 1/8 afin de contrôler un
fuge 5 mn à 1500 t/mn à + 4” C. On doit
éventuel pouvoir anticomplémentaire).
observer les pourcentages suivants d’hémolyse
Les dilutions se font pour quatre sérums
dans les témoins :
simultanément, à l’aide des microdilueurs que
- contrôle complément 5 unités : 100 p. 100
l’on reporte après les avoir trempés dans les
- contrôle complément 2,5 unités : 90 -
solutions au 1/4 dans les premières cupules de
100 p. 100
4 rangées verticales. Après rotation, on passe
- 454 -
Photo w 1. - Epreuve de fixation du complément sur microplaque.
- sérum sans anticorps : no 6
1
: nos l-3-4
1
- sérum ayant des anticorps au -
- sérum ayant des anticorps au - : no 2
1 6
8
1
- sérum ayant des anticorps au - : no S-7-8
3 2
aux deuxièmes cupules puis aux troisièmes. On
à l’étuve à 37” C (agitation à la 15” minute),
retrempe alors les dilueurs dans les dilutions
puis elles sont centrifugées 5 mn à 1 500 t/mn
initiales au 1/4 et on les porte dans les cupules
à + 4°C.
témoins. Puis on distribue dans les cupules té-
Le titre des sérums est indiqué par la dilu-
moins, 0,025 ml de VG. 0,05 ml sont distribués
tion la plus élevée donnant de 0 à 30 p. 100
dans trois cupules témoins complément (5 - 2,5 -
d’hémolyse.
1,25 unités) et 0,l ml dans un témoin hématie.
L’antigène titré est dilué et distribué dans
les 3 premières cupules des rangées verticales
II. RESULTATS ET DISCUSSION
(0,025 ml par cupule). Après agitation on
laisse 15 mn à température ambiante.
A. Les différents constituants
Le complément dilué est ensuite distribué
1. L’antigène : la souche neurotrope utilisée
(0,05 ml par cupule) :
pour préparer l’antigène doit être diluée au
- à 5 unités dans toutes les cupules réactions,
1/20 minimum. Plusieurs essais faits avec des
à 5, 2,5 et 1,25 unités dans les témoins
concentrations virales plus importantes se sont
correspondants.
révélés négatifs, les souris inoculées résistant à
l’injection. D’autre part, deux années d’expéri-
Après agitation, on met à + 4” C pendant
mentation sur l’antigène de cerveau non pré-
18 h. Ensuite, on stabilise 15 mn à température
paré comme indiqué dans la technique classi-
ambiante, on distribue dans toutes les cupules
que de CLARKE et CASALS (3), ont montré
0,025 ml de SS - SH.
que cet antigène utilisé dans le mois suivant sa
Après agitation, les plaques sont mises 30 mn
préparation ne présentait pas de pouvoir anti-
- 455 -
complémentaire et conservait un titre oscillant
des différences apparaissent d’une épreuve à
autour du 1/16. Ces titres sont inférieurs à ceux
l’autre. On ne saurait donc trop recommander
obtenus par STELLMANN, MTRCHAMSY,
2 contre-examens en cas de doute.
GIRAUD, HAZRATI et FAVRE (8) sur anti-
Il faut insister également sur l’importance de
gène traité mais restent dans des limites
l’agitation en cours de réaction. Une certaine
acceptables.
habitude est nécessaire et il a été démontré
2. Les sérums : En ce qui concerne les
qu’un manipulateur non confirmé pouvait rater
sérums à examiner, il est nécessaire que leur
successivement plusieurs séries faites avec les
récolte soit faite quelques heures après la prise
mêmes sérums.
de sang. Il a été constaté que le sérum d’un
2. Portée de la réaction et limites : Il est
sang laissé trop longtemps au repos avant l’ex-
très rare de déceler en microméthode des anti-
traction se révélait par la suite anticomplémen-
corps au-delà d’une dilution au 1/64 alors
taire plus particulièrement en ce qui concerne
qu’en macrométhode on peut en déceler jus-
les sérums d’âne ainsi que l’ont montré PILO-
qu’au 1/128 (5).
MORON, VINCENT, AIT-MESBAH et FOR-
THOMME (7).
D’autre part, on considère en matière de
peste équine que le 1/8 en microméthode est
La décomplémentation à 60” C au lieu de
la limite inférieure pour un taux d’anticorps
56” C permet, dans de nombreux cas, de faire
significatif, ce qui explique que seuls soient
disparaître le pouvoir anticomplémentaire com-
utilisés en série le 1/8, le 1/16 et le 1/32.
me le fait remarquer LENNETTE (4).
3. Le système hémolytique : le fait d’em-
ployer l’hémolyse en excès, diminue la possi-
CONCLUSION
bilité de conservation des hématies sensibilisées
qui s’agglutinent, aussi, vaut-il mieux utiliser
La microméthode de fixation du complé-
une suspension fraîche de SS - SH pour cha-
ment peste équine est une épreuve de groupe
que réaction.
pouvant être utilisée facilement par un labora-
toire non spécialisé. Utilisant des antigènes
B. L’épreuve de fixation du complément et inactivés, elle peut servir au contrôle des anti-
sa valeur
corps dans un pays réputé non infecté.
1. Technique : la microtechnique utilisée
Son emploi requiert une manipulation métho-
s’est révélée très pratique. 200 sérums peuvent
dique par un agent entrainé.
être analysés en une seule épreuve quantitative.
C’est une réaction très intéressante lorsqu’on
L’ensemble des manipulations est réalisable en
veut faire le survol de l’immunité récente d’une
deux heures par un seul technicien. La lecture
population équine, mais dans tous les autres
est assez aisée si la centrifugation est faite.
cas il sera nécessaire de faire appel à d’autres
La reproductibilité statistique est également
techniques telle la séroneutralisation sur sourîs
bonne mais il faut noter que d’une manière in-
ou la recherche de l’index de neutralisation sur
dividuelle, ainsi que l’a montré BERNARD (2),
cultures cellulaires.
S U M M A R Y
Adaptation of the microtechnique complement fixation test
for the diagnosis of africau horse sickuess
TO determine the immunity of a large equine population, it was
necessary to have a rapid as well as simple method. The author has done
this adaptation of the microtechnique complement fixation test to africah
herse sickness by precising the different conditions and reagents used in
the test.
This test should be applied only for the pur-pose of statistical research,
and in case of recbnt immunization.
- 456 -
RESUMEN
Adaptacih de la microtécnica de fijacih del complemento
para el diagnbstico de la peste équina.
Para determinar rapidamente la inmunidad de una poblacion de
caballos, necesitaba tener un método sensillo. El autor ha urobado la
microtécnica de fijacion del complemento para la peste equina,‘precisando
las diferentes condiciones de uso. Esta técnica sirve unicamente para la
busqueda estadistica y para casos de inmunizacion reciente.
BIBLIOGRAPHIE
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- 457 -
VETERINAIRE DES PAYS TROPICAUX
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I
ET DE
MÉDECINE VÉ ÉRINAIRE
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DES PAYS TROPICAUX
Adaptation de la microtechnique
de fixation du complément
au diagnostic de la peste équine
par G. BERNARD
Tome XXVIII (nouvelle skie)
No 4 - 1975
,VIGOT FRERES, EDITEURS
23, rue de I’Ecole-de-Médecine, Paris-VI’
Rev. Elev. Med. vét. Pays trop., 1975, 28 (4) : 451-457
Adaptation de la microtechnique de fixation
du complément au diagnostic de la peste équine
par G. BERNARD (*)
RESUME
Adaptation de la microtechnique de fixation du complément
au diagnostic de la peste équine
Afin de déterminer rapidement l’immunité d’une population équine,
il était nécessaire de posséder une méthode simple. L’auteur a fait une
adaptation à la peste équine de la microtechnique de fixation du com-
plément, en précisant les différents paramètres. Cette épreuve doit être
utilisée pour une recherche statistique uniquement et pour des cas d’im-
munisation récente.
INTRODUCTION
1. MATERIEL ET METHODE
La peste équine sévit toujours à l’état endé-
A) Les milieux
mique en Afrique. 11 est même vraisemblable
Les suspensions virulentes utilisées pour les
qu’elle diffuse vers le Nord à partir de foyers
silencieux centre-africains mis en évidence par
inoculations intracérébrales de souris sont réa-
lisées dans un tampon phosphaté pH 7,4 dont
MAURICE et PROVOST (6). D’autre part,
la formule est la suivante (1) :
BOURDIN, BERNARD et LAURENT (1974)
ont montré l’existence d’une forte proportion
- phosphate disodique
d’anticorps parmi les équins du Sénégal. Les
(NazHPOr) anhydre . . . 3,20 g
échanges entre l’Afrique et l’Europe s’accen-
- Phosphate monosodique
tuant, un marché des chevaux africains est en
NaH2P04, 2 H20) cristallisé 0,33 g
train de se développer.
- Chlorure de sodium. . . 6 g
Aussi, il a paru nécessaire de mettre au
- Eau bidistillée Q.S.P. . .
1000 ml
point une méthode rapide et commode de re-
cherche des anticorps dans le serum.
Stériliser à l’autoclave à 1200 C pendant
20 minutes.
Il existe 8 types principaux d’antigène Peste
equine, il fallait donc s’adresser à une épreuve
Les hématies sont récoltées dans du citrate
de groupe telle la fixation du complément (5).
de soude ou dans une solution de Alsever.
La microméthode a été retenue car elle pré-
Les sérums, antigènes et complément sont
sente une commodité d’emploi appréciab]e et
dilués dans une solution de Veronal Gela-
permet de faire un grand nombre d’examens
tine (VG) :
simultanément.
- 10 comprimés « Complement fixa-
tion test diluent tablets » (oxoïd) .
(*) Laboratoire National de I’Elevage et de Recher-
- Gelatine (Di£co) . . . . . 1 g
ches Vétérinaires, B.P. 2057, Dakar-Hann. Répu-
blique du Sénégal.
- Eau bidistillée Q.S.P. . . . 1 000 ml
- 451 -
Dissoudre au bain-marie à chaud.
mouton. Le sang est prélevé dans une quantité
Lorsqu’on prépare une gamme d’hémolyse,
égale de citrate de soude ou de Alsever. On le
on utilise une solution de Veronal 5 fois con-
conserve 4 à 5 jours à + 4” C avant l’utilisa-
centrée (V5) préparée en dissolvant à chaud
tion. Les hématies sont alors lavées trois fois
un comprimé « Oxoïd » dans 20 ml d’eau bi-
après centrifugation, avec la solution VG. Le
distillée.
culot du dernier lavage est remis en suspension
dans un volume égal de VG. Conservation
Tous ces milieux sont conservés à + 4” C.
d’une semaine à + 40 C.
B) Le matériel spécial
3. Le sérum hémolytique : on utilise Ie sé-
rum de lapin anti-hématies de mouton.
A côté du matériel habituel, on utilise des
microdilueurs de 0,025 ml, des pipettes comp-
Dans toutes les épreuves, on utilise une solu-
te-gouttes des 0,025 ml, des microplaques en U,
tion d’hémolysine (SH) diluée au 1/500 (2 mi-
des porte-plaques pour centrifugation et du pa-
crogouttes de SH dans 12 ml de VG) réalisant
pier GO.NO.GO pour contrôle des microdi-
ainsi les conditions d’excès d’hémolysine.
lueurs.
4. Préparation du stock d’hématies sensibi-
Ces instruments font partie du Microtiterkit
lisées (SS-SH) : on prépare une suspension à 3
produit par Cooke Instruments.
p. 100 d’hématies (SS) dans la solution de VG
à laquelle on ajoute, en effectuant un mouve-
C) Préparation des différents constituants :
ment rotatif, un volume identique de SH (au
1/500). Après incubation de 15 mn à tempéra-
1. L’antigène : la fixation du complément
ture ambiante, la suspension de SS-SH peut
peste équine étant une épreuve de groupe, on
être conservée 24 h à + 4” C.
pourra utiliser l’un quelconque des types.
Néanmoins, le type 9-S2 convient particulière-
5. Préparation de la gamme d’hémolyse :
ment.
suivant BARME et Collaborateurs (1) il est
nécessaire de disposer d’une échelle étalon d’hé-
L’antigène est préparé sur cerveaux de souris
molyse avec laquelle des comparaisons pour-
âgées de trois semaines environ.
ront être faites. On prépare :
On inocule, à chaque animal, 0,03 ml par
u) une solution d’hémoglobine (solution A)
voie intracérébrale, d’une dilution au 1/20
contenant 1 ml de SS + 7 ml d’eau bidistillée.
dans du tampon phosphaté pH 7,4 de la souche
Après agitation, on ajoute 2 ml de solution
neurotrope conservée lyophilisée à - 2.50 C.
de V5.
Au bout de 3 à 5 jours, les souris présentant
b) Une suspension d’hématies (suspension
des symptômes nerveux très importants et
B) en ajoutant 9 ml de VG à 1 ml de SS. On
une paralysie presque complète sont anesthé-
répartit dans 11 tubes à hémolyse :
siées, Après découpage de la boîte crânienne,
les cerveaux seront récoltés et congelés. Après
Solution A : 0,O - 0,l - 0,2 - 0,3 - 0,4 - 0,5 -
décongélation, ils sont lavés trois fois dans du
0,6 - 0,7 - 0,8 - 0,9 - 1,00 ml
VG. On prépare une suspension au 1/20 (10
Solution B : 1,OO - 0,9 - 0,8 - 0,7 - 0,6 - 0,5 -
cerveaux + 12 ml de VG) que l’on broie dans
0,4 - 0,3 - 0,2 - 0,l - 0 ml
un mixer. La suspension est centrifugée 1. h à
Pourcentage d’hémolyse : 0 - 30 - 20 - 30 - 40 -
10 000 t/mn à + 4” C. Le surnageant repré-
50 - 60 - 70 - 80 - 90 - 100
sente l’antigène. II peut être utilisé tel quel
(le conserver à + 4” C) ou bien inactivé par
Après agitation on reporte 5 gouttes à 0,025
0,l ml de solution de betapropiolactone à
ml de chaque pourcentage dans les cupules
0,l p. 100 dans de l’eau distillée pour 0,9 ml
d’une micro-plaque. On centrifuge 5 à 1 500
d’antigène (agitation de 3 h à température am-
t/mn à + 4” C. On recouvre de cellophane
biante puis 18 h à + 4” C).
adhésive et l’on peut conserver plusieurs jours
Les antigènes préparés de cette manière ne
à -t 4” c.
présentent aucun pouvoir anticomplémentaire
s’ils sont utilisés dans un délai de 1 mois.
D) Titrage des différents constituants
2. Les hématies : on utilise des hématies de
1. Le complément : on utilise dans la réac-
- 4 5 2 -
SCHEMA no 1
0,1
092 0,3 0,4 0,6 0,a 1
2 3
4
Rapport p.100 d’hématies lysées/p.lOO non lysées.
Schéma II” 1. - Recherche de l’unité de complément hémolyse 50 p. 100.
tion 5 unités de complément hémolyse 50
Abscisses : 0,111 - 0,25 - 0,43 - 0,67 - 1,00 -
p. 100. On prépare deux solutions mères dans
1,50 - 2,33 - 4,00 - 9,00.
du VG : l’une au 1/250 (solution A) et l’autre
suivant les valeurs données par WORK et
au 1/300 (solution B). Si le complément est
HAMMON (9). Puis on joint d’une part AB et
très actif, préparer les solutions mères au
d’autre part CD. On trace la droite passant
1/400 et 1/450. On fait les dilutions suivantes
par le milieu de AB et de CD. Elle coupe la
en tubes à hémolyse :
ligne logarithmique 1,OO en un point dont l’or-
Tube
No1
2
3
4
donnée Y sert au calcul suivant :
VG
0,60
0,55
0,50
0,40
5Y
0,4
Solution A
0,20
0,25
0,30
0,40
250 (ou 300) = x
0,05 ml d’une dilution à 1/X contiendront les
Tube
N”5
6
7
8
5 unités 50 p. 100.
VG
0,60
0,55
0,50
0,40
2 . L’antigène : On recherche l’optimum anti-
Solution B
0,20
0,25
0,30
0,40
génique, on prépare, d’une part 6 tubes à hémo-
lyse contenant les dilutions d’un sérum positif
On effectue le titrage en quadruple sur une
connu décomplémenté à 60” C pendant 30 mn
plaque. On reporte 4 gouttes de 0,025 ml de
(dilutions du 1/4 au 1/128) et d’autre part 6
chacun des tubes 1 à 8 et on ajoute 0,025 ml
tubes contenant les dilutions de l’antigène (du
de SS-SH dans chaque cupule. Après agitation,
1/2 au 1/64). On utilise une microplaque
on met 30 mn à l’étuve à 37” C avec agitation
(schéma no 2) dans laquelle on distribue dans
à la 15” minute. On centrifuge alors 5 mn à 6 rangées verticales les dilutions du sérum, à
1 500 t/mn à + 4” C.
raison de 0,025 ml par cupule et dans 7 cupules
Les quatre titrages doivent donner des résul-
par rangée (la dernière qui est le témoin sérum
tats identiques, sinon l’on prend la moyenne.
sert à contrôler un éventuel pouvoir anticomplé-
On établit les courbes d’hémolyse sur papier
mentaire dans chaque dilution).
logarithmique pour 1/250 et 1/300 (schéma
Dans 6 rangées horizontales, on distribue les
no 1). Les points A, B, C, D de la courbe auront
dilutions de l’antigène à raison de 7 cupules par
pour ordonnée le volume de complément dans
dilution et 0,025 ml par cupule (la dernière
les tubes 1. à 4 (pour 1/250 et 5 à 8 (pour
étant le témoin antigène). Dans les 2 rangées
1/300). Les abscisses seront données par les
témoins antigène et sérum, on ajoute 0,025 ml
valeurs suivantes correspondant aux pourcen-
de solution de VG par cupule. On distribue
tages d’hémolyse :
0,05 ml de VG dans 3 cupules qui serviront de
Pourcentage d’hémolyse : 10 - 20 - 30 - 40 -
contrôle complément et 0,l ml dans une cupule
50 - 60 - 70 - 80 - 90.
qui sera le témoin hématies.
- 453 -
SCHEMA no 2
d i l u t i o n s é r u m
contrôle complément
114 118 1/16 1132 1164 m8T Ag
5
2.5 1.25
T
sérum
contrôle hématies
Schéma no 2. - Recherche de l’optimum antigénique:
disposition des différents constituants sur la microplaque.
On agite et on laisse 15 mn à température
- contrôle complément 1,25 unités : 40 -
ambiante, temps pendant lequel on prépare
75 p. 300
les dilutions du complément :
- témoins Antigène : 100 p. 100
a) à 5 unités - 6 ml selon la dilution déter-
- témoins Sérums : 100 p. 100
minée par le titrage.
- témoins Hématie : 0 p. 100
b) à 2,5 unités - 1 ml à 5 unités + 1 ml
Le titre sera donné par la dilution de l’anti-
de VG.
gène ayant fourni le plus haut titre au sérum
c) à 1,25 unités - 0,5 ml à 5 unités +
(courbe à 30 p. 100 d’hémolyse).
1,5 ml de VG.
Le complément est alors distribué dans toutes
E. Exécution de la réaction de fixation du
les cupules (0,05 ml par cupule) sauf dans le
complément (photo’ no 1)
témoin hématies :
Les sérums à examiner sont dilués au 1/4
- à 5 unités dans toutes les cupules réaction.
dans la solution de VG et décomplémentés à
- à 5, à 2,5 et à 1,25 unités dans les trois
60’) C pendant 30 mn. Pendant ce temps les
cupules témoins complément.
micro-dilueurs sont contrôlés sur papier GO.
Après agitation, on place à + 40 C pendant
NO.GO.
18 heures.
On distribue pour chaque sérum 0,025 ml
La plaque est ensuite remise à température
de VG dans 4 cupules d’une rangée verticale
ambiante pendant 15 mn puis on distribue dans
(les trois premières contiendront des dilutions
toutes les cupules 0,025 ml de SS-SH. Après
du sérum allant du 1/8 au 1/32 et la 4’ servira
30 mn à 37” C (agitation à 15 mn) on centri-
de témoin sérum au 1/8 afin de contrôler un
fuge 5 mn à 1500 t/mn à + 4” C. On doit
éventuel pouvoir anticomplémentaire).
observer les pourcentages suivants d’hémolyse
Les dilutions se font pour quatre sérums
dans les témoins :
simultanément, à l’aide des microdilueurs que
- contrôle complément 5 unités : 100 p. 100
l’on reporte après les avoir trempés dans les
- contrôle complément 2,5 unités : 90 -
solutions au 1/4 dans les premières cupules de
100 p. 100
4 rangées verticales. Après rotation, on passe
- 454 -
Photo w 1. - Epreuve de fixation du complément sur microplaque.
- sérum sans anticorps : no 6
1
: nos l-3-4
1
- sérum ayant des anticorps au -
- sérum ayant des anticorps au - : no 2
1 6
8
1
- sérum ayant des anticorps au - : no S-7-8
3 2
aux deuxièmes cupules puis aux troisièmes. On
à l’étuve à 37” C (agitation à la 15” minute),
retrempe alors les dilueurs dans les dilutions
puis elles sont centrifugées 5 mn à 1 500 t/mn
initiales au 1/4 et on les porte dans les cupules
à + 4°C.
témoins. Puis on distribue dans les cupules té-
Le titre des sérums est indiqué par la dilu-
moins, 0,025 ml de VG. 0,05 ml sont distribués
tion la plus élevée donnant de 0 à 30 p. 100
dans trois cupules témoins complément (5 - 2,5 -
d’hémolyse.
1,25 unités) et 0,l ml dans un témoin hématie.
L’antigène titré est dilué et distribué dans
les 3 premières cupules des rangées verticales
II. RESULTATS ET DISCUSSION
(0,025 ml par cupule). Après agitation on
laisse 15 mn à température ambiante.
A. Les différents constituants
Le complément dilué est ensuite distribué
1. L’antigène : la souche neurotrope utilisée
(0,05 ml par cupule) :
pour préparer l’antigène doit être diluée au
- à 5 unités dans toutes les cupules réactions,
1/20 minimum. Plusieurs essais faits avec des
à 5, 2,5 et 1,25 unités dans les témoins
concentrations virales plus importantes se sont
correspondants.
révélés négatifs, les souris inoculées résistant à
l’injection. D’autre part, deux années d’expéri-
Après agitation, on met à + 4” C pendant
mentation sur l’antigène de cerveau non pré-
18 h. Ensuite, on stabilise 15 mn à température
paré comme indiqué dans la technique classi-
ambiante, on distribue dans toutes les cupules
que de CLARKE et CASALS (3), ont montré
0,025 ml de SS - SH.
que cet antigène utilisé dans le mois suivant sa
Après agitation, les plaques sont mises 30 mn
préparation ne présentait pas de pouvoir anti-
- 455 -
complémentaire et conservait un titre oscillant
des différences apparaissent d’une épreuve à
autour du 1/16. Ces titres sont inférieurs à ceux
l’autre. On ne saurait donc trop recommander
obtenus par STELLMANN, MTRCHAMSY,
2 contre-examens en cas de doute.
GIRAUD, HAZRATI et FAVRE (8) sur anti-
Il faut insister également sur l’importance de
gène traité mais restent dans des limites
l’agitation en cours de réaction. Une certaine
acceptables.
habitude est nécessaire et il a été démontré
2. Les sérums : En ce qui concerne les
qu’un manipulateur non confirmé pouvait rater
sérums à examiner, il est nécessaire que leur
successivement plusieurs séries faites avec les
récolte soit faite quelques heures après la prise
mêmes sérums.
de sang. Il a été constaté que le sérum d’un
2. Portée de la réaction et limites : Il est
sang laissé trop longtemps au repos avant l’ex-
très rare de déceler en microméthode des anti-
traction se révélait par la suite anticomplémen-
corps au-delà d’une dilution au 1/64 alors
taire plus particulièrement en ce qui concerne
qu’en macrométhode on peut en déceler jus-
les sérums d’âne ainsi que l’ont montré PILO-
qu’au 1/128 (5).
MORON, VINCENT, AIT-MESBAH et FOR-
THOMME (7).
D’autre part, on considère en matière de
peste équine que le 1/8 en microméthode est
La décomplémentation à 60” C au lieu de
la limite inférieure pour un taux d’anticorps
56” C permet, dans de nombreux cas, de faire
significatif, ce qui explique que seuls soient
disparaître le pouvoir anticomplémentaire com-
utilisés en série le 1/8, le 1/16 et le 1/32.
me le fait remarquer LENNETTE (4).
3. Le système hémolytique : le fait d’em-
ployer l’hémolyse en excès, diminue la possi-
CONCLUSION
bilité de conservation des hématies sensibilisées
qui s’agglutinent, aussi, vaut-il mieux utiliser
La microméthode de fixation du complé-
une suspension fraîche de SS - SH pour cha-
ment peste équine est une épreuve de groupe
que réaction.
pouvant être utilisée facilement par un labora-
toire non spécialisé. Utilisant des antigènes
B. L’épreuve de fixation du complément et inactivés, elle peut servir au contrôle des anti-
sa valeur
corps dans un pays réputé non infecté.
1. Technique : la microtechnique utilisée
Son emploi requiert une manipulation métho-
s’est révélée très pratique. 200 sérums peuvent
dique par un agent entrainé.
être analysés en une seule épreuve quantitative.
C’est une réaction très intéressante lorsqu’on
L’ensemble des manipulations est réalisable en
veut faire le survol de l’immunité récente d’une
deux heures par un seul technicien. La lecture
population équine, mais dans tous les autres
est assez aisée si la centrifugation est faite.
cas il sera nécessaire de faire appel à d’autres
La reproductibilité statistique est également
techniques telle la séroneutralisation sur sourîs
bonne mais il faut noter que d’une manière in-
ou la recherche de l’index de neutralisation sur
dividuelle, ainsi que l’a montré BERNARD (2),
cultures cellulaires.
S U M M A R Y
Adaptation of the microtechnique complement fixation test
for the diagnosis of africau horse sickuess
TO determine the immunity of a large equine population, it was
necessary to have a rapid as well as simple method. The author has done
this adaptation of the microtechnique complement fixation test to africah
herse sickness by precising the different conditions and reagents used in
the test.
This test should be applied only for the pur-pose of statistical research,
and in case of recbnt immunization.
- 456 -
RESUMEN
Adaptacih de la microtécnica de fijacih del complemento
para el diagnbstico de la peste équina.
Para determinar rapidamente la inmunidad de una poblacion de
caballos, necesitaba tener un método sensillo. El autor ha urobado la
microtécnica de fijacion del complemento para la peste equina,‘precisando
las diferentes condiciones de uso. Esta técnica sirve unicamente para la
busqueda estadistica y para casos de inmunizacion reciente.
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