INSTITUT D’ÉLEVAGE ET DE MÉDECINE VÉTÉRINAIRE DES...
INSTITUT D’ÉLEVAGE ET DE MÉDECINE
VÉTÉRINAIRE DES PAYS TROPICAUX
REVUE D’ÉLEVAGE
ET DE
MÉDECINE VÉ ÉRINAIRE
DES PAYS TROPICAUX
Application de la méthode de séro-
neutralisation cinétique à la recherche
des anticorps neutralisant le virus
de la peste bovine chez les bovins,
les caprins et les ovins
par P. BOURDIN et G. BERNARD
Tome XX (nouvelle série)
N ” 4 - 1067
VIGOT FRÈ RES, É DITEURS- =
23, rue de l'École-de-Médecine, PARIS-VI”
Rev. Elev. Méd. Véf. Pays trop., 1967, 20, 4 (531-536)
Application de la méthode
de séro-neutralisation cinktique
à la recherche des anticorps neutralisant le virus
de la peste bovine chez les bovins
les caprins et les ovins *
par P. BOURDIN ef G. BERNARD
RÉSUMÉ
La méthode cinétique de séro-neutralisation mise au point par LEPINE,
ROGER et ROGER (1959) peut être adaptée avec quelques modifications à la
recherche des anticorps bovipestiques chez les bovins, les ovins et les caprins.
Elle a révélé, au Sénégal, que 48 p. 100 des caprins et 62,7 p. 100 des ovins
vivant en zone d’endémie étaient porteurs d’anticorps neutralisants, ce chiffre
descendant à 28 p. 100 pour les caprins vivant en zcne indemne. La responsa-
bilité de la présence de ces anticorps en zone indemne peut être attribuée
au virus PPR.
La technique de séro-neutralisation sur cul-
recherche des anticorps neutralisant le virus
tures cellulaires décrites par PLOWRIGHT et
bovipestique chez les bovins, les caprins et les
FERRIS (1961) a l’avantage d’être une méthode
ovins.
sûre et efficace. Elle a permis de contrôler au
Nigeria les résultats de la vaccination des bovins
lors de la campagne conjointe (rapport du
1. -MATÉRIEL ET MÉTHODE
Département Fédéral de Recherches Vétérinaires
VOM, 1964) et de rechercher la présence d’anti-
A) Les réactifs.
corps neutralisant le virus de la peste bovine chez
a) Milieux.
les caprins et les ovins ; ZWART et ROWE
(1966). Cependant, elle a l’inconvénient d’être
Le milieu de Earle décrit par JOHNSON
d’un débit relativement faible. Pour remédier à
(1962),
contenant une forte concentration de
ce défaut, il a été envisagé d’adapter la méthode
glucose et une faible concentration d’hydrolysat
cinétique de séro-neutralisation mise au point
de lactalbumine,
a été utilisé, Cependant, pour
par LEPINE, ROGER et ROGER (1959) à la
éviter les changements de milieux trop fréquents,
la quantité de bicarbonate de sodium qui est
* Communication présentée au 18e congrès mondial
de 0,759 p. 1.000 dans le milieu de JOHNSON,
vétérinaire. Paris, 17-22 juillet 1967.
a été portée à 1,5 g p. 1.000.
531
REVUE D’ÉLEVAGE
1
Ce milieu contient, en outre, des acides ami-
Trypsinel/250.. . . . . . . . , .
2,5
g
nés et des vitamines dans les proportions sui-
Pénicilline . . . . , . . . ,
100.000 UI
vantes :
Streptomycine , . . . . . . . . . . . . .
0,l
g
L Glutamine
. . , . . . . .
0,l
g p, 1.000
Filtrer sur Seitz EKS et conserver à ~OC.
L acide glutamique . . 0,l
g
-
Solution de versène :
L méthionine . . . . . .
0,15 g
-
Chlorure de sodium . . . , . . . . . . . .
8
g
L c h l o r h y d r a t e d’arginine., 0,04 g -
Chlorure de potassium.. . . . . . . . .
0,2
g
Biotine . . . . , . , . , .
0,001 g
-
Phosphate disodique.. . . . . . . . . . .
1,15 g
Acide folique , . , . , . . . , . .
0,001 g
-
Phosphate monopotassique . . . . . . 0,2 g
b) Tampon.
E. D.T. A. sodique . , . . . . . . . . . . .
0,2
g
Le tampon tris utilisé dans la technique de
Eau bidistilI&e . . . . . . . . . . . . . . . . .
1.000 ml
LEPINE, ROGER et ROGER (1959) retarde
Rouge de phénol . . . . . . . . . . . . . . .
0,015g
l’apparition de l’effet cytopathogène ; le tampon
Autoclaver 20 minutes à 120 OC, conserver à
bicarbonate n’a pas cet inconvénient. La quan-
+ 4 oc.
tité de 1,5 g p. 1.000 de bicarbonate de soude
Au moment de l’emploi, quatre parties de
présente dans le milieu est complétée par 1,5 ml
versène sont mélangées à une partie de trypsine.
p. 100 d’une solution de bicarbonate de soude à
Pour détacher les cellules, on procède à trois
55 p. 1 .OOO et 0,5 ml p, 100 de soude N/lO. Les cel-
lavages successifs avec environ 10 ml du mélange
lules supportent bien le pH élevé qui en résulte.
pour une boîte de Roux, le dernier lavage étant
c) Sérum.
laissé 5 à 10 minutes à l’étuve à 370C. Quand
Contrairement à la technique décrite par
les cellules sont complètement détachées, on
LEPINE, ROGER et ROGER, le milieu ne contient
procède à la récolte et à la numération puis à
pas de sérum en dehors du sérum examiné dont
la répartition à la concentration voulue.
la concentration finale ne doit pas dépasser
5 p. 100 pour éviter un retard dans l’apparition
e) Virus.
de l’effet cytopathogène.
Le virus utilisé est la souche RP KO/BK
d) Souche cellulaire.
(99 passages) de PLOWRIGHT et FERRIS (1962)
provenant de la souche africaine Kabete 0
La souche MDBKC, isolée par MADIN et
atténuée par passages sur cellules rénales
DARBY (1958), convient parfaitement pour la
d’embryon de veau. Ce virus inoculé sur cellules
séro-neutralisation cinétique. Elle tire son origine
MDBKC détruit le tapis cellulaire en 5 à 6 jours.
d’un rein de bovin adulte et en est actuellement
Quand le tapis est atteint à 80 p. 100, la sus-
à son 315e passage. Elle est cultivée dans .le
pension virulente est récoltée, distribuée en
milieu décrit précédemment (paragraphe a)
flacons de 5 ml et conservée à - 30 OC.
contenant 1,5 g de bicarbonate p, 1 .OOO et
10 p. 100 de sérum de veau. Après 8 jours de
f) Sérum à titrer.
culture, les cellules sont détachées à l’aide d’un
mélange de versène mis en solution dans du
Les sérums sont recueillis stérilement, centri-
PBS sans calcium ni magnésium et de trypsine
fugés, inactivés 30 minutes à 56 OC et conservés
dissoute en tampon tris, dont voici les formules :
à - 20 OC en attendant leur emploi.
Trypsine en tris :
B) Titrage du virus.
Chlorure de sodium . . . . . . . , , , ,
8
g
Chlorure de potassium . . . . . . . . . .
0,38 g
Pour tenir compte des indications de LEPINE,
Phosphate disodique . . . . . , . . . . . ,
0,l
g
ROGER et ROGER (1959), il convient de recher-
Dextrose . . . . . . . . . , . . , . . . . . , .
1
g
cher la plus petite quantité de virus capable de
Tris , . . , , . . . . , . . . . , , , , . , . , , .
3
g
produire une destruction homogène dans le
Rouge de phénol . . . . . . . . . . . . . . . .
0,015 g
même temps et dans tous les tubes considérés.
Eau distillée . . . . . . . . . . . . . . . , . . . .
1.000 ml
Cette destruction cesse d’être homogène avec
Ajuster à pH 7,4 avec CIH N/I
les cellules MDBKC à partir du 6e jour. Le
5 3 2
problème revient à chercher la plus petite
corps (provenant de la même espèce que le
w
DL 100.
sérum soumis à l’examen) 0,5 ml de suspension
Le virus est dilué de 0,5 en 0,5 logarithme
cellulaire et 0,5 ml d’huile de vaseline.
I
dans le milieu contenant du bicarbonate de
Dès le ,troisième ou quatrième jour, les cellu-
sodium et de la soude N/I0 aux concentrations
les se sont multipliées au fond du tube où elles
indiquées. Chaque dilution est répartie dans
forment un tapis complet aussi bien dans les
10 tubes à hémolyse à raison de 0,5 ml par tube,
tubes témoins que dans les tubes de la réaction.
puis pour se placer dans les conditions mêmes
Les tubes sont examinés au microscope inversé
de la réaction comme l’ont fait ZWART et
les 5e et 6e jours, A cette date, l’effet cytopatho-
.
ROWE (1966) il convient d’ajouter dans tous
gène doit être complet dans tous les témoins
les tubes 0,05 ml de sérum de bovin ou de
virus. Dans les tubes utilisés pour la réaction,
caprin, inactivé et dépourvu d’anticorps pesti-
différentes lésions peuvent être distinguées au
ques. Cette répartition se fait avec une pipette
moment de la lecture :
.
compte-gouttes. Après agitation énergique, les
10 Le tapis cellulaire n’est pas modifié : le
tubes sont placés à 37 OC pendant une heure.
virus a été neutralisé par le sérum qui contient
Puis une suspension de cellules MDBKC à
des anticorps à la dilution de IjlO.
100.000 unités par ml, réalisée dans un milieu
20 Le tapis cellulaire est complètement détruit
identique dépourvu de sérum est introduite dans
ou présente plusieurs plages bordées de cellules
tous les tubes à raison de 0,5 ml par tube. Après
arrondies, le témoin sérum ne présentant pas
agitation, il est distribué dans tous les tubes
de lésions : le sérum ne contient pas d’anticorps
0,5 ml d’huile de vaseline stérilisée à 105 OC.
pouvant neutraliser le virus à la dilution au
Finalement, l’ensemble est mis à l’étuve à 37 OC.
1 /lO.
L’expérience a montré que le titrage devait
s’effectuer en présence d’un sérum provenant
30 La réaction est douteuse, lorsque dans les
de la même espèce animale que celui examiné
tubes, on observe la présence d’amas de cellules
lors de la réaction, car la DL 100 varie suivant
arrondies sans plage, O?I bien lorsque 2 tubes
sur 4 présentent des lésions nettes.
c
l’origine du sérum.
II. - LES RÉSULTATS
T
C) La réaction de séro-neutralisation.
L’examen de chaque sérum nécessite 5 tubes,
La tec.hnique cinétique a été appliquée
4 pour la réaction et un témoin sérum dans
conjointement avec la méthode de PLOWRIGHT
lequel le virus est remplacé par une quantité
et FERRIS (1961) pour un certain nombre d’exa-
identique de milieu tamponné.
mens.
Le virus est dilué, à la concentration indiquée
A) Recherche d’anticorps neutralisants chez les
par le titrage, dans le milieu tamponné. Cette
bovins.
solution est répartie à la quantité de 0,5 ml dans
tous les tubes sauf les témoins. Puis 0,05 ml de
Les sérums au nombre de 51 provenaient
sérum à examiner sont ajoutés dans chacun des
d’animaux achetés au Maroc et au Sénégal
5 tubes, le sérum se trouvant ainsi dilué au l/lO.
oriental, reconnus indemnes de peste bovine.
Après agitation, les tubes sont placés à l’étuve
L’examen des sérums dilués au I/l0 donne le
à 37oC pendant une heure.
même résultat : tous les sérums sont dépourvus
t
Passé ce délai, chaque tube reçoit 0,5 ml de
d’anticorps, avec les deux méthodes.
suspension cellulaire à 100.000 unités par ml
B) Recherche d’anticorps neutralisants chez les
distribuées en milieu tamponné. On recouvre
caprins et les ovins âgés de 6 mois à 4 ans,
la surface libre d’huile de vaseline, à raison de
f
d’origine sénégalaise.
0,5 ml par tube. L’ensemble est ensuite placé à
l’étuve à 37 OC jusqu’au moment de la lecture.
10 Caprins vivanfs en zone d’endémie.
Il est nécessaire de réaliser un témoin virus
305 sérums examinés par les deux méthodes
sur 5 tubes, recevant chacun 0,5 ml de suspension
après dilution au I/l0 ont permis d’enregistrer
virulente, 0,05 ml de sérum dépourvu d’anti-
les résultats suivants :
333
c
a) Méthode classique.
Les résultats différents, dont le pourcentage
Animaux dépourvus d’anticorps . . 35,4 p. 100
est de 17,6 p, 100, se répartissent de la manière
-
Animaux pourvus d’anticorps . . . 41,7 p. 100
suivante :
Animaux douteux . . . , . . , . . . . . . , .
22,9 p. 100
Méthode cinétique
Méthode classique
-
-
.
9,4 p. 100 . . . .
neutralisant55
douteux
b) Méthode cinétique.
4,8 p. 1 0 0 . . .
neutral isants
pas d’anticorps
Animaux dépourvus d’anticorps .
31,2 p. 100
1,4p.100....
douteux
pas d’anticorps
Animaux pourvus d’anticorps .
48,8 p. 100
2 p.lOO....
douteux
neutralisants
Animaux douteux . . . .
20,O p. 100
30 Caprins vivant en zone indemne :
c) Comparaison des deux méthodes.
?
L’examen de 231 sérums, dilués au l/lO,
L’analyse des résultats obtenus montre qu’ils
provenant de caprins âgés de 1 à 5 ans, testés
sont identiques dans 85,3 p. 100 des cas, répartis
par les deux méthodes, a permis de noter les
comme suit :
résultats suivants :
Animaux dépourvus d’anticorps .
31,2 p. 100
a) Méthode classique.
Animaux pourvus d’anticorps .
39,7 p. 100
Animaux douteux . . . . .
14,4 p. 100
Animaux dépourvus d’anticorps . . 60,6 p. 100
Animaux pourvus d’anticorps . . . 19 p. 100
Les résultats différents, dont le pourcentage
Animaux douteux . . . . . . . .
20,4 p. 100
est de 14,7 se répartissent de la manière ci-après.
b) Méthode cinétique.
Méthode cinétique
Méthode classique
-
-
Animaux dépourvus d’anticorps .
54,l p. 100
7,9 p. 100.. . .
neutralisant5
douteux
Animaux pourvus d’anticorps
28,6 p. 100
1,3 p.lOO....
neutralisants
pas d’anticorps
Animaux douteux . . . . . . . . . . . 17,3 p. 100
2,9 p. 100.. . .
douteux
pas d’anticorps
2,6 p. 100.. . .
douteux
neutralisants
c) Comparaison des deux méfhodes.
L’analyse des résultats montre qu’ils sont
.
20 Ovins vivanf en zone d’endémie.
identiques dans 81,4 p. 100 des examens, répartis
comme suit :
L’examen de 244 sérums après dilutions au
.
l/lO, provenant d’ovins âgés de 1 à 5 ans, testés
Animaux dépourvus d’anticorps ,
54,2 p. 100
par les deux méthodes, a permis d’enregistrer
Animaux pourvus d’anticorps
15,2 p. 100
les résultats suivants :
Animaux douteux . . . . . . . .
1 2
p. 100
a) Méthode classique.
Les résultats différents, dont le pourcentage
atteint 18,6 p, 100, se répartissent de la manière
Animaux dépourvus d’anticorps , . 31,2 p. 100
suivante :
Animaux pourvus d’anticorps . . . 50,5 p. 100
Méthode cinétique
Méthode classique
Animaux douteux . . . , .
18,3 p. 100
-
-
7,8 p. 100.. . ~
neutralisants
douteux
b) Méthode cinétique.
6 p.lOO....
neutralisants
pas d’anticorps
Animaux dépourvus d’anticorps . 25 p. 100
0,9 p. 100.. . .
douteux
pas d’anticorps
Animaux pourvus d’anticorps . .
62,7 p. 100
3,9 p. 100.. . .
douteux
neutralisants
Animaux douteux . . . , .
12,3 p. 100
Ill. - DISCUSSION
L
c) Comparaison des deux méthodes.
Elle portera sur deux points, la valeur de la
L’analyse des résultats obtenus montre qu’ils
méthode cinétique et la présence d’anticorps
sont identiques dans 83,4 p, 100 des examens,
chez les petits ruminants.
répartis comme suit :
Animaux dépourvus d’anticorps 25 p. 100
A) La méthode cinétique.
Animaux pourvus d’antjcorps . . . 48,5 p. 100
L’analyse des résultats obtenus par les 2 métho-
Animdux douteux , . . . :, . . . . , .
9,9 p. 100
des montre que ceux-ci diffèrent dans des pro-
534
portions variant entre 14 et 18 p. 100. L’examen
b) En zone indemne.
du tableau comparatif révèle que :
15,2 p. 100 des caprins d’après la technique
a) 7,9 à 9,4 p. 100 des sérums positifs avec la
classique et 28,6 p. 100 d’après la méthode
méthode cinétique sont douteux avec la technique
cinétique hébergent des anticorps dans leur
classique.
sérum.
0,9 à 2,9 p. 100 des sérums douteux avec la
ZWART et ROWE (1966) signalent au Nigeria,
méthode cinétique sont négatifs avec la technique
la préseilce d’anticorps à un taux moyen de
classique. Ce fait traduit un défaut de sensibilité
15,2 p, 100 chez les caprins et de 18,8 p. 100 chez
de la méthode cinétique dans environ 11 p. 100
les ovins vivants en zone d’endémie. Les pourcen-
des examens.
tages sont beaucoup plus élevés au Sénégal.
Ces mêmes auteurs rapportent que dans une
b) 1,3 à 6 p. 100 des sérums positifs avec la
région indemne, il n’y a pour ainsi dire pas
méthode cinétique sont négatifs avec la méthode
d’anticorps chez les ovins.
classique, ce qui traduit un manque de sensibilité
Au Sénégal, les résultats sont différents. En
totale.
effet, en :Zone indemne le taux de caprins héber-
c) 2 à 3,9 p, 100 des sérums douteux avec la
geant des anticorps varie entre 15,2 et 18,6 p, 100
méthode cinétique sont positifs avec la technique
selon la technique utilisée. Quelle est l’origine
classique, ce qui traduit un certain pourcentage
de ces anticorps ? Si, en zone d’endémie, on peut
de résultats abhérents.
suspecter la transmission du virus bovipestique
par contezct aux petits ruminants, comme l’ont
En conclusion, la méthode cinétique employée
montré ZWART et MACADAM (1967), cette
conjointement avec la technique classique donne
transmission ne peut être retenue en zone
des résultats similaires dans 85,3 à 81,4 p. 100
indemne. Dans ce cas, on peut suspecter I’exis-
des examens. Les résultats différents sont en
tente d’un virus de faible virulence,
adapté
majorité dus au manque de sensibilité de cette
aux petits ruminants, qui se transmettrait d’un
méthode. Néanmoins, elle a l’avantage d’être
animal ii l’autre. On peut penser qu’il s’agit
d’un plus grand débit, mais son emploi en rai-
du virus PPR décrit par MORNET et collab.
son de son léger manque de sensibilité doit
(1956). Il serait un mutant du virus pestique
être réservé aux enquêtes épidémiologiques,
transmis:;ible
de caprins à caprins mais incapa-
les examens individuels devant se faire par la
ble de passer des caprins aux bovins comme
technique classique.
l’ont montré GILBERT et MONNIER (1962).
Des travaux en cours au laboratoire de Dakar
B) La présence d’anticorps neutralisants chez les
tendent à montrer que les virus bovipestique et
petits ruminants.
PPR, s’ils sont identiques du point de vue immu-
nologique, diffèrent néanmoins par certaines de
a) En zone d’endémie.
leurs propriétés biologiques et ainsi serait
confirmé le qualificatif de mutant appliqué au
41,7 p. 100 des caprins d’après la technique
virus PPR.
classique et 48,8 p. 100 d’après la méthode ciné-
tique hébergent des anticorps dans leur sérum,
Institut d’Elevage et de Médecine Vétérinaire
50,5 p, 100 des ovins d’après la technique
des Pays tro+aux Maisons-Alfirort
classique et 62,7 p. 100 d’après la méthode
Laboratoire National de /‘Elevage
cinétique ont des anticorps dans leur sérum.
et de Recherches Véférinoires Dakar-Hann
SUMMARY
Application of the Kinetic Seroneutralization test to the research
of Rinderpest neutralizing antibodies in cattle sheep and goat
The kinetic Sero-neutralization method, developped by LEPINE, ROGER et
ROGER (1959), has been adapted with some slight alteration to the research
of Rinderpest antibodies in cattle sheep and goat. In Senegal, these neutralizing
antibodies have been evidenced in 48 p. 100 of the goats and 62,7 p. 100 of the
sheeps living in enzootic area ; in the areas free of Rinderpest the percentage
of the goats showing these neutralizing antibodies was only 28 p. 100. The
cause of the presence of these antibodies in free disease area has been assumed
to be the SPR (Smal I Ruminant Rinderpest) virus.
RESUME N
Aplicacih del método cinético de set-o-neutralizacih
para la bhqueda
de 10s anticuerpos neutralizando el virus de la peste bovina en 10s bovinos,
10s caprinos y 10s ovinos
Se puede adaptar el método cinético de sero-neutralizacion
mejorada por
LEPINE, ROGER y ROGER (1969) con algunas modificaciones para la bkqueda
de 10s anticuerpos bovipesticos en 10s bovinos, 10s ovlnos y 10s caprinos. En
Senegal, mediante el dicho método se demostro la presencia de anticuerpos
neutralizantes en 48 p. 100 de 10s caprinos y 62,7 p. 100 de 10s ovinos viviendo
en zona de endemia, mientras el porcentaje solo Ilegaba a 28 p. 100 en 10
concerniente 10s caprinos viviendo en una zona indemne de peste bovina. El
virus PPR (Peste de 10s pequecos rumiantes) seria causa de la presencia de estos
anticuerpos en la zona indemne.
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-_
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ET DE
MÉDECINE VÉ ÉRINAIRE
DES PAYS TROPICAUX
Application de la méthode de séro-
neutralisation cinétique à la recherche
des anticorps neutralisant le virus
de la peste bovine chez les bovins,
les caprins et les ovins
par P. BOURDIN et G. BERNARD
Tome XX (nouvelle série)
N ” 4 - 1067
VIGOT FRÈ RES, É DITEURS- =
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Application de la méthode
de séro-neutralisation cinktique
à la recherche des anticorps neutralisant le virus
de la peste bovine chez les bovins
les caprins et les ovins *
par P. BOURDIN ef G. BERNARD
RÉSUMÉ
La méthode cinétique de séro-neutralisation mise au point par LEPINE,
ROGER et ROGER (1959) peut être adaptée avec quelques modifications à la
recherche des anticorps bovipestiques chez les bovins, les ovins et les caprins.
Elle a révélé, au Sénégal, que 48 p. 100 des caprins et 62,7 p. 100 des ovins
vivant en zone d’endémie étaient porteurs d’anticorps neutralisants, ce chiffre
descendant à 28 p. 100 pour les caprins vivant en zcne indemne. La responsa-
bilité de la présence de ces anticorps en zone indemne peut être attribuée
au virus PPR.
La technique de séro-neutralisation sur cul-
recherche des anticorps neutralisant le virus
tures cellulaires décrites par PLOWRIGHT et
bovipestique chez les bovins, les caprins et les
FERRIS (1961) a l’avantage d’être une méthode
ovins.
sûre et efficace. Elle a permis de contrôler au
Nigeria les résultats de la vaccination des bovins
lors de la campagne conjointe (rapport du
1. -MATÉRIEL ET MÉTHODE
Département Fédéral de Recherches Vétérinaires
VOM, 1964) et de rechercher la présence d’anti-
A) Les réactifs.
corps neutralisant le virus de la peste bovine chez
a) Milieux.
les caprins et les ovins ; ZWART et ROWE
(1966). Cependant, elle a l’inconvénient d’être
Le milieu de Earle décrit par JOHNSON
d’un débit relativement faible. Pour remédier à
(1962),
contenant une forte concentration de
ce défaut, il a été envisagé d’adapter la méthode
glucose et une faible concentration d’hydrolysat
cinétique de séro-neutralisation mise au point
de lactalbumine,
a été utilisé, Cependant, pour
par LEPINE, ROGER et ROGER (1959) à la
éviter les changements de milieux trop fréquents,
la quantité de bicarbonate de sodium qui est
* Communication présentée au 18e congrès mondial
de 0,759 p. 1.000 dans le milieu de JOHNSON,
vétérinaire. Paris, 17-22 juillet 1967.
a été portée à 1,5 g p. 1.000.
531
REVUE D’ÉLEVAGE
1
Ce milieu contient, en outre, des acides ami-
Trypsinel/250.. . . . . . . . , .
2,5
g
nés et des vitamines dans les proportions sui-
Pénicilline . . . . , . . . ,
100.000 UI
vantes :
Streptomycine , . . . . . . . . . . . . .
0,l
g
L Glutamine
. . , . . . . .
0,l
g p, 1.000
Filtrer sur Seitz EKS et conserver à ~OC.
L acide glutamique . . 0,l
g
-
Solution de versène :
L méthionine . . . . . .
0,15 g
-
Chlorure de sodium . . . , . . . . . . . .
8
g
L c h l o r h y d r a t e d’arginine., 0,04 g -
Chlorure de potassium.. . . . . . . . .
0,2
g
Biotine . . . . , . , . , .
0,001 g
-
Phosphate disodique.. . . . . . . . . . .
1,15 g
Acide folique , . , . , . . . , . .
0,001 g
-
Phosphate monopotassique . . . . . . 0,2 g
b) Tampon.
E. D.T. A. sodique . , . . . . . . . . . . .
0,2
g
Le tampon tris utilisé dans la technique de
Eau bidistilI&e . . . . . . . . . . . . . . . . .
1.000 ml
LEPINE, ROGER et ROGER (1959) retarde
Rouge de phénol . . . . . . . . . . . . . . .
0,015g
l’apparition de l’effet cytopathogène ; le tampon
Autoclaver 20 minutes à 120 OC, conserver à
bicarbonate n’a pas cet inconvénient. La quan-
+ 4 oc.
tité de 1,5 g p. 1.000 de bicarbonate de soude
Au moment de l’emploi, quatre parties de
présente dans le milieu est complétée par 1,5 ml
versène sont mélangées à une partie de trypsine.
p. 100 d’une solution de bicarbonate de soude à
Pour détacher les cellules, on procède à trois
55 p. 1 .OOO et 0,5 ml p, 100 de soude N/lO. Les cel-
lavages successifs avec environ 10 ml du mélange
lules supportent bien le pH élevé qui en résulte.
pour une boîte de Roux, le dernier lavage étant
c) Sérum.
laissé 5 à 10 minutes à l’étuve à 370C. Quand
Contrairement à la technique décrite par
les cellules sont complètement détachées, on
LEPINE, ROGER et ROGER, le milieu ne contient
procède à la récolte et à la numération puis à
pas de sérum en dehors du sérum examiné dont
la répartition à la concentration voulue.
la concentration finale ne doit pas dépasser
5 p. 100 pour éviter un retard dans l’apparition
e) Virus.
de l’effet cytopathogène.
Le virus utilisé est la souche RP KO/BK
d) Souche cellulaire.
(99 passages) de PLOWRIGHT et FERRIS (1962)
provenant de la souche africaine Kabete 0
La souche MDBKC, isolée par MADIN et
atténuée par passages sur cellules rénales
DARBY (1958), convient parfaitement pour la
d’embryon de veau. Ce virus inoculé sur cellules
séro-neutralisation cinétique. Elle tire son origine
MDBKC détruit le tapis cellulaire en 5 à 6 jours.
d’un rein de bovin adulte et en est actuellement
Quand le tapis est atteint à 80 p. 100, la sus-
à son 315e passage. Elle est cultivée dans .le
pension virulente est récoltée, distribuée en
milieu décrit précédemment (paragraphe a)
flacons de 5 ml et conservée à - 30 OC.
contenant 1,5 g de bicarbonate p, 1 .OOO et
10 p. 100 de sérum de veau. Après 8 jours de
f) Sérum à titrer.
culture, les cellules sont détachées à l’aide d’un
mélange de versène mis en solution dans du
Les sérums sont recueillis stérilement, centri-
PBS sans calcium ni magnésium et de trypsine
fugés, inactivés 30 minutes à 56 OC et conservés
dissoute en tampon tris, dont voici les formules :
à - 20 OC en attendant leur emploi.
Trypsine en tris :
B) Titrage du virus.
Chlorure de sodium . . . . . . . , , , ,
8
g
Chlorure de potassium . . . . . . . . . .
0,38 g
Pour tenir compte des indications de LEPINE,
Phosphate disodique . . . . . , . . . . . ,
0,l
g
ROGER et ROGER (1959), il convient de recher-
Dextrose . . . . . . . . . , . . , . . . . . , .
1
g
cher la plus petite quantité de virus capable de
Tris , . . , , . . . . , . . . . , , , , . , . , , .
3
g
produire une destruction homogène dans le
Rouge de phénol . . . . . . . . . . . . . . . .
0,015 g
même temps et dans tous les tubes considérés.
Eau distillée . . . . . . . . . . . . . . . , . . . .
1.000 ml
Cette destruction cesse d’être homogène avec
Ajuster à pH 7,4 avec CIH N/I
les cellules MDBKC à partir du 6e jour. Le
5 3 2
problème revient à chercher la plus petite
corps (provenant de la même espèce que le
w
DL 100.
sérum soumis à l’examen) 0,5 ml de suspension
Le virus est dilué de 0,5 en 0,5 logarithme
cellulaire et 0,5 ml d’huile de vaseline.
I
dans le milieu contenant du bicarbonate de
Dès le ,troisième ou quatrième jour, les cellu-
sodium et de la soude N/I0 aux concentrations
les se sont multipliées au fond du tube où elles
indiquées. Chaque dilution est répartie dans
forment un tapis complet aussi bien dans les
10 tubes à hémolyse à raison de 0,5 ml par tube,
tubes témoins que dans les tubes de la réaction.
puis pour se placer dans les conditions mêmes
Les tubes sont examinés au microscope inversé
de la réaction comme l’ont fait ZWART et
les 5e et 6e jours, A cette date, l’effet cytopatho-
.
ROWE (1966) il convient d’ajouter dans tous
gène doit être complet dans tous les témoins
les tubes 0,05 ml de sérum de bovin ou de
virus. Dans les tubes utilisés pour la réaction,
caprin, inactivé et dépourvu d’anticorps pesti-
différentes lésions peuvent être distinguées au
ques. Cette répartition se fait avec une pipette
moment de la lecture :
.
compte-gouttes. Après agitation énergique, les
10 Le tapis cellulaire n’est pas modifié : le
tubes sont placés à 37 OC pendant une heure.
virus a été neutralisé par le sérum qui contient
Puis une suspension de cellules MDBKC à
des anticorps à la dilution de IjlO.
100.000 unités par ml, réalisée dans un milieu
20 Le tapis cellulaire est complètement détruit
identique dépourvu de sérum est introduite dans
ou présente plusieurs plages bordées de cellules
tous les tubes à raison de 0,5 ml par tube. Après
arrondies, le témoin sérum ne présentant pas
agitation, il est distribué dans tous les tubes
de lésions : le sérum ne contient pas d’anticorps
0,5 ml d’huile de vaseline stérilisée à 105 OC.
pouvant neutraliser le virus à la dilution au
Finalement, l’ensemble est mis à l’étuve à 37 OC.
1 /lO.
L’expérience a montré que le titrage devait
s’effectuer en présence d’un sérum provenant
30 La réaction est douteuse, lorsque dans les
de la même espèce animale que celui examiné
tubes, on observe la présence d’amas de cellules
lors de la réaction, car la DL 100 varie suivant
arrondies sans plage, O?I bien lorsque 2 tubes
sur 4 présentent des lésions nettes.
c
l’origine du sérum.
II. - LES RÉSULTATS
T
C) La réaction de séro-neutralisation.
L’examen de chaque sérum nécessite 5 tubes,
La tec.hnique cinétique a été appliquée
4 pour la réaction et un témoin sérum dans
conjointement avec la méthode de PLOWRIGHT
lequel le virus est remplacé par une quantité
et FERRIS (1961) pour un certain nombre d’exa-
identique de milieu tamponné.
mens.
Le virus est dilué, à la concentration indiquée
A) Recherche d’anticorps neutralisants chez les
par le titrage, dans le milieu tamponné. Cette
bovins.
solution est répartie à la quantité de 0,5 ml dans
tous les tubes sauf les témoins. Puis 0,05 ml de
Les sérums au nombre de 51 provenaient
sérum à examiner sont ajoutés dans chacun des
d’animaux achetés au Maroc et au Sénégal
5 tubes, le sérum se trouvant ainsi dilué au l/lO.
oriental, reconnus indemnes de peste bovine.
Après agitation, les tubes sont placés à l’étuve
L’examen des sérums dilués au I/l0 donne le
à 37oC pendant une heure.
même résultat : tous les sérums sont dépourvus
t
Passé ce délai, chaque tube reçoit 0,5 ml de
d’anticorps, avec les deux méthodes.
suspension cellulaire à 100.000 unités par ml
B) Recherche d’anticorps neutralisants chez les
distribuées en milieu tamponné. On recouvre
caprins et les ovins âgés de 6 mois à 4 ans,
la surface libre d’huile de vaseline, à raison de
f
d’origine sénégalaise.
0,5 ml par tube. L’ensemble est ensuite placé à
l’étuve à 37 OC jusqu’au moment de la lecture.
10 Caprins vivanfs en zone d’endémie.
Il est nécessaire de réaliser un témoin virus
305 sérums examinés par les deux méthodes
sur 5 tubes, recevant chacun 0,5 ml de suspension
après dilution au I/l0 ont permis d’enregistrer
virulente, 0,05 ml de sérum dépourvu d’anti-
les résultats suivants :
333
c
a) Méthode classique.
Les résultats différents, dont le pourcentage
Animaux dépourvus d’anticorps . . 35,4 p. 100
est de 17,6 p, 100, se répartissent de la manière
-
Animaux pourvus d’anticorps . . . 41,7 p. 100
suivante :
Animaux douteux . . . , . . , . . . . . . , .
22,9 p. 100
Méthode cinétique
Méthode classique
-
-
.
9,4 p. 100 . . . .
neutralisant55
douteux
b) Méthode cinétique.
4,8 p. 1 0 0 . . .
neutral isants
pas d’anticorps
Animaux dépourvus d’anticorps .
31,2 p. 100
1,4p.100....
douteux
pas d’anticorps
Animaux pourvus d’anticorps .
48,8 p. 100
2 p.lOO....
douteux
neutralisants
Animaux douteux . . . .
20,O p. 100
30 Caprins vivant en zone indemne :
c) Comparaison des deux méthodes.
?
L’examen de 231 sérums, dilués au l/lO,
L’analyse des résultats obtenus montre qu’ils
provenant de caprins âgés de 1 à 5 ans, testés
sont identiques dans 85,3 p. 100 des cas, répartis
par les deux méthodes, a permis de noter les
comme suit :
résultats suivants :
Animaux dépourvus d’anticorps .
31,2 p. 100
a) Méthode classique.
Animaux pourvus d’anticorps .
39,7 p. 100
Animaux douteux . . . . .
14,4 p. 100
Animaux dépourvus d’anticorps . . 60,6 p. 100
Animaux pourvus d’anticorps . . . 19 p. 100
Les résultats différents, dont le pourcentage
Animaux douteux . . . . . . . .
20,4 p. 100
est de 14,7 se répartissent de la manière ci-après.
b) Méthode cinétique.
Méthode cinétique
Méthode classique
-
-
Animaux dépourvus d’anticorps .
54,l p. 100
7,9 p. 100.. . .
neutralisant5
douteux
Animaux pourvus d’anticorps
28,6 p. 100
1,3 p.lOO....
neutralisants
pas d’anticorps
Animaux douteux . . . . . . . . . . . 17,3 p. 100
2,9 p. 100.. . .
douteux
pas d’anticorps
2,6 p. 100.. . .
douteux
neutralisants
c) Comparaison des deux méfhodes.
L’analyse des résultats montre qu’ils sont
.
20 Ovins vivanf en zone d’endémie.
identiques dans 81,4 p. 100 des examens, répartis
comme suit :
L’examen de 244 sérums après dilutions au
.
l/lO, provenant d’ovins âgés de 1 à 5 ans, testés
Animaux dépourvus d’anticorps ,
54,2 p. 100
par les deux méthodes, a permis d’enregistrer
Animaux pourvus d’anticorps
15,2 p. 100
les résultats suivants :
Animaux douteux . . . . . . . .
1 2
p. 100
a) Méthode classique.
Les résultats différents, dont le pourcentage
atteint 18,6 p, 100, se répartissent de la manière
Animaux dépourvus d’anticorps , . 31,2 p. 100
suivante :
Animaux pourvus d’anticorps . . . 50,5 p. 100
Méthode cinétique
Méthode classique
Animaux douteux . . . , .
18,3 p. 100
-
-
7,8 p. 100.. . ~
neutralisants
douteux
b) Méthode cinétique.
6 p.lOO....
neutralisants
pas d’anticorps
Animaux dépourvus d’anticorps . 25 p. 100
0,9 p. 100.. . .
douteux
pas d’anticorps
Animaux pourvus d’anticorps . .
62,7 p. 100
3,9 p. 100.. . .
douteux
neutralisants
Animaux douteux . . . , .
12,3 p. 100
Ill. - DISCUSSION
L
c) Comparaison des deux méthodes.
Elle portera sur deux points, la valeur de la
L’analyse des résultats obtenus montre qu’ils
méthode cinétique et la présence d’anticorps
sont identiques dans 83,4 p, 100 des examens,
chez les petits ruminants.
répartis comme suit :
Animaux dépourvus d’anticorps 25 p. 100
A) La méthode cinétique.
Animaux pourvus d’antjcorps . . . 48,5 p. 100
L’analyse des résultats obtenus par les 2 métho-
Animdux douteux , . . . :, . . . . , .
9,9 p. 100
des montre que ceux-ci diffèrent dans des pro-
534
portions variant entre 14 et 18 p. 100. L’examen
b) En zone indemne.
du tableau comparatif révèle que :
15,2 p. 100 des caprins d’après la technique
a) 7,9 à 9,4 p. 100 des sérums positifs avec la
classique et 28,6 p. 100 d’après la méthode
méthode cinétique sont douteux avec la technique
cinétique hébergent des anticorps dans leur
classique.
sérum.
0,9 à 2,9 p. 100 des sérums douteux avec la
ZWART et ROWE (1966) signalent au Nigeria,
méthode cinétique sont négatifs avec la technique
la préseilce d’anticorps à un taux moyen de
classique. Ce fait traduit un défaut de sensibilité
15,2 p, 100 chez les caprins et de 18,8 p. 100 chez
de la méthode cinétique dans environ 11 p. 100
les ovins vivants en zone d’endémie. Les pourcen-
des examens.
tages sont beaucoup plus élevés au Sénégal.
Ces mêmes auteurs rapportent que dans une
b) 1,3 à 6 p. 100 des sérums positifs avec la
région indemne, il n’y a pour ainsi dire pas
méthode cinétique sont négatifs avec la méthode
d’anticorps chez les ovins.
classique, ce qui traduit un manque de sensibilité
Au Sénégal, les résultats sont différents. En
totale.
effet, en :Zone indemne le taux de caprins héber-
c) 2 à 3,9 p, 100 des sérums douteux avec la
geant des anticorps varie entre 15,2 et 18,6 p, 100
méthode cinétique sont positifs avec la technique
selon la technique utilisée. Quelle est l’origine
classique, ce qui traduit un certain pourcentage
de ces anticorps ? Si, en zone d’endémie, on peut
de résultats abhérents.
suspecter la transmission du virus bovipestique
par contezct aux petits ruminants, comme l’ont
En conclusion, la méthode cinétique employée
montré ZWART et MACADAM (1967), cette
conjointement avec la technique classique donne
transmission ne peut être retenue en zone
des résultats similaires dans 85,3 à 81,4 p. 100
indemne. Dans ce cas, on peut suspecter I’exis-
des examens. Les résultats différents sont en
tente d’un virus de faible virulence,
adapté
majorité dus au manque de sensibilité de cette
aux petits ruminants, qui se transmettrait d’un
méthode. Néanmoins, elle a l’avantage d’être
animal ii l’autre. On peut penser qu’il s’agit
d’un plus grand débit, mais son emploi en rai-
du virus PPR décrit par MORNET et collab.
son de son léger manque de sensibilité doit
(1956). Il serait un mutant du virus pestique
être réservé aux enquêtes épidémiologiques,
transmis:;ible
de caprins à caprins mais incapa-
les examens individuels devant se faire par la
ble de passer des caprins aux bovins comme
technique classique.
l’ont montré GILBERT et MONNIER (1962).
Des travaux en cours au laboratoire de Dakar
B) La présence d’anticorps neutralisants chez les
tendent à montrer que les virus bovipestique et
petits ruminants.
PPR, s’ils sont identiques du point de vue immu-
nologique, diffèrent néanmoins par certaines de
a) En zone d’endémie.
leurs propriétés biologiques et ainsi serait
confirmé le qualificatif de mutant appliqué au
41,7 p. 100 des caprins d’après la technique
virus PPR.
classique et 48,8 p. 100 d’après la méthode ciné-
tique hébergent des anticorps dans leur sérum,
Institut d’Elevage et de Médecine Vétérinaire
50,5 p, 100 des ovins d’après la technique
des Pays tro+aux Maisons-Alfirort
classique et 62,7 p. 100 d’après la méthode
Laboratoire National de /‘Elevage
cinétique ont des anticorps dans leur sérum.
et de Recherches Véférinoires Dakar-Hann
SUMMARY
Application of the Kinetic Seroneutralization test to the research
of Rinderpest neutralizing antibodies in cattle sheep and goat
The kinetic Sero-neutralization method, developped by LEPINE, ROGER et
ROGER (1959), has been adapted with some slight alteration to the research
of Rinderpest antibodies in cattle sheep and goat. In Senegal, these neutralizing
antibodies have been evidenced in 48 p. 100 of the goats and 62,7 p. 100 of the
sheeps living in enzootic area ; in the areas free of Rinderpest the percentage
of the goats showing these neutralizing antibodies was only 28 p. 100. The
cause of the presence of these antibodies in free disease area has been assumed
to be the SPR (Smal I Ruminant Rinderpest) virus.
RESUME N
Aplicacih del método cinético de set-o-neutralizacih
para la bhqueda
de 10s anticuerpos neutralizando el virus de la peste bovina en 10s bovinos,
10s caprinos y 10s ovinos
Se puede adaptar el método cinético de sero-neutralizacion
mejorada por
LEPINE, ROGER y ROGER (1969) con algunas modificaciones para la bkqueda
de 10s anticuerpos bovipesticos en 10s bovinos, 10s ovlnos y 10s caprinos. En
Senegal, mediante el dicho método se demostro la presencia de anticuerpos
neutralizantes en 48 p. 100 de 10s caprinos y 62,7 p. 100 de 10s ovinos viviendo
en zona de endemia, mientras el porcentaje solo Ilegaba a 28 p. 100 en 10
concerniente 10s caprinos viviendo en una zona indemne de peste bovina. El
virus PPR (Peste de 10s pequecos rumiantes) seria causa de la presencia de estos
anticuerpos en la zona indemne.
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