Gouvernement de la RGpublique du Sénègal ...
Gouvernement de la RGpublique du
Sénègal
Ninistère du Dévcloppcment Rural
Service de 1'Océanographic et des
Pkhcs Maritimes
Centre- de Recherches Gcéanographiques
de Dakar-Thiarcye
PROTOCOLES D'ANALYSES ELECTROPHORETIQUES
A EMPLOYER AVEC L'APPAREIL J,C.B,
( 2, l'usage des préparateurs )
J.C, BARON
I>'IZCI:R&i%IE DES NATIOI?S UNIS POUR LE DEVELOPPlZXE3JT
IlllllaI---
.-
DAKAR p Octobre 1971
D oS.P,, no35
~
PROTOCOLES D'ANALYSES
ELWTROPHOREI'IQUES
A EWIXIYER AVEC L'APPARJZL J.C.B.
(A l'usage des préparateurs)
Par
J.G. BARON
I N T R O D U C T I O N
I -
GEL D'ANIDON
II -
GEL D'AGAROSE
III -
PREX%.RATIVE PAPIZ.31
IV -
REVï%ATIoNS PARTICULIERI8
V-
AUTRES TAMPONS
VI-
EXTRACTIOlJ DE PROTEINES DES TISSUS
VII -
PREiIJWENENTDU SANGEI'DU SERUH
VIII -
LISTE NOlXNATIVE DES PRODUITS NECESSAIRJZS
OCTOBRE 1971
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I N T R O D U C T I O N
CO fascicule complète de faqon pratique llenseignemsnt théori-
que du l* fascicule sur les "Données de base pour la recherche
sérologique appliquée aux poissonslt (Abidjan FAO/PDPPC/RS/-2/70)
et dont une deuxième réédition revue et complétée est prévue.
L'appareil d'électrophorèse employé, fabriqué ~JJ laboratoire
est fragile et doit Étre manipulé avec précaution, 11 comprend
deux bacs à tampon, un plateau à gel et une enceinte rêfrigérante‘
11 est complété par 2 électrodes à fil de platine, 1 cadre à gel
et un couvercle.
-3-
Régler le goutte 5 goutte du tampon, installer lc bac do récupé-
v&inn dl1 trnn alcin. Renlcr la réfrigération.
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-20
1 - PROTOCOtF: D'EIJXTROPHORlSS EN GELD'ANID~
(AMIDON HYDR&ULIsE'CONNAUGHT)
AEFTECTUERLAVEILZ
1 - APPmL : S'assurer de la propreté de ltappamil et du cadre et les nctto-
-
-
yer à l'alcool. Fixer le cadre, obturer les fentes avec de
l'adhésif et de la pâte à modeler.
Vérifier le réfrigérant.
Nettoyer la plaque qui reoouvre le gel et préparer les poids qui
p&sent sur cette plaque.
2- GEL
-m
Préparer dans un erlenmeyer de 2 litres 90 g d'amidon, Boucher
au papier d'aluminium.
Préparer dans une éprouvette de 1 litre 35 ml de solution
1 et 675 ml de solution 2 (tampon Borate lithium - Triscitrique).
3 -PAPIERS D*INCI.USION MHATIkIAN No 1 d Vérifier qu'il y en a suffisamment d.es
2 dimensions utilisées : 10 x 10 mm et 15 x 10 mm0
AEJE'F'IXTUBR LEJOURf4EME
l- GEL A 12$ Préparer le gel d*emidon à l'aide de l'erlenmeyer de 2 litrcjs
dans lequel on a versé 10s 750 ml de tampon. Chauffer avec
les 2 becs bunsen et débuller à la trompe à vide (bouchon n* 45)
pendant 1 minute & compter du soulèvement du gel.
Couler le gel et le recouvrir avec la plame de plexiglass
prévue à cet effet. Ajouter 2 poids sur cette plaque et laisser
refroidir 30 à 45 mn à la température du laboratoire puis 30 à
45 mn en chambre froide ou au frigidaire (5 à 100). Décoller le
gel du cadre à l'aide d'une lame (grattoir à papier), ôter le
cadre et enlever les bavures d'amidon.
2- ~MXUSIO~J DES ECHANTILLONS
Décongclcr et préparer les échantillons à traiter. Nettoyer la
réglette repère et la disposer sur le gel pour pratiquer à
l'aide d'une microspatule de 10 x 10 mm ou 22 de 15 mm pour les
papiers de 15 x î0 mm* Déposer alors 10s papiers sur les trous
borgnes et à l'aide de pipettes différentes (ou la m&me rincée
trois fois et séchée au papier filtre) déposer 2 gouttes de
l'échantillon à anslYser (sérum, extrait de tissus, hémoglobine).
Introduire ensuite 10s papiers daz~s les fontes correspondantes.
3 -1cIGRATION :Hettre les élcctrodcs, remplir les bacs de tampon, ajuster le
couvercle, brancher les fils électriques et faire passer le
courent en notant l'heure de départ*
Régler le voltage au redresseur à 120 volts cc qui donno uno
d.d.p d'environ M volts par cm de gel,,
. . ./.*.
Régler le goutte à goutte du tampon, installer lc bac de récupé-
.
ration du trop plein. Régler la réfrigération.
Au bout de 3O.mn on peut ôter les papiers dlïnclusion et ressor-
rer les bords des fontes.
Laisser migror encore 6 h (soit un to-l,al de 6 h 30) puis arrêter
le courant, débrancher le goutte à goutte, ôter le couvercle ot
les électrodes et siphonncr le tampon des bacse
4 - REVI!XATION.DES PROTEINXS :
Couper et ôter les pieds du gel, glisser un fil métallique: fin
wntrc le gel et 10 plateau pour supprimer les adhérogccs. Rdap-
ter le chevalet puis la glissière. A l'aide du fil métallique
on coupe lc gel dans 10 sons do la longueur. La tranche supérieure
(6 mm) est ôt& et disposée dans une seconde glissière ; la tran-
chc inférieure de 3 mm reste au fond de la glissière que l'on dé-
pose dans un bac, Le bain révélateur est alors versé par dessus
le gel (ou étalé avec un pinceau si la quantité.cst trop faible),
Deux tranches de 3 mm sont encore disponibles pour 2 révélations
différentes
dont ccllcs des protéines totales à l'amidoschwarz
(colorée s pendant 1 minute).
T- P$OTOGRAPHIE DES ELZCTROPHOREGRAX~E3S
Pour les rkélations fugaces la photographie os-6 prise imxédi.,atc-
ment après avoir séché la surface du gel avec du papier filtrcO
Pour les révélations stables procéder à des lavages suoxscils dc
gel ct à la décoloration du fond.
A E?l?K!TUER LES JOURS SUIVANTS
l- Dï3COLORAr~ION DES G,;LS I?I PROTOGRAPHIES
--v
Conti= à, ddcolorcr les c;cls. Faire des ph&ographic:; ?. l': ici<.
du support dc photographiv (appareil 3 roulcttw fabric@ :~'.i IF'.-
boratoirc:)
L1 éclairsga est rklisé pzr 2 lampeshalogèncs do (SO0 wa+ii: ~;I:;sc~~~~.
de chaqw côtE du gel. 11 est recommandé d'utiliser le f‘iltr.;
rouge Kodak wratt~n no 25 pour les gels colorés on bleu, Ztili:;:-i:
un appareil photographiqu c ;~vcc un objectif dc 50 mm muni d.':n
paresoleil, Txlps de pose 1/30 ; diaphragme variant de g?& 5, ?;
pour un film noir et blxw do 40 ASA,
2- PLASTIFICATION DES GZ3
Les gels sont plac& pendant au moins 3 hcurc:; daw li: b:!,in eui-
vant prépar axant l'cmploi:y50 ml d'acide acétique à 5 $ CL
50 ml do glycérol,
Le gel est cnouitc: recouvert de pnpicr Arches 302 2-t plac& A
30 cm d'une lampe 3 infra, rouge jusqu'à plastification complOto
(2 à 3 hourcs). Le papier out alors cnlcv& par frottement dz
doigt sous un filct d'eau. Après avoir séché 10 gel avcc un
papier fïltrb on rkzlisc un sous-verre avec do l'adhésif,
a..
.“.
- 4 . .
AJ?rmxE
--mw
l- Tampon discontinu Vorate-lithium, T$s-citrique
Solution 1 :
(POU 1~33 032~) Li 03 (0,0251~1)
5,244 Q
H2B03 (O,Oi@
30,922 :y
eau distillQc
5 litres
Solution 2 0
Acide citrique
(0,08N
3;2 e
Tris
(0,05H
12,1 g
(pH18,3ff=0,058) CRU distillée 2 litres
2- Colorant pour ‘amidon
---m :
:- --,
-.o-.. ~!:yi&)
16 g
acide acétique
160 r27-
sl.cool méthylique
800 ml
e2u distillée
803 m!.
3 - Décolor,ant pour tiidon 0
-.-.h-,..e._. W
zc:idc nc6tiqx
350 ml
I--
,zlcool mGth;liquc
2000 ;,1'-
Cü,U diat:illéc
2300 m -
-5-
II - PROTOCOLE D'ELECTROPRORESE EN GEL D'AGAROSE
(Agarose I.B.F.)
1 - APPAREIL : S'assurer de la propreté de l'appareil et du cadre à gel et les
nettoyer à l'alcool. Fixer le cadre, obturer les fentes avec de
l'adhésif et de la pâte à modeler.
Vérifier le réfrigérant,
Assurer l'horizontalité de l'appareil.
Nettoyer à l'alcool la plaque de verre support du ge:L et la
déposer sur le plateau de l'appareil.
12 - GEL A q,5%:Préparer le gel d'agarose à l'aide d'un erlenmeyer de 1 litre
dans lequel on a versé 9 grammes d'agarose et 600 cm3 de tampon
de Rirschfeld (400 ml de solution concentrée et 200 ml d'eau dis-
tillée).
Après dissolution complète de l'agarose laisser légèrement re-
froidir et verser doucement dans le cadre.
Laisser refroidir une heure puis décoller le gel du cadre à
l'aide dfune lame (grattoir à papier), ôter le cadre et enlever
les bavures d'agarosee
3 - INCLUSION DES ECHANTILIQNS :
3.1. Agarose non tamponné à 3 % : Préparer 1,5 g d'agarose + 50 ml
d'eau distillée dans un bécher, mettre ce dernier dans un autre
bécher plus grand rempli au 1/4 d'eau distillée qui servira au
rinçage de la pipette, Déposer les béchers dans un bain marie0(4ro)
3.2. Préparation des échantillons -A l'aide d'une p:LpetUe Pasteur
jaugée, rincée à l'eau
entre chaque prél&vement, on dCpose
des volumes égaux d'échantillons dans de petits tube:; à bactério-
logie,
3.3. Réservoirs : La réglette repère étant disposée sur le gel,
pratiquer les réservoirs à l'aide d'un emporte piece (Apclab)
en aspirant à un bout.
3 -4. Inclusion : Les échantillons à étudier sont mélangés en
parties égalcs avec l'agarose non tamponné (attendre qu'une "peau"
se soit formée à la surface) et déposés dans les réservoirs.
4 - MIGRATION :Mettre les électrodes, remplir les bacs de tampon, a,juster le cou-
vercle, brancher les fils électriques et faire passer le courant
en notant l'heure de départ.
Régler le voltage au redresseur à 75 volts (190 m A) ce qui donno
une d.d.p. d'environ 4,5 volts par cm de gel.
Installer le bac dc récupération du trop plein et régler le goutte
à goutte du tampon. Régler la réfrigération si l'électrophorke
n'est pas faite on chambre froide ce qui serait préf&ablc, lc
gel d'agarose ne risquant pas de Be casser.
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Laisser migrer pendant 4 h 30. Débrancher le goutte à goutte,
ôter le couvercle et les électrodes et siphonner le tampon hors
des bacs.
5 - REVXLATION DES PROTEINES :
Couper le gel à ras de la plaque de verre, soulever celle-ci
et recouvrir le gel d'une fouille de papier Arches 302.
4.1. Protéines dénaturées
Dessécher le gel sous une lampe à rayons Infra rouge jusqu'à
obtenir un mince film adhérant au verre. Immerger la plaque
dans le bain révélateur des protéines pendant 1 heure puis
effectuer la décoloration par des ba.ins successifs de décolo-
rant. Laisser ensuite sécher à l'air libre*
4.2. Protéines non dénaturées :
Effectuer les réactions colorées sur le gel avant de fixer les
protéines soit à 1 ‘acide acétique à 5 $ pendant 3 heures soit
par la chaleur. Procéder ensuite comme' précédemmente
6 - PHOTOGRAPHIE DES ELECTROPHOFLEGR :
Pour les révélations fugaces la photographie est prise immé-
diatement après avoir séché la surface du gel avec du papier
filtre. Pour les protéines denaturées à la chaleur, la photo-
graphie peut attendre, les gels réduits à.l'état de film se
conservant indéfiniment.
ANNEXE
1 - Tampon de Hirschfeld
Solution concentrée pour le gel :
.
véronal acide
3,32 E:
véronal sodé
21,02 ,i;
lactate de Ca
3,67 g
eau distillée
2 litres
Solution pour les bacs (pH = 8,6)
véronal acide
699 g
véronal sodé
43,8 g
lactate de 'Ca
1992
eau distillée
5 litres
2- Colorant pour agarose :
noir amido
acétate de Na
6,8 g
eau distillée 965 ml
acide acétique
35,5 ml
glycérol
Ill ml
3 - Décolorant pour agaroso r
glycérine
360 ml
acide acetiquc
100 ml
eau distillée q.s,p.f, 5 litres (4,6401)
III - PROTOCOLJ- D'ELJXTROPHORESE PREPARATIVE
SUR PAPIJB (Uhatman no 3)
1 -APPAREIL : S'assurer de la propreté do l'appareil et du cadre à papier et
les nettoyer à l'alcool. Mettre l'appareil en place, remplir
les bacs a tampon, installer les électrodes' le goutte à goutte
et le trop plein,
2- PAPIXR :
On utilise 2 feuilles de papier Irdhatman nJ 3 découpées à l’avance
dans les grandes feuilles du commerce (qui contiennent 4 feuilles
de 285 x 210 mm). Reporter sur ces feuilles le tracé de la figure
2 à l'aide d'un crayon ni trop dur ni trop gras en prenant garde
de ne pas poser les doigts sur le papier. Puis tendre les feuil-
les sur le support en les bloquant par dessous entre les 2 pieds
du cadre et les arroser de tampon à l'aide d'une pissette, Lais-
ser sécher 5 mne
3 - DE!?OT DE L'ECHANTILLOM :
0,75 ml d'échantillon sont déposés à l'aide d'une pipette entre
les doux traits de départ (à 2 cm du bord cathodique du cadre).
Le dépôt doit être fait en plusieurs fois et de faqon régulière
ce qui est très important.
4 - MIGRATION tLo cadre est déposé ~LIT le plateau de l'appareil, les tendeurs
sont mis en place ainsi guc le couvercle et l'étanchéité est ren-
forcée par de la pâte a modeler. Mettre le contact électrique et
régler lo voltage à îy0 volts au redresseur ce qui donne une ddp,
d'environ 9 volts par cm de papier. Laisser migrcr pondant 7 h 45.
5 - l3XUELATION DES PROTEINES :
Les bandes témoins sont découpées et colorées au noir ramido pcn-
dant 10 minutes puis décolorées.
Pondant co temps les bandes tracées à l'avance sont découpées et
stcckées telles quelles au frigidaire ou au congélateur ou bien
pressées dans des corps dc seringue pour en extraire les protéines
qui seront soumisos à une 23 élcctrophorèsc (électrophorèsc bi-
dimcntionnellc).
1 - Tampon : Ce tampon appelé tampon de Hirschfeld est lc mc^mc
q,ue celui utilisé dans les bacs lors de l'électrophoresc
en:gel d'agarose (pH = 8,6 g)
véronal acide
%Y g
véronal sodé
43,Q g
lactate de Ca
1192 g
eau distillée 5 litres
2 - Colorant pour papier
noir amido
20 g
alcool méthylique
1800 ml
acide acétique
200 ml
Agiter et filtrer avant l'emploi.
3. Decolorant pour papier
alcool méthylipe
1800 ml
acide acétique
200 ml
.**/ 0.0
-8-
IV - Rl2'V-EIATIO1~S PARTICULIERES
1 - FBVEIATIONS DES HAPTOGLOBINES :
Le sérum étudié doit être additionne d"h6moglobine. Après l'Qlec-
trophorèse badigeonner le gel avec la solution suixante :
- eau distillé
10 ml
- dissoudre 4 cachets de Beneidine
- ajouter 10 ml d'acide acétique glacial
2 - REJVXIATIO~J DES ESTZRASES
1 - Tampon phosphate 0,4 M (pH = 6,55)
,-
a - Phosphate de plra2-.0,4N
143,26 g
(Na$PC4,12FJ20 = 358,14)
eau distillée
-1 litre
b - Phosphate de K - 0,4M
54944 g
(KH2PO4
= 136,Y)
eau distillée
1 litre
c - Réalise 1: le tampon en ajustant la solution (a) 2, i'::,idc
de la solution (b) jusqu'a obtention d'un pli de 6,35.
2 - Solution de substrat :y. naphtyl acetato
o,m {‘
&&t one
0 ml
3 - Révélateur des cstérases : La tranche do gel est mine à
incuber 30 mn dans la solution suivante :
- Tampon phos,phate 0,414 (pH = 6,55)
200 ml
-vC naphtyl acétate à 1 $ dan:: l'acétone
8 ml
(ou&naphtyl butyratc)
- Fast blue RI? (ou RR) salt
200 m,g
-9 -
1 - TAWON DISCON3XU DE POULIK pH = 8,O
. Solution concentrée pour le gel
-
-
-
Tris hydroxymethyla aminométhans
92 g
acide citrique
10>5 g
cau distillée qOs.p,f.
1 litre
diluer 10 fois pour l'utilisation
. Solution pour les bacs
-
-
acide borique
7 4 1 4 &
Na C;H (en pastilles)
Ys72 ES
eau distillée q*s,p,f.
4 litres
2 - TAMPON DïSC0WKtN-U TRIS4L~CIN3
-
-
. Solu-tion pour 10 .gcl
TriE
Glycine (glycocolle)
oau distillée q.s.,p.f.
Ajuster le pH à 8,7 avec H Cl normal
. Solution pour les bacs
e-m
.-m
Fris
Clycinc
eau distilloc q.s.p.f,
3 - TAXPO1J DISCUJï'INU DE AStiTON t (donne une bonne résolution cntrc
-
-
ies~globulincs et l'albumine).
. Solution 1
_----.-._. (pour 10s bacs),
Jiydroxydc de lithium
6g
acide borique
5?,45 6:
eau distiliée q.e.p.f.
5 litres
. Solution 2
-
-
-
acide citrique
3,2 Q
Tris
1238 g
eau distillée q*seP*f*
2 litres
. Solution pour le gel
10 % de solution i
90 $ dc soluticn 2
TAMPON VERONAL : pH = 8,2
4
-
veronal sodU
4706 g
I-I@1 N
63 ml
eau distillée
4,3 ml
o.o/o‘
I _
-io-
5--
TAWX TRIS - Z.D.T.A. pH = 8,8
Tris
%)TA
Acide borique
em distillée qeSep.f.
6- TAHPO:N D?Z ARONSSON ï$C' GRGN%ALL (pour acétate? àe
P.
cellulose) pIl - y.2
. c
Tris
XDTA
Acide borique
oau distillk
7--
TM@()N pHOSpWT% pH = 7,3 (kiilkins) pour hénoglobi.:lc D
K2HPO4
9',85 g
NaH2P04,2H20
4.975 t7
eau distillée
10 litxcs
- Il -
VI - MTRJLCTION DE PROTEINE3 DES TISSUS
Les extractions sont faites à partir de tissus de poissons, gen&rale-
ment à partir des muscles (blancs ou rouges), du coeur ou des gonades:.
1 -PREIZ?ZXENTS: Les préEvemcnts sont effectues soit sur 12 poisson frai.::
soit sur le poisson conservé congelé. Les morceaux de muo-
cles sont toujours préleves au même endroit, au niveau de
la nagooiro pectorale, sur le dos par exemple, et tout de
suite congelés en attendant d'être utilisés, Les prélévcmcnts
sont numérotés comme les poissons dont on a relevé la lon-
gueur à la fourche et lc sexe,
2 - ZXTRkCTION
Peser u grammes de tissu (muscle) et les deposer dans un
mortier Potter de 5 ml.Br,yer à l'aide du pilon puis ajcw-
ter u ml d'eau distillée
-
- - Broyer à nouveau0 On pratique
par groupe de 8 échantillons que l'on pèse succcss1v13rc'c~-~~
puis que l'on broie à tour de rôle en revenant au 1" aprks
le 80. Lorsque les broyages sontterminés, laisser les pilons
enfoncés dans les mortiers et verser les surnagcants dans
les tubes en plastiques (numérotés dü 1 à 8) servant: A :!.:
centrifugation. Quilibrcr les tubes trop lagers (no jTJn:)._.:;
ajouter d'eau qui diluerait les protéines) et les moitrc d*:ns
les pots de centrifugation.
Visecr les bouchons, déposer les 8 pots dans la p>tlto c=ou-
r0nn.c et la couronne dans la centrifugeuse
- - - -
- r3fri&r+o
me -
El.?.;;.
---.-------
dont on a mis le compresseur en route 10 minutes plu0 toy,
(sur 4°)Q Régler In. centrifugation
sur 15 0 000 I; ours/:*;< :lu" *:
pendant 20 minutes. Lorsque la centrifugation est +.,:i~.i.~ 5!!
$tcr la couro:me pdi.s les pots ScnS 12s n.yitcro Pr:i,lL.L->-!
:Le surnagesat de chquc tube plastique 5, l'nido d'une: ;>:~IV? Lc
Past cur et lc déposer dans un tube bact6riologiqu.c n.vn:' ro-k 5
que l'on conuL
~rvc 2,~ congélateur jusqu'au m0mc:n-t; ù:: 2.' <:m;~loi.
Lfos pipotttis ayant servi ;tux prelevc,mtnt s 7 .-l.t laissiks :I.;Xs
les tubcss
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1 - - 1 1 1 1 1 . 1 . - - - ~ - - I
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1 -PF!lXXW:mTDU SANG
Mode opératoire
Le pré1&.wrxnt se fait sur la sardinelle vivonteo Si le
poisson est trcn vivscc il faut le laisser quclqucs minutes
hors dc l'eau peur l'affaiblir, nous avons constaté en effet
que lc volume d<, S?ang total obtenu est alors plus important.
Avec un pois son trop vif les ondées de sang sont désordonnées
et de faible amplitude, en outre le "1° jet" est souvent pcr-
du ; avec ~;LYI poisson affaibli les ondées sont lentes mais
fortes et l'on ne rate que rarement la première giclée.
Tenir la sardinclle dans la main gauche, ventre en l'air
pouce et indexe sous les oparculcs (1), DC la main droite
scctionnor à l'-cLidz d'une paire de ciseaux pointus la bnsc
des arcs branchiaux (2) puis tirer la tc^te vers le bas pour
déchirer les chairs et faire appara?tre lc coeur (3). Scc-
tionner un avant du blulhc! cardiaque (4) et recueillir le C;L~&
pulsé dans un tube de kahn numoroté, sec ct stérile, débouché
et présenté p.-r un aid> de préférence, Le tube est aussit$t
rebouché et maintenu dans l,> glaciaire portative.
Les &harAillons de sang sont conservés de 24 à 4% heure::
en glacisirc 6 mvirGI1 + 4-O (et non 2.u congdlatcur, ce qui p-w-
vaquerait 1'l~~mclysu d<,z globules).
II - PIICLEVEENT DU SE@JlY
-
Ia si:rw est C!llF.~1ii;~ pr5lové cn (leur, fois 5 la pipi;ttc,
en utilisznt une pip&tc neuve par échantillon :
- um prcmi&rc: fois après xcuda-iion naturi: !.l%:
de s&xm (genCrziLme:i-t P~U hémolysé).
- ~?I:L) deu.:cième fois apr6s centrifugation (3 nm
à 2 CCC t/mn) CL: qli prcvoquc souvent une hémolysa des globules
toin.tsnt en rGU@ 1:: S&U~, Les deux préloücmrnts vont stock&
au con@lxtcur clans 2 tubes différents portant le m8mc numt?ro.
- 14 -
VIII - LSSTE NOKtl'~ATIVZ D%S PRODUITS'NECESSAII
-
-
--
Abréviations :
E = cloctrophorèsc C = chromatoe;raphic F = filtration
T = tampons
Z = enzymes
I*Z = inhibitaurs cnzyma.tiqucs
s -; substraks enzymatiques
I- S-UBSTRATS :
AC?ZJ!ATE DE CELLUMSZ
RGm MOBU Spécial
AGAROSE 1,B.F.
AMIDON
hydrolysé
CELLOGEL oseDEAE - cellulose
PAPIER ARCHES
COFFUU
~WLTXAH
SEPHADEX G 25 à G 200
II - PRODmTS CHIinQmS COURANTS
AClYlYATE DE Na
TE
ACETONE
ACIDE ACEl'IQUZ
AGIDE BORïQUE
ACIDE CITRIQUE
&'IDE CHLQRYDCXQJJE
ACIDE LtZCTIQLE3
AXOOL ETHyLïQuJZ ABSOLU
II
Il
300
11
1t
703
BENZENE
CHL(jmrfDPJLTE D'HYDROXYLRI:IINE
*TE
CHLOROFOR1m
CHLORUR.~S de ~~U~NGANESE
CHI.OR-WS de MAGXESIU&l
CITR&TE TRISODIQUX dc Bn
D~EFHYL&'IAI~~$YL'URZX SUDEE (VC:ronxl sodé)
TE
DImHYW&LOmLmX (VCronal)
TE:
EAU OXYG23.XZJ3
- 15 -
E.D,T,A. (Idranal)
TE
GLUCOSE (D) &ydre
GLYCEROL
HYDROXYDE de LITHIUM (lithine caustique)
TE
LACTATE de CALCIU&f
TE
NERCUROTHIOLAT'E DE Xa
MS 222 SAND02
PnOSPFrXTE dc Na2
T
II
”
Na
T,
Il
" K2
T
II
" K
T
POLYvINYLPYxRoLIDiz
SAPOI:INE (norkol)
SODIUM AZIDE
SOUDE CAUSTIQUE
SUL3ATE D'AFIOXIUM
TOLUENE
TRISHYDROXY3WIY~ AbIINOl'@X'HAh%
TJREE
III - COLQRANTS
AMIDOSCHTfARTZ (Noir amido)
AZOCARXIN G
Bm DE BRO!~iOPHlXC\\L
BENZIDINE
F'AST BLUE BB
11
Il
RR
NITROSO R SALT
XITRO BLUE DE TETRAZOLIUX @BT)
OIL RXD 0,
0 - DIANISIDII?E!
ROUGE POHCEAU
ROUGE CEROL
VTIIT DE HET-HYIX
_L_ .--- _- ---..-
---
- 76 -
IV - PRODUITS SPECIAUX PGUR BTZYNES
ACIDE LACTIQUE
ACETAZOLAMIDE
ARYIAM (mwine)
IZ
EENZIDINE
(pax) CHLCiRC~,i:IUE1CiJI:Te~~ZOATE
CYANURE de K
DICHLOf~RIITE DEIl , PHEF~YIJ3!GDIAJ~INE
DI-ISOPROPYLFLUOROPHGS9iATE (DIPF)
IZ
D.P.NI,
ESERLNE
IZ
1 1
SALICYLGTE
1t
SULFATE
(alpha) NAPHTYL ACZTATE
sz
11
ACIDE PHOSPITATE
sz
II
BUTY?ii4TE
sz
II
PHOSPHATE 0% Mn.
sz
(béta) NAPHTYL ACETATE
sz
NAPHTYL N. XQ?TFXL CAIBAiinTl2 (Scvine)
IZ
mxmu-1INID~Si:
P.N,S.
V- PRODUITS, DIVERS
-
-
COTON CARDE
COTON HYDROPHïLG
&JJtDES ADHESI~S
E
PATE A XODELER
%
Sénègal
Ninistère du Dévcloppcment Rural
Service de 1'Océanographic et des
Pkhcs Maritimes
Centre- de Recherches Gcéanographiques
de Dakar-Thiarcye
PROTOCOLES D'ANALYSES ELECTROPHORETIQUES
A EMPLOYER AVEC L'APPAREIL J,C.B,
( 2, l'usage des préparateurs )
J.C, BARON
I>'IZCI:R&i%IE DES NATIOI?S UNIS POUR LE DEVELOPPlZXE3JT
IlllllaI---
.-
DAKAR p Octobre 1971
D oS.P,, no35
~
PROTOCOLES D'ANALYSES
ELWTROPHOREI'IQUES
A EWIXIYER AVEC L'APPARJZL J.C.B.
(A l'usage des préparateurs)
Par
J.G. BARON
I N T R O D U C T I O N
I -
GEL D'ANIDON
II -
GEL D'AGAROSE
III -
PREX%.RATIVE PAPIZ.31
IV -
REVï%ATIoNS PARTICULIERI8
V-
AUTRES TAMPONS
VI-
EXTRACTIOlJ DE PROTEINES DES TISSUS
VII -
PREiIJWENENTDU SANGEI'DU SERUH
VIII -
LISTE NOlXNATIVE DES PRODUITS NECESSAIRJZS
OCTOBRE 1971
-___
~
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_I
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- I”
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-.-.
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--,^
.-_--_l_
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-
I N T R O D U C T I O N
CO fascicule complète de faqon pratique llenseignemsnt théori-
que du l* fascicule sur les "Données de base pour la recherche
sérologique appliquée aux poissonslt (Abidjan FAO/PDPPC/RS/-2/70)
et dont une deuxième réédition revue et complétée est prévue.
L'appareil d'électrophorèse employé, fabriqué ~JJ laboratoire
est fragile et doit Étre manipulé avec précaution, 11 comprend
deux bacs à tampon, un plateau à gel et une enceinte rêfrigérante‘
11 est complété par 2 électrodes à fil de platine, 1 cadre à gel
et un couvercle.
-3-
Régler le goutte 5 goutte du tampon, installer lc bac do récupé-
v&inn dl1 trnn alcin. Renlcr la réfrigération.
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-20
1 - PROTOCOtF: D'EIJXTROPHORlSS EN GELD'ANID~
(AMIDON HYDR&ULIsE'CONNAUGHT)
AEFTECTUERLAVEILZ
1 - APPmL : S'assurer de la propreté de ltappamil et du cadre et les nctto-
-
-
yer à l'alcool. Fixer le cadre, obturer les fentes avec de
l'adhésif et de la pâte à modeler.
Vérifier le réfrigérant.
Nettoyer la plaque qui reoouvre le gel et préparer les poids qui
p&sent sur cette plaque.
2- GEL
-m
Préparer dans un erlenmeyer de 2 litres 90 g d'amidon, Boucher
au papier d'aluminium.
Préparer dans une éprouvette de 1 litre 35 ml de solution
1 et 675 ml de solution 2 (tampon Borate lithium - Triscitrique).
3 -PAPIERS D*INCI.USION MHATIkIAN No 1 d Vérifier qu'il y en a suffisamment d.es
2 dimensions utilisées : 10 x 10 mm et 15 x 10 mm0
AEJE'F'IXTUBR LEJOURf4EME
l- GEL A 12$ Préparer le gel d*emidon à l'aide de l'erlenmeyer de 2 litrcjs
dans lequel on a versé 10s 750 ml de tampon. Chauffer avec
les 2 becs bunsen et débuller à la trompe à vide (bouchon n* 45)
pendant 1 minute & compter du soulèvement du gel.
Couler le gel et le recouvrir avec la plame de plexiglass
prévue à cet effet. Ajouter 2 poids sur cette plaque et laisser
refroidir 30 à 45 mn à la température du laboratoire puis 30 à
45 mn en chambre froide ou au frigidaire (5 à 100). Décoller le
gel du cadre à l'aide d'une lame (grattoir à papier), ôter le
cadre et enlever les bavures d'amidon.
2- ~MXUSIO~J DES ECHANTILLONS
Décongclcr et préparer les échantillons à traiter. Nettoyer la
réglette repère et la disposer sur le gel pour pratiquer à
l'aide d'une microspatule de 10 x 10 mm ou 22 de 15 mm pour les
papiers de 15 x î0 mm* Déposer alors 10s papiers sur les trous
borgnes et à l'aide de pipettes différentes (ou la m&me rincée
trois fois et séchée au papier filtre) déposer 2 gouttes de
l'échantillon à anslYser (sérum, extrait de tissus, hémoglobine).
Introduire ensuite 10s papiers daz~s les fontes correspondantes.
3 -1cIGRATION :Hettre les élcctrodcs, remplir les bacs de tampon, ajuster le
couvercle, brancher les fils électriques et faire passer le
courent en notant l'heure de départ*
Régler le voltage au redresseur à 120 volts cc qui donno uno
d.d.p d'environ M volts par cm de gel,,
. . ./.*.
Régler le goutte à goutte du tampon, installer lc bac de récupé-
.
ration du trop plein. Régler la réfrigération.
Au bout de 3O.mn on peut ôter les papiers dlïnclusion et ressor-
rer les bords des fontes.
Laisser migror encore 6 h (soit un to-l,al de 6 h 30) puis arrêter
le courant, débrancher le goutte à goutte, ôter le couvercle ot
les électrodes et siphonncr le tampon des bacse
4 - REVI!XATION.DES PROTEINXS :
Couper et ôter les pieds du gel, glisser un fil métallique: fin
wntrc le gel et 10 plateau pour supprimer les adhérogccs. Rdap-
ter le chevalet puis la glissière. A l'aide du fil métallique
on coupe lc gel dans 10 sons do la longueur. La tranche supérieure
(6 mm) est ôt& et disposée dans une seconde glissière ; la tran-
chc inférieure de 3 mm reste au fond de la glissière que l'on dé-
pose dans un bac, Le bain révélateur est alors versé par dessus
le gel (ou étalé avec un pinceau si la quantité.cst trop faible),
Deux tranches de 3 mm sont encore disponibles pour 2 révélations
différentes
dont ccllcs des protéines totales à l'amidoschwarz
(colorée s pendant 1 minute).
T- P$OTOGRAPHIE DES ELZCTROPHOREGRAX~E3S
Pour les rkélations fugaces la photographie os-6 prise imxédi.,atc-
ment après avoir séché la surface du gel avec du papier filtrcO
Pour les révélations stables procéder à des lavages suoxscils dc
gel ct à la décoloration du fond.
A E?l?K!TUER LES JOURS SUIVANTS
l- Dï3COLORAr~ION DES G,;LS I?I PROTOGRAPHIES
--v
Conti= à, ddcolorcr les c;cls. Faire des ph&ographic:; ?. l': ici<.
du support dc photographiv (appareil 3 roulcttw fabric@ :~'.i IF'.-
boratoirc:)
L1 éclairsga est rklisé pzr 2 lampeshalogèncs do (SO0 wa+ii: ~;I:;sc~~~~.
de chaqw côtE du gel. 11 est recommandé d'utiliser le f‘iltr.;
rouge Kodak wratt~n no 25 pour les gels colorés on bleu, Ztili:;:-i:
un appareil photographiqu c ;~vcc un objectif dc 50 mm muni d.':n
paresoleil, Txlps de pose 1/30 ; diaphragme variant de g?& 5, ?;
pour un film noir et blxw do 40 ASA,
2- PLASTIFICATION DES GZ3
Les gels sont plac& pendant au moins 3 hcurc:; daw li: b:!,in eui-
vant prépar axant l'cmploi:y50 ml d'acide acétique à 5 $ CL
50 ml do glycérol,
Le gel est cnouitc: recouvert de pnpicr Arches 302 2-t plac& A
30 cm d'une lampe 3 infra, rouge jusqu'à plastification complOto
(2 à 3 hourcs). Le papier out alors cnlcv& par frottement dz
doigt sous un filct d'eau. Après avoir séché 10 gel avcc un
papier fïltrb on rkzlisc un sous-verre avec do l'adhésif,
a..
.“.
- 4 . .
AJ?rmxE
--mw
l- Tampon discontinu Vorate-lithium, T$s-citrique
Solution 1 :
(POU 1~33 032~) Li 03 (0,0251~1)
5,244 Q
H2B03 (O,Oi@
30,922 :y
eau distillQc
5 litres
Solution 2 0
Acide citrique
(0,08N
3;2 e
Tris
(0,05H
12,1 g
(pH18,3ff=0,058) CRU distillée 2 litres
2- Colorant pour ‘amidon
---m :
:- --,
-.o-.. ~!:yi&)
16 g
acide acétique
160 r27-
sl.cool méthylique
800 ml
e2u distillée
803 m!.
3 - Décolor,ant pour tiidon 0
-.-.h-,..e._. W
zc:idc nc6tiqx
350 ml
I--
,zlcool mGth;liquc
2000 ;,1'-
Cü,U diat:illéc
2300 m -
-5-
II - PROTOCOLE D'ELECTROPRORESE EN GEL D'AGAROSE
(Agarose I.B.F.)
1 - APPAREIL : S'assurer de la propreté de l'appareil et du cadre à gel et les
nettoyer à l'alcool. Fixer le cadre, obturer les fentes avec de
l'adhésif et de la pâte à modeler.
Vérifier le réfrigérant,
Assurer l'horizontalité de l'appareil.
Nettoyer à l'alcool la plaque de verre support du ge:L et la
déposer sur le plateau de l'appareil.
12 - GEL A q,5%:Préparer le gel d'agarose à l'aide d'un erlenmeyer de 1 litre
dans lequel on a versé 9 grammes d'agarose et 600 cm3 de tampon
de Rirschfeld (400 ml de solution concentrée et 200 ml d'eau dis-
tillée).
Après dissolution complète de l'agarose laisser légèrement re-
froidir et verser doucement dans le cadre.
Laisser refroidir une heure puis décoller le gel du cadre à
l'aide dfune lame (grattoir à papier), ôter le cadre et enlever
les bavures d'agarosee
3 - INCLUSION DES ECHANTILIQNS :
3.1. Agarose non tamponné à 3 % : Préparer 1,5 g d'agarose + 50 ml
d'eau distillée dans un bécher, mettre ce dernier dans un autre
bécher plus grand rempli au 1/4 d'eau distillée qui servira au
rinçage de la pipette, Déposer les béchers dans un bain marie0(4ro)
3.2. Préparation des échantillons -A l'aide d'une p:LpetUe Pasteur
jaugée, rincée à l'eau
entre chaque prél&vement, on dCpose
des volumes égaux d'échantillons dans de petits tube:; à bactério-
logie,
3.3. Réservoirs : La réglette repère étant disposée sur le gel,
pratiquer les réservoirs à l'aide d'un emporte piece (Apclab)
en aspirant à un bout.
3 -4. Inclusion : Les échantillons à étudier sont mélangés en
parties égalcs avec l'agarose non tamponné (attendre qu'une "peau"
se soit formée à la surface) et déposés dans les réservoirs.
4 - MIGRATION :Mettre les électrodes, remplir les bacs de tampon, a,juster le cou-
vercle, brancher les fils électriques et faire passer le courant
en notant l'heure de départ.
Régler le voltage au redresseur à 75 volts (190 m A) ce qui donno
une d.d.p. d'environ 4,5 volts par cm de gel.
Installer le bac dc récupération du trop plein et régler le goutte
à goutte du tampon. Régler la réfrigération si l'électrophorke
n'est pas faite on chambre froide ce qui serait préf&ablc, lc
gel d'agarose ne risquant pas de Be casser.
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Laisser migrer pendant 4 h 30. Débrancher le goutte à goutte,
ôter le couvercle et les électrodes et siphonner le tampon hors
des bacs.
5 - REVXLATION DES PROTEINES :
Couper le gel à ras de la plaque de verre, soulever celle-ci
et recouvrir le gel d'une fouille de papier Arches 302.
4.1. Protéines dénaturées
Dessécher le gel sous une lampe à rayons Infra rouge jusqu'à
obtenir un mince film adhérant au verre. Immerger la plaque
dans le bain révélateur des protéines pendant 1 heure puis
effectuer la décoloration par des ba.ins successifs de décolo-
rant. Laisser ensuite sécher à l'air libre*
4.2. Protéines non dénaturées :
Effectuer les réactions colorées sur le gel avant de fixer les
protéines soit à 1 ‘acide acétique à 5 $ pendant 3 heures soit
par la chaleur. Procéder ensuite comme' précédemmente
6 - PHOTOGRAPHIE DES ELECTROPHOFLEGR :
Pour les révélations fugaces la photographie est prise immé-
diatement après avoir séché la surface du gel avec du papier
filtre. Pour les protéines denaturées à la chaleur, la photo-
graphie peut attendre, les gels réduits à.l'état de film se
conservant indéfiniment.
ANNEXE
1 - Tampon de Hirschfeld
Solution concentrée pour le gel :
.
véronal acide
3,32 E:
véronal sodé
21,02 ,i;
lactate de Ca
3,67 g
eau distillée
2 litres
Solution pour les bacs (pH = 8,6)
véronal acide
699 g
véronal sodé
43,8 g
lactate de 'Ca
1992
eau distillée
5 litres
2- Colorant pour agarose :
noir amido
acétate de Na
6,8 g
eau distillée 965 ml
acide acétique
35,5 ml
glycérol
Ill ml
3 - Décolorant pour agaroso r
glycérine
360 ml
acide acetiquc
100 ml
eau distillée q.s,p.f, 5 litres (4,6401)
III - PROTOCOLJ- D'ELJXTROPHORESE PREPARATIVE
SUR PAPIJB (Uhatman no 3)
1 -APPAREIL : S'assurer de la propreté do l'appareil et du cadre à papier et
les nettoyer à l'alcool. Mettre l'appareil en place, remplir
les bacs a tampon, installer les électrodes' le goutte à goutte
et le trop plein,
2- PAPIXR :
On utilise 2 feuilles de papier Irdhatman nJ 3 découpées à l’avance
dans les grandes feuilles du commerce (qui contiennent 4 feuilles
de 285 x 210 mm). Reporter sur ces feuilles le tracé de la figure
2 à l'aide d'un crayon ni trop dur ni trop gras en prenant garde
de ne pas poser les doigts sur le papier. Puis tendre les feuil-
les sur le support en les bloquant par dessous entre les 2 pieds
du cadre et les arroser de tampon à l'aide d'une pissette, Lais-
ser sécher 5 mne
3 - DE!?OT DE L'ECHANTILLOM :
0,75 ml d'échantillon sont déposés à l'aide d'une pipette entre
les doux traits de départ (à 2 cm du bord cathodique du cadre).
Le dépôt doit être fait en plusieurs fois et de faqon régulière
ce qui est très important.
4 - MIGRATION tLo cadre est déposé ~LIT le plateau de l'appareil, les tendeurs
sont mis en place ainsi guc le couvercle et l'étanchéité est ren-
forcée par de la pâte a modeler. Mettre le contact électrique et
régler lo voltage à îy0 volts au redresseur ce qui donne une ddp,
d'environ 9 volts par cm de papier. Laisser migrcr pondant 7 h 45.
5 - l3XUELATION DES PROTEINES :
Les bandes témoins sont découpées et colorées au noir ramido pcn-
dant 10 minutes puis décolorées.
Pondant co temps les bandes tracées à l'avance sont découpées et
stcckées telles quelles au frigidaire ou au congélateur ou bien
pressées dans des corps dc seringue pour en extraire les protéines
qui seront soumisos à une 23 élcctrophorèsc (électrophorèsc bi-
dimcntionnellc).
1 - Tampon : Ce tampon appelé tampon de Hirschfeld est lc mc^mc
q,ue celui utilisé dans les bacs lors de l'électrophoresc
en:gel d'agarose (pH = 8,6 g)
véronal acide
%Y g
véronal sodé
43,Q g
lactate de Ca
1192 g
eau distillée 5 litres
2 - Colorant pour papier
noir amido
20 g
alcool méthylique
1800 ml
acide acétique
200 ml
Agiter et filtrer avant l'emploi.
3. Decolorant pour papier
alcool méthylipe
1800 ml
acide acétique
200 ml
.**/ 0.0
-8-
IV - Rl2'V-EIATIO1~S PARTICULIERES
1 - FBVEIATIONS DES HAPTOGLOBINES :
Le sérum étudié doit être additionne d"h6moglobine. Après l'Qlec-
trophorèse badigeonner le gel avec la solution suixante :
- eau distillé
10 ml
- dissoudre 4 cachets de Beneidine
- ajouter 10 ml d'acide acétique glacial
2 - REJVXIATIO~J DES ESTZRASES
1 - Tampon phosphate 0,4 M (pH = 6,55)
,-
a - Phosphate de plra2-.0,4N
143,26 g
(Na$PC4,12FJ20 = 358,14)
eau distillée
-1 litre
b - Phosphate de K - 0,4M
54944 g
(KH2PO4
= 136,Y)
eau distillée
1 litre
c - Réalise 1: le tampon en ajustant la solution (a) 2, i'::,idc
de la solution (b) jusqu'a obtention d'un pli de 6,35.
2 - Solution de substrat :y. naphtyl acetato
o,m {‘
&&t one
0 ml
3 - Révélateur des cstérases : La tranche do gel est mine à
incuber 30 mn dans la solution suivante :
- Tampon phos,phate 0,414 (pH = 6,55)
200 ml
-vC naphtyl acétate à 1 $ dan:: l'acétone
8 ml
(ou&naphtyl butyratc)
- Fast blue RI? (ou RR) salt
200 m,g
-9 -
1 - TAWON DISCON3XU DE POULIK pH = 8,O
. Solution concentrée pour le gel
-
-
-
Tris hydroxymethyla aminométhans
92 g
acide citrique
10>5 g
cau distillée qOs.p,f.
1 litre
diluer 10 fois pour l'utilisation
. Solution pour les bacs
-
-
acide borique
7 4 1 4 &
Na C;H (en pastilles)
Ys72 ES
eau distillée q*s,p,f.
4 litres
2 - TAMPON DïSC0WKtN-U TRIS4L~CIN3
-
-
. Solu-tion pour 10 .gcl
TriE
Glycine (glycocolle)
oau distillée q.s.,p.f.
Ajuster le pH à 8,7 avec H Cl normal
. Solution pour les bacs
e-m
.-m
Fris
Clycinc
eau distilloc q.s.p.f,
3 - TAXPO1J DISCUJï'INU DE AStiTON t (donne une bonne résolution cntrc
-
-
ies~globulincs et l'albumine).
. Solution 1
_----.-._. (pour 10s bacs),
Jiydroxydc de lithium
6g
acide borique
5?,45 6:
eau distiliée q.e.p.f.
5 litres
. Solution 2
-
-
-
acide citrique
3,2 Q
Tris
1238 g
eau distillée q*seP*f*
2 litres
. Solution pour le gel
10 % de solution i
90 $ dc soluticn 2
TAMPON VERONAL : pH = 8,2
4
-
veronal sodU
4706 g
I-I@1 N
63 ml
eau distillée
4,3 ml
o.o/o‘
I _
-io-
5--
TAWX TRIS - Z.D.T.A. pH = 8,8
Tris
%)TA
Acide borique
em distillée qeSep.f.
6- TAHPO:N D?Z ARONSSON ï$C' GRGN%ALL (pour acétate? àe
P.
cellulose) pIl - y.2
. c
Tris
XDTA
Acide borique
oau distillk
7--
TM@()N pHOSpWT% pH = 7,3 (kiilkins) pour hénoglobi.:lc D
K2HPO4
9',85 g
NaH2P04,2H20
4.975 t7
eau distillée
10 litxcs
- Il -
VI - MTRJLCTION DE PROTEINE3 DES TISSUS
Les extractions sont faites à partir de tissus de poissons, gen&rale-
ment à partir des muscles (blancs ou rouges), du coeur ou des gonades:.
1 -PREIZ?ZXENTS: Les préEvemcnts sont effectues soit sur 12 poisson frai.::
soit sur le poisson conservé congelé. Les morceaux de muo-
cles sont toujours préleves au même endroit, au niveau de
la nagooiro pectorale, sur le dos par exemple, et tout de
suite congelés en attendant d'être utilisés, Les prélévcmcnts
sont numérotés comme les poissons dont on a relevé la lon-
gueur à la fourche et lc sexe,
2 - ZXTRkCTION
Peser u grammes de tissu (muscle) et les deposer dans un
mortier Potter de 5 ml.Br,yer à l'aide du pilon puis ajcw-
ter u ml d'eau distillée
-
- - Broyer à nouveau0 On pratique
par groupe de 8 échantillons que l'on pèse succcss1v13rc'c~-~~
puis que l'on broie à tour de rôle en revenant au 1" aprks
le 80. Lorsque les broyages sontterminés, laisser les pilons
enfoncés dans les mortiers et verser les surnagcants dans
les tubes en plastiques (numérotés dü 1 à 8) servant: A :!.:
centrifugation. Quilibrcr les tubes trop lagers (no jTJn:)._.:;
ajouter d'eau qui diluerait les protéines) et les moitrc d*:ns
les pots de centrifugation.
Visecr les bouchons, déposer les 8 pots dans la p>tlto c=ou-
r0nn.c et la couronne dans la centrifugeuse
- - - -
- r3fri&r+o
me -
El.?.;;.
---.-------
dont on a mis le compresseur en route 10 minutes plu0 toy,
(sur 4°)Q Régler In. centrifugation
sur 15 0 000 I; ours/:*;< :lu" *:
pendant 20 minutes. Lorsque la centrifugation est +.,:i~.i.~ 5!!
$tcr la couro:me pdi.s les pots ScnS 12s n.yitcro Pr:i,lL.L->-!
:Le surnagesat de chquc tube plastique 5, l'nido d'une: ;>:~IV? Lc
Past cur et lc déposer dans un tube bact6riologiqu.c n.vn:' ro-k 5
que l'on conuL
~rvc 2,~ congélateur jusqu'au m0mc:n-t; ù:: 2.' <:m;~loi.
Lfos pipotttis ayant servi ;tux prelevc,mtnt s 7 .-l.t laissiks :I.;Xs
les tubcss
_ _ _ . “ I <
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I I .
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I I -
1 - - 1 1 1 1 1 . 1 . - - - ~ - - I
- . - .
- - _ I _ - -
1 -PF!lXXW:mTDU SANG
Mode opératoire
Le pré1&.wrxnt se fait sur la sardinelle vivonteo Si le
poisson est trcn vivscc il faut le laisser quclqucs minutes
hors dc l'eau peur l'affaiblir, nous avons constaté en effet
que lc volume d<, S?ang total obtenu est alors plus important.
Avec un pois son trop vif les ondées de sang sont désordonnées
et de faible amplitude, en outre le "1° jet" est souvent pcr-
du ; avec ~;LYI poisson affaibli les ondées sont lentes mais
fortes et l'on ne rate que rarement la première giclée.
Tenir la sardinclle dans la main gauche, ventre en l'air
pouce et indexe sous les oparculcs (1), DC la main droite
scctionnor à l'-cLidz d'une paire de ciseaux pointus la bnsc
des arcs branchiaux (2) puis tirer la tc^te vers le bas pour
déchirer les chairs et faire appara?tre lc coeur (3). Scc-
tionner un avant du blulhc! cardiaque (4) et recueillir le C;L~&
pulsé dans un tube de kahn numoroté, sec ct stérile, débouché
et présenté p.-r un aid> de préférence, Le tube est aussit$t
rebouché et maintenu dans l,> glaciaire portative.
Les &harAillons de sang sont conservés de 24 à 4% heure::
en glacisirc 6 mvirGI1 + 4-O (et non 2.u congdlatcur, ce qui p-w-
vaquerait 1'l~~mclysu d<,z globules).
II - PIICLEVEENT DU SE@JlY
-
Ia si:rw est C!llF.~1ii;~ pr5lové cn (leur, fois 5 la pipi;ttc,
en utilisznt une pip&tc neuve par échantillon :
- um prcmi&rc: fois après xcuda-iion naturi: !.l%:
de s&xm (genCrziLme:i-t P~U hémolysé).
- ~?I:L) deu.:cième fois apr6s centrifugation (3 nm
à 2 CCC t/mn) CL: qli prcvoquc souvent une hémolysa des globules
toin.tsnt en rGU@ 1:: S&U~, Les deux préloücmrnts vont stock&
au con@lxtcur clans 2 tubes différents portant le m8mc numt?ro.
- 14 -
VIII - LSSTE NOKtl'~ATIVZ D%S PRODUITS'NECESSAII
-
-
--
Abréviations :
E = cloctrophorèsc C = chromatoe;raphic F = filtration
T = tampons
Z = enzymes
I*Z = inhibitaurs cnzyma.tiqucs
s -; substraks enzymatiques
I- S-UBSTRATS :
AC?ZJ!ATE DE CELLUMSZ
RGm MOBU Spécial
AGAROSE 1,B.F.
AMIDON
hydrolysé
CELLOGEL oseDEAE - cellulose
PAPIER ARCHES
COFFUU
~WLTXAH
SEPHADEX G 25 à G 200
II - PRODmTS CHIinQmS COURANTS
AClYlYATE DE Na
TE
ACETONE
ACIDE ACEl'IQUZ
AGIDE BORïQUE
ACIDE CITRIQUE
&'IDE CHLQRYDCXQJJE
ACIDE LtZCTIQLE3
AXOOL ETHyLïQuJZ ABSOLU
II
Il
300
11
1t
703
BENZENE
CHL(jmrfDPJLTE D'HYDROXYLRI:IINE
*TE
CHLOROFOR1m
CHLORUR.~S de ~~U~NGANESE
CHI.OR-WS de MAGXESIU&l
CITR&TE TRISODIQUX dc Bn
D~EFHYL&'IAI~~$YL'URZX SUDEE (VC:ronxl sodé)
TE
DImHYW&LOmLmX (VCronal)
TE:
EAU OXYG23.XZJ3
- 15 -
E.D,T,A. (Idranal)
TE
GLUCOSE (D) &ydre
GLYCEROL
HYDROXYDE de LITHIUM (lithine caustique)
TE
LACTATE de CALCIU&f
TE
NERCUROTHIOLAT'E DE Xa
MS 222 SAND02
PnOSPFrXTE dc Na2
T
II
”
Na
T,
Il
" K2
T
II
" K
T
POLYvINYLPYxRoLIDiz
SAPOI:INE (norkol)
SODIUM AZIDE
SOUDE CAUSTIQUE
SUL3ATE D'AFIOXIUM
TOLUENE
TRISHYDROXY3WIY~ AbIINOl'@X'HAh%
TJREE
III - COLQRANTS
AMIDOSCHTfARTZ (Noir amido)
AZOCARXIN G
Bm DE BRO!~iOPHlXC\\L
BENZIDINE
F'AST BLUE BB
11
Il
RR
NITROSO R SALT
XITRO BLUE DE TETRAZOLIUX @BT)
OIL RXD 0,
0 - DIANISIDII?E!
ROUGE POHCEAU
ROUGE CEROL
VTIIT DE HET-HYIX
_L_ .--- _- ---..-
---
- 76 -
IV - PRODUITS SPECIAUX PGUR BTZYNES
ACIDE LACTIQUE
ACETAZOLAMIDE
ARYIAM (mwine)
IZ
EENZIDINE
(pax) CHLCiRC~,i:IUE1CiJI:Te~~ZOATE
CYANURE de K
DICHLOf~RIITE DEIl , PHEF~YIJ3!GDIAJ~INE
DI-ISOPROPYLFLUOROPHGS9iATE (DIPF)
IZ
D.P.NI,
ESERLNE
IZ
1 1
SALICYLGTE
1t
SULFATE
(alpha) NAPHTYL ACZTATE
sz
11
ACIDE PHOSPITATE
sz
II
BUTY?ii4TE
sz
II
PHOSPHATE 0% Mn.
sz
(béta) NAPHTYL ACETATE
sz
NAPHTYL N. XQ?TFXL CAIBAiinTl2 (Scvine)
IZ
mxmu-1INID~Si:
P.N,S.
V- PRODUITS, DIVERS
-
-
COTON CARDE
COTON HYDROPHïLG
&JJtDES ADHESI~S
E
PATE A XODELER
%