ESTIMATION FLUORIMETRIQUE DE LA
.RIOMASSE PHYTOPLANCTONIQUE.
METHODOLOGIE,COMMENTAIRES ET
ANALYSE BIBLIOGRAPHIQUE.
I? CECCHI
PO C UMENT
SCIENTIFIQU!!
CEHTRE DE R E C H E R C H E S OCiANOGRAPHIQUES DE OAKAR - TIAROYE
kJM!iRO 1 3 4
* IHSTITUT SÉNÉGALAIS DE R E C H E R C H E S AGRICOLES *
DÉCEMBRE 19 9 2

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~~T:~MATl~~~ FLUQRIMETRIQUE D E
HIOMASSE PHYTOPLANCTUNIQUE +
METHODQLOGIElCJOMMENTAIRES
ANALY-SE BIl3LIOGRAPHIQUE.

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=-ESTIMATION FLUORIMETRIQUE DE LA BIOMASSE PHYTOPLANCTONIQUE.
cMETHODOLOGIE, COMMENTAIRES ET ANALYSE BIBLIOGRAPHIQUE.
-_
Par
Philippe CECCHI(*)
RESUME
L’objet de ce document est de présenter, en la commentant et en la justifiant par une ,tnalyse
bibliographique, la méthodologie utilisée pour l’estimation fluorimétrique de la teneur en chlorophylle des
échantillons de phytoplancton récoltés lors de 1’Ctude d’environnement de la Basse ValEe du fleuve Sénégal.
Les résultats pr&entés montrent que la correction des phéopigments par acidification de l’extrait
méthanolique des échantillons est source d’imprécision et d’erreurs, et n’apporte rien 4 la description à
large échelle des variations de la biomasse chlorophyllienne.
Une introduction à l’analyse de la signature spectrale des échantillons fractionnés par taille est
prop&e. Le développement de techniques donnant accès à la structure des peuplements étud%s, en
l’occurrence au travers des concentrations en pigments accessoires, semble souhaitable voire nécessaire. La
caractérisation “ataxinomique” des assemblages permet, dans le cadre d’études à l’échelle des
Ccosystèmcs,
d’accCder à des propriétés éme.rgentes de la communauté phytoplanctonique, en s’allégeant de l’observation
microscopique systématique des échantillons recueillis. De manière routinière, pour un grand nombre
d’échantillons et à large échelle, la description d’un peuplement phytoplanctonique grâce au spectre de taille
et aux caractéristiques spectrales apporte en effet des informations essentielles à l’interprétation des
propriétés métaboliques et démographiques développées par les algues.
Mors cl& : chlorophylle, fluorimétrie, méthodologie, revue bibliographique.
ABSTRACT
This document prcsents the fluorimetric methodology used for the estimation of chlorophyll
biomass during the study of thc cnvironmental conditions and the phytoplankton dynamics in thc Scncgal
River, in confrontation of a literature review. Rcsults show that the acidifïcation of the methanolic
extracts,
which induce mistakes and a loss of sensibility, is to be discarded.
The spectral analysis of size-fractionatçd natural samples is introduced. It appears necessary to
promote thc use of novcl methodology which touch the structure of the phytoplankton assemblages through
their accessory pigments concentrations. For ecosystem studies, such an “ataxinomic” tool would indced
characterize somc global properties of the phytoplankton community, without microscopie observations. Al
thc laboratory and for a grcat number of samples collected at large scale, the six spectrum ami the spectral
characteristics would indccd give valuablc informations for the interpretation of the metabolic and
demographic properties developed by the algae.
Kc~ words : chlorophyll, fluorimetry, methodology, literature review.
(*)
Biofogiste de I’ORSTOM en poste au Centre de Recherches Océanographiques de Dakar-Thiaroye
(CRODT-WA), BP 2241, Dakar (SENEGAL).
adresse actuelle : ORSTOM-HOT, BP 5045,34032, MONTPELLIER, CEDEX 01 (FRANCE).
1

---

Les processus métaboliques des algues (photosynthèse, respiration, . ..) sont
suffisamment redondants pour que l’on puisse considérer qu’un assemblage
phytoplanctonique, en un site donné et à un instant donné, se comporte comme une super-
espece (Talling 1957, Yentsch et Phinney 1985). En particulier, la chlorophylle 3 est un
intermédiaire obligatoire pour le captage et le transfert de l’énergie lumineuse chez
l’ensemble des organismes photosynthétiques qui en possèdent tous une plus ou moins
grande quantité. De fait, dans la zone euphotique, la chlorophylle 3 est généralement le
pigment dominant.*
En ce sens, le dosage de la teneur en chlorophylle a d’un échantillon naturel vise à
une estimation synthétique de la biomasse phytoplanctonique (Vollenweider 1969), et
peut être interprétée comme une propriété émergente (Harris 1986) de cet assemblage
phytoplanctonique, qui intègre les particularités spécifiques des divers élements le
composant.
On considère qu’il y a deux raisons majeures au changement de la signature
pigmentaire d’un assemblage phytoplanctonique :
- une réponse cellulaire aux fluctuations de l’environnement qui se traduit par une
évolution de la quantité et/ou de la qualité des pigments présents. II s’agit là d’une
régulation physiologique, d’ordre phénotypique, qui peut s’exercer à diverses échelles de
temps (périodicité semi-diurne, circadienne, semi-mensuelle, saisonnière . ..)
- une modification de la structure de la communauté phytoplanctonique sous l’effet
de perturbations qui peuvent être de divers ordres. II s’agit alors d’une réponse d’ordre
génotypique qui, le plus souvent, s’exerce suivant une échelle de temps plus étendue que
les adaptations physiologiques et en réponse à des modifications plus drastiques (en
intensité et/ou en fréquence) des caractéristiques de l’environnement.
Dans une logique d’étude d’écosystème, dont le fonctionnement est étudié aux
travers des propriétés émergentes de la communauté phytoplanctonique, la quantification
de la biomasse chlorophyllienne, via l’estimation de la concentration en chlorophylle a,
permet une mesure globale des divers mécanismes mis en oeuvre par le phytoplancton
pour réagir aux fluctuations de son environnement.
--
* Je rrwercie Jeart Pa@s, Jmques Lentoalle et Louis Le Reste pour leur lecture attentive et leurs critiques
constructives.
2

---

des résultats analytiques recueillis lors de l’étude du phytoplancton et des conditions de
milieu dans la Basse Vallée du Fleuve Sénégal a fait l’objet d’une compilation dans une
archive du CRODT (Corbin et Cecchi 1991), tandis que l’analyse de la dynamique
phytoplanctonique dans l’estuaire du fleuve Sénégal a fait l’objet d’une thèse de doctorat
(Cecchi 1992). Nous justifierons donc de la sorte la méthodologie retenue, qui ne prétend en
aucun cas être la plus performante, mais qui nous est apparue la plus apte à une gestion
pertinente des imperfections inévitablement liées à toute méthodologie. Cette note peut en
ce sens être considérée comme un complément mis à jour du document publié par Pagès
en 1981.
Cette note est organisée suivant le plan suivant :
- 1. Filtration
- II. Dosage fluorimétrique
- 11.1. Choix du solvant
- 11.2. Méthodologie fluorimétrique
- 11.2.1. Acidification
- 11.2.2. Mesure des phéopigments
- 11.2.2.1. Phéopigments et broutage
- 11.2.2.2. Des interférences...
- 11.2.2.3. De la chlorophylle b...
- 11.2.2.4. Autres substances
- 11.2.2.5. Equations trichromatiques
- 11.3. Calcul des concentrations
- 11.4. Résultats expérimentaux
- II 1. Quelques précisions méthodologiques
- 111.1. Stockage des échantillons
- 111.2. Pression de filtration
- 111.3. Utilisation de MgC03
- 111.4. Temps d’extraction
- Ill.5 Broyage du filtre
- 111.6. Calibration du fluorimètre
- 111.7. Reproductibilité des mesures effectuées
- IV. Autres méthodes : signature spectrale et spectre de taille...
- Conclusions
Remarque :
4
Les annotations qui figurent sous cette forme sont reliées à !a méthodologie
l
que nous avons utilisée et aux résultats expérimentaux que nous avons obtenus.

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r_- 1. FILTRATION - 1
Le dosage en routine de la concentration en chlorophylle par fluorrmétrie ou
spectrophotométrie nécessite la séparation des organismes de leur environnement liquide.
L’emploi des filtres de verre a été adopté de longue date (Yentsch et Menzel 1963, Holm-
liansen et al. 1965) sans toutefois que la porosité des filtres utilisés ne soit réellement
connue ; Yentsch et Menzel (1963) avaient simplement constaté après divers tests effectués
en laboratoire, que même les plus petites algues (3 à 4 prn) étaient retenues sur les filtres en
fibre de verre (Whatman GF/C ; porosité nominale 1,2 hrn) qu’ils utilisaient.
Vollenweider (1969) a ultérieurement préconisé un usage généralisé des filtres en
fibre de verre en attirant l’attention sur le fait que ce type de filtres semblait plus sélectif que
les membranes filtrantes, en ne retenant que les grosses particules,. Sheldon (1972) a
minimisé cette objection en comparant à l’aide d’un compteur électronique de particules la
capacité de rétention de différents types de matériel. Il a ainsi montré que la taille minimale
de rétention est de l’ordre de 0,7 prn pour les filtres Whatman GF/C en précisant que le
cheminement tortueux des particules à travers la matrice en fibre de verre permet la
rétention de particules encore plus petites. Selon Sheldon (1972), la taille moyenne
minimale des particules retenues n’est comparable à la porosité nominale que Eorsque de
petites quantités d’eau peu chargées sont filtrées. Quand le volume et/ou la charge de
l’échantillon augmente, la taille moyenne de rétention diminue et devient inférieure à la
porosité. Dufour (1972) a d’autre part discuté de l’importance du volume filtré sur la qualité
de l’estimation de la biomasse chlorophyllienne, en montrant que l’augmentation de ce
volume entraîne une diminution (perte ou destruction) des pigments au fur et à mesure que
le volume augmente.
Ceci nous a conduit à standardiser le protocole de collecte des échantillons
lors de la phase d’étude de /‘estuaire avec la filtration systématique (en tout i:eu et
en tout temps) d’un même volume (250 ml) mesuré à j’aide d’une unique bouteille à
DBO.
Selon Yentsch (1983), la quantité de particules chlorophylliennes qui passent à
travers les filtres Whatman GF/C est variable, et semble être fonction auss du type
d’organismes en suspension. II apparaît que la plupart des organismes qui sont retenus
possèdent comme pigments accessoires des caroténoïdes (fucoxanthine et péridinine
essentiellement), alors que les algues qui ne sont pas retenues apparaissent plutôt riches en
phycobillines (phycoérythrine et phycocyanine). II s’agit de fait principalement de diatomées
4

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et de dinoflagellés qui resteront piégés sur le filtre, alors que les microfliagellés et
cyanophycées unicellulaires ne sont que peu retenus. Cynar et al. (1985) ont de la même
façon montré que le nanoplancton n’est pas intégralement retenu par les filtres Whatman
GF/F de porosité 0,4-0,6 hrn, et donc a fortiori par les filtres type GF/C.
Dans la Basse Vallée du Fleuve Sénégal, les diatomées et les ciinoflagelk5s
constituent la base principale des diagnostiques établis
à partir des numérations.
Les informations recueillies au travers des comptages seront donc comparables
aux estimations de la biomasse des peuplements via Je dosage de la chlorophylle a.
La porosité des filtres utilisés constitue un paramètre important pour la mesure de la
biomasse chlorophyllienne d’échantillons naturels, surtout depuis que l’abondance du
picoplancton a été mise en évidence (Jonhson et Sieburth 1979, Stockner 1988).
Jusqu’alors, la fluorescence du filtrat était en effet connue sous le nom de “fluorescence
soluble” (voir par ex. Herbland 1978), et elle ne fut associée que plus tard à des cellules
phytoplanctoniques ayant transité à travers le filtre (Yentsch 1983, Keller 1987). La part de
“fluorescence soluble” directement imputable à des cellules intactes et viables semble varier
de 2 à 78% (moyenne de 17%) selon des essais effectués sur des échantillons provenant de
mésocosmes d’eaux estuariennes ou douces (Keller et al. 1990), et les algues qui en sont
responsables peuvent constituer jusqu’à 10% de la biomasse chlorophyllienne totale en
région côtière (Yentsch 1983).
Taguchi et Laws (1988) ont montré que la fluorescence de filtrats recueillis après
passage sur Whatman GF/F (et donc a fortiori sur GF/C) est attribuable à des
cyanophycées, des bactéries et au picoplancton. Li (1990) a d’autre part observé un
assemblage mixte d’ultraphytoplancton marin viable dans des filtrats obtenus à l’aide de
différents types de filtres (dont Whatman). Stockner et al. (1990) ont par ailleurs montré, et
illustré à l’aide de photographies prises au microscope électronique à balayage, que
même
de “grosses” cellules (en l’occurrence des diatomées des genres Cyclotella, Skeletonema,
Rhizosolenia et Coscinodiscus) sont susceptibles de passer au travers des filtres. Ces
aute:Jrs précisent toutefois que pour un même échantillon, la quantité de phytoplancton qui
n’est pas retenue reste sensiblement équivalente d’un répliquat à l’autre.
Yentsch et Phinney (1985) ont proposé une voie pour s’affranchir des biais lies à la
non-rétention d’une fraction du peuplement, particulièrement dans les zones réputées très
oligotrophes (chlo. < 1 pg.l-’ ; fréquemment dominées par des algues de petite taille), en

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travaillant directement sur des échantillons naturels de faible volume non filtrés auxquels le
solvant extractant est directement rajouté.
Cette non-rétention lors de la filtration d’une fraction du peuplement
phytoplanctonique pose toutefois divers problèmes :
- quant à la qualité de l’eau de mer “stérile” utilisée dans la préparation des réactifs
nécessaires aux dosages physico-chimiques et à la dilution des échantillons à analyser. Un
autoclavage systématique de cette eau de mer paraît nécessaire de manière à éviter tout
risque (Li 1990).
- quant à l’étude du phytoplancton et de son environnement hydrobioclimatrque dans
des régions réputées oligotrophes. Les mesures de C, N, P particulaires, MES,
chlorophylle, .I. sont sous-estimées alors qu’à l’inverse les concentrations en éléments
dissous sont sur-estimées du fait de la présence possible dans le filtrat de femto,- (0,02-0,2
prn) et de picoplancton (0,2-2 hrn) (Li et al. 1983, Stockner et al. 1990). Phinney et Yentsch
(1985) ont ainsi fourni des données qui illustrent de manière évidente l’inadéquation des
filtres en fibre de verre pour l’estimation de la biomasse chlorophyllienne lorsque les
concentrations en chlorophylle sont faibles. Ces auteurs proposent une valeur limite de 1
pg.1.1 en deçà de laquelle les filtres en fibre de verre ne doivent plus être utilisés.
- quant à l’étude fractionnée des différentes classes de taille d’un peuplement
puisqu’il semble que ni les filtres Whatman, ni la plupart des membranes filtrantes ne
donnent de résultats totalement satisfaisants. Li et al. (1983) rapportent cependant qu’une
filtration terminale effectuée sur Whatman GF/F (porosité nominale de 0,7 Pr-n) CU sur
membrane filtrante Nuclepore 0,2 prn donne des résultats comparables. De fait, il est admis
que pour un même échantillon, la quantité de chlorophylle dosée après filtration sdr filtre de
verre est toujours supérieure ou égale à la quantité dosée après filtration sur membrane
filtrante (Long et Cooke 1971; Holm-Hansen et Riemann 1978). Seules plusieurs filtrations
consécutives semblent pouvoir conduire à un fractionnement efficace d’échantillons naturels
(Taguchi et Laws 1988).
Il est à noter enfin que le choix du modèle de filtre en fibre de verre à adopter est
tributaire du type de peuplement que l’on s’attend à échantillonner. Prepas et al. (,l988) ont
en effet montre que les différences observées sur les concentrations en chlorophylle a
obtenues à partir d’échantillons filtrés sur Whatman GF/F et GF/C sont le plus setivent
insignifiantes. Ces auteurs ont étudié de manière comparative des échantillons provenant de
la zone euphotique de 28 lacs mésotrophes à hypereutrophes (chlorophylle variant ce 2 à
6

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175 ,!@V1). Leur étude a révélé qu’en l’absence d‘un picoplancton abondant, la différence
de porosité entre ces deux modèles est trop faible, et les tailles moyennes minimales de
rétention trop voisines, pour que les différences observées sur l’estimation de la biomasse
chlorophyllienne soient importantes, compte tenu de la capacité de rétention relativement
variable (Sheldon 1972) de ce type de matériel.
Nous avons comparé à l’occasion d’une série de prélèvements (16
échantillons, voir tableau A,. 1) la rétention des filtres Whatman GF/C et GF/F. La
figure AZ. 1 représente la régression de l’estimation de la teneur en chlorophylle
(non corrigée des phéopigments) obtenue après filtration sur GF/F en fonction de
fa teneur obtenue à l’aide des filtres GF/C.
II en ressort que, systématiquement, la teneur en chlorophylle est sous-
estimée quand les filtrations sont effectuées à /‘aide de GF/F. Un test de
comparaison sur ta pente observée (aobs =0,817) montre en effet que /‘hypothèse
nulle Ho: aobs ‘atheo = 7 (figurée en tiret) ne peut être acceptée (p-O,p5 ;
t = 9,429), ce qui sous-entend que les teneurs évaluées consécutivement aux deux
filtrations ne sont pas équivalentes, et donc, que la capacité de rétention diffère
pour ces deux types de filtres : les filtres de moindre porosité {GF/C) apparaissant
les plus efficaces.
La reproductibilité des estimations de la teneur en chlorophylle a par ailleurs
été estimée pour chacune des séries de filtration à l’aide d’une méthode détaillée
par Lemoalle (1973). La reproductibilité est évaluée par l’écart type ‘Y sur les
valeurs de chlorophylle calculées pour chaque doublet. On définit l’intervalle de
confiance sur chaque estimation à partir des écarts entre x) et x’~, les valeurs d’un
même doublet Y, tel que, pour k échantillons :
C(X’j - X”i)2
s=
2k
!
j et le résultat vrai s’exprime alors selon :
~
(x; + x5)
xi =
-+
;
2
On obtient (voir tab. A2. 7) :
- pour GF/C : Xi ZI 0,99,
- pour GF/F : Xi 2 0,78.
7

---

-_--- - ..-.-.
--.
-----.
GF/C
GF/F
- - -
-1--1
X’j
?C”i
Ximoy
X’iX’>
X”i
Ximoy
X’jX”j
5.60 5.91
5.76
0.31
4.42
4.44 0.04
2.14 2.27
2.21
0.13
1.83
1.76 0.15
1 9 . 0 3 1 9 . 4 2
19.23
0.39
15.80
15.42 0.76
6.97 5.95
6.46
1.02
3.95
5.27 2.63
2.72 2‘19
2.46
0.53
2.08
-
2.08 0
2.85
-
2.85
0
2.78
2.85 0.13
2.27 2.08
2.18
6.19
2.08
1.84 0.49
4.31 4.07
4.19
0.24
3.13
3.33 0.39
3.13 2.97
3.05
0.16
2.27
2.29 0.04
3.79 3.56
3.68
0.23
2.24
2.26 0.04
10.13 8.83
9.48
1.30
7.98
8.04 0.12
6.73 8.60
7.67
1.87
5.54
5.54 0
6.22 8.32
7.27
2.10
5.54
5.91 0.74
7.41 6.56
6.99
0.85
5.60
5.49 0.23
a.71 10.47
9.59
1.76
8.77
8.26 1.02
1 4 . 4 7 1 5 . 2 3
14.85
0.76
11.99
12.28 0.57
_-_---_
-
----~-_
2 =15.75
c - 9 . 9 1
s =0.70
S = 0.56
-_--.
- - -
Ximoy
2 0.99
Ximoy v 0.78
_.- - - - - -.-
---.-.
Tab. A-. 1: Comparaison de la reproductibilité des estimations fkrorimétriques de la
biomasse chlorophyllienne (non corrigée) suivant le modèle de filtre (Whatman) utilisé.
n - 1 6
a=0,a1-l
b = - 0 , 0 6 9
Fia. AV.1 : Comparaison des
biomasses @g.I-1) estimées après
filtrations sur Whatman GF/F et
GF/C. (~a diagonale - en poinri/illés -
figure la ligne des kovaleurs que l’on
obtiendrait si les rétentions étarent
identiques avec les deux types de
filtres.)
l3
4
8
1 2
1 6
28
CHLCI <GF/C)
8

---

Bien 9ue /‘effectif de l’échantillon utilisé pour cette comparaison soit petit, ii
apparaît :
,~ d’une part, 9ue la rétention est meilleure lorsque sont utilisés des filtres de
type GF/C dont la porosité nominale est pourtant iégèrement plus faible que celle
des fiitres GF/F,
“I d’autre part, que la qualité de la filtration est altérée par une moindre
reproductibiiité des résultats lorsque sont utilisés les filtres GF/C.
Nous interprétons ce double résultat suivant les remarques de Sheidon (‘1972)
qui précise que la capacité de rétention des filtres de ce type est principalement
liée à la texture de la matrice en fibre de verre dont les “mailles” sont plus serrées
pour GF/F que pour GF/C. ii semble donc paradoxalement que le colmatage de la
matrice des filtres GF/C soit plus rapide que celui qui intervient lors de i’utiiisation
des GF/F, augmentant ainsi la capacité de rétention. Lors de ces essais, un soin
attentif a été apporté aux pressions de filtration exercées (1/2 atm. au maximum), et
ce quel que soit le type de filtres uitiiisés. Cette augmentation de la rétention
semble toutefois se faire au détriment de la reproductibiiité de la mesure, ce que
/‘on peut attribuer au fait que le colmatage ne se fait pas toujours de la même
manière. Ce résultat demeure paradoxal et sans explication précise.
Le choix des filtres en fibre de verre Whatman GF/C réside donc en une série de
compromis tant logistiques que méthodologiques :
1. recommandations bibliographiques :
Ce matériel est en effet recommandé (Golterman et al. 1978, Marker et al. 1980) pour
diverses raisons :
- la filtration est rapide,
- ces filtres sont insolubles dans les solvants organiques ce qui élimine les problèmes de
turbidité, notamment pour la spectrophotométrie,
- le ,filtre constitue lui-même un abrasif qui aidera au broyage si besoin.
2. Nécessité d’une porosité unique pour l’étude fractionnée des échanrillons
recueillis : fraction particulaire (chlorophylle, MES) et fraction dissoute (sels nutritifs, CGD).

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Sur le terrain, ceci s’est traduit par une “optimisation” de la manipulation de
collecte des échantillons avec trois filtrations successives (par prélèvement) en
utilisant le même type de filtres (Whatman GF/C) :
filtration
objet
filtra t
1
chlo.
rinçage du matériel de filtration
2
chlo.
rinçage des flacons de stockage
3
MES
stockage de l’eau à analyser
L’utilisation de ce type de filtres a en outre l’avantage de produire des résultats
comparables aux résultats obtenus avec du matériel identique lors d’autres études,
comme
ce fut le cas notamment en Casamance (Pagès 1988).
L’utilisation préférentielle du modèle GF/C peut également se justifier par l’économie
substantielle réalisée (voir Prepas et al. 1988) du fait de son moindre coût (le modèle
GF/C
est environ deux fois moins cher que le modèle GF/F) lorsque les études réalisées
nécessitent un grand nombre de filtrations.
Influence de la préfiltration des échantillons
II est fréquemment fait mention dans la littérature d’une préfiltration des échantillons
sur maille fine pour écarter le zooplancton et autres particules de grosses tailles.
Nous avons à l’occasion d’un suivi de l’évolution journalière des principaux
facteurs de l’environnement, testé l’effet d’une préfiltration des échantillons à (‘aide
d’une maille à bluter de 80 prn de porosité. Des duplicats ont donc été filtres sur
Whatman GF/C avec ou sans préfiltration sur 80 prn, (tab. A2.2).
La figure AZ.2 rend compte des estimations des teneurs en chlorophylle (non
Corrig&e des phéopigments) obtenues après préfiltration en fonction des teneurs
obtenues sans préfiltration.
1 0

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Bien que le nombre de couples de valeurs soit faible (n = 78), et que cet essai
ne concerne qu’un seul sîte (amont immédiat du barrage de Diama), et une seule
date (06-04-19881, les résultats obtenus nous ont amené à abandonner
systématiquement la préfiltration des échantillons.
En effet, /es résultats obtenus (fig. A2.2) montrent qu’il existe une relation très
hautement significative entre /es estimations obtenues avec ou sans préfiltration,
telle que
Chlo (préfiltrée) = 0,236 t 0,719 Chlo (non préfiltrée).
R2 = 96,6%, Fratio =451,1.
Régression forcée par le couple (0,O).
L’ordonnée à /‘origine est significativement non différente de /a valeur
attendue b = 0 (p = 0,12 l), et il apparaît que la préfiltration des échantillons profloque
une sous estimation systématique moyenne de 28% sur E’estimatior~ de /a biomasse
chlorophyllienne retenue sur le filtre GF/C.
Ces résultats, n’onobstant les réserves liées à /a localisation spatio-
temporelle unique et au faible effectif des échantillons considérés, nous ont amené
à ne pas effectuer de préfiltration systématique sur mai//e fine des préJ&vements
destinés à /‘estimation de /a biomasse phytoplanctonique.
L’écart sur /‘estimation des biomasses n’apparaît /ié (résultats non figurks) :
- ni à la biomasse présente estimée sans filtration préalable,
- ni à /‘écart entre les volumes filtrés lors de la filtration des répliquats,
- ni à la profondeur d’origine des échantillons.
II est probable que les causes de /‘écart observé sont liées :
- d’une part, à un artefact méthodologique qui a trait à la rétention
systématique d’une fraction du volume de /‘échantillon sur /a mai//e à bluter,
- d’autre part, à /a rétention préférentielle par /a maille à bluter des ce//w/es de
grosses tailles qui, bien que rares, contribuent fortement à la teneur en pigment
des échantillons (Harris et a/. 1987). Nous n’avons pas collecté d’échantillons pour
/a caractérisation du peuplement phytoplanctonique /ors de ce suivi, mars les
11

---

résultats obtenus par ailleurs ont montré que les peuplements du lac de retenue
sont constitués principalement de cvptophycées de taille moyenne (environ 30 prn
de longueur) et de cyanophycées filamenteuses (Oscillatoria sps) libres ou en
amas. Ces dernières sont tout à fait susceptibles d’être retenues lors de la
préfiltration et d’induire la sous estimation ici décrite.
_-_---
CHLOROPHYLLE (pg.l-‘)
- - - - -
préfiltrée non préfiltrée
0,oo
0,oo
2,54
2,96
2,98
4,33
2,60
3,05
3,26
3,80
2,77
3,66
2,72
3,52
3,14
4,42
3,67
4,6l
2,98
3,78
2,54
3,59
4,02
5,02
5,06
6,77
3,08
4,09
2,37
2,86
4,7l
6,32
4,75
6,19
e
1
2
3
4
6
6
‘7
8
2,71
2,86
---
-I
C h l o <mg/m3> n o n pçefiltre
Lad42 EGomasses @g-l-‘)
Fia. Az.2: comparaison des
avec ou sans préfiltration
biomasses obtenues avec
sur maille à bluter 80 prn.
ou sans préfiltration.
_--_-~-
-~
II. DOSAGE FLUORIMETRIQUE...
-_-_---- .
.~
La procédure analytique utilisée classiquement pour le dosage in-vitro de la
concentration en pigments est basée sur l’extraction de ces pigments par NI solvant
organique, puis sur la détermination de l’absorption (spectrophotométrie) ou dc la
fluorescence (fluorimétrie) de l’extrait.
Depuis Yentsch et Menzel (1963) et Holm-Hansen et al. (1965), les techniques axées
sur la fluorescence d’extraits naturels sont plus utilisées que la spectrophotométr:e
du fait de
12

---

leur plus grande sensibilité (avec un gain de sensibilité de 50 à 100 fois selon Holm-Hansen
et al. 1965). Cette méthode est ainsi particulièrement adaptée lorsque les estimations
portent sur de faibles biomasses (Golterman et al. 1978).
11.1. Choix du solvant
L’extraction par l’acétone a longtemps été retenue comme la méthode 13 plus
performante (UNESCO/SCOR 1966, Strickland et Parsons 1968), sur la base notamment de
connaissances assez précises des propriétés chimiques des chlorophylles dans ce
salvant.
L’extraction à l’aide de solvants alcoolisés a cependant aussi été utilisée de longue date,
notamment par les physiologistes, du fait d’une plus grande vitesse et de meilleures
performances d’extraction des pigments pour la plupart des chlorophycées et
cyanophycées (Marker 1972, tab. 1 in Wood 1985). L’utilisation du méthanol est toutefois
longtemps demeurée limitée pour plusieurs raisons, notamment :
” suspicion à propos de la stabilité des chlorophylles ainsi extraites,
” augmentation du risque d’apparition de produits altérés (notamment de dérivés de la
chlorophylle contenant des groupements -méthyl),
” interférence accrue de la chlorophylle b lors de la détermination de la chlorophylle a :
Riemann (1978) a ainsi montré que le pic d’absorption de la chlorophylle b passe de 642 nm
dans l’acétone à 652 nm dans le méthanol. Ce déplacement peut donc entraîner une
interférence accrue de la chlorophylle b sur l’estimation spectrophotométrique de la
concentration en chlorophylle a dont le pic d’absorption se trouve à 665 nm.
Bien que la fluorescence par unité de chlorophylle soit plus faible avec le méthanol
qu’avec l’acétone (Holm-Hansen et Riemann 1978), ce qui entraîne une moins Donne
sensibilité, le méthanol est particulièrement recommandé (UNESCO 1966, Golterman et
al.
1978, Riemann et al. 1980) lorsque les peuplements étudiés sont constitues de
chlorophycées et de cyanophycées. Wood (1985) reconnait toutefois qu’il n’existe aucun
solvant universel, et que même les pigments des diatomées ne sont pas complètement
extraits par les solvants classiques (acétone à 90%, méthanol).
Bien que d’autres solvants aient été proposés dans l’objectif d’accrôitre l’efficacité de
l’extraction (éthanol (M. Ostrofsky jr~ Bergman et Peters 1980), mélange métnanol-
13

---

chloroforme (Wood 1985), mélange acétone-diméthylsulfoxyde (Shoaf et Lium 1970), par
exemple), le choix du méthanol se justifie :
- du fait de l’abondante littérature signalant ses mérites, notamment en regard de la
forte représentation des chlore- et cyanophycées dans la flore des eaux continentales
sahelo-soudaniennes (Iltis 1980),
- du fait d’autre part qu’il existe des valeurs des coefficients d’absorption spécifiques
disponibles dans la littérature qui n’existent pas forcément pour d’autres solvants.
Dilution du solvant
L’équipe PIRAL (Herbland et al., Comm. pers.) a estimé que, suivant son protocole
opératoire (filtres GF/F de 25 mm de diamètre), la quantité d’eau résiduelle présente dans le
filtre après la filtration est de l’ordre de O,l5 ml.
Ceci les a conduit à utiliser du méthanol à 97-98% lors du calibrage du fluorimètre
alors que les échantillons sont extraits avec du méthanol à 95%.
Riemann (1980) a de plus proposé de maintenir inférieure à 5% la quantité d’eau
dans le solvant pour limiter le déplacement du noyau -phytyl de la chlorophylle e:, de la
phéophytine et éviter ainsi la formation de nouveaux dérivés non pris en compte
ultérieurement dans la détermination fluorimétrique.
f ‘ensemble des extractions effectuées sur les échantillons d’origine naturelle
que nous avons récoltés à été fait à l’aide de méthanol à 95% (de diverses
origines), suivant les recommandations de l’équipe PIRAL (Herbland et a/., comm.
pers.).
Il semble toutefois d’après une figure de Shertz et Merz (1928) reproduite dans
Phinney et Yentsch (1985) que l’efficacité de l’extraction par le méthanol soit
considérablement diminuée lorsque ce solvant est dilué, puisque cette figure fait apparaître
une réduction de l’ordre de 50% dans l’efficacité de l’extraction de la chlorophylle d’ortie
blawhe avec du méthanol à 95% par rapport au méthanol absolu. La question de la
concentration optimale à utliser reste posée : la prise en compte de la fraction d’eau
résiduelle piégée dans le filtre impose une légère dilution du méthanol utilisé pour les
calibrations, tandis que la dilution du méthanol utilisé pour les extractions des échantillons
naturels ne semble pas se justifier.
14

---

11.2. Méthodologie fluorimétrique
L’intérGt de la quantification de la biomasse du phytopiancton au moyen de la
mesure de la fluorescence d’un extrait naturel dans un solvant organique réside
principalement dans son faible coût, sa facilité de mise en oeuvre et son appreciable
sensibilité.
La technique fluorimétrique originale a été développée en n’utilisant qu’un seul jeu de
filtres optiques, et en supposant que les seules entités extraites sont la chlorophylle a et la
phéophytine a. Les déterminations fluorimétriques (Hoim-Hansen et ai. 1965, Loftus et
Carpenter 1971) requièrent ainsi un traitement acide de l’extrait pour la détermination des
concentrations en chlorophylle eJ phéopigments a.
La séparation chromatographique des pigments photosynthétiques montre toutefois
qu’il peut exister :
- d’une part, une variété d’autres dérivés plus ou moins connus de la chlorophylle a
dont les plus importants sont les chlorophyilides et phaeophorbides 3 qui possèdent une
signature spectrale très proche respectivement de celles de fa chlorophylle a et de la
phéophytine a dans des extraits bruts. Pour Yentsch et Menzel (‘1963), Se terme
“phéophytine” recouvrait l’ensemble de ces produits de dégradation de la chlorophylle
a, et
dans les équations classiques (Strickland et Parsons, 1968), ces produits sont inclus dans la
détermination de la phéophytine a.
- d’autre part, une variété d’autres pigments dont l’abondance dépend de la
composition taxinomique de l’échantillon, de Sa pression de prédation, de l’âge et de l’état
physiologique des cellules et de leur capacité physiologique spécifique à modifier la
composition de leur structure pigmentaire pour s’adapter aux fluctuations des
caractéristiques de leur environnement (ressource en nutriments, régime lumineux, etc).
11.2.1. Acidification
L’acidification s’accompagne de nombreux changements chimiques au sein de
l’extrait chlorophyllien qui dépendent :
I de la nature des pigments,
- du solvant,
15

---

_ de la nature et de la quantité d’acide ajoutée,
- de la durée de la réaction.
Holm-Hansen et al. (1965) notaient que ni la quantité ni la concentration de l’acide
ajouté n’apparaissent très critiques.
L’acidification s’accompagne cependant de
modifications des caractéristiques spectrales de l’extrait dues notamment à la formation de
dérivés monocationiques et di-cationiques de la phéophytine. Le contr&e de la
concentration de /‘extrait acidifié est en ce sens essentiel pour éviter la formation de ces
dérivés di-cationiques (Marker et al. 1980).
Ces auteurs ont ainsi préconisé de maintenir la concentration finale de
l’extrait < 3.10-3 M, tout en signalant que même dans ce cas, ces dérivés ne sont pas
totalement absents. La conversion de la chlorophylle a vers la phéophytine 3 doit d’autre
part se faire rapidement, et ces auteurs recommandent une lecture après un temps de
réaction de l’ordre de 3 minutes, suffisant pour que la lecture soit stable. Les dérives de
fluorescence observées après acidification par Herbland (Comm. pers.) ont été attribuées à
la présence de chlorophylle Q dont la transformation en phéophytine Q semble se faire
suivant une cinétique moins rapide que la transformation de la chlorophylle a en
phéophytine a.
Marker et al. (1980) ont d’autre part précisé qu’après acidification, la neutralisation
par MgC03 de t’extrait méthanolique ne se justifie pas.
11.2.2. Mesure des phéopigments
En milieu naturel, la dégradation des chlorophylles en phéopigments résulte
principalement du broutage des algues par le zooplancton. A ce titre, la teneur en
pheopigments a fréquemment été corrélée à la pression de prédation qu‘exerce le
zooplancton sur le phytoplancton.
11.2.2.1. Phéopigments et broutage
16

---

En marge des problèmes méthodologiques relatifs à la détermination de la
chlorophylle et des phéopigments par fluorimétrie, se pose le problème de la signification du
dosage des phéopigments.
La dégradation des pigments chlorophylliens en matières non fluorescentes après
leur passage dans le tractus digestif des prédateurs est un fait classique (Mouretatos 1989).
Conover et al. (1986) et Lopez et al. (1988) ont ainsi clairement montré que les pigments
chlorophylliens peuvent être convertis, après leur ingestion, en molécules qui ne sent pas
détectables par fluorimétrie.
Penry et Frost (1991) ont par ailleurs montré que la dégradation de la chlorophylle a
par le broutage et la digestion varie quantitativement en fonction de conditions
expérimentales (biomasse de phytoplancton) et physiologiques (adaptation de fa stratégie
digestive des prédateurs à l’abondance de leurs proies). Pour ces auteurs, la comparaison
de la teneur en chlorophylle a et en produits dégradés (phéopigments a) ne peut être utilisée
qu’au titre d’indicateur qualitatif de I’inaestion du phytoplancton par le zooplancton.
11.2.2.2. Des interférences dans la détermination des phéopigments . . .
Outre les problèmes liés à la représentativité des phéopigments en relation avec le
broutage, leur détermination est inféodée aux interférences que peut entraîner la presence
d’autres pigments dans l’extrait étudié au moment de la mesure.
Hurley et Watras (1991) ont ainsi montré en comparant les resultats obtenus
classiquement par spectrophotométrie (méthode de Lorenzen 1967) avant et après
acidification et par extraction différentielle des divers pigments par chromatographie qu’il
peut exister de sérieuses interférences entre les phéopigments ainsi mesurés et la
bactériochlorophylle d qui peut se trouver en abondance dans les couches anoxiqties de
certains lacs stratifiés. En ré-interprétant
d’anciennes données obtenues par
spectrophotométrie, ils ont montré que les couches profondes de sedimentation du
phytoplancton ou d’accumulation de produits d’excrétion du zooplancton sont en fait
constituées de bactéries phototrophes.
Ces observations montrent - dans ce cas très particulier (lac profond stratifie) que
nous n’avons pas rencontré lors de notre étude - que l’approche traditionnelle dars des
systkmes naturels peut tendre à des interprétations erronées tant dans la répartition du
phytoplancton que dans les processus impliqués dans le contrôle de cette répartition.
17

---

11.2.2.3. De la Chlorophylle b . . .
De manière beaucoup plus courante, il est admis désormais que la détermination de
la chlorophylle 3 et des phéopigments a peut $tre fortement perturbée par la presence de
chlorophylle b. Selon Holm-Hansen et Riemann (1978), quand la concentration en
chlorophylle tu est très inférieure à la concentration en chlorophylle a, les interférences sont
mineures et peuvent être négligées. Toutefois, quand le rapport chl.b/chl.a devient :> 0,4 la
quantité de phéopigments est alors sur-estimée. Selon I’UNESCO (1980) et Lorenzen
(1981), la concentration en chlorophylle b peut effectivement fausser I”estimation
fluorrmétrique de la teneur en phéopigments car elle est partiellement prise en compte dans
le calcul de leur concentration.
Seules des teneurs particulièrement élevées en chlorophylle tu semblent influencer la
détermination de la concentration en chlorophylle 8, avec une surestimation pouvant
atteindre 30% (Lorenzen 1981). Riemann (1978) estime quant à lui que lorsque la
chlorophylle b intervient pour 10 à 20% de la chlorophylle totale, la surestimation sur la
concentration en chlorophylle a ne varie qu’entre 4 et 9%. Aussi, Marker et ai. (1980) ont-ils
proposé d’ignorer l’interférence liée à la présence de chlorophylle b dans le cas de l’étude
de la plupart des populations naturelles.
Les biais méthodologiques liés à la présence de chlorophylle b dans les populations
phytoplanctoniques naturelles affectent principalement la détermination de la ‘teneur en
phéopigments. Neveux et De Billy (1986) ont comparé les résultats obtenus par fluorimétrie
et par spectrofluorométrie sur des profils verticaux effectués dans l’Océan indien. Ils ont
montré que le maximum profond de phéopigments obtenu par l’analyse fluorimétrique
classique n’est pas retrouvé lorsque les échantillons sont étudiés en spectrofluorimétrie, et,
en particulier, que ce pic correspond en réalité à un maximum de chloIrophylle b, Ces
auteurs estiment que la surestimation sur la concentration des phéopigments peut alors
atteindre 300%.
Vernet et Lorenzen (1987) ont comparé les résultats du dosage des chlorophyiles 3,
b et c et de leurs produits de dégradation par fluorimétrie et HPLC. Ils citent plusieurs
références qui évoquent la surestimation des teneurs en phéopigments avec un orore de
grandeur qui varie de 1 ,O à 2,5 fois la concentration en chlorophylle b. Selon ces auteurs, la
surestimation est liée à une diminution du rapport de fluorescence avant et après
acidification de l’extrait qui est proportionnelle à la concentration en chlorophylle tu quand la
somme (chlo a + chlo b) reste constante. Cet effet peut être particulièrement important pour
18

---

le phytoplancton tropical et équatorial pour lequel, selon ces auteurs, le rapport (chlo b/chlo
a) peut atteindre 0,55. Ces auteurs insistent toutefois sur la variabilité de l’interférence
causée par la chlorophylle b. En particulier, ils montrent que la surestimation de la teneur en
phéopigments n’est pas constante, ce qui implique la nécessité d‘estimer en chaque
situation la concentration en chlorophylle b (par HPLC par exemple) et d’appliquer les
corrections ad-hoc si l’on veut calculer la concentration en phéopigments.
Ce type d’interférences peut devenir particulièrement important lors de l’étude des
peuplements continentaux tropicaux, du fait de la représentation souvent elevbe des
chlorophycées, euglénophycées et prasinophycées (riches en chlorophylle tjJ dans ces
milieux (Iltis 1980). De la même façon, l’existence d’un picoplancton phototrophe inféodé
aux horizons profonds de la zone euphotique de î’océan tropical et équatorial (Herbland et
al. 1985) rend obsolète la technique fluorimétrique classique. En effet, apres acidification, la
bande d’émission de la fluorescence des phéopigments b se superpose à celie des
phéopigments a et conduit à une forte surestimation (Marker et al. 1980). Dans de teiles
circonstances, ces auteurs préconisent l’usage de techniques spectrophotométriyues. Si de
plus l’estimation précise des diverses fractions pigmentaires est souhaitée, seule la
chromatographie (HPLC) permet une approche détaillée des proportions relatives des divers
constituants en présence (UNESCO 1980, Hurley et Watras 1991).
Selon Neveux et De Billy (1986)’ le ratio (chlo b/chlo a) varie dans les popuations
naturelles suivant différents facteurs liés :
- au nombre de cellules qui appartiennent à des taxons riches en chlorophylle b
(chlore-, eugléno- et prasinophycées),
- à l’évolution de ce rapport au sein de chacune des cellules phytoplanctoniques qui
constituent le peuplement sous l’effet d’une adaptation à un régime lumineux peu intense
et/ou aux caractéristiques spectrales particulières (eaux profondes ou particulièrement
turbrdes),
_ à l’augmentation du nombre de cellules physiologiquement faibles et!ou à
l’abondance des détritus (tripton enrichi en chlorophylle) dans les échantillons.
11.2.2.4. Autres substances que la chlorophylle b...
Outre la chlorophylle b, d’autres matières sont susceptibles d’influer la détermination
fluorimétrique des teneurs en chlorophylle et phéopigment a.
19

---

Holm-Hansen et al. (1965) et Lot?us et Carpenter (1971) ont ainsi discuté la présence
de chlorophylle c dans les échantillons et montré que son influence es,t négligeable, eu
égard à la faible représentation de ce pigment dans des échantillons d’origine naturelle.
Marker et al. (1980), puis Vernet et Lorenzen (1987) ont confirmé ces observations en
recommandant d’ignorer l’existence de ce pigment lors du calcul des concentrations.
Par ailleurs, I’UNESCO (1980) reconnait que les caroténoïdes n’ont pas d’effet sur la
fluorescence des extraits et n’interférent donc pas sur la détermination des teneurs en
chlorophylle et phéopigments 3.
Carlson et Shapiro (1981) ont quant à eux discuté l’influence des substances
humiques dissoutes sur les lectures fluorimétriques d’estimation de la biomasse.
ik oit ainsi
constaté l’existence de biais significatifs lors de l’estimation des phaeopigments, et ont
préconisé l’usage pour les estimations de biomasse du phytoplancton de la &lorophvlle
totale i.e. non corriaée des phéopigments et des autres pigments. En effet, les
comparaisons faites par ces auteurs (fluorimétrie classique versus fluorimétrie in-vive} ont
montré que la chlorophylle totale est nettement mieux corrélée que la chlorophylle corrigée
aux estimations in-vivo de la biomasse phytoplanctonique. Phinney et Yentsch (1985) ont
aussi évoque l’existence de substances dissoutes diverses qui peuvent affecter la
fluorescence d’extraits bruts, particulièrement dans les eaux douces, et affecter de la sorte la
qualité de l’estimation de la biomasse.
11.2.2.5. Equations trichromatiques
L’utilisation d’équations “empiriques” dites trichromatiques a étB développée en
fluorimétrie par Loftus et Carpenter (1971) pour répondre aux problèmes des interférences.
L.es résultats obtenus paraissent satisfaisants tant que le phytoplancton est en bonne santé
i.e. tant que les concentrations en pigments annexes et produits de dégradation de la
chlorophylle 3 demeurent en faible quantité (Sakshaug 1980).
Nous nous sommes toutefois rangés à l’avis de Marker et al. (1980) qui ne
préconisent pas l’utilisation de ces équations du fait que, naturellement, il est rare que les
concentrations en chlorophylle b et c soient suffisamment élevées pour significativement
affecter la détermination de la concentration en chlorophylle a.
Lorsque la concentration en chlorophylle totale (sans correction) est peu difiérente
de la concentration en chlorophylle a estimée à partir des équations trichromatiques, ces
auteurs en déduisent que les interférences générées par la présence des c:hlorophylles b et
20

---

G deviennent négligeables, et que les corrections ne sont pas nécessaires. Ces auteurs en
déduisent que dans la majorité des situations, l’utilisation d’équations monochromatiques
est suffisante.
11.3. Calcul des concentrations en fluorimétrie
Dans les équations classiques, le terme “phéophytine” recouvre en fait l’ensemble
des produits de décomposition de la chlorophylle a i.e. les phaeophorbides a une variété
d’autres composés plus ou moins connus (Yentsch et Menzel 1963). Selon Holm-Hansen et
ai. (1965), une grande fraction de la phéophytine ainsi définie est attribuable au broutage par
le zooplancton, ce qui se justifie par la conversion stoechiométrique des molécules de
chlorophylle en phaeophorbides avec une efficacité voisine de 100% (Shuman et Lorenzen
1975). De fait, de très nombreux auteurs ont considéré sur ces bases que les phéopigments
(les phaeophorbides) sont quantitativement représentatifs de la pression de prédation
qu’exerce le zooplancton (voir par ex. Welschmeyer et al. 1984, Welschmeyer et Lorenzen
1985, Carpenter et al. 1986, Leavitt et al. 1989, Leavitt et Carpenter 1990).
En fait, Conover et al. (1986) ont montré que les formulations mathématiques
utilisées classiquement à partir des lectures de fluorescence (Strickland et Parsons 1968,
Golterman et al. 1978) doivent être corrigées d’un facteur faisant intervenir le rapport des
poids moléculaires des phéopigments et de la chlorophylle a. Conover et al. (1986) ont en
effet montré que l’expression classique fournit pour les phéopigments un résultat exprimé
en “équivalent chlorophylle”, mais que cette équivalence n’est valide que ,si l’on considère
les poids moléculaires des composés et non leurs concentrations
La correction que ces auteurs préconise ne concerne pas le calcul de la
concentration en chlorophylle a pour lequel les équations classiques restent valides. En
revanche, selon le produit de dégradation considéré, la correction préconasée pour
l’estimation de la teneur en phéopigments sera plus ou moins importante :
- si la chlorophylle 3 est transformée en phéophytine a, le rapport moléculaire est
voisin de 0,97 (Lorenzen et Jeffrey 1980, in Conover et al. 1986), et le résultat corrige de la
concentration en phéopigments ne diffère que de façon négligeable du résultat non co:rigQ.
- si par contre le produit final est constitué de phaeophorbide, ce qui est
apparemment le cas quand la chlorophylle est digérée par du zooplancton (Huriey et
2 1

---

Arrnstrong 1990), alors le ratio moléculaire devient 0,66 et la surestimation systématique de
ta teneur en phéopigments induites par l’équation classique non corrigée avoisine les 30%.
Comme la méthode fluorimétrique ne donne pas d’information sur la nature des
produits dérivés et sur leurs identités respectives, on ne peut pas obtenir par cette methode
d’information précise (et quantifiée) sur la concentration en produit de dégradation dans
l’eau.
Ces réserves, rarement évoquées, mais suspectées ou constatées de longue date
avaient notamment conduit Talling et al. (1973) à ne pas distinguer les produits de
dégradation de la chlorophylle 3 dans les estimations spectrophotornétriques de la
biomasse.
11.4. Résultats expérimentaux
Sont présentées çi-dessous quelques observations relatives aux écarts observés
entre les estimations des teneurs en chlorophylle avec ou sans correction des
phéopïgments.
II est à noter que la simple observation des graphiques proposés (obtenus lors de la
phase de pré-échantillonnage de notre programme d’étude), nous a amen& à abandonner
la correction des phéopigments.
En effet, alors que nous avons argumenté la perte de précision qu’implique la
correction consécutive à I’acidification, les résultats présentés ici illustrient le caractere
“évolutif” de cette correction ; caractère évolutif qui tend à masquer la variabilité temporelle
des observations de chlorophylle effectuées.
Nous avons considéré ici l’ensemble des estimations de la biomasse
effectuées /ors des quinze premières campagnes d’échantillonnage de la phase
exploratoire de notre étude (n = 714). Nous avons représenté sur la figure A2..3, les
teneurs en chlorophylle non corrigées des phéopigments (une seule lecture de
fluorescence) en fonction des teneurs obtenues après correction (même
échantillon mais avec une seconde lecture de fluorescence après acidificatron de
l’extrait).
Outre /a grande dispersion des points, on observe (fig. A23) :
- d’une part, l’individualisation de plusieurs unités dans le nuage de points ;
par exemple l’ensemble des points provenant des échantillons récoltés lors de
/a
22

---

campagne 15 et dont la pente (b = 2,353) s’écarte significativement de ia diagonale
(b = 1).
- d’autre part, la position sous la diagonale d’un grand nombre de points pour
lesquels, la teneur en chloroohy//e non corriaée est donc inférieure à r’a teneur
obtenue aorès correction.
Y----
2 6
1 6
1 2
8
“.
-7
4
.-_
__
_”
0
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-i--- *-----A _,_’
4
8
1 2
1 6
2 8
C h l o r o p h y l l e corrigee (mg/m3>
Fia. A2.3: Comparaison des teneurs en chlorophylle obtenues avec: OU sans
correction des phéopigments (Cl5 : campagne no 15).
Nous avons considéré d’autre part l’évolution de la différence de teneur en
chlorophylle (Chlo non corrigée - Chlo corrigée) suivant l’évolution du rapport de
fluorescence Fo/F,, avec F. : fluorescence avant acidification, et Fa : fluorescence
après acidification. On constate (fig. A2.4) que ce rapport est très fluctuant, et que,
selon sa valeur, les teneurs en chlorophylle non corrigée seront supkieures
(FcJFa > 2,15) ou inférieures (Fo/F, < 2,75) aux teneurs en chlorophylle obtenues
après correction.
23

---

Rappellons que ces observations se rapportent à des échantillons naturels
collectés dans l’estuaire, dans le lit principal ou dans les tributaires du fleuve
Sénégal (une douzaine de stations), à différentes profondeurs, et en une quinzaine
d’occasions couvrant une année hydrologique. Les peuplements considérés sont
donc trés divers, ce qui nous a amené à supposer que le rapport (Fc,4Fa pouvait être
forcé par des paramètres indépendants de la nature -structure- des peuplements
et/ou de l’état physiologique des algues considérées.
.._I>_--a---
2
2 . 4
rapport <Fo/Fd>
Fig. A-.4: Evolution de l’écart entre les teneurs en chlorophylle estimées a.vec
(Chio,)ou sans correction (chloT) des phéopigments selon le rapport de fluorescence.
L’observation de /a figure A$ montre l’évolution de la modiane de l’écart
entre les estimations de la chlorophylle et de la médiane du rapport de
fluorescence pour chaque campagne. II n’apparaît aucune tendance ou
saisonnalité qui pourrait être reliée à une tendance ou saisonnalité de même nature
dans les peuplements. L’évolution observée rend compte simplement d‘une
24

---

modification progressive de la valeur de ce rapport au fur (et à mesure des
campagnes, évolution qui entraîne une progression dans l’écart entre les teneurs
en chlorophylle corrigées et non Corri!gées.
-e.i
-II--
-I--- a.-_-_-_A.
e
3
6
9
1.2
1s
N u m e r o d e c a m p a g n e
Fia. A-.5: Evolution comparée des médianes (par campagne) du rapport de
fluorescence (ordonnée droite) et de l’écart entre les teneurs en chlorophylle estimées avec
ou sans correction des phéopigments (chIo, - chlo,, ordonnée gauche).
II apparaît ainsi que :
- campagnes 2 à 7 : Chlo T < Chlo a,
- campagnes I et 8 à 15 : Chlo T) Chlo a,
Cet écart systématique, évolutif, de la teneur en chlorophylle corrigée par
rapport à la teneur en chlorophylle non corrigée est pour nous le signe d’un biais
systématique sans rapport avec l’a structure ou /‘état physiologique des
peuplements considérés. L’évolution du rapport de fluorescence ~q ‘apparaît de plus
liée a aucune des caractéristiques globales de I’hydroclimat.
1
25

---

II nous paraît plutôt nécessaire d’ïncriminer :
.- d’une part, un effet de la qualité du solvant utilisé (méthanoi de diverses
origines, non tamponné par MgCO$,
- d’autre part, un effet de i’acidification (qualité et quantité d’acide utiiise).
----“-~
--
1 III. QUELQUES PRECISIONS METHODOLOGIQUES . . .
- -
I
-
l
111.1. Stockage des échantillons
La conservation des échantillons non filtrés durant quelques heures au froid et à
l’obscurité (Strickland et Parsons 1968) est possible sans que la qualite de l’estimation
ultérieure de la biomasse par la mesure de la fluorescence des extraits ne soit
excessivement altérée. Holm-Hansen et Riemann (1978) ont de plus montré que la
congélation des filtres ne provoque aucune perte, même lorsque le solvant utilisé est
I’acetone. Golterman et al. (1978) préconise toutefois de conserver les filtres congelés sur
dessiccateur.
Wood (1985) cite par ailleurs une communication personnelle de F.P Headley qui a
montre que la congélation n’affecte pas le pouvoir d’extraction du méthanol lors de l’étude
de populations d’Anabaena et de Scenedesmus. Ce même auteur a par ailleurs montré lors
de l’essai comparatif de divers solvants que la congélation diminue beaucoup la capacité
d’extraction de l’acétone et du mélange méthanol-diméthyl sulfoxyde mais pas du melange
méthanol-chloroforme, et peu du méthanol. Des filtres (ultérieurement extraits à l’acétone)
ont par ailleurs été conservés congelés sur gel de silice durant dix mois de manière
satisfaisante (Dufour 1972).
111.2. Pression de filtration
La capacité de rétention d’un filtre en fibre de verre évolue suivant la pressron de
filtration. Elle apparaît toutefois dépendante d’un grand nombre d’autres facteurs (taille des
cellules, densité, flexibilité et diamètre des pores) ce qui conduit à des résultats
extremement variables lorsque l’on essaye d’estimer l’évolution de cette capacité de
rétention en fonction de la pression de filtration imposée (Li 1986).
26

---

Sheldon (1972) suggérait que lorsque l’on veut retenir et non fractionner, la pression
de filtration n’a que peu d’importance. De manière générale, les pressions élevées sont
déconseillées pour éviter de briser les cellules du phytoplancton (Li et al. 1983, PlaM et al.
1983, Smith et al. 1985), ce qui a conduit l’équipe PIRAL (Herbland et al.., comm. pers.) à
préconiser une pression exercée inférieure à 75 mm Hg.
111.3. Utilisation du MgC03
Le carbonate de magnésium a été fréquemment utilisé pour accroître fa rétention des
filtres en fibres de verre (Golterman et al. 1978)’ et neutraliser l’extrait de manière à eviter la
dégradation des pigments qui s’y trouvent. L’utilisation du méthanol comme solvant
s’accompagne en effet de changements des caractéristiques spectrales de la phéophytine
après acidification, ce qui avait conduit Marker (1972) a préconiser {‘ajout d’un tampon (Le.
MgC03) pour en limiter les effets.
Daley et al. (1973)’ Holm-Hansen et Riemann (1978)’ Daley et Nusch (1980) n’ont
toutefois pas trouvé de différences significatives entre les concentrations en chlorophylle
obtenues avec ou sans ajout de MgCO3, ce qui a conduit Marker et al. (1980) a ne pius en
recommander l’utilisation lorsque le méthanol est utilisé comme solvant.
II apparaît cependant, selon Golterman et al. (1978) que les solvants alcooliques
(dont le méthanol) de qualité commerciale tendent fréquemment
a être légèrement acides.
Aussi recommandent-ils le stockage du méthanol sur MgC03 pour neutraliser et tamponner
le solvant.
111.4. Temps d’extraction
Holm-Hansen et Riemann (1978) ont montré que sur des peuplements domines soit
par des diatomées, soit par des cyanophycées, l’extraction par le méthanol est complete au
bout d’une heure. Les recommandations de l’équipe PIRAL (Herbland et ai., Comm. pers.)
font cependant état d’extractions complètes après seulement 15 minutes de contact entre le
filtre et le solvant.
27

---

111.5. Broyage du filtre
Les méthodes classiques (UNESCO 1966, Strickland et Parsons 1963) préconisaient
le broyage du filtre après extraction lorsque l’acétone était utilisé comme solvant. Herbland
et ai. (1985) ont cependant montré que l’on n’observe pas de différence significative sur les
estimations de chlorophylle a extraite au méthanol avec ou sans broyage, c~onfirmant ainsi la
suggestion de Holm-Hansen et Riemann (1978) selon laquelle le broyage est inutile lorsque
ce solvant est utilisé.
Après chaque prélèvement, les échantillons ont été immédiatement filtrés sur
Whatrnan GF/C (sans ajout de MgCO3) à l’aide d’une pompe à vide manuelle, sans
que la pression de filtration n’excède 1/2 atm. Les filtres, préalablement essorlk,
ont été placés sur silicagel, et conservés dans une glacière jusqu’h leur
congélation quelques heures plus tard.
L’extraction (à froid, au réfrigérateur et à l’abri de la lumière) a &é faite à
l’aide de méthanol à 95% de qualité commerciale non saturé en MgCO3, et a
systématiquement duré une heure. Aucun broyage n”a été opéré. (Le temps
séparant la collecte des échantilions de leur anaiyse a varié entre 2-3 jours et un
mois au maximum.
111.6. Calibration du fluorimètre
La calibration du fluorimètre est obtenue par rapport à une mesure d’absorption
photométrique à 665 nm corrigée de la lecture effectuée à 750 nm pour tenir C#ompte Je
l’absorption résiduelle (turbidité, autres composés dissous, . ..) (Holm-Hansen et Riemann
1978). Nous avons utilisé les coefficients d’absorption spécifiques proposes par Marker et
al. (1980), que ces auteurs ont obtenu en prenant la moyenne des diverses valeurs
recensées dans la littérature, soit un SAC de 7’7,O pour la chlorophylle a dans le méthanol
absolu (alors que l’ensemble des extractions que nous avons effectué a été fait avec du
méthanol à 95%).
Le méthanol utilisé pour la calibration et dans lequel la chlorophylle 3 de pureté
analytique (commercialisée par Sigma Chimie) est diluée doit être fégèrement plus aqueux
(92”93%) que celui utilisé pour l’extraction des échantillons (95%) pour tenir compte de la
petite quantité d’eau résiduelle qui est piégée dans le filtre lors de la filtration (équipe PIRAL,
Herbland et al., Comm. pers.}.
28

---

La relation exacte entre l’absorption et la fluorescence des extraits de chlorophylle
pure doit être régulièrement déterminée pour chaque appareil (en l’occurrence TURNER
111) et pour chacun des couples (fente-filtre) disponibles.
Selon Neveux (1976), pour des concentrations en chlorophylle 3 > 7561 pg.l-l, la
relation linéaire entre la fluorescence de l’extrait et la concentration en chlorophylle a
calculée par spectrophotométrie disparaît, ce qui interdit alors l’utilisation des équations
définies pour les concentrations inférieures a cette valeur. En milieu naturel, de telles
concentrations ne sont cependant que rarement rencontrées.
111.7. Reproductibilité des mesures effectuées
L’estimation de la reproductibilité des mesures de la biomasse phytoplanctonrque a
porte sur 253 prélèvements répliqués récoltés lors des diverses campaglries de la phase
d’échantillonnage exploratoire.
Lors de chaque réplication d’échantillons, nous n’avons retenu 9ue les deux
valeurs les plus extrêmes (Cmin et C,,.,ax), de sorte que la reproductibiiité estimée
suivant la méthode décrite par Lemoalle (1973) soit maximisée.
Nous avons comparé dans un premier temps les distributions des deux séries
I C,,.,, et C,, (Tab. A2.3) :
C min
effectif
253
253
506
moyenne
5,69
5,ll
5,40
variante
49,23
36,93
43,08
écart-type
7,02
6,08
6,57
médiane
4,34
3,91
4,12
Tab. A2.3: Statistiques simples des séries des minima et maxima considérées pour
l’estimation de la reproductibilité des mesures de chlorophylle (no171 corrigee des
phéopigments).
La différence des moyennes des deux séries est Dm = 0,584, et le rapport des
variantes vaut R,= 1,333. Un test sur les moyennes des deux séries montre
29

---

(tcat = 1,OO) que les deux séries ne sont pas statistiquement differentes (@~:0,05).
Un test sur le tau de Kendall (tau = 0,894), montre de plus que /es deux séries sont
très fortement (p <O,OOl) marquées par une même tendance.
Pour chaque doublet Y”, on calcule (Lemoalie 1973) :
X(X’i - X’ai)2
,2 zz
(variante intra-classe).
2k
(X’i + X”i)
2s
X i =
soit Xi = X,,,oy + r (réplicabilité).
2
ys-
Sur l’ensemble des couples considérés (chlorophylle non corrigée des
phéopigments), on obtient (n = 253) :
” moyenne des écarts = 154 ; médiane des écarts - 0,12
2 s
r = t
r = -t 1,24 c1s.f’
Cette valeur - mauvaise - de la réplicabilité paraît fortement tributaire d’un
certain nombre de valeurs pour lesquelles /‘écart entre duplicats est élevé, et qui
justifie pour partie f’écart observé entre la moyenne et la médiane des écarts entre
répjica ts.
Cette observation nous a amené à recalculer sélectivement la valeur de la
réplicabilité en considérant différentes classes pour ia valeur de l’écart entre
duplicats (tab. AZ.~).:
II en ressort (fig. AZ. 6) :
l
- qu’une seule valeur (sur les 253 considérées) suffit à faire varier r de :c 0,80
à + 7,24 ,ug.rl,
~ que dans 50% des cas, r <:: 0,20 c1g.f ‘,
l
” que dans 90% des cas, r < 0,50 pg.f ‘.
Ceci suggère qu’il existe un “biais” systématique dans l’estimation de la
reproductibilité, qui a trait à l’influence de la teneur en chlorophylle (moyenne des
duplicats) des échantillons considérés sur la précision de la mesure (écart entre
duplica ts).
3 0

---

-----
n
%(n)
DC*
s
r
21
8,30
CO,01
0,013
0,02
91
35,97
<0,05
0,084
0,12
1 1 4 45,06
<O,lO
0,114
0,16
1 5 2 60,08 <0,20
0,168
0,24
1 7 0 67,19
<0,3
0,197
0,28
f a 4 72,73
<0,4
0,221
0,31
1 8 6 73,512
<0,5
0,226
0,32
1 9 4 76‘68
<0,6
0,246
0,35
2 0 1 79,45
CO,7
0,263
0,37
2 0 5 87,03
<0,8
0,274
0,39
2 0 8 82,2i
CO,9
0,283
0,40
2 1 3 84,19
<l,O
0,299
0,42
2 2 0 86,96
cl,1
0,321
0,45
2 2 7 89,72
cl,5
0,346
0,49
2 3 7 93,f33
<2,0
0,389
0,55
2 3 9 94,47
<2,5
0,400
0,57
2 4 1 95,26
<3,0
0,412
0,58
2 4 3 96,05
<3,5
0,427
060
2 4 4 96,44
<4,0
0,435
0,62
2 4 7 97,63
<4,5
0,462
0,65
2 4 9 98‘42
4,o
0,481
0,6a
2 5 0 98,81
<7,0
0,491
0,69
Replicabilite (mg
251
99,21
<15,0
0,511
0,72
chloAn3)
2 5 2 99,60
<30,0
0,562
0,80
253
100
Cdata
0,877
1,24
_---
Tab. 1.4: Evolution de la réplicabilité
Fia. A2.6: Evolution de la répkabiiité
-
-
suivant l’écart entre répliquats
selon la fréquence des diverses
avec :
classes décrites dans le tableau A2.4.
” n : effectif de la classe,
- DC2 : carré de l’écart entre duplicats,
- s : variante intra-classe,
L
- r : réplicabilité.
Fia. A9.7: évolution de l’écart
entre duplicats selon la moyenne
entre duplicats.
0
4
6
12
16
20
Ch10 moyenne (mg/m3)
31

---

L’existence d’une telle relation (fig. Api’) a été testée sur I’ensembk des
couples dont /a moyenne est < 20 pg.i.’ à l’aide du coefficient de rang de Kendall.
II apparaît que (ta@ = 0,3738 ; (n = 250), et la variable associée (Scherrer 1984)
qta./) = 7,391”
Qn constate qu’il existe une relation très hautement significative (p d: 0,001)
liant la moyenne et l’écart entre duplicats, ce qui suggère que la replicabirité est
affectée par des facteurs méthodologiques gui varient en fonction de la biomasse
mesurée.
II nous est donc apparu peu pertinent de fournir une valeur unique de ta
répiicabilité, ce qui nous a amené à recalculer cette réplicabilité pour différentes
classes de biomasse moyenne.
Pour cela, ‘Y’ a été calculé pour chaque classe de chlorophylle moyenne
d’unité en unité, puis les classes ont été regroupées de manière B considérer des
proportions comparables de l’effectif total des duplicats (tab. AF5).
II en ressort ainsi que quelle que soit la classe considérée, la réplicabilité est
en moyenne de l’ordre de Or 15% de la valeur de la biomasse estimée.
r-l
r/Chlo,,y
WI
%
+ 0,15
> 15
i: 0,37
12,3 - 37,0
-t 0,52
10,4 - 17,3
k 0,95
11,9 - 19,0
t 1,19
< 14,9
Tab. A2.5: Evolution de la réplicabilité (r) suivant la teneur moyenne en chlorophylle
(Chlo,,y) des duplicats considérés. (n : effectif des classes).
L’intensité de la fluorescence des extraits analysés est fonction de la quantité
de lumière utilisée pour l’excitation de la chlorophylle extraite (contrôlée par un
diaphragme à 3 positions), et de la quantité de fluorescence mesurée par l’appareil
(contrôlée par un jeu de filtres neutres). L’ensemble des biais méthodologiques
Iks
à la filtration et à l’extraction de la chlorophylle par le solvant sont
vraisemblablement peu tributaires de la biomasse chlorophyllienne extraite ; à
l’inverse, la précision des mesures est directement inféodée au couple (fente, filtre)
~ utilisé, qui est lui-même sélectionné en fonction de la quantité de ch/oro+phylie
32

---

mesurée. L’efficacité des filtres neutres et le positionnement attentif du diaphragme
d’émission apparaîssent en ce sens tout à fait déterminants dans le contr& de /a
précision - et donc de la reproductibilité - des extraits mesurés.
Chlorophylle corrigée des phéopigments
Lors de l’analyse précédente, nous n’avons considéré que les chlorophylles
non corrigées des phéopigments. Cela signifie que la seule JectuTe de
fluorescence avant acidification des extraits a été prise en compte ,pour Ie calcul de
la biomasse chlorophyllienne.
La même approche a été conduite sur ces échantillons répliqués, mais dont
/a biomasse en chlorophylle a été calculée en tenant compte aussi de la teneur en
phéopigments dans les extraits.
Sur /‘ensemble des couples considérés, on obtient :
- moyenne des écarts = 1,75 pg.r ’ (n = 253),
- et la reproductibilité vaut : r = 1+ 132 1.49.r’.
On observe que cette valeur est sensiblement plus élevée que celle obtenue
en considérant la teneur en chlorophylle non corrigée des phéopigments
(r = + 1,24 pg,rl,.
Les échantillans considérés sont les mêmes et l’écart observé entre les deux
valeurs de Y n’est imputable qu’à la procédure d’acidification de l’extrait pour
l’estimation de la teneur en phéopigments (quantité et qualité de l’acide, nature des
produits de dégradation, interférences avec d’autres pigments, dmode de
calcul, etc . . .).
Nous avons calculé sélectivement la reproductibilité pour différentes
classes
de la valeur de l’écart entre duplicats (tab. A2-6).
II en ressort (fig. A2.8) :
- que dans 50% des cas, r < 0,25 pg.r’,
- que dans 90% des cas, r < 0,60 I.1s.r ‘,
- que ces valeurs sont sensiblement plus élevées que celles obtenues sur les
observations non corrigées (respectivement 0,20 et 0,50 pg.rl).
33

---

n
%(n)
S
r
26
10.28
CO,01
0.034 0.05
7 0
27.67
CO.05
0.100 0.14
93
36.76
<O,lO
0.128 0.18
126
49.80
<0,20
0.178 0.25
146
57.71
<0,3
0.210 0.30
164
64.82
<0,4
0.244 0.34
177
69.96
CO,5
0.268 0.38
187
73.91
<0,6
0.287 0.41
192
75.89
CO,7
0.298 0.42
197
77.87
<0,8
0.310 0.44
198
78.26
CO,9
0.313 0.44
200
79.05
< 1 ,o
0.319 0.45
213
84.19
cl,5
0.367 0.52
223
88.14
<2,0
0.408 0.58
227
89.72
<2,5
0.427 0.60
232
91.70
<3,0
0.455 0.64
234
92.49
<3,5
0.468 0.66
236
93.28
<4,0
0.483 0.68
238
94.07
<4,5
0.499 0.71
243
96.05
< 5.0
0.541
0.77
244
96.44
<6,0
0.550 0.78
245
96.84
<7,0
0.560 0.79
246
97.23
<9,0
0.574 0.81
247
97.63
<lO,O
0.589 0.83
248
98.02
<14,0
0.610 0.86
249
98.42
<15,0
0.633 0.90
0.3
8.6
8.9
1.2
1. '5
280
9881
<23,5
0.667 0.94
Replicabilite (mg/m3)
251
9921
<30,0
0.701 0.99
252
99.60
cl00
0.78
1.10
253
100
Xdata
0.935
1.32
Tab. A2.6, évolution de la réplicabilité
Fia. A2.8: évolution de I,a réplicabilté
mivant l’écart entre répliquats
selon la fréquence des diverses
(Chlo. corrigée). avec :
classes décrites dans le tableau A2 .6.
n : effectif de la classe,
. DC2 : carre de l’écart entre duplicat,
n
:1
- s : variahce intra-classe,
r : réplicabiiité.
Cl
Cl
cl
Fï3.A2-9: évolution de l’écart
entre duplicats selon la moyenne
entre duplicats (chlo. corrigée).
.J _-
34

---

Là encore, l’écart entre duplicats est très significativement lié à la teneur
moyenne en chlorophylle des duplicats (fig. A2.9) ; pour les 2.50 couples pour
lesquels la moyenne est < 20 pg.f j, le tau de Kendall vaut 0,376, d’où la variable
associée Zctau) = 8,86 > > > 1,96 (p =: 0,001).
Aussi, la reproductibilité a-t-elle été recalculée sur différentes classes de
chlorophylle moyenne (tab. A27). Les valeurs obtenues sont sensiblement
supérieures à celles obtenues lorsque la chlorophylle non cor,rigée Btait
1
considérée, notamment pour des biomasses > 3 m.kl.
I-1
‘(non cqrr.)
Kl.1
Kl.l
t 0,12
2 0;15
2 0,43
2 0,37
2 0,73
5 0,52
rr 1,32
2 0,95
f: 1,91
k 1,‘19--Y-------.--
Tab, A?.7: Evolution de la réplicabilité suivant la teneur moyenne en chlorophylle
(Chlo,,y) dei duplicats (r? : effectif des classes, r(no,-, corr.) : chlo. non corrigée et r : chlo.
corrigée des phéopigments).
On constate que la procédure de correction de la teneur en phi?opigments
s’accompagne d’une diminution de la .reproductibifité des analyses, diminution dont
les causes sont vraisemblablement complexes. On peut toutefois observer que les
essais de réplication ont été effectués, pour chaque couple, à la même date, avec
le même solvant et le même acide, sans que la calibration du fluorimètre n’ait
évolué.
La comparaison des valeurs de la reproductibilité nous (renseigne donc
directement sur Vincertitude méthodologique liée à I’acidification {qualité et
quantité d’acide ajouté, temps de rkaction, processus chimiques induit:, dans
l’extrait et interférences, lecture de /a fluorescence...). Ces résultats iirlustrenr la
perte de sensibilité qu’induit I’acidification des extraits, indépendamment des
fluctuations à long terme (de dosage en dosage, voir paragraphe lI.4,J liées à
i’évolution du rapport de fluorescence.
35

---

I
IV. AUTRES METHODES : signature spectrale et spectre de taille <,..
Des techniques diverses ont été développées qui visent à une augmentation de la
précision du dosage des divers pigments en présence simultanément dans un extrait
naturel.
Les techniques chromatographiques (HPLC en phase inverse notamment) sont les
seules qui permettent une connaissance précise de l’ensemble du pool pigmentaire en
présence dans l’extrait (voir par exemple Knowlton et Jones 1989, Hurley et Watras 1931).
Par ailleurs, des méthodes spectrofluorimétriques ont été élaborées qui permettent
de distinguer sans acidification les chlorophylles 2, b et g et leurs produits de dégradation
(Neveux et Panouse 1987). L’étude de la “signature spectrale” (Ventsch et Yentsch 1979)
d’un assemblage phytoplanctonique (Le. la quantification de la concentration en pigments
accessoires) vise ainsi à la recherche de propriétés émergentes “ataxinomiques” du
peuplement étudié qui permettent d’en approcher de manière globale la composition.
Selon Yentsch et Phinney (1984), la signature spectrale est en effet le reflet de
l’assemblage phytoplanctonique, et son évolution illustre les changements de di~dersité
spécifique des populations naturelles et peut être associée aux changements du statut
nutritif des masses d’eau. Ces auteurs ont montré par ailleurs qu’il existe une étroite relation
entre l’évolution des rapports de fluorescence à diverses longueurs d’onde (E539jE459
notamment, voir tab. A2.8) et la taille moyenne des cellules phytoplanctoniques concernées
(Yentsch et Phinney 1985). Selon ces auteurs, une réduction de la taille moyenne, assock2e
à une évolution de la signature spectrale, correspond à une nécessité évolutive pour la
survie du phytoplancton dans les régions (océaniques) oligotrophes.
Ces résultats sont à rapprocher de ceux obtenus par Harris et al,. (1987) qui ont
montré que le spectre de taille du phytoplancton dans les eaux de surface est corrélé à de
nombreux paramètres liés à la biomasse, au métabolisme des algues, et de manier-e
synthétique< à leurs propriétés démographiques. En particulier, ce spectre de taitle paraît
intimement tributaire de la ressource en nutriments et des capacités qu’ont les algues à les
exploiter plus ou moins efficacement. En ce sens, pour Harris et al. (1987), I’identificatron du
spectre de taille est un bon indicateur de la voie d’utilisation du carbone en région
pélagique, puisque les zones de production “nouvelle” active sont caractérisées par des
biomasses élevées déterminées principalement par de fortes densités de diatomées de
grande taille et des flagellés, alors que les zones de production “régénérées” apparaissent
dominées par des peuplements constitués de cellules de petite taille, développant de iaibles
biomasses et dotées de fort taux de minéralisation du carbone à l’obscurité. Ces auteurs
36

---

notent d’autre part que cette typologie métabolique d’utilisation du carbone a de fortes
incidences sur la nature du couplage phyto-zooplancton du fait notamrnent du/ turn-over
démographique du phytoplancton qui est intimement lié au spectre de taille des cellules
concernées.,
_--
-
-
-
organismes
pigments accessoires
W530/E450)
-
Dinoflagellés
caroténoïdes chlo c
0,8 - 0,9
Diatomées
caroténoïdes chlo c
0,7 - 0,8
Coccolithophores
caroténo’ides chlo c
0,3 - 0,4
Flagellés “verts”
chlo b
0,i -0,2
Cryptophycées
phycobillines chlo c
0,7 - 0,8
Cyanobactéries
phycobillines
-
Tab. AZ.8: Principaux pigments accessoires et “signature spectrale“ pour les taxons
phytoplanctoniques les plus communs (d’après Yentsch et Phinney 1985).
Pius récemment, Jarry et al. (1990) ont discuté de la répartition spatiale du
phytoplancton dans l’étang de Thau à partir des rapports pigmentaires, et ils ont prioposé
une image biochimique de la composition taxinomique des assemblages qui se juxtaposent
dans la lagune en en soulignant l’hétérogénéité.
Cette spatialisation, basée essentiellement sur l’analyse de l’évolution du rapport
chlo b/chlo a met en exergue l’opposition :
- entre les zones peu profondes et à faible énergie de l’étang (Sud Ouest) d’une part,
où se rencontrent de faibles biomasses caractérisées par un rapport élevé
(chlo b/chlo a > 0,15) : zones oligotrophes caractérisées par un recyclage rapide des
nutriments et peuplées préférentiellement de nanoflagellés de petite taille,
- et les zones à forte énergie et plus influencées par I’advection manne (Nord Ouest)
d’autre part, qui sont caractérisées par des biomasses plus élevées, un rapport
chlo b/chlo a faible et une forte représentation des diatomées.
Ces brefs exemples illustrent tout l’intérêt que peuvent présenter des techniques plus
sophistiquées que le simple dosage routinier de la chlorophylle totale non corrigée
37

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d’échantillons naturels. Une part essentiel de l’information relative à la structure pigmentaire
du peuplement étudié est en effet perdue, quii pourtant est riche d’enseignements à tirer
quand à la diversité taxinomique du peuplement concerné. II apparaît un couplage étroit
entre structure pigmentaire et structure de taille d’une part, et un couplage tout aussi étroit
entre la structure de taille et les potentialites métaboliques des algues d’autre part.
L’évolution d’un assemblage phytoplanctonique au fur et à mesure que se développe une
situation de succession typique est ainsi fortement corrélée à l’évolution du spectre de taille
de cet assemblage (Margalef 1978, Malone 1980).
Une solution élégante pourrait être de coupler certaines de ces techniques de
manière à appréhender de diverses façons plusieurs éléments redondants ‘et émergents qui
permettent de caractériser non seulement la biomasse de l’assemblage phytoplanctonique
considéré, mais aussi sa structuration.
On pourrait ainsi imaginer :
- d’une part une fluorimétrie in-vivo exploratoire et descriptive, d’accès immédiat et
qui peut fournir d’excellentes indications quant à la biomasse phytoplanctoniqtie en
présence (quantification et répartition), (voir Falkowski et Kiefer 1985),
- d’autre part une analyse spectrofluorimétrique sur des échantillons fractionn&s par
filtration différentielle et recueillis en connaissances de cause.
- enfin un effort taxinomique ciblé, qui permette le paramètrage de la signature
spectrale et l‘identification des changements de composition floristique qui er sont
responsables.
j CONCLUSION
(
Les résultats expérimentaux que nous avons décrits :
- 1: existence d’un biais systématique (et évolutif) lors de chaque serie de mesures
de fluorescence au laboratoire lié à l’évolution du rapport de fluorescence,
- 2: moindre reproductibilité (au sein d’une série) lorsqu’est appliquée une correction
pour tenir compte de la teneur en phéopigments,
et l’ensemble des réserves liées à I’acidification, aux interférences diverses, à la
signification et à l’estimation des phéopigments..., nous ont conduits à retenir la
chlorophylle non corrigée des phéopigments comme estimateur de la biomasse
3 8

---

phytoplanctonique, rejoignant en cela H. Bührer (1991) qui illustre l’inutilité de la prise en
compte des phéopigments et conclut :
“Forget about calculated pheophytine !“.
Les équations classiques monochromatiques ont été utilisées ; l’intégralité des
échantillons a été filtrée sur filtre en fibre de verre Whatman GF/C, sans. préfiltration sur
maille fine.
Dans une optique d’étude d’environnement (i.e. fonctionnement d’un écosystème),
l’utilisation de techniques plus sophistiquées semble toutefois souhaitable. En particulier, il
nous semble utile de développer des méthodes rationnelles et efficace.s qui autorisent
l’appréhension de propriétés fonctionnelles globales du phytoplancton. II semble en ce
sens se dégager un intérêt croissant pour l’étude des spectres de taille du (phyto)plancaon
(traceur physiologique et métabolique), d’une part, et des signatures spectrales (traceur
taxinomique) d’autre part ; la promotion du couplage de ces techniques nous paraît
repondre de manière pertinente aux attentes et besoins des environnementa8istes ‘qui
utilisent le phytoplancton comme révélateur du fonctionnement des .systèmes qu’ils
étudient.
39

---

REFERENCES BI~~LI~GRAP~~uES
Bergmann M., and R.H. Peters, (1980) - A simple reflectance method for the measurement
of particulate pigment in lake water and its application to Phosphorus-Chlorophyll-
Seston relationships. Can. J. Fish. Aquat. Sci., 37(l): 11 l-1 14.
Bührer H., (1991) - Problems in estimation of pheophytine. Ver-h. Internat, Vereirx Lmnol.,
24(2): 1259.
C,arlson R.E., and J. Shapiro, (1981) - Dissolved humic substances : a major source of error
in fluorometric analysis involving lake waters. Lin-mol. Oceanogr., 26(4): 785790
Carpenter S.R., M.M. Elser, and J.J. Elser, (1986) - Chlorophyll budgets : zooptankton
grazing and phytoplankton growth in a temperate fjord and the Central Pacifie gyres.
Lin-moi. Oceanogr., 31: 112-l 24.
Cecchi Ph., 1992 - Phytoplancton et conditions de milieu dans l’estuaire du fleuve Sénégal :
effets du barrage de Diama. Thèse de Doctorat, Université de Montpellier, 437 pages.
Corbin D., et Ph. Cecchi, 1991 - Hydrobioclimat du fleuve Sénégal dans la zone d’influente
du barrage de Diama : compilation des données recueillies d’avril 1988 à juin 1990.
Archive du CRODT, no 185, mars 1991,49 p.
Conover R.J., R. Durvasula, S. Roy, and R. Wang, (1986) Probable loss of chlorophyll-
derived pigments during passage through the gut of zooplankton, and some of the
consequences. Lin-mol. Oceanogr., 25: 597-609.
Cynar F.I., K.W. Ester, and J. McN Siburth, (1985) - The detection and characterization of
bacteria-sized protist in “protist-free””
filtrates and their potential impact on
experimental marine ecology. Microb. Ecol., 11: 281-288.
Daley D.J., C.B.J. Gray, and S.R. Brown, (1973) -A quantitative semi-routine method for
determining algal and sedimentary chlorophyll derivates. J, Fish. Res. Bd. Car,., 30:
345356.
Daley D.J., and E.A. Nush, (1980) - Comparison of different methods for chlorophyll and
pheopigments determination. Arch. ffydfobiol. Beih. Ergbn. Linmol., 14: 14-36.
Dufour P., (1972) - Contribution à la connaissance des possibilités et limites de la mbthode
de dosage des pigments de phytoplancton. ORSTOM, Dot. Scient., Centre de Pointe
Noife, 24: l-25.
Falkowski P.G., and D.A. Kiefer, (1985) - Chlorophyll a fluorescence in phytoplankton:
relationship to photosynthesis and biomass. J. P/a&!on Res., 7(5): 715-731.
Golterman H.L., R.S. Clymo, and M.A.M. Ohnstag, (1978 -dMethods for chernical analysis of
fresh waters. BP Handbook, 8, Blackwell, Oxford, 3 Il edition, 213 p.
Harris G.P., (1986) - Phytoplankton ecology : structure, function and fluctuation. Chapman
and Hall, 384 p.
Harris G.P., G.G. Ganf, and D.P. Thomas, (1987) - Productivity, growth rates and ceil size
distributions of phytoplankton in the S. W. Tasman sea : implications for carbon
metabolism in the photic zone. J. PlanMon Res., g(5): 1003-1030.
4 0

---

Herbland A., (1978) - The soluble fluorescence in the open sea : distribution and ecological
significance in the Equatorial Atlantic Ocean. J. Exp. Mar. Biol. Ecol., 66: 47-58.
Herbland A., A. Le Bouteiller and P. Raimbault, (1985) - Size structure of phytoplankton
biomass in the equatorial Atlantic Ocean. Deep Sea Research, 32(7): 819-836.
Holm-Hansen O., C.J. Lorenzen, R.W. Holmes, and J.D.H. Strickland, (1965) - Fluorimetric
determination of chlorophyll. J. Cons. perm. ht. Explor. Mer, 30:3-l 5.
Holm-Hansen O., and B. Riemann, (1978) - Chlorophyll a determination : improvements in
methodology. Oikos, 30: 438-447.
Hurley J.P., and D.E. Armstrong (1990) - Fluxes and transformations of aquatic pigments in
lake Mendota, Wisconsin. Limnol. Oceanogr., 35(2): 384-398.
Hurley J.P., and C.J. Watras, (1991) - Identification of bacteriochlorophylls in1 lake via reverse
phase HPLC. Limnol. Oceanogr., 36(2): 307-315.
Iltis A., (1980) - Les algues. pp. 9-61. In J.R. Durand et C. i-évêque (Eds). Flore ei faune
aquatiques de l’Afrique sahelo-soudanienne, IDT no 44(I), ORSTOM, Paris, 389 p.
Jarry V., M. Fiala, G.F. Frisoni, G. Jacques, J. Neveux, and M. Panouse, (1990) - The spatial
distribution of phytoplankton in a Mediterranean lagoon (Etang de Thau).. Oceanol.
acfa, 13/4: 503-5 12.
Jonhson P.W., and J. McN. Sieburth, (1979) - Chroococcoid cyanobacteria in the sea : a
ubiquitous and diverse phototrophic biomass. Limnol. Oceanogr., 24: 928-935.
Keller A.A., (1987), - Mesocosms studies of DCMU-enhanced fluorescence .as a measure of
phytoplankton photosynthesis. Mar. Biol., 96: 107-l 14.
Keller A.A., L-L. Beatty, L.E. Weber, and C.A. Heil, (1990) Soluble fluorescence : effects on
chlorophyll determination at different salinities. Cari. J. Fish. Aquat. Sd,, 47(Q): 1700-
1709.
Knowlton M.F., and J.R. Jones, (1989) - Comparison of surface and depth-integrated
composite samples for estimating algal biomass and phosphorus values and notes on
the vertical distribution of algae and photosynthetic bacteria in mid-western lakes.
Arch. Hydrobiol., Suppl. 83: 175-196.
Leavitt P.R., S.R. Carpenter, and J.F. Kitchell, (1989) - Whole-lake experiments : the annual
record of fossil pigments and zooplankton. Limnol. Oceanogr., 34: 700-717,
Leavitt P.R.? and S.R. Carpenter, (1990) - Regulation of pigments sedimentation by photo-
oxydation and herbivore grazing. Caf?. J. Fish. Aquat. Sci., 47: 1166-l 176.
Lemoalle J., (1973) - L’énergie lumineuse et l’activité photosynthétique du phytopiancton du
lac Tchad. Cah. ORSTOM, sér. Hydrobiol., 7(2): 95-116.
Li W.K.W., (1986) - Experimental approaches to field measurements :: methods and
interpretation. pp. 251-256. In T. Platt and W.K.W. Li (Eds), Photosynthetic
picoplankton. Cari. Bull. Fish. Aguat. Sd., 214.
Li W.K.W., (1990) - Particles in “particle-free” sea-water : growth of ultraphytoplankton and
implications for dilution experiments. Can. J. Fish. Aguat. Sci., 47(7):1258-l 268.
Li W.K.W., D.V. Subba Rao, W.G. Harrison, J.C. Smith, J.J. Cullen, B. Irwin, and T Platt,
(1983) - Autotrophic picoplankton in the tropical ocean. Science, 219: 292-295.
41

---

L.oftus M.E., and J.H. Carpenter, (1971) - A fluorometric method for determining chlorophylls
a, b and c. J. Mac Res., 29:319-338.
L.ong E.B., and Cooke G.D., (1971) -A quantitative comparison of pigment extraction by
membranes and glass-fiber filters. Unnol. Oceanogr., 16: 990-992.
L.opez M.D.G., M.E. Huntiey, and P.F. Sykes, (1988) - Pigment destruction by Calanus
pacificus : impact on the estimation. 3. Plankton Res., 10: 715-734.
L.orenzen CJ., (1967) - Determination
of chlorophyll and phaeopigments :
spectrophotometric equations. Lin?#o/. Oceanogr., 12: 342-346.
Lorenzen C.J,, (1981) ” Chlorophyll b in the eastern North Pacifie Ocean. Deep Sea Res., 28:
1049-l 056.
L.orenzen C.J., and J. Newton Downs, (1986) - The specific absorption coefficients of
chlorophyllide a and pheophorbide a in 90% acetone, and comments on the
fluorometric determination of chlorophyll and pheopigments. Lin~~o/. Oceanogr.,
31(2): 449-452.
Malone T.C., (1980) - Algal size. pp. 433-464. In 1. Morris (Ed), The physiological ecology of
phytoplankton. Etudies in Ecology, 7. Blackwell, 625 p.
Margalef R., (1978) - Life-forms of phytoplankton as survival alternatives in an unstable
environment. Oceanologica acta, 1: 493-509.
Marker A.F.H., (1972) _ The use of acetone and methanol in the estimation of chlorophyll in
the presence of phaeophytine. Freshwat Bol., 2: 361-385.
Marker A.F.H., E.A. Nush, H. Rai, and B. Riemann, (1980) - The rneasurement of
photosynthetic pigments in freshwater and standardization of methods : conclusions
and recommendations. Arch. Hydrobiol. Beih. frgebn. Lhnol., 14: 91-‘106.
Mourelatos S., (1989) - Broutage du zooplancton in-situ : revue critique des méthocles
courantes. Acfa Oecologica, Oecoi. Gener., 1 O(3): 257-271.
Neveux J., (1976) - Dosage de la chlorophylle a et de la phéophytine a par fluorimétrie. Ann.
Inst. Oceanogr., Paris, 52: 165174.
Neveux J., and G. De Billy, (1986) - Spectrofluorometric determination of Ichlorophylts and
pheophytins. Their distribution in the western part of the Indian Ocean (July ta August
1979). Deep Sea Research, 33(i): 1-l 4.
Neveux J., and M. Panouse, (1987) - Spectrofluorometric determination of chlorophylis and
pheophytins. Arch. Hydrobiol., 109(4): 567-581.
Pagès J., (1981) - Dosage fluorimétrique des pigments chlorophylliens : essai de revue des
modalités techniques. Archive CRODT, 96, 15 p.
Pagès J., (1988) - Techniques d’étude de I’hydrobioclimat de la Casamance et compilation
des données de février 1984 à juillet 1987. Archive CROIT, 169,30 p.
Penry D.L., and B.W. Frost, (1991) - Chlorophyll a degradation by Calanus pacificus :
dependence on ingestion rate and digestive acclimation to food resources. Lirnnol.
Oceanogr., 36(l): 147-l 59.
Phinney D.A., and C.S. Yentsch, (1985) -A novel phytoplankton chlorophyll technique:
toward automated analysis. J. PlanMon Res., 7(5): 633-642.
42

---

Platt T., D.V. Subba Rao, and B. Irwin, (1983) - Photosynthesis of picoplankton in the
oligotrophic ocean. Nature, 301: 702-704.
Prepas E.E., M.E. Dunnigan, and A.M. Trimbee, (1988) - Comparison of in-situ estimates of
chlorophyll a obtained with Whatman GF/F and GF/C glass-fiber filters in mesotrophic
to eutrophic lakes. Can. J. Fish. Aquat. Sci., 45: 910-914.
Riemann B., (1978) - Absorption coefficients for chlorophylls a and b in methanol and a
comment on interference of chlorophyll b in determinations of chlorophyll a. Vatien, 3:
187-194.
Riemann B., (1980) - A note on the use of methanol as an extraction solvent for chlorophyll a
determination : improvements in methodology. Arch. Hydfobiol. Beih. (‘EfgbrP. Limnol.),
14: 70-78.
Sakshaug E., (1980) - Problems in the methodology of studying phytoplankton. pp. 57-91, In
1. Morris (Ed), The physiological ecology of phytoplankton. Studies in Ecobgy, 7,
Blackwell, Oxford, 625 p,
Sheldon R.W., (1972) - Size separation of marine seston by membrane and glass fiber filters.
Limnol. Oceafiogr., 17: 494-498.
Shoaf W.T., and B.W. Lium, (1976) - Improved extraction of chlorophyll a and b using
dimethyl sulfoxide. Limnol. Oceanogf., 21: 926-928.
Shuman FR., and C.J. Lorenzen, (1975) -Quantitative degradation of chlorophyli by a
marine herbivore. Limnol. Oceanogf., 20:580-586.
Smith J.C., T. Platt, W.K.W. Li, E.P.W. Horne, W.G. Harrison, D.V. Subba Rao, and B.D.
Irwin, (1985) - Arctic marine photoautotrophic picoplankton. Maf. Ecol. Pfog. Ser., 20:
207-220.
Stockner J.G., (1988) - Phototrophic picoplankton : an overview from marine and freshwater
ecosystems. Limnol. Oceanogr., 33(4/2): 765-775.
Stockner J.G., M.E. Klut, and W.P. Cochlan, (1990) - Leaky filters : a warning l:o aquatic
ecologists. Can. J. Fish. Aquat. Sci., 47(l): 16-23.
Strickland J.D.H., and T.R. Parsons, (1968) -A practical handbook on sea-water analysis.
Bull. Fish. Res. Bd. Can., 167, 310 p.
Taguchi S., and E.A. Laws, (1988) - On the microparticles which pass through glass-fiber
filter type GF/F in coastal and open ocean. J. PlanMon Res., lO(5): 99!3-1008.
Talling J.F., (1957) - The phytoplankton population as a compound photosynthetic system.
New Phytol., 56: l33- 149.
Talling J.F., R.B. Wood, M.V. Prosser, and R.M. Baxter, (1973) - The Upper limit of
photosynthetic productivity by phytoplankton: evidence from Ethiopian soda Lakes.
Freshwat. Bio/., 3: 53-76.
UNESCO/SCOR, (1966) - Determination of photosynthetic pigments in sea-water. Report
SCOR,QNESCO working group 17, UNESCO, Paris, Monographs on Oceanogfaphic
Methodology, 1.
UNESCO, (1980) - Determination of chlorophyll in sea water. UNESCO technicai papers in
marine science, 35.
4 3

---

Vernet M., and C.J. Lorenzen, (1987) - The presence of chlorophyll b and the estimation of
phaeopigments in marine phytoplankton. J. PlanMon Res., g(2): 255265.
Vollenweider R.A., (1969) - A manual on methods for measuring primary production in
aquatic environments. BP Handbook, 12, Blackwell.
Welschmeyer N.A., A.E. Coping, M. Vernet, and C.J. Lorenzen, (1984) - Diel fluctua,tion in
zooplankton grazing rate as determined from the downward flux of phaeopigments.
Mar. Biol. 83:263-270.
Welschmeyer N.A., and C.J. Lorenzen, (1985) - Chlorophyll budgets : zoopiankton grazing
and phytoplankton growth in a temperate fjord and the Central Pacifie gyres. Limnol.
Oceanogf., 30: l-21.
Wood L.W., (1985) - Chloroform-methanol extraction of chlorophyll a. Cari. J. Fish. Aguat.
Sd., 42:38-48.
Yentsch C.S., (1983) - A note on the fluorescence characteristics of particles that pass
through glass-fiber filters. Linmol. Oceanogr., 28: 597-599.
Yentsch C.S., and D.W. Menzel, (1963) -A method for the determination of phytoplankton
chlorophyll and pheophytin by fluorescence. Deep Sea Research, 10: 221-231.
Yentsch CS., and C.M. Yentsch, (1979) - Fluorescence spectral signatures : the
characterization of phytoplankton populations by the use of excitation and emission
spectra. J. Mar. Res., 37: 471-483.
Yentsch C.S., and D.A. Phinney, (1984) - Observed changes in spectral signatures of natural
phytoplankton populations : the influence of nutrient availability. pp., 129-140. In 0.
Holm-Hansen, L. Bolis and R. Gilles (Eds), Marine phytoplankton productivity.
Lectures Notes on Coastal and Estuarine Sciences, 8, Springer-Verlag, 175 p
Yentsch C.S., and D.A. Phinney, (1985) - Spectral fluorescence : an ataxonomic tool for
studying the structure of phytoplankton populations. J. Plankfon Res., ‘7(5): 617-632.
44

---

175 pg.l-‘). Leur étude a révélé qu’en l’absence d’un picoplancton abondant, fa différence
de porosité entre ces deux modèles est trop faible, et les tailles moyennes minimales de
rétention trop voisines, pour que les différences observées sur l’estimation de fa biomasse
chlorophyllienne soient importantes, compte tenu de la capacité de rétention relativement
variable (Shefdon 1972) de ce type de matériel.
Nous avons comparé à l’occasion d’une série de prélèvements (16
échantillons, voir tableau AZ. 1) la rétention des filtres Whatman GF/C et GF/F. La
figure AF I représente la régression de l’estimation de la teneur en chlorophylle
(non corrigée des phéopigments) obtenue après filtration sur GF/F en fonction de
la teneur obtenue à l’aide des filtres Gf/C.
II en ressort que, systématiquement, la teneur en chlorophylie est sous-
estimée quand les filtrations sont effectuées à l’aide de GF/F. Un test de
comparaison sur /a pente observée (aobs =0,817) montre en effet que l’hypothèse
nulle bf($ aobs =afhéo = 7 (figurée en tiret) ne peut être acceptée (p :=O,j?5 ;
t = 9,429), ce qui sous-entend que les teneurs évaluées consécutivement aux deux
filtrations ne sont pas équivalentes, et donc, que la capacité de rétentïot? diffère
pour ces deux types de filtres : les filtres de moindre porosité (G,F/C) apparaissant
les plus efficaces.
La reproducfibilïté des estimations de la teneur en chlorophylle a par ailleurs
été estimée pour chacune des séries de filtration à /‘aide d’une méthode détaillée
par Lemoalle (1973). La reproductibilité est évaluée par l’écart type “s” sur les
valeurs de chlorophylle calculées pour chaque doublet. On définit l’intervalle de
confiance sur chaque estimation à partir des écarts entre x7 et x”i, les valeurs d’un
même doublet ‘Y, te/ que, pour k échantillons :
2 k
.
et le résultat vrai s’exprime alors selon :
On obtient (voir tab. A,. 1) :
- pour GF/C : Xi -+ 0,99,
- pour GÇ/F : Xi +- 0,78.
7

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