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DOSAGE
FLUORIMÉTRIQ!JE
E S S A I D E REVUE D E S
. .
MOL)ALITES ‘ T E C H N I Q U E S .
Jean PAGES
I N T R O D U C T I O N
La biomasse du phytoplancton est souvent d&erminée par le biais de
ses pigments chlorophylliens. La mesure de la concentration de ces pigments
est dé,j$ un procéd6 fort ancien, mais une rapide revue de la littérature
fait cependant appara'itre que, malgrk divers essais de normalisation (SCOR-
-TJ~~SQ) 1966 ), les madalit& techniques sont loin d%tre uniformes.
.&us avons tenté de rasscsnbler ici un certain ncmbre de détails tech-
niques cités par divers auteurs, afin dPobtenir une vue g&-&rale. Ceci ne
saurait ^etre une revue exhaustive, et encore moins critique, venant &prè;s
les travEtux publiés dans les "Ergebnisse der Limnologie" (Beiheft 14,, 1980).
Il s'agit plut& d'un essai de mise au point, 3 usage interne, axé sur les
dkails matériels et prenant en compte quelques techniques récentes.
En outre, l'accent a été mis, volontairement, sur le dosage par fluo-
rimÉtrie, plus adapté aux conditions de la haute mer et plus rapide ; la
spectrophotan%rie a été assez n&$&e.
1 .
F 1 LT R AT 10 N "
'
1.7. CEOIX DES FILTRES
Les membranes filtrantes permettent,, du moins en théorie. de séparer
des tailles différentes dgorganimes (Faust et Correl, 1976 : Venrick et 81,:
19?7?. En fait, le choix de la marque est assez capital ; les membrane7
Nuclepore semblent peulwfournir des perforations réellanent calibr6es
(Sheldon, 1972), La plupart'des membranes, ~epend&t~~'coimatënt assék'vite
et peuvent, par leur dissolution ult&ieure,apporter des substances parasites.
Les filtres en fibre de verre ont des caractéristiques de filtration
.@us satisfaisantes (Lenz et Fritsche, 1980). Leurs fibres sméliorent la
2
destruction des cellules dans le cas où& filtre est broyé dans le SO~&?+I~.
Leur gorosit est assez bien contr%lée (Holm Hansen et Riemann, 1978 ; MSX?.CT
et Ed.,, 1980). Il semble cependant que lcsk'ilhesGelmah type A soient infé-
rieurs aux filtres Whatman GF/C (Herbland, comm. pers.),,
"..,
1.2. MODALTTF DE 'L&FILTRATION "
La dépression, lors de la filtration, ne doit, pas dépasser l/lOc d'at-
,mosph&e (As&nson, 1978 ; Ekmxp;.~978).
L9addition d'une suspension de %$!~
R. i-té recommand& (Strickland et
Parsons, 1968) 1 LPutilité, ou m;bme les bienfaits, d'une tzlle procédure, SO?:*
assez discut& pourtant (Holm Hansen et Riemann, 13'78 r, Marker et al,, 1980 b),
1.3. I~~OTJSEXVATIOI\\J DES FILTRES
Certains auteurs signalent une 'baisse sensible de la teneur en chlora-
phylle, tant dans les extraits que swhs filtres (Blasco, 19731, même si
ceux-ci sont lyophilis& (Lenz et Fritsche, l@O),, Inversement, d'autres
essais n'ont pu mettre en 6vidence de perte.9 sur des filtres congelés enco-
re humides et conserv& 3 -20% (Holà Hanscin ct Riemann, 1980). Des filtres
ont St6 conservés de façon satisfaisante (moins de 20 ? de pertes) à -15*C,
sur gel de silice, pendant 10 mois (Dufour, 1972).
2'.
EXTRACTIOI'J
,<
,'.
Plusieurs 3aivae3 ont été employks pour extraire les pigments. L7 a&-
tone est le plus‘fr&quemment utili&e, mais d7autres solvants ont &é reca-
mandés.
.
.
2.1,. ACETONF
Le tiélange le plus fr6quen-t est lvacCtone SS 10 $ dPeau ("acétone'90 "").
Certains auteurs emploient des mélanges & 85 ou 80 %, Baudouin et Seoppa
(1971) utilisent lrac6tone 85 $ satur6e de MG?O~.
Afin d'améliorer lgefficacité de l"extraction, Stauffer et RI. (1'379)
pr&onisent un mélange acétone-DMSO (a:a) (1). Le broyage desx&es a 6%:
recommande (Strickland et Parsons, l968) mais somh:Le d'une efficacitg dis-
cutable (Holm Hansen et Riemann, 1978) et pc& m$me augmenter la variabili-
té @ufow, 1972).
Un des principaux d&avs,nts.ges de l'ac&one est sa faible efficacits
d'extractipn sur de nombreuses formes Planctonique:%.
('1) f;e DM50 fltiorcsce fortement avec &?x, = 405, ,\\hi z 525 m
.
3
2.2. METHAWL
Plusieurs auteurs recommandent, comme plus efficace, le m~thanol, soit
bouillant p&dant 30 s (?&aney, 1978 ; Stauffer et al., 1979 : Biemann,
1980), soit plus simplement b froid (Berland et -1970 : Holà Hansen et'
iGaa.nn, 1978 ; Masker et al,, 1980 a et b), %?%oyage du filtre est alors
inutile.
Le comportement des pipents dans le méthanol acidifié peut prhmter
quelques'problèsaes (Marker et al., 1980 a ; Uusch, 1980). Les vapeurs de
m-thanol sont assez taxiquo*soh, 1980).
L'éthanol bouillant est aploy6 par quelques auteurs (Moed et Hallgracff.
1978 a' '&rker et af., 1980 a ; Musch, 7980). Le bon ccmportemsnt lors de
1'ncidificati.o~ intéressant, Le prix S%uit est un arment suppl&ncn-
taire.
3.
ACIDIFICATIOI~'
Pour transformer les chlorophylles en phEopi@xents, divers Ments peu-
vent ijtre employés. La chaleur ( 100°C) a été mployee (Vhitc et rd. ,, ? 972).
Plus fréquent 3 car plus simple, est l’emploi de lzacidificatiGsr UE
acide minéral fort ou un acide organique,
3.1. MODALITES
3.1.1. HC1
La procédure la plus fréquente consiste ~3 !additionner un volume faible
de HC1 dilué ?ï l*échantillon. Les conditions op6%atoires sont souvent d&ri-
tes avec une surprenante imprécision, tant sur le volume ("quelques gouttes")
que sur la concentration("dilué<', 'de 0,5 à '1 #'), Holà Ransen et Rianann
(1978) reecmmandent une concentration finale de 3,10'3M BCI, ,s..gissar.tt 3min.
Le pR intervient fortement 9 à la fois sur les spectres-des diff&ents pig-
aents et sur la vitesse de transformation'des chlorophylles :, la ch1 b se
transforme en ph6o b 5 a 9 fois plus lentement que la ch1 a en phéo R-
f Holm Hansen et FlieîGann, 1978). Moed et Hallegraeff (1978)~indiquent-un
pH souhaitable de 2 $6 à 2,s. Pour un &ne volume d ‘HCl, le pouvoir tampon
des difffrents solvants d&r&t dans le sens éthanol-néthanol-ac&one ;
80 %-acétone 90 fi.
P~I.w des dosages ultérieurs en spectrm&rie, l’extrait sera neutreSi-
sé ~HO$JI Haisen et Riunann, 1978 ; Mctrker et al., 198o.b).
:-
3.j.2, Acide oxafique
Afin de limiter les risques dgacidification excessive,certains auteurs
préconisent L’emploi de l’acétone saturée d$acide oxalique, 3 raison de 2
2 5 % de'l'&hantillon (Baudouin et Scoppa,l97l).La r6actionest beaucoup plus
lente (HO&~ Hansen .et al. 5 1965) ; il est possible que ce soit une raison
du peu de succès demthode,
4
3.2. FACTEUR ACIDE ("'ACID FACTOR"', ACID RATIO"')
Dam le cas a< la spectrophotcm%tric, la majori& des auteurs conside-
rent que le facteur .acide5 rapports des absorptions avant et après acidifie.
cation, a une valeur constante de 137 pour 1% c!i~, a ~OIXXZV& a 6.65 rrm.
_I
Le rapport des fluorescences avant et aprC:o Gcidification (F,/Fa) varie
en fonction de nombreux facteurs :
- Modalité de l'acidification (voir plus hmt) 4, 'le temps joue un, @-
le pr6pondbrant dcms le cas des acides faibles ;
- Pourcent~c,3 dscau dans lsacbtone (Neveu.x,, 1376) ; cet, effet est pro-
bablement Ii6 au pH (Moed et Hallegraeff, i%?7). 5~ facteur acide diminue
quand le pourcentage d'eau augmente :
- Longueur d"onde de lgexcitation, ii largeur de bande constant (Saijo
et Nishizawa, 1969) ;
- Largeur de bende de la lumière dlekzitation (Baudouin et Scoppa;l971):
- Rature des filtres secondaires et du pf-loto~multiplicateur (Neveux,
1976).
L'interaction de ces diff&ents facteurs explique les chiffres extrême-
ment variables apparaissant dans les publications D puisque les conditions
expkimentales sont pour le moins variables, ct pqrfo:is non contrôlables.
Le facteur acide diffère, de plus, suivant le pigment consid&Éj. Les valcurr~
varient ainsi entre G,g et plus de 11, suivant les conditions (tabl. 1).
I
4...
M E S U R E S
P A R
P L U D R I: Y E T R f E
4.1, CARACTERISTL~ES OPTIQJJES DES PIGMENTS
Les logeurs d*onde d'absorption (excitntion) et d'émission maximum
sont variables selon les pigments consid&&, Airk, Baurio?~in et Stoppa
(1971) rcl&ent un spectre de diffkence entre chl 2 et ph6o 2 avec wi
maximum 3 433 nm :, le '?ratio spectru$ de ces deux pieents n un maximum
5 environ 438 m.
Pour les divers pi@ents principaux, les longueurs d‘onde d'excitation
et d'6mission sont assez diffÉrentes suivant les euteurs (tabl. X.1).
Les fluorescences ont des intensit6s rel?kives varia,bles. En outre, le
signal donné par 1 ~$lM.l-~ dPun pi(pnent don& LX;.~ ?on&ion. de la longueur
d'onde d'excitation (White et al,;, 1372).
4.2:MATFRIEL
': Les probl$mes purement techniques de m~?3&ieX sont souvent totalement
négligés? ou du moins fort peu mentionn6s. La rigueur :semble faire souvent
defaut quant aux conditions exp6rimentales (temps, vol,umes: p?l, etc), nous
l'avons dfj8 vu. Peu d*efforts sont faits, fgalemcnt, en vue d'améliorer
les techniques et le mat&iel et des publicatians relevant des d&ails im-
portzknts ont 6% n&$igi'es au profit, de routines bien &ablies mais per-
sonnelles.
- Le'fluorimètre le plus employé est 'JC Turner 111: t'quipc de divers,ac-
cesSOi+es. L@cmploi de spectrofluarim$tres est' exceptionnel en routine de
terrain.
5
4.2.1. Lampes
- F4T4 BL (Strickland et Parsons, 19681, lmpe UV à vapeur de rq~;, donc
spectre dc lignes ;
- F&TSB, qui a une hission continue (dOap&s le $onstructeur) et non
un pie (neveux, 1976) ;
- Ranovia xenon:iYI W(Baudouin et Stoppa, 1971). On peut.remarquer que
la puissance totale du Turner 111 est de 720 W (Operatingmanùa=l) ;
- Kulandaivelu et Daniel1 (7980) indiquent un optimum de 10 W,m'-2 pour
l'excitation.
4.2.2. Photcrmultiplicateur
- RCA 931 A sur les anciens Turner 111 :
R 136 Hmamatsu, 15 fois plus senible que le pr&édent dans le rouge
mevei.x, 1976) ; i
- R 446 Hswmatsu, plus sensible encore (Baudouin et Stoppa, 19'Tl).
TnstallG en usine sur les modèles actuels Turner Ill-003 et 111-004 ;
- R 456 Hemamatsu (Baudouin et Stoppa, 1971) ;
- R 375 Hauamatsu (Kulandaivelu et Daniell, 1980).
4.2.3. Filtres optiques
Il semble que les publications montrant l'importance du choix des lon-
gueurs d'onde, et de leur précision, n'aient guère eu d'Écho. Les filtres
interf&entiels semblent rarement employ&, bien que nettement pr&&ables
quant a la dEfinition et & l'Z%roitesse de leur bande passante. Ils sant
plus chers que les filtres d'absorption (600 FF ou 120 US$ contre ZOO'FF),
4.2.3.1. Filtres'$rimaires
-_------------------------
- CS 5-60 Corning (Turner 110~992), le plus employc ; maximum a 420 nm
:Blas~a, 1973) ou 425 nn (Heaney, 1978) ;
- CS 5-62 (Corning ?), maximum 8 402 nm (White et al., 1972) ;
- cs 5-74
i l
, maximum à 44.2 nm (White n., 1972) ;
- cs 5-75
f9
s mairmun à 465 nm (mite èt., 1972) ;
- Corning 5113, maximum à 400-460 m (filandaiv~ Daaiell) 1:
- Corning 5543
3
.,,
(Slovacek et Hannan, 1977) ;
- wkatten 47 3, Equivalent au CS 5-60 (Strickland et Par~ons).
4.2.3.2. Filtres secondaires
--------------------------"
- CS 2-64 (Turner 110~9211, filtre d'arrêt :
. a.rrGt à 640, maximum à 675 m (~lasco, 1973),
645,
l
a r r ê t à
maximum à 687 mn (Heaney, 1978),
ar&t à 650 environ (Holm Hansen et a~.., 19651,
: cs 2-60 :
arr& 3 630 (Holm Hansen et al., 1965) ou 599 mn White et al.,l972) m
L Wratten 25 :
arr& à 600 nm environ (Holm Hansen et al., 1965), moins 6troi.t que
CS 2-64 (Tunzi et al
1974).
- (CS 2-6o-T%$,‘(1) 680) maximum à 680 m (White et a~
1972) ;
- (CS 2-60 + D&L (650) maximum à 653 nm (White et ri$72) ;
.
-“.
(1: B&L : Bauscb, b ksnb.
---
6
- (Cs 2264 '4 Mratten 70)
.*
arr% 3 660 nm (Loftus et Carpenter, 1~1)
- (CS 2-59 + Corion 6509 (1))
maximum 2 650 nm(~oftus et Carpenter, 19’71)
.:.
*--~(CS.‘2%2, ,+ COpimi 6217. ( 1))
mtii&nG 620 rnn(Loftus et Carpenter/ 1971)
.; _ ~&&
“$,41 8
!.
.-
.-
0
(Slovacek et'Hanr,an, 19'7'0
- Schott 7 ?
maximum & 690 rm (Kulandaivelu et Dani.ell, 198@
.,
. ..4.2.4.. Cuvettes
i’
La forme des cuvettes employées nFest g6n~ralement pas mentlonG%', ."
Turnér fournit des cuvettes cylindriques, Une cuV&te rectarqulai?e e s t em-
ploy& paJ: Kulandaivelu et D&niell.(l@û).
'
.:.
~,2,5, mploi du fluori&tre ,' .
Bien que de ncanhreux fluorimètre.1; soient rem,arquabl<ment stables dans
le temps (Dufour, canm. pers.), plusieurs auteurs reccmmandcnt 'des reCali-
brations périodiques par le sulfate de quinine en solution dans H@?.+ 0,1 g
3 des concentratiuns variables (Loftus et Csrpenter; 1971 : Slovacek et
HanMi; '1977). StèMrt et Wetzel (1980) indiqucrit un'e lecture, de 40, en
éch&fie 1O'X; po& .15.clff.l-' ,de quinine.
:, :
Une rècalibration est aussi. possible par de la chlorophylle 2 pure '
(ref. C57?3 chez Signa Chemical Canpany, POP 14508, St-LOUIS, 63172, USA).
4.3. MESITiES‘mT F&ORIMETRIE
4.3.1. Mek~i~sur les extraits
Dans la Plupart des cas, une seule longueur d'onde est utilisGc cii
l'excitation, une autre B. la lecture. Des interf+ences peuvent aj@ra?tre,
surtout &r la ch1 b (Rolm Hansen et Ri,gann, 19'ï'fi ; R1%i, 1980). Il est ~OR--
sible de travailler-2 plusieurs 'longueurs dlonde pour kviter ces interf&f:nczs.
!40nOchraaatiauu-,
--IL).".l"-l---l
Si T est le facteur acide, d&termi& p&ci.labl&ent dans les tGmes con-
ditions expérimentales, on a :
ch1 2 = CX.(T /(T~l)).(Fo-Fa)
phco 5 = %.(T /(W)).(T.F,-F,)
I.
avec un facteur constant c1 regroupant'toutcs les caract&istiquês de l"aD-
pareilla&z. Le Pactcur a devra aussi être d?%erminé cxp&imentaleW?nt
(Holm Hansen et al,, 1965 ; LStrickland et Pazsons 3 1g68 : Loftus et C!arpentcrn
1971).
'!
Les équ+tions ci-dessus $&supposent lVabsc?nce de ch1 2, dont la Prg-
(1) Il est R remarquer que ces deux r?!fErences n'existent pas dans lc
catalogue Corion 1979.
7
sente entraînera une sur-esttiation de la ph$o a (Marker et al., 1980 b).
Les diff&ences de vitesse: de transf@xg@xion dëk ch1 R emholm Hansen
et Rismann, 1980) n’ont pas été utili&es, 3 notre’èorGaiss&ce, pour dis-
tinguer entre les deux :chlorophyiles. ’
*.
Polycbrrcanatique :
m.w---- .a.---.. .
-.
Les longueurs d’onde différentes dsexcitation et d’kaiasion maximum des
divers pie;ments peuvent permettre de les distinguer. Quelques hypothèses
doivent être faites, entre autres que les divers composants du mélange fluo-
rescent ind6pendamment et que la ccanbinaison de leur r6action est lin6aire.
- A l’excitation (White.et al., 1972) :
. en 1 ‘absence de phbop~gments :
chl a = 0,733.F4,5
- 0,029.F460
ch1 b =
0,292,~-~
-
0,131.F403
.~
1...
. en prdsence de ph&opiigrnents, avec II la variation de F apr& acidifi-a
cation, et Fa la fluorescence après acidifidation :
ch1 2 = l,46.A44*
+ O,O~3.A46,
ch1 0 = 0,43.A460
- 0,33.A 440
ph6o ‘it = 0,70.F,405 - w3*F844f-J
p h é o T) = ,81 .Fa440 - 0,04 .Fa405
- A l’&nission (Loftus et Carpenter, f971) :
ch1 2 = 0, 1 ~~~A660-o,1~~.A~~o~~,~ 10.0t;20
ch1 b = o,052.1i6&,- 0,2R6.A650+0,310.~620
ch1 2 = -o,o12.A~60+0)036.A650f0,264.A620
4.3.2. MesWes in vivo
Ie concentration de chlorophylle (mesurde par spectrophotaw%rie, ou
par fluorim&rie sur les extraits) ne P&ente pas uné relation linéaire
avec la fluorescence in vive (“IVT ),
un prunier facteur est instrwnental. 1Jeveu.x (1976) relève une saturation
de L’appareillage, Une telle saturation, due & l’instrumentation autant qu D %
19auto-ahsorption par le pigment m%ne, appara%t aussi sur des extraits au-
delà de 100 pg.1 -l (Dufour, cam, pers. 1. Strickland (1968) observe une loi
exponentielle entre IVF et chl, et reccmmande de ne pas utiliser l’échclfc
1X. Thanas (1970! obtient une réponse linéaire mais ne précise pas la masque.
tilandaivclu et Daniel1 (1980) indiquent un maximum mesurable de 500 &#.l’l.
Dans la plupart des cas in situ, la relation est cependant linéaire dans
une même masse d9eau entre IV* et chlkophylle (Blasco, 1973 ; Neveux, 1976:
Herbland et Voituriez; 1977) et on peut écrire : :
chl
- K.(IvJ?)
Ce coefficient de proportionalité, K, varie de 1,l (He&ey, 1-978) ?i
7,6 (Tunzi e t a., 1974) en fonction de nanbreux facteurs, -E diminue quand
la profond= la thermocline -ente (Rerbland et Voituriez, 19?7) ;
l’espèce daninante joue un rôle (Striskland, 1968 ; Slovaeck et.Hannan,1977i.
L’état physiologique semble jouer un rôle primordial, par exem-@e déficience
en N ou P (Kïefer , 1 B73 a et b ; Slovaeek et Hannan, 1977) ou taux de crois-
sance in situ ~(fïe'ariey, 1978) ,ou in vitro (Dufouz, colllll. pers,,). Le "fluores--
pence numbc& (Kiefer, 1973.a) varie tr& fort:%ent avec la bdèrr !%aJIeY,
1978); La photoinhibition se manifeste nett@ent (Kiefer, 197 1: ; Heaney,
1978) 3 des intensites lumineuses faibles. 3071 m6canisme est double (Kiefer,
1973 a ; Barris et Piccinin, 1977).
La mesure.de,la IVF ne résoud donc pas lc probl&e dc la d&er&nation
de la'%?i.&asse pl.anotonique. En outre3 de nombreux travaux effectues sur ,l:t,
IVF' ne tiennent pas ocmpte de la fluorescence dissoute, dont l'importanee~
n"est pas &gligeable pcw*fois (Herbl%td et Voituriez, 1'37'7 :, Heaney, 197'R"
Cullen et Renger, 7979). Suivant le type de filtre employé; des dgbris ce&-
lulaires ou des cellules de petite taille pruvent passer dans le filtrat
(Herbland, cm. pers.) et cntrazner une sur-&,ïustion sérieuse de ln fluo.-,
rescence dissoute.
4.3.3. Emploi de la DE
Les Vari@ions vues ci-dessus du'tfluorescentit: number" K correspondent
rendement de luorescence ("Fluorescence yicld")vari&le.
Ce rendement est fonction inverse du taux de trsnspart dî$lectrons
la photosynthèse (Kiefer., 1973 a) :, le r'~ndement de fluorescence_est
,. . \\
-
en ccmpétition avec le rendement chimique (Dutlor, 1966). JJne mesure I~ïa~ble
de la chlorophylle par IVY implique un d6coupl~e, par blocs.& chimique
in vivo
(Duysens et Sweers', 1963) ?i qui 6q7liv;Crr~t .au dilcouplage rWis6, au-
treznent, par lFextraction a&t.onique. La DCXU ('l) r&lise ce blocegc au nivelu
de la r&ction de JXi.11 (Fleischhacker et Zcngerz, 1978).
- a
Les concentrations finales r&alis6es sont veziables : ICI'M(Fheischhacker
et Se er, 1970 : Semuelson et al., ii78 :, Ku ~~dsivclu et Daniël19 1980),
3.10- G (Culien et Renger,
t
1979), 3 à lO.~l!Y'11 (Slovscek et Hannan, 1977).
Les G%ais de &action, et d'observation, vari<& de 30 E (Cullen et Renger,
1979 ; Kulandaivelu et Daniell, 1980) ,I 10 min (Samuc%sor~ et al, 2 1978). 1.~
production dgOz est totalement stoppse aprss ?,5 min m&e -es formes
cuirassées (Slcvczcek et IIsnnan, 1!)77). Des dtlais de 1+ ls 1Jr s sont probable-.
.
ment insuffisants., et expliqueraient certains r.ds
~~ultats'dkcevants in situ
-1
(Roy et Legendre, t980).' ’
.
La fluorescence est mesurée sans DCMU (Y,!;) itt avec DCMU (PD). On Calcu"
le,,, ,sqit le r&pport FD/$?R (Roy et Legendre 3 l@O), soit un Y7fluorescencc
re'sponse index", FR1 : ,:
.‘
FR1 = .(FD - Fti)/PD
. . .
Une val&r nulle de FRI, correspondant '.X une absence? d'effet de la
DGMII, indique une. capaGit. photosynth&ique nulle.
-:
:.
(1) DCMU : 3-(3,4-dichlorophenyl)-l,l-dim6thyl-ur6e
fabriqu6e par K: f. K '
’
vendue par 0,S.I. (154 FF/100 d
ou Touzart et Matignon
9
Résultats :
<' .
FD augmente de fac;on asymptotique avec le temps de seaction (Ssmuelson
a l
et . , 1978'). La fluorescence double (FR1 = 0,5) apr& 30 i? 60 s tant sur
des cultures que sur des populations n&turelles. In, situ, le maximum de FRI
(1?,6) est obser&. 2 la profondeur du maximum de chlorophylle (Cullen et,
Renger, 1979). ?RI aug&en%e avec la profondeur (Roy et Legendre, 1980).
Plusieurs Gtats physiologiques extr2mes ont été r6alisés sur des cultu-
res z forte carence en N, P, (102, empoisonnaaent par B$jC%.~ etc... Quelles
que soient les espèces et les conditions, il existe une relation entre 'bjD
et la concentration de ch1 a mesurge sur les extraits (Slovacek et Hannan, .
1977).
On observe d9autre part une elation étroite entre FR1 et la photosyn-
thèse, mesurée par exwple par
IEC (Ssmuclson et al., 1978). D'autres ex!za-
?les d'utilisation de la DC!& aboutissent 2 des~lusions analogues quant.
2 lPint&êt de cette méthode (Halmann et Elgavish, 1979 ; Kulandaivelu et :
Daniell, 1980).
5 .
M E S U R E S
P A R
S F E C T R O P H O T O M E T R I E
La spectrophotc&trie est gén&alanent consid&& canme la méthode de
rkférence pour des mesures par fluorim&rie. îQus avons vu que 19anploi de
la DWU pemet des déterminations absolues y, drautre part, la calibration
du fluorim8tre peut se fsire sur de la. chlorophylle pure, Pour ces raisons?
la spectrophotanétrie perd une partie de son importance, et ne sera t.rait&e
ici que rapidement,paur m&oire.
Les corrections de turbidité des extraits sont ba&es généralEment sur
une lecture & 750 nm (Mass, 1967 ; Samuelson et al., 19781, encore que d'au--
tres longueurs d'onde aient été esnployees : 7G (Jensen, 1978) ou 720 rm,
5.1. MESURES MOIW!HR~ATIQ'JES
Pour la chlorophylle a, 'les coefficients dYabsorption spécifique sont
assez bien connus (Marker et al., Tg80 b). A 665 mn, on a selon le solvant
employ6 :
- acétone 90 $
89
- Êthanol 90 $
87
- méthanol
77
- diéthyl éther
100
Pour l'acétone 90 3, on aura ainsi l'équation (Jençen, 1978) :
ch1 a = 71,23.(D665 - D730)
D'autres auteurs utilisent des‘vnleurs quelque peu differentes
: Il,9
chez Talling et Driver (1963) par exonple.
La détermination des phéopigments se fait par lecture à 665 nm avant
(1+)) et après (D,) acidification. Diverses 6quations sont don&es, analogues
ElR3.S
non idcntiques,par divers auteurs. En n6gligeant les facteurs de volu-
mes d'extrait et dgéchantillon, on trouve ainsi :
ch1 a = 26,I (Do i Dal
) Strickland et“
phE0 -
= 26,‘7 (1,7.D, - Do) )- Parsons, 1968
5.2. MESURES A DEUX LONGUlS DICNDE
Differents pigments peuvent être détermin& en utilisant les diffErents
aaximums dlabstirption :
et
5.3. ME&RES A 'TROIS LONGUXURS D"OTVDE
.:
',Des.îectures 5 trois longueurs d'onde permettent de déterminer les con-
centrations respectives' de ch1 a, 2 et c. Les 6quations no prennent cepen-
dant pss cn c&pte les ph6opigments correspondants et, de ce fait, qur-
évaluent 'les chlorophylles (Markrr et al., 1980 b).
Les coefficients, et, les 1o~ëiZYd'ondc.
varient suivant les aut,zurs 1
Jensen (1978) donne les cquations :
ch1 a = 11 ,85.11G64 - 1 ,54,D61rpf ~- 0,0:5.D63C
ch113 z
5,43.DG64 +21,03.D647 - :?$.D,;3,
ch1 c =
1 ,67.n61;4 “- 7$.!fIh47 .,i!+:52.Dtj30
Strickland et Parsons (1968) donnent, troic s&es d'équations., de saur-
ces différentes, sans d6terminer la 'valeur rol::tivz de ces iiquations, dont
les, coefficients sont assez fortement diff&cztn.
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14
TAIEEAU T .*L- Valeur du facteur acide
*
c h l a
Rif.
*.
-7
I.
-
-
2,3
valeur moyenne
(1)
’ 1,7
acide oxnliqué, 3 min
(2)
6,f-l
excitation .G 445 nli
12,s
excitation 3 438 nm
extrapol. à
largeur de bande nulle
0,4-3.,Q
suivant acide em?loyG et temps
1,4?
avec Fh-tomllltipF.iCateur ?! 1! 3fi
3,07,
(0)
2,,n-11,5
exci.tation entre 430 et 4W m, lar:~eur
(7)
:
4e bande l? nm
..-
-
-
-
-
-
--4
ch1 JJ
! 0,42
(5)
i
0,s
(
6
)
chl c
-
-u-m
CI.
1,73
fi.1 tre
(5)
2,4
fi3 tre. CC 2-6h
(4)
538
filtre CC 7-45~
14 ; 1
(6)
-
.
TARLRAlJ II.-- Caract&istiques optiques
1 5
!
* j
excitation
, r$f * 7:
' .
&ission
t, ref.
;
; pheo a :
.- <
i pheo 2 i
437
610
wREFEREI?CES POUR LES TAF$LF,AUX
(11 z Strickland et Parsons, 1968
(2) : Yentsch et Menzel, 1963
(3) : Bfmdouin et Smppa, 1971
(4) : HCGZI Hansen et al., 1965
-.
W : tieveux, 1976
(6) : Loftus et Cerpenter, 1971
(7) : Saîjo et Nishiznwa, 1969
(8) : Vhite et al., 1 9 7 1
(9) : Tunzi et,, 1974
<<
:
.
:
. <.
DOSAGE
FLUORIMÉTRIQ!JE
E S S A I D E REVUE D E S
. .
MOL)ALITES ‘ T E C H N I Q U E S .
Jean PAGES
I N T R O D U C T I O N
La biomasse du phytoplancton est souvent d&erminée par le biais de
ses pigments chlorophylliens. La mesure de la concentration de ces pigments
est dé,j$ un procéd6 fort ancien, mais une rapide revue de la littérature
fait cependant appara'itre que, malgrk divers essais de normalisation (SCOR-
-TJ~~SQ) 1966 ), les madalit& techniques sont loin d%tre uniformes.
.&us avons tenté de rasscsnbler ici un certain ncmbre de détails tech-
niques cités par divers auteurs, afin dPobtenir une vue g&-&rale. Ceci ne
saurait ^etre une revue exhaustive, et encore moins critique, venant &prè;s
les travEtux publiés dans les "Ergebnisse der Limnologie" (Beiheft 14,, 1980).
Il s'agit plut& d'un essai de mise au point, 3 usage interne, axé sur les
dkails matériels et prenant en compte quelques techniques récentes.
En outre, l'accent a été mis, volontairement, sur le dosage par fluo-
rimÉtrie, plus adapté aux conditions de la haute mer et plus rapide ; la
spectrophotan%rie a été assez n&$&e.
1 .
F 1 LT R AT 10 N "
'
1.7. CEOIX DES FILTRES
Les membranes filtrantes permettent,, du moins en théorie. de séparer
des tailles différentes dgorganimes (Faust et Correl, 1976 : Venrick et 81,:
19?7?. En fait, le choix de la marque est assez capital ; les membrane7
Nuclepore semblent peulwfournir des perforations réellanent calibr6es
(Sheldon, 1972), La plupart'des membranes, ~epend&t~~'coimatënt assék'vite
et peuvent, par leur dissolution ult&ieure,apporter des substances parasites.
Les filtres en fibre de verre ont des caractéristiques de filtration
.@us satisfaisantes (Lenz et Fritsche, 1980). Leurs fibres sméliorent la
2
destruction des cellules dans le cas où& filtre est broyé dans le SO~&?+I~.
Leur gorosit est assez bien contr%lée (Holm Hansen et Riemann, 1978 ; MSX?.CT
et Ed.,, 1980). Il semble cependant que lcsk'ilhesGelmah type A soient infé-
rieurs aux filtres Whatman GF/C (Herbland, comm. pers.),,
"..,
1.2. MODALTTF DE 'L&FILTRATION "
La dépression, lors de la filtration, ne doit, pas dépasser l/lOc d'at-
,mosph&e (As&nson, 1978 ; Ekmxp;.~978).
L9addition d'une suspension de %$!~
R. i-té recommand& (Strickland et
Parsons, 1968) 1 LPutilité, ou m;bme les bienfaits, d'une tzlle procédure, SO?:*
assez discut& pourtant (Holm Hansen et Riemann, 13'78 r, Marker et al,, 1980 b),
1.3. I~~OTJSEXVATIOI\\J DES FILTRES
Certains auteurs signalent une 'baisse sensible de la teneur en chlora-
phylle, tant dans les extraits que swhs filtres (Blasco, 19731, même si
ceux-ci sont lyophilis& (Lenz et Fritsche, l@O),, Inversement, d'autres
essais n'ont pu mettre en 6vidence de perte.9 sur des filtres congelés enco-
re humides et conserv& 3 -20% (Holà Hanscin ct Riemann, 1980). Des filtres
ont St6 conservés de façon satisfaisante (moins de 20 ? de pertes) à -15*C,
sur gel de silice, pendant 10 mois (Dufour, 1972).
2'.
EXTRACTIOI'J
,<
,'.
Plusieurs 3aivae3 ont été employks pour extraire les pigments. L7 a&-
tone est le plus‘fr&quemment utili&e, mais d7autres solvants ont &é reca-
mandés.
.
.
2.1,. ACETONF
Le tiélange le plus fr6quen-t est lvacCtone SS 10 $ dPeau ("acétone'90 "").
Certains auteurs emploient des mélanges & 85 ou 80 %, Baudouin et Seoppa
(1971) utilisent lrac6tone 85 $ satur6e de MG?O~.
Afin d'améliorer lgefficacité de l"extraction, Stauffer et RI. (1'379)
pr&onisent un mélange acétone-DMSO (a:a) (1). Le broyage desx&es a 6%:
recommande (Strickland et Parsons, l968) mais somh:Le d'une efficacitg dis-
cutable (Holm Hansen et Riemann, 1978) et pc& m$me augmenter la variabili-
té @ufow, 1972).
Un des principaux d&avs,nts.ges de l'ac&one est sa faible efficacits
d'extractipn sur de nombreuses formes Planctonique:%.
('1) f;e DM50 fltiorcsce fortement avec &?x, = 405, ,\\hi z 525 m
.
3
2.2. METHAWL
Plusieurs auteurs recommandent, comme plus efficace, le m~thanol, soit
bouillant p&dant 30 s (?&aney, 1978 ; Stauffer et al., 1979 : Biemann,
1980), soit plus simplement b froid (Berland et -1970 : Holà Hansen et'
iGaa.nn, 1978 ; Masker et al,, 1980 a et b), %?%oyage du filtre est alors
inutile.
Le comportement des pipents dans le méthanol acidifié peut prhmter
quelques'problèsaes (Marker et al., 1980 a ; Uusch, 1980). Les vapeurs de
m-thanol sont assez taxiquo*soh, 1980).
L'éthanol bouillant est aploy6 par quelques auteurs (Moed et Hallgracff.
1978 a' '&rker et af., 1980 a ; Musch, 7980). Le bon ccmportemsnt lors de
1'ncidificati.o~ intéressant, Le prix S%uit est un arment suppl&ncn-
taire.
3.
ACIDIFICATIOI~'
Pour transformer les chlorophylles en phEopi@xents, divers Ments peu-
vent ijtre employés. La chaleur ( 100°C) a été mployee (Vhitc et rd. ,, ? 972).
Plus fréquent 3 car plus simple, est l’emploi de lzacidificatiGsr UE
acide minéral fort ou un acide organique,
3.1. MODALITES
3.1.1. HC1
La procédure la plus fréquente consiste ~3 !additionner un volume faible
de HC1 dilué ?ï l*échantillon. Les conditions op6%atoires sont souvent d&ri-
tes avec une surprenante imprécision, tant sur le volume ("quelques gouttes")
que sur la concentration("dilué<', 'de 0,5 à '1 #'), Holà Ransen et Rianann
(1978) reecmmandent une concentration finale de 3,10'3M BCI, ,s..gissar.tt 3min.
Le pR intervient fortement 9 à la fois sur les spectres-des diff&ents pig-
aents et sur la vitesse de transformation'des chlorophylles :, la ch1 b se
transforme en ph6o b 5 a 9 fois plus lentement que la ch1 a en phéo R-
f Holm Hansen et FlieîGann, 1978). Moed et Hallegraeff (1978)~indiquent-un
pH souhaitable de 2 $6 à 2,s. Pour un &ne volume d ‘HCl, le pouvoir tampon
des difffrents solvants d&r&t dans le sens éthanol-néthanol-ac&one ;
80 %-acétone 90 fi.
P~I.w des dosages ultérieurs en spectrm&rie, l’extrait sera neutreSi-
sé ~HO$JI Haisen et Riunann, 1978 ; Mctrker et al., 198o.b).
:-
3.j.2, Acide oxafique
Afin de limiter les risques dgacidification excessive,certains auteurs
préconisent L’emploi de l’acétone saturée d$acide oxalique, 3 raison de 2
2 5 % de'l'&hantillon (Baudouin et Scoppa,l97l).La r6actionest beaucoup plus
lente (HO&~ Hansen .et al. 5 1965) ; il est possible que ce soit une raison
du peu de succès demthode,
4
3.2. FACTEUR ACIDE ("'ACID FACTOR"', ACID RATIO"')
Dam le cas a< la spectrophotcm%tric, la majori& des auteurs conside-
rent que le facteur .acide5 rapports des absorptions avant et après acidifie.
cation, a une valeur constante de 137 pour 1% c!i~, a ~OIXXZV& a 6.65 rrm.
_I
Le rapport des fluorescences avant et aprC:o Gcidification (F,/Fa) varie
en fonction de nombreux facteurs :
- Modalité de l'acidification (voir plus hmt) 4, 'le temps joue un, @-
le pr6pondbrant dcms le cas des acides faibles ;
- Pourcent~c,3 dscau dans lsacbtone (Neveu.x,, 1376) ; cet, effet est pro-
bablement Ii6 au pH (Moed et Hallegraeff, i%?7). 5~ facteur acide diminue
quand le pourcentage d'eau augmente :
- Longueur d"onde de lgexcitation, ii largeur de bande constant (Saijo
et Nishizawa, 1969) ;
- Largeur de bende de la lumière dlekzitation (Baudouin et Scoppa;l971):
- Rature des filtres secondaires et du pf-loto~multiplicateur (Neveux,
1976).
L'interaction de ces diff&ents facteurs explique les chiffres extrême-
ment variables apparaissant dans les publications D puisque les conditions
expkimentales sont pour le moins variables, ct pqrfo:is non contrôlables.
Le facteur acide diffère, de plus, suivant le pigment consid&Éj. Les valcurr~
varient ainsi entre G,g et plus de 11, suivant les conditions (tabl. 1).
I
4...
M E S U R E S
P A R
P L U D R I: Y E T R f E
4.1, CARACTERISTL~ES OPTIQJJES DES PIGMENTS
Les logeurs d*onde d'absorption (excitntion) et d'émission maximum
sont variables selon les pigments consid&&, Airk, Baurio?~in et Stoppa
(1971) rcl&ent un spectre de diffkence entre chl 2 et ph6o 2 avec wi
maximum 3 433 nm :, le '?ratio spectru$ de ces deux pieents n un maximum
5 environ 438 m.
Pour les divers pi@ents principaux, les longueurs d‘onde d'excitation
et d'6mission sont assez diffÉrentes suivant les euteurs (tabl. X.1).
Les fluorescences ont des intensit6s rel?kives varia,bles. En outre, le
signal donné par 1 ~$lM.l-~ dPun pi(pnent don& LX;.~ ?on&ion. de la longueur
d'onde d'excitation (White et al,;, 1372).
4.2:MATFRIEL
': Les probl$mes purement techniques de m~?3&ieX sont souvent totalement
négligés? ou du moins fort peu mentionn6s. La rigueur :semble faire souvent
defaut quant aux conditions exp6rimentales (temps, vol,umes: p?l, etc), nous
l'avons dfj8 vu. Peu d*efforts sont faits, fgalemcnt, en vue d'améliorer
les techniques et le mat&iel et des publicatians relevant des d&ails im-
portzknts ont 6% n&$igi'es au profit, de routines bien &ablies mais per-
sonnelles.
- Le'fluorimètre le plus employé est 'JC Turner 111: t'quipc de divers,ac-
cesSOi+es. L@cmploi de spectrofluarim$tres est' exceptionnel en routine de
terrain.
5
4.2.1. Lampes
- F4T4 BL (Strickland et Parsons, 19681, lmpe UV à vapeur de rq~;, donc
spectre dc lignes ;
- F&TSB, qui a une hission continue (dOap&s le $onstructeur) et non
un pie (neveux, 1976) ;
- Ranovia xenon:iYI W(Baudouin et Stoppa, 1971). On peut.remarquer que
la puissance totale du Turner 111 est de 720 W (Operatingmanùa=l) ;
- Kulandaivelu et Daniel1 (7980) indiquent un optimum de 10 W,m'-2 pour
l'excitation.
4.2.2. Photcrmultiplicateur
- RCA 931 A sur les anciens Turner 111 :
R 136 Hmamatsu, 15 fois plus senible que le pr&édent dans le rouge
mevei.x, 1976) ; i
- R 446 Hswmatsu, plus sensible encore (Baudouin et Stoppa, 19'Tl).
TnstallG en usine sur les modèles actuels Turner Ill-003 et 111-004 ;
- R 456 Hemamatsu (Baudouin et Stoppa, 1971) ;
- R 375 Hauamatsu (Kulandaivelu et Daniell, 1980).
4.2.3. Filtres optiques
Il semble que les publications montrant l'importance du choix des lon-
gueurs d'onde, et de leur précision, n'aient guère eu d'Écho. Les filtres
interf&entiels semblent rarement employ&, bien que nettement pr&&ables
quant a la dEfinition et & l'Z%roitesse de leur bande passante. Ils sant
plus chers que les filtres d'absorption (600 FF ou 120 US$ contre ZOO'FF),
4.2.3.1. Filtres'$rimaires
-_------------------------
- CS 5-60 Corning (Turner 110~992), le plus employc ; maximum a 420 nm
:Blas~a, 1973) ou 425 nn (Heaney, 1978) ;
- CS 5-62 (Corning ?), maximum 8 402 nm (White et al., 1972) ;
- cs 5-74
i l
, maximum à 44.2 nm (White n., 1972) ;
- cs 5-75
f9
s mairmun à 465 nm (mite èt., 1972) ;
- Corning 5113, maximum à 400-460 m (filandaiv~ Daaiell) 1:
- Corning 5543
3
.,,
(Slovacek et Hannan, 1977) ;
- wkatten 47 3, Equivalent au CS 5-60 (Strickland et Par~ons).
4.2.3.2. Filtres secondaires
--------------------------"
- CS 2-64 (Turner 110~9211, filtre d'arrêt :
. a.rrGt à 640, maximum à 675 m (~lasco, 1973),
645,
l
a r r ê t à
maximum à 687 mn (Heaney, 1978),
ar&t à 650 environ (Holm Hansen et a~.., 19651,
: cs 2-60 :
arr& 3 630 (Holm Hansen et al., 1965) ou 599 mn White et al.,l972) m
L Wratten 25 :
arr& à 600 nm environ (Holm Hansen et al., 1965), moins 6troi.t que
CS 2-64 (Tunzi et al
1974).
- (CS 2-6o-T%$,‘(1) 680) maximum à 680 m (White et a~
1972) ;
- (CS 2-60 + D&L (650) maximum à 653 nm (White et ri$72) ;
.
-“.
(1: B&L : Bauscb, b ksnb.
---
6
- (Cs 2264 '4 Mratten 70)
.*
arr% 3 660 nm (Loftus et Carpenter, 1~1)
- (CS 2-59 + Corion 6509 (1))
maximum 2 650 nm(~oftus et Carpenter, 19’71)
.:.
*--~(CS.‘2%2, ,+ COpimi 6217. ( 1))
mtii&nG 620 rnn(Loftus et Carpenter/ 1971)
.; _ ~&&
“$,41 8
!.
.-
.-
0
(Slovacek et'Hanr,an, 19'7'0
- Schott 7 ?
maximum & 690 rm (Kulandaivelu et Dani.ell, 198@
.,
. ..4.2.4.. Cuvettes
i’
La forme des cuvettes employées nFest g6n~ralement pas mentlonG%', ."
Turnér fournit des cuvettes cylindriques, Une cuV&te rectarqulai?e e s t em-
ploy& paJ: Kulandaivelu et D&niell.(l@û).
'
.:.
~,2,5, mploi du fluori&tre ,' .
Bien que de ncanhreux fluorimètre.1; soient rem,arquabl<ment stables dans
le temps (Dufour, canm. pers.), plusieurs auteurs reccmmandcnt 'des reCali-
brations périodiques par le sulfate de quinine en solution dans H@?.+ 0,1 g
3 des concentratiuns variables (Loftus et Csrpenter; 1971 : Slovacek et
HanMi; '1977). StèMrt et Wetzel (1980) indiqucrit un'e lecture, de 40, en
éch&fie 1O'X; po& .15.clff.l-' ,de quinine.
:, :
Une rècalibration est aussi. possible par de la chlorophylle 2 pure '
(ref. C57?3 chez Signa Chemical Canpany, POP 14508, St-LOUIS, 63172, USA).
4.3. MESITiES‘mT F&ORIMETRIE
4.3.1. Mek~i~sur les extraits
Dans la Plupart des cas, une seule longueur d'onde est utilisGc cii
l'excitation, une autre B. la lecture. Des interf+ences peuvent aj@ra?tre,
surtout &r la ch1 b (Rolm Hansen et Ri,gann, 19'ï'fi ; R1%i, 1980). Il est ~OR--
sible de travailler-2 plusieurs 'longueurs dlonde pour kviter ces interf&f:nczs.
!40nOchraaatiauu-,
--IL).".l"-l---l
Si T est le facteur acide, d&termi& p&ci.labl&ent dans les tGmes con-
ditions expérimentales, on a :
ch1 2 = CX.(T /(T~l)).(Fo-Fa)
phco 5 = %.(T /(W)).(T.F,-F,)
I.
avec un facteur constant c1 regroupant'toutcs les caract&istiquês de l"aD-
pareilla&z. Le Pactcur a devra aussi être d?%erminé cxp&imentaleW?nt
(Holm Hansen et al,, 1965 ; LStrickland et Pazsons 3 1g68 : Loftus et C!arpentcrn
1971).
'!
Les équ+tions ci-dessus $&supposent lVabsc?nce de ch1 2, dont la Prg-
(1) Il est R remarquer que ces deux r?!fErences n'existent pas dans lc
catalogue Corion 1979.
7
sente entraînera une sur-esttiation de la ph$o a (Marker et al., 1980 b).
Les diff&ences de vitesse: de transf@xg@xion dëk ch1 R emholm Hansen
et Rismann, 1980) n’ont pas été utili&es, 3 notre’èorGaiss&ce, pour dis-
tinguer entre les deux :chlorophyiles. ’
*.
Polycbrrcanatique :
m.w---- .a.---.. .
-.
Les longueurs d’onde différentes dsexcitation et d’kaiasion maximum des
divers pie;ments peuvent permettre de les distinguer. Quelques hypothèses
doivent être faites, entre autres que les divers composants du mélange fluo-
rescent ind6pendamment et que la ccanbinaison de leur r6action est lin6aire.
- A l’excitation (White.et al., 1972) :
. en 1 ‘absence de phbop~gments :
chl a = 0,733.F4,5
- 0,029.F460
ch1 b =
0,292,~-~
-
0,131.F403
.~
1...
. en prdsence de ph&opiigrnents, avec II la variation de F apr& acidifi-a
cation, et Fa la fluorescence après acidifidation :
ch1 2 = l,46.A44*
+ O,O~3.A46,
ch1 0 = 0,43.A460
- 0,33.A 440
ph6o ‘it = 0,70.F,405 - w3*F844f-J
p h é o T) = ,81 .Fa440 - 0,04 .Fa405
- A l’&nission (Loftus et Carpenter, f971) :
ch1 2 = 0, 1 ~~~A660-o,1~~.A~~o~~,~ 10.0t;20
ch1 b = o,052.1i6&,- 0,2R6.A650+0,310.~620
ch1 2 = -o,o12.A~60+0)036.A650f0,264.A620
4.3.2. MesWes in vivo
Ie concentration de chlorophylle (mesurde par spectrophotaw%rie, ou
par fluorim&rie sur les extraits) ne P&ente pas uné relation linéaire
avec la fluorescence in vive (“IVT ),
un prunier facteur est instrwnental. 1Jeveu.x (1976) relève une saturation
de L’appareillage, Une telle saturation, due & l’instrumentation autant qu D %
19auto-ahsorption par le pigment m%ne, appara%t aussi sur des extraits au-
delà de 100 pg.1 -l (Dufour, cam, pers. 1. Strickland (1968) observe une loi
exponentielle entre IVF et chl, et reccmmande de ne pas utiliser l’échclfc
1X. Thanas (1970! obtient une réponse linéaire mais ne précise pas la masque.
tilandaivclu et Daniel1 (1980) indiquent un maximum mesurable de 500 &#.l’l.
Dans la plupart des cas in situ, la relation est cependant linéaire dans
une même masse d9eau entre IV* et chlkophylle (Blasco, 1973 ; Neveux, 1976:
Herbland et Voituriez; 1977) et on peut écrire : :
chl
- K.(IvJ?)
Ce coefficient de proportionalité, K, varie de 1,l (He&ey, 1-978) ?i
7,6 (Tunzi e t a., 1974) en fonction de nanbreux facteurs, -E diminue quand
la profond= la thermocline -ente (Rerbland et Voituriez, 19?7) ;
l’espèce daninante joue un rôle (Striskland, 1968 ; Slovaeck et.Hannan,1977i.
L’état physiologique semble jouer un rôle primordial, par exem-@e déficience
en N ou P (Kïefer , 1 B73 a et b ; Slovaeek et Hannan, 1977) ou taux de crois-
sance in situ ~(fïe'ariey, 1978) ,ou in vitro (Dufouz, colllll. pers,,). Le "fluores--
pence numbc& (Kiefer, 1973.a) varie tr& fort:%ent avec la bdèrr !%aJIeY,
1978); La photoinhibition se manifeste nett@ent (Kiefer, 197 1: ; Heaney,
1978) 3 des intensites lumineuses faibles. 3071 m6canisme est double (Kiefer,
1973 a ; Barris et Piccinin, 1977).
La mesure.de,la IVF ne résoud donc pas lc probl&e dc la d&er&nation
de la'%?i.&asse pl.anotonique. En outre3 de nombreux travaux effectues sur ,l:t,
IVF' ne tiennent pas ocmpte de la fluorescence dissoute, dont l'importanee~
n"est pas &gligeable pcw*fois (Herbl%td et Voituriez, 1'37'7 :, Heaney, 197'R"
Cullen et Renger, 7979). Suivant le type de filtre employé; des dgbris ce&-
lulaires ou des cellules de petite taille pruvent passer dans le filtrat
(Herbland, cm. pers.) et cntrazner une sur-&,ïustion sérieuse de ln fluo.-,
rescence dissoute.
4.3.3. Emploi de la DE
Les Vari@ions vues ci-dessus du'tfluorescentit: number" K correspondent
rendement de luorescence ("Fluorescence yicld")vari&le.
Ce rendement est fonction inverse du taux de trsnspart dî$lectrons
la photosynthèse (Kiefer., 1973 a) :, le r'~ndement de fluorescence_est
,. . \\
-
en ccmpétition avec le rendement chimique (Dutlor, 1966). JJne mesure I~ïa~ble
de la chlorophylle par IVY implique un d6coupl~e, par blocs.& chimique
in vivo
(Duysens et Sweers', 1963) ?i qui 6q7liv;Crr~t .au dilcouplage rWis6, au-
treznent, par lFextraction a&t.onique. La DCXU ('l) r&lise ce blocegc au nivelu
de la r&ction de JXi.11 (Fleischhacker et Zcngerz, 1978).
- a
Les concentrations finales r&alis6es sont veziables : ICI'M(Fheischhacker
et Se er, 1970 : Semuelson et al., ii78 :, Ku ~~dsivclu et Daniël19 1980),
3.10- G (Culien et Renger,
t
1979), 3 à lO.~l!Y'11 (Slovscek et Hannan, 1977).
Les G%ais de &action, et d'observation, vari<& de 30 E (Cullen et Renger,
1979 ; Kulandaivelu et Daniell, 1980) ,I 10 min (Samuc%sor~ et al, 2 1978). 1.~
production dgOz est totalement stoppse aprss ?,5 min m&e -es formes
cuirassées (Slcvczcek et IIsnnan, 1!)77). Des dtlais de 1+ ls 1Jr s sont probable-.
.
ment insuffisants., et expliqueraient certains r.ds
~~ultats'dkcevants in situ
-1
(Roy et Legendre, t980).' ’
.
La fluorescence est mesurée sans DCMU (Y,!;) itt avec DCMU (PD). On Calcu"
le,,, ,sqit le r&pport FD/$?R (Roy et Legendre 3 l@O), soit un Y7fluorescencc
re'sponse index", FR1 : ,:
.‘
FR1 = .(FD - Fti)/PD
. . .
Une val&r nulle de FRI, correspondant '.X une absence? d'effet de la
DGMII, indique une. capaGit. photosynth&ique nulle.
-:
:.
(1) DCMU : 3-(3,4-dichlorophenyl)-l,l-dim6thyl-ur6e
fabriqu6e par K: f. K '
’
vendue par 0,S.I. (154 FF/100 d
ou Touzart et Matignon
9
Résultats :
<' .
FD augmente de fac;on asymptotique avec le temps de seaction (Ssmuelson
a l
et . , 1978'). La fluorescence double (FR1 = 0,5) apr& 30 i? 60 s tant sur
des cultures que sur des populations n&turelles. In, situ, le maximum de FRI
(1?,6) est obser&. 2 la profondeur du maximum de chlorophylle (Cullen et,
Renger, 1979). ?RI aug&en%e avec la profondeur (Roy et Legendre, 1980).
Plusieurs Gtats physiologiques extr2mes ont été r6alisés sur des cultu-
res z forte carence en N, P, (102, empoisonnaaent par B$jC%.~ etc... Quelles
que soient les espèces et les conditions, il existe une relation entre 'bjD
et la concentration de ch1 a mesurge sur les extraits (Slovacek et Hannan, .
1977).
On observe d9autre part une elation étroite entre FR1 et la photosyn-
thèse, mesurée par exwple par
IEC (Ssmuclson et al., 1978). D'autres ex!za-
?les d'utilisation de la DC!& aboutissent 2 des~lusions analogues quant.
2 lPint&êt de cette méthode (Halmann et Elgavish, 1979 ; Kulandaivelu et :
Daniell, 1980).
5 .
M E S U R E S
P A R
S F E C T R O P H O T O M E T R I E
La spectrophotc&trie est gén&alanent consid&& canme la méthode de
rkférence pour des mesures par fluorim&rie. îQus avons vu que 19anploi de
la DWU pemet des déterminations absolues y, drautre part, la calibration
du fluorim8tre peut se fsire sur de la. chlorophylle pure, Pour ces raisons?
la spectrophotanétrie perd une partie de son importance, et ne sera t.rait&e
ici que rapidement,paur m&oire.
Les corrections de turbidité des extraits sont ba&es généralEment sur
une lecture & 750 nm (Mass, 1967 ; Samuelson et al., 19781, encore que d'au--
tres longueurs d'onde aient été esnployees : 7G (Jensen, 1978) ou 720 rm,
5.1. MESURES MOIW!HR~ATIQ'JES
Pour la chlorophylle a, 'les coefficients dYabsorption spécifique sont
assez bien connus (Marker et al., Tg80 b). A 665 mn, on a selon le solvant
employ6 :
- acétone 90 $
89
- Êthanol 90 $
87
- méthanol
77
- diéthyl éther
100
Pour l'acétone 90 3, on aura ainsi l'équation (Jençen, 1978) :
ch1 a = 71,23.(D665 - D730)
D'autres auteurs utilisent des‘vnleurs quelque peu differentes
: Il,9
chez Talling et Driver (1963) par exonple.
La détermination des phéopigments se fait par lecture à 665 nm avant
(1+)) et après (D,) acidification. Diverses 6quations sont don&es, analogues
ElR3.S
non idcntiques,par divers auteurs. En n6gligeant les facteurs de volu-
mes d'extrait et dgéchantillon, on trouve ainsi :
ch1 a = 26,I (Do i Dal
) Strickland et“
phE0 -
= 26,‘7 (1,7.D, - Do) )- Parsons, 1968
5.2. MESURES A DEUX LONGUlS DICNDE
Differents pigments peuvent être détermin& en utilisant les diffErents
aaximums dlabstirption :
et
5.3. ME&RES A 'TROIS LONGUXURS D"OTVDE
.:
',Des.îectures 5 trois longueurs d'onde permettent de déterminer les con-
centrations respectives' de ch1 a, 2 et c. Les 6quations no prennent cepen-
dant pss cn c&pte les ph6opigments correspondants et, de ce fait, qur-
évaluent 'les chlorophylles (Markrr et al., 1980 b).
Les coefficients, et, les 1o~ëiZYd'ondc.
varient suivant les aut,zurs 1
Jensen (1978) donne les cquations :
ch1 a = 11 ,85.11G64 - 1 ,54,D61rpf ~- 0,0:5.D63C
ch113 z
5,43.DG64 +21,03.D647 - :?$.D,;3,
ch1 c =
1 ,67.n61;4 “- 7$.!fIh47 .,i!+:52.Dtj30
Strickland et Parsons (1968) donnent, troic s&es d'équations., de saur-
ces différentes, sans d6terminer la 'valeur rol::tivz de ces iiquations, dont
les, coefficients sont assez fortement diff&cztn.
BIRLIOGRAPï:: IF
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14
TAIEEAU T .*L- Valeur du facteur acide
*
c h l a
Rif.
*.
-7
I.
-
-
2,3
valeur moyenne
(1)
’ 1,7
acide oxnliqué, 3 min
(2)
6,f-l
excitation .G 445 nli
12,s
excitation 3 438 nm
extrapol. à
largeur de bande nulle
0,4-3.,Q
suivant acide em?loyG et temps
1,4?
avec Fh-tomllltipF.iCateur ?! 1! 3fi
3,07,
(0)
2,,n-11,5
exci.tation entre 430 et 4W m, lar:~eur
(7)
:
4e bande l? nm
..-
-
-
-
-
-
--4
ch1 JJ
! 0,42
(5)
i
0,s
(
6
)
chl c
-
-u-m
CI.
1,73
fi.1 tre
(5)
2,4
fi3 tre. CC 2-6h
(4)
538
filtre CC 7-45~
14 ; 1
(6)
-
.
TARLRAlJ II.-- Caract&istiques optiques
1 5
!
* j
excitation
, r$f * 7:
' .
&ission
t, ref.
;
; pheo a :
.- <
i pheo 2 i
437
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