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t
,
Multiplication végétative in vitro du gommier : Acacia senegal L.
3
(Willd.).
,
,b.’ . .
In vitro Vegetative Propagation of the Gum Arabie Tree (Acacia senegal (L.) Willd.).
S. BADJI ‘,‘, Y. MAIRONE ‘, 1. NDIAYE ‘, G. MERLIN ‘, J. P. COLONNA 2, P.
DANTHU 3 et P. NEVILLE ’
I - Laboratoire de Morphogenèse végétale (442) Université d’Aix-Marseille III,
Faculté des Sciences et Techniques de Saint-Jérôme, Avenue Escadrille
Normandie Niemen. 13397 Marseille Cedex 13 (France)
2- Centre ORSTOM, B. P. 1386, Dakar (Sénégal)
3- Chercheur du CIRAD-Forêt mis à la disposition de la DRPF / ISRA, B.P. 2312,
Dakar (Sénégal)
*- Adresse actuelle: Direction des Eaux, Forêts, Chasses et de la Conservation des
Sols, B. P. 1831, Dakar (Sénégal)
RESUME
La méthode décrite ici nous a permis de produire trois à quatres vitroplants
d’Acacia senegal à partir d’un seul explant uninodal. Celui-ci est prélevé soit sur
une plante axénique soit sur une plante de 4 ou 5 ans cultivée en serre.
Zéatine ou BAP sont incorporées, à diverses concentrations, au milieu de
Murashige et Skoog (M S) dont la teneur en macroéléments a été divisée par deux
(MS mod.). A la concentration de 5. 10e7 M., la zéatine fournit les meilleurs taux de
multiplication pour les deux types de matériel végétal.
Pour obtenir un taux d’enracinement de ces microboutures proche de
lOO%, il faut procéder en deux étapes. La première étape, dite d’induction,
consiste en un passage de 6 à 12 jours sur le milieu de Jordan dont la teneur en
macroéléments a été divisé par deux (JN mod.) et auquel on a incorporé de I’ANA
à la concentration de 5. 10e5 M. La seconde étape, dite étape d’expression
racinaire, nécessite un passage des microboutures sur ce dernier milieu
totalement dépourvu de phytohormone. Les racines apparaissent au bout de
quelques jours.
Le sevrage et l’acclimatation en serre s’effectuent avec un taux de réussite
voisin de 100% lorsque les vitroplants enracinés sont transférés dans des pots
renfermant un mélange de vermiculite et de terreau (1: 1; vlv)
MOTS-CLES: Acacia senegal, microbouturage, Cytokinines, In vitro, noeuds
Abbréviations: BAP, 6benzylaminopurine; ANA, acide naphthalène acétique,
MS, milieu de Murashige and Skoog, JN, milieu de Jordan.
* Badji S., Mairone Y., Ndiaye I., Merlin G., Colonna J.P., Danthu
P.
et Neville P.
(1992).
Multiplication végétative in vitro du
gommier : Acacia senegal L.
(Willd),
in Production de variétés
génétiquement ameliorées d'espèces forestières à croissance rapide
- Actes du Symposium, Bordeaux 1992. Tome II. AFOCEL ~(1. Nsnc>;c
1 C;c 1 LL
(ii) des plants de 4 ou 5 ans cultivés en serre et maintenus à 1’ état juvénile par des
recbpages rbguliers. Ce deuxieme type de matériel sera qualifié de mature par opposition au matériel
juv&tile. Les segments de rameaux ont bté pn$lev&s sur la partie non lignifiée des jeunes rejets en
croissance. Ils sont totalement defeuill& puis trempés, pendant 7 min sous agitation dans une
solution de bichlorure de mercure (HgCQ àqi% dans l’&hanol à 70” additionné de quelques gouttes
de Tween 20. Les fragments ont Bt& par la suite, plongés pendant 30 s dans I’éthanol à 70” avant
d’&re rinç& trois fois à l’eau distillde st&ile. Les segments de rameaux sont alors découpés en
microboutures uninodales de 15 à 20 mm de long introduites aseptiquement, sous hotte à flux
laminaire, dans les tubes contenant les milieux testés.
Ces deux types d’explants provenant soit de plants juvéniles axéniques soit de plants
adultes cultivés en serre sont appelés “microboutures de premiére génération”
Les explants obtenus à partir des rameaux produits par ces microboutures de première
génbration, ont servi à l’étude de l’enracinement. Ils sont appelés “microboutures de deuxième
gbnhration”.
METHODES
l.- Milieux et Conditions de culture
Deux milieux minéraux de base ont été utilisés, suivant l’objectif recherché.
Allongement des rameaux
Pour l’allongement des rameaux des microboutures de première génération on a utilisé,
comme milieu de base, un milieu de Murashige et Skoog (1962) modifié (MS mod.). La modification
consiste à diluer de moitié la teneur en macroéléments. On ajoute à ce milieu de base soit de la
6-benzyl-amino-purine (BAP) soit de la 6-(4-hydroxy-3-methyIbut-trans-2-enyl)-aminopurine
(Zéatine)
à trois concentrations différentes: 5. 10T7 M, 1. 10” M, 5. 10” M pour les expériences effectuées sur
les plantules et 1. 10e7 M, 5. 10m7 M, 1. 10” M pour les expériences effectuées sur le matériel adulte.
Les concentrations ont été définies après des essais pr&iminaires. Le milieu témoin ne contient pas
de régulateurs de croissance.
Enracinement
L’étude de l’enracinement a été effectuée sur des explants uninodaux de deuxième
génération, prélevés en phase d’allongement sur les rameaux des microboutures de première
génbration ayant poussé sur le milieu “MS mod. + zéatine 5. 10.’ M”. L’enracinement comporte une
phase d’induction de la rhizogenèse suivie une phase d’expression de la rhizogenèse.
Les milieux d’induction racinaire renferment de I’ANA à la concentration de 5. 10.5 M. Deux
milieux d’induction ont été testés, pour une durée de 6jours: (a) H,O, (b) milieu de Jordan modifié (JN
mod.) en diluant de moitié ses macroél8ments. Deux durées d’ induction ont été aussi testées: 6
jours et 12 jours. L’influence de ces modalités d’induction sur l’expression racinaire a été déterminée
après passage sur le milieu dit “d’expression racinaire” constitué par le milieu de Jordan modifié (JN
mod.) ne contenant pas de substance de croissance.
Les milieux utilisés pour la caulogenèse et la rhizogenèse contiennent 20 g de saccharose
par litre et ont été solidifiés par 6 g. I ’ de gélose DIFCO et stérilisé par autoclavage à 120” C durant 15
min. Le pH est ajusté à 5.8 avant autoclavage.
Les paniers contenant les tubes sont placés dans une chambre de culture dans laquelle la
température est de 30+2” C, l’humidité varie de 20 à 40%, avec un régime photopériodique
comportant 16 h de jour et 8 h de nuit. La lumière artificielle est fournie par des tubes fluorescents
Sylvania Grolux F 40 W à raison de 12,5 W. m-2.
2.- Sevrage et acclimatation
Apres enracinement, les vitroplants sont extraits d&catement des tubes de culture pour être
Vansplant& directement en pot sur un substrat constitue de vermiculite en mélange à part égale avec
du terreau fertiligbne (support NF U 44551, Ets Puteaux S. A. 78150 LE CHESNAY, France), à base
de tourbe de Sphagnum et de Carex, pr&sentant les caract&istiques suivantes: matiGre sèche /
produit brut = 32%; mati&e organique / produit brut = 22%; pH (H,O) = 6; résistivitb = 900 . cm“;
retention en eau = 360% du poids de maMe skhe).
Ils sont alors maintenus pendant 4 j, en serre, sous un double confinement assuré par une
mini-serre et une cloche de matiére plastique transparent (Fig. 6),à la température moyenne de 35” C ,
1’ hygrométrie variant de 70 à 100%. Durant les 7 jours suivants les plants débarassés de leur cloche
sont maintenus dans la miniserre, sous brumisation (3 fois 6 min tous les 24 h).
Les plants sont ensuite élevés en serre sous n&bulation à la température de 35” + 8” C et
sous le même rythme d’ arrosage (Fig. 7).
3.- Schéma expérimental
Pour chaque traitement des diverses expérimentations ci-dessus, on a utilisé 24 tubes
contenant chacun un expiant. Certains résultats ont été soumis à 1’ analyse de variante et dans ces
cas le test de Duncan (1955) a été employé. L’intervalle de confiance de la moyenne a été calculée à
la probabilit6 de 5%.
Les expressions caulogène et racinaire ont été évaluées par des paramètres consignés dans
les tableaux.
RESULTATS
Materiel juvénile
A. Caulogenèse
Les deux cytokinines testées (BAP et zéatine), induisent sur le
développement des rameaux axiliaires formés, des influences différentes suivant
leurs concentrations dans le milieu.
Le tableau 1 montre 1’ effet des concentrations en zéatine et en BAP sur le
développement caulogène des microboutures. Au bout de 60 j de culture, le
traitement “zéatine 5. 1 O-’ M” induit un meilleur développement caulogène que tous
les autres traitements et aboutit à la formation d’ un rameau de 36 mm de long en
moyenne; ce rameau comporte 4 noeuds et permet de produire 3 explants
bouturables. Plus de 79% des explants ayant subi ce traitement portent un rameau
développé de plus de 10 mm de long. En présence de concentrations en zéatine
plus élevées (1. 10e6 M et 5. 106 M), ce pourcentage diminue nettement ainsi que le
nombre d’explants bouturables mais le nombre de noeuds reste à peu près le
même. II y a donc diminution de la taille des entre-noeuds. A la base des
fragments, se sont développés des cals de volume moyen plus important (environ
566 mm3) avec 5. 10” M en zéatine, qu’avec les autres concentrations. La
prolifération du cal basa1 ne semble pas affecter le développement du rameau
axillaire. Aucun cal n’est observé chez le témoin, qui globalement, pour tous les
paramètres étudiés, a donné des résultats inférieurs.
Pour la BAP, c’est la concentration la plus élévée (5. 10.” M) qui fournit le
meilleur allongement du rameau des microboutures de première génération.
Toutefois cet allongement est très inférieur à celui obtenu avec la zéatine puisque
à 60 j de culture il n’atteint en moyenne que l5,5 mm au lieu de 36 mm. AU bout de
ce laps de temps et pour les trois concentrations de BAP, deux noeuds en
moyenne sont formés sur le rameau. Le pourcentage d’explants portant un rameau
de plus de 10 mm de long n’est que de 62 et non de 79 pour le cas précédent. Le
cal, inexistant pour la plus faible teneur en BAP (5. 10’ Mn) et pour le témoin atteint
en moyenne 32 mm3 à 1. 10e6 M et 103 mm3 à 5. 106 M.
B. Rhizogenèse
-Effet de l’apport minéral et vitaminique dans le milieu d’induction sur l’expression
racinaire (Tabl. 2)
Après la transplantation sur le milieu d’expression racinaire, les explants
de 28me génération provenant du milieu d’induction ” eau gélosée + ANA non
enrichie en macroéléments et vitamines”, où ils ont séjourné pendant 6 j, donnent
leur première racine en 10 j. Après 30 j, le pourcentage de plants enracinés atteint
60% en moyenne; le nombre de racines par explant enraciné 1,7; la taille du
rameau formé 10 mm. Le taux de multiplication de ces microboutures de deuxième
génération, c’est à dire le nombre d’explants uninodaux bouturables (longueur zz
10 mm) obtenus sur le rameau formé à partir d’un explant uninodal enraciné de
deuxième génération est de 1,5 en moyenne.
Lorsque le milieu d’induction a au contraire été enrichi en minéraux et en
vitamines, l’apparition des racines après transplantation sur le milieu d’expression
racinaire se fait en un temps beaucoup plus court : 5 j seulement. Cette première
amélioration de l’expression racinaire est suivie de l’amélioration de tous les
paramètres mesurés : en 30 j le pourcentage de plants enracinés atteint 100%
(Fig. 2), le nombre de racines par explant enraciné est de 3,5, la taille du rameau
formé est plus que triplée (34,5 mm) et le taux de multiplication lui même est plus
que doublé (3,5 au lieu de 1,5).
-Effet de la durée de passage dans le milieu d’induction sur l’expression racinaire
(Tabl. 3)
L‘intérêt d’incorporer des éléments minéraux et vitaminiques au milieu
d’induction déjà enrichi en ANA apparaît nettement dans l’expérience ci-dessus,
avec une durée d’induction de 6 j. Au bout de ce délai tous les explants sont
enracinés et 3 racines sont apparues en moyenne par explant. Cependant, la
prolongation de 6 nouveaux jours de cette durée d’induction, passant de 6 à 12
jours, améliore le nombre moyen de racines formées, pour chaque microbouture
de 133%. On note une amélioration du même ordre pour tous les paramètres
consignés dans le tableau 3.
Materiel adulte
Les conditions de propagation in vitro du matériel juvénile issu de graine
ayant été défini dans les expériences précédentes, il convenait de déterminer si la
multiplication in vitro de matériel végétal adulte, issu de rejets de pieds-mères
âgés de 4 à 5 ans, cultivés en serre, était possible et dans quelles conditions. En
effet, le végétal provenant de plantes adultes, même rajeunies par recépages
constants, n’aura pas forcément le même comportement in vitro que les
microboutures provenant de plantules issues de graines.
A. Caulogenèse
Sur le milieu de culture MS mod. contenant zéatine ou BAP aux
concentrations de 1. 10W7 M, 5. 10e7M, 1. 10.” M ou zéro (Témoin), une seule tige se
forme à partir du bourgeon axillaire; elle s’allonge pour produire plusieurs
fragments bouturables (Fig. 4). La longueur maximale atteinte en 60 j par cette tige
est plus important pour la zéatine (29,2 mm) que pour la BAP (17,2 mm); pour le
témoin sans cytokinine elle n’est que de 10,9 mm (Tabl. 4).
Pour les deux cytokinines les concentrations les plus efficaces ne sont pas
les mêmes. En effet, par rapport au témoin la longueur de la tige formée en
présence de zéatine s’accroit de 84% pour la concentration de 1. 1 Oe7 M, de 168%
pour 5. 10e7 M et seulement de 35% pour 1. 10e6 M. Par contre, en présence de
BAP, le seul accroissement significatif (+ 58%) est obtenu pour la concentration la
plus élevée (1. 1 Oe6 M).
Seules les tiges ayant atteint une longueur de 10 mm sont utiles pour
l’obtention d’ explants réellement bouturables. Si 1’ on considère le pourcentage
d’explants ayant, en 60 j, développé un rameau axillaire bouturable, on retrouve le
schéma précédent: les plus fortes concentrations de BAP et les faibles
concentrations de zéatine fournissent les meilleurs résultats (Tabl. 4). Ces
rameaux de longueur égale ou supérieure à 10 mm donnent chacun un ou
plusieurs fragments bouturables. Le meilleur taux de multiplication est 3.3; il est
obtenu avec la zéatine à la concentration de 5. 10e7 M. Cette cytokinine donne aux
concentrations utilisées des taux de multiplication supérieures à ceux obtenus
avec la BAP, pour laquelle le meilleur résultat est de 2.2 à la concentration de 1.
1 O+ M.
B. Enracinement
Tous les explants, après un traitement inducteur de la rhizogenèse par un
séjour de 12 jours dans le milieu de JN mod. à forte concentration d’ auxine (5. 10.”
M) ont donné des racines. On note un bon développement de leur rameau
axillaire, au bout de 60 j (Fig. 5).
Dans nos conditions expérimentales, il apparait clairement qu’il est possible
d’obtenir des microboutures de deuxième génération à la fois enracinées et ayant
développé un rameau vigoureux (Fig. 5) produisant en moyenne 4 microboutures.
DISCUSSION ET CONCLUSION
Développement caulogène
En règle générale, les cytokinines sont indispensables pour le
débourrement, la multiplication des pousses et leur croissance (Skoog et Miller,
1957). Parmi les cytokinines, c’ est, sans doute, la BAP qui est la plus utilisée chez
la plupart des espèces ligneuses comme Acacia koa (Skolmen et Mapes, 1976),
Sequoia sempervirens (Boulay, 1980) Ceratonia siliqua (Thomas et Metha, 1983),
Acacia albida (Duhoux et Davies, 1985), Leucaena leucocephala (Dhawan et
Bhojwani, 1985), Casuarina equisetifolia (Duhoux et a/. , 1986) ou Quercus robur
(Chalupa, 1988). La zéatine, substance naturelle, très peu signalée dans la
littérature, stimule la croissance des tiges des microboutures notamment chez Olea
europea (Canas, 1988) et induit le développement des bourgeons axillaires d’
apex de certains pommiers (Elliot, 1971).
En ce qui concerne Acacia senegal, la BAP s’ est montrée moins efficace
que la zéatine pour le débourrement des bourgeons et le croissance des rameaux
formés. La zéatine, utilisée à faible dose (5. 10w7 M), a permis un meilleur
développement des rameaux produits. Ce n’ est pas le cas pour le peuplier
hybride TT 32, chez lequel on observe une prolifération de bourgeons adventifs
sur les tiges avec l’augmentation de la concentration en zéatine dans le milieu
(Douglas, 1985).
Le mode de bourgeonnement -couramment décrit dans la littérature se
rapporte surtout à la prolifération des pousses en présence de cytokinines (Al Kai
et a/. 1984; Barghchi, 1987; Mittal et a/. 1989). Cela r-r’ est pas observé sur Acacia
senegal dans les conditions de notre expérience. A partir du bourgeon axillaire,
une seule tige parvient à s’allonger pour produire plusieurs fragments bouturables.
Ce mode de propagation a permis d’ atteindre à partir d’ explants aussi bien de
plantules que de jeunes rejets de pieds-mer-es âgés de 4 ou 5 ans, un coefficient
moyen de multiplication égal à 3 ou 4, relativement comparable à celui obtenu
chez Prosopis juliflora (Goya1 et Arya, 1984) et Pferocarpus santalinus (Patri et a/ .,
1988).
Enracinement et acclimatation
En soumettant les microboutures d’Acacia senegal à un traitement inductif
de courte durée, nous leur avons assuré un taux maximal d’ enracinement de
100%. Le transfert des pousses dans le milieu dépourvu de phytohormone a
permis un développement vigoureux des racines. D’ autres auteurs, en procédant
à la séparation des processus de rhizogenèse en différentes phases, sont arrivés à
des constatations analogues. C’ est le cas pour Depommier (1981) sur Eucalyptus
SP., Amerson et Mott (1982) sur Pinus monficola, Basbaa (1991) sur Gleditsia
triacan thos
Chez Acacia senegal, les racines, dans la phase d’ induction et d’ initiation,
développées à partir d’ un cal rhizogène, semblable à celui décrit par Skolmen et
Mapes (1978) sur Acacia koa, apparaissent deux fois plus tôt lorsque le milieu
contient des éléments minéraux; ce qui dénote l’importance de ceux-ci dans cette
étape. Au cours de la phase d’ élongation des racines, nous avons constaté que la
qualité de 1’ enracinement avait une influence considérable sur le développement
caulogène des explants. En effet, les rameaux portés par les explants enracinés se
sont développés beaucoup mieux que ceux obtenus sur des explants très peu
enracinés ou pas dutout. L’ élongation des rameaux réalisée en même temps gue
l’enracinement, au cours de cette étape en 1’ absence de phytohormone (Fig?&?),
offre sans aucun doute 1’ avantage de poursuivre la multiplication in vitro de 1’
Acacia senegal, tout comme chezG/editsia triacanthos (Basbaa, 1991).
L’ acclimatation des plants enracinés effectuée sans difficulté en serre, (Fig.
6 et 7) indique la fiabilité de la technique de la multiplication végétative in vitro
appliquée à 1’ espèce étudiée.
Les résultats obtenus sur matériel juvénile et adulte nous montre que la
propagation en’ masse de 1’ Acacia senegal, essence à fonctions multiples,
productrice de gomme arabique, peut être assurée par cette méthode
Remerciements
Ce travail a été réalisé grâce au support financier de la Société “Colloïdes
Naturels International” (C. N. 1.) de Rouen Les auteurs remercient Madame J
Bernard pour son assistance technique.
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Tableau 2 . Influence du milieu mineraf sur la rhizogcnèse.
30 jours aprés repiquage et sur fa
caulogenèse, 60 jours après repiquage sur milieu d’efongation racinaire (sans ANA).
Milieu induction
Cinétique
Plants
Nombre de
Taille du rameau
T M *
1’ racine
enracinés
racineslexplants
(mm)
(46)
enracinés
JOR/2 + ANA**
5 j
100,oo
3.5 III 0,8
34,5 k 5,6
3,5 z!I 0,3
E A U
+ ANA
10 j
6om
1,7 z!I 0,2
10,o f 3,3
1,5 rt 0,4
* TM (Taux de multiplication) = nombre d’explants uninodaux fxruturables de 10 mm ou plus par
microbouture primaire ayant développé un bourgcon égal ou supérieur à 10 mm.
+* L’ANA est utilise à fa concentration de 5.10-5 M.
JOW = Milieu de JORDAN dont la solution minérale est diluée de moitié.
Les valeurs sont Ctablies à partir de 24 microboutures de chaque lot.
Les erreurs standards ont Cré calculées au seuil de 5% (tes1 de “T”).
Tableau 3 . Influence de la dur& du sejour sur milieu d’induction avec auxine sur la rhizogenèse,
apres 30 jours sur milieu d’élongation.
Durée
Milieu
Plants
Diamètre
Nombre de
induction
enracinés
des racines*
racines par
(%>
expfants
6 jours
JORL! + ANA**
100.00
+ +
3,0 + 0.76
E A U + A N A
50.00
+
1,5 f 0,23
12 jours
JOR/2 + ANA
100,OO
+ + +
4,0 I!Z 0,8 1
E A U
+ ANA
66.00
+ +
2,0 f 0,27
*
Le diamétre des racines est csrimé à l’oeil nu : (+) racines fines, (+ +) racines moyennes,
(+ + +) racines grosses.
* * L’ANA est utilisé a fa concentration de 5.10-5 M.
JOfQ?= Milieu de JORDAN dont la solution minérale est diluée de moitié.
Les erreurs standards ont été cafculécs au seuil de 5% (test de “T”)
Tableau 4 . Influence, après 60 jours de culture in vitro, des concentrations de z&nine
et de BAP sur le développement des microboutures prClev& sur des plantes-mères
recepées d ’ Acacia senegal agkes de 4 ans.
Zéatine
B A P
Nombre de
Hauteur du rameau
Ekplants ayant dtveloppk
Taux de
survivants
formé issu de
un rameau égal ou supé-
multiplication
( Conc. mol. l-l )
bourgeon
rieur h 10 mm*
(TW**
(mm)
(%>
0
0
1 Q-24
10.90 f 4,18
38.88
1.14 + 0.31
1 10-7
0
17/24
20,lO + 9,22
47.05
1.87 + 0.81
5 10-7
0
17/24
29,20 k 4 . 7 8
41.17
3.28 i 1,02
1 104
0
22124
14,70 k 8,48
27.27
2.33 $r 0.54
0
1 10-7
19/24
11.92 f 8,34
3 1.57
1.50 zk 1,27
0
5 1 0 - 7
12/24
10.18 f 5.77
41.66
1,40 + 0.64
0
1 .10-6
16/24
17,25 + 7,76
50,cQ
2.12 f 0.52
*
Rapporte au nombre de survivants,
* * Taux de multiplication (TM) = nombre d’explants uninodaux bouturables
de 10 mm ou plus, par microbouture.
Chaque valeur représente la moycnnc pour 24 individus.
Les intervalles de confiance ont été calculé au seuil de 5% (test de “T”).
“--
II-
_
-?
i .
$
,
Multiplication végétative in vitro du gommier : Acacia senegal L.
3
(Willd.).
,
,b.’ . .
In vitro Vegetative Propagation of the Gum Arabie Tree (Acacia senegal (L.) Willd.).
S. BADJI ‘,‘, Y. MAIRONE ‘, 1. NDIAYE ‘, G. MERLIN ‘, J. P. COLONNA 2, P.
DANTHU 3 et P. NEVILLE ’
I - Laboratoire de Morphogenèse végétale (442) Université d’Aix-Marseille III,
Faculté des Sciences et Techniques de Saint-Jérôme, Avenue Escadrille
Normandie Niemen. 13397 Marseille Cedex 13 (France)
2- Centre ORSTOM, B. P. 1386, Dakar (Sénégal)
3- Chercheur du CIRAD-Forêt mis à la disposition de la DRPF / ISRA, B.P. 2312,
Dakar (Sénégal)
*- Adresse actuelle: Direction des Eaux, Forêts, Chasses et de la Conservation des
Sols, B. P. 1831, Dakar (Sénégal)
RESUME
La méthode décrite ici nous a permis de produire trois à quatres vitroplants
d’Acacia senegal à partir d’un seul explant uninodal. Celui-ci est prélevé soit sur
une plante axénique soit sur une plante de 4 ou 5 ans cultivée en serre.
Zéatine ou BAP sont incorporées, à diverses concentrations, au milieu de
Murashige et Skoog (M S) dont la teneur en macroéléments a été divisée par deux
(MS mod.). A la concentration de 5. 10e7 M., la zéatine fournit les meilleurs taux de
multiplication pour les deux types de matériel végétal.
Pour obtenir un taux d’enracinement de ces microboutures proche de
lOO%, il faut procéder en deux étapes. La première étape, dite d’induction,
consiste en un passage de 6 à 12 jours sur le milieu de Jordan dont la teneur en
macroéléments a été divisé par deux (JN mod.) et auquel on a incorporé de I’ANA
à la concentration de 5. 10e5 M. La seconde étape, dite étape d’expression
racinaire, nécessite un passage des microboutures sur ce dernier milieu
totalement dépourvu de phytohormone. Les racines apparaissent au bout de
quelques jours.
Le sevrage et l’acclimatation en serre s’effectuent avec un taux de réussite
voisin de 100% lorsque les vitroplants enracinés sont transférés dans des pots
renfermant un mélange de vermiculite et de terreau (1: 1; vlv)
MOTS-CLES: Acacia senegal, microbouturage, Cytokinines, In vitro, noeuds
Abbréviations: BAP, 6benzylaminopurine; ANA, acide naphthalène acétique,
MS, milieu de Murashige and Skoog, JN, milieu de Jordan.
* Badji S., Mairone Y., Ndiaye I., Merlin G., Colonna J.P., Danthu
P.
et Neville P.
(1992).
Multiplication végétative in vitro du
gommier : Acacia senegal L.
(Willd),
in Production de variétés
génétiquement ameliorées d'espèces forestières à croissance rapide
- Actes du Symposium, Bordeaux 1992. Tome II. AFOCEL ~(1. Nsnc>;c
1 C;c 1 LL
(ii) des plants de 4 ou 5 ans cultivés en serre et maintenus à 1’ état juvénile par des
recbpages rbguliers. Ce deuxieme type de matériel sera qualifié de mature par opposition au matériel
juv&tile. Les segments de rameaux ont bté pn$lev&s sur la partie non lignifiée des jeunes rejets en
croissance. Ils sont totalement defeuill& puis trempés, pendant 7 min sous agitation dans une
solution de bichlorure de mercure (HgCQ àqi% dans l’&hanol à 70” additionné de quelques gouttes
de Tween 20. Les fragments ont Bt& par la suite, plongés pendant 30 s dans I’éthanol à 70” avant
d’&re rinç& trois fois à l’eau distillde st&ile. Les segments de rameaux sont alors découpés en
microboutures uninodales de 15 à 20 mm de long introduites aseptiquement, sous hotte à flux
laminaire, dans les tubes contenant les milieux testés.
Ces deux types d’explants provenant soit de plants juvéniles axéniques soit de plants
adultes cultivés en serre sont appelés “microboutures de premiére génération”
Les explants obtenus à partir des rameaux produits par ces microboutures de première
génbration, ont servi à l’étude de l’enracinement. Ils sont appelés “microboutures de deuxième
gbnhration”.
METHODES
l.- Milieux et Conditions de culture
Deux milieux minéraux de base ont été utilisés, suivant l’objectif recherché.
Allongement des rameaux
Pour l’allongement des rameaux des microboutures de première génération on a utilisé,
comme milieu de base, un milieu de Murashige et Skoog (1962) modifié (MS mod.). La modification
consiste à diluer de moitié la teneur en macroéléments. On ajoute à ce milieu de base soit de la
6-benzyl-amino-purine (BAP) soit de la 6-(4-hydroxy-3-methyIbut-trans-2-enyl)-aminopurine
(Zéatine)
à trois concentrations différentes: 5. 10T7 M, 1. 10” M, 5. 10” M pour les expériences effectuées sur
les plantules et 1. 10e7 M, 5. 10m7 M, 1. 10” M pour les expériences effectuées sur le matériel adulte.
Les concentrations ont été définies après des essais pr&iminaires. Le milieu témoin ne contient pas
de régulateurs de croissance.
Enracinement
L’étude de l’enracinement a été effectuée sur des explants uninodaux de deuxième
génération, prélevés en phase d’allongement sur les rameaux des microboutures de première
génbration ayant poussé sur le milieu “MS mod. + zéatine 5. 10.’ M”. L’enracinement comporte une
phase d’induction de la rhizogenèse suivie une phase d’expression de la rhizogenèse.
Les milieux d’induction racinaire renferment de I’ANA à la concentration de 5. 10.5 M. Deux
milieux d’induction ont été testés, pour une durée de 6jours: (a) H,O, (b) milieu de Jordan modifié (JN
mod.) en diluant de moitié ses macroél8ments. Deux durées d’ induction ont été aussi testées: 6
jours et 12 jours. L’influence de ces modalités d’induction sur l’expression racinaire a été déterminée
après passage sur le milieu dit “d’expression racinaire” constitué par le milieu de Jordan modifié (JN
mod.) ne contenant pas de substance de croissance.
Les milieux utilisés pour la caulogenèse et la rhizogenèse contiennent 20 g de saccharose
par litre et ont été solidifiés par 6 g. I ’ de gélose DIFCO et stérilisé par autoclavage à 120” C durant 15
min. Le pH est ajusté à 5.8 avant autoclavage.
Les paniers contenant les tubes sont placés dans une chambre de culture dans laquelle la
température est de 30+2” C, l’humidité varie de 20 à 40%, avec un régime photopériodique
comportant 16 h de jour et 8 h de nuit. La lumière artificielle est fournie par des tubes fluorescents
Sylvania Grolux F 40 W à raison de 12,5 W. m-2.
2.- Sevrage et acclimatation
Apres enracinement, les vitroplants sont extraits d&catement des tubes de culture pour être
Vansplant& directement en pot sur un substrat constitue de vermiculite en mélange à part égale avec
du terreau fertiligbne (support NF U 44551, Ets Puteaux S. A. 78150 LE CHESNAY, France), à base
de tourbe de Sphagnum et de Carex, pr&sentant les caract&istiques suivantes: matiGre sèche /
produit brut = 32%; mati&e organique / produit brut = 22%; pH (H,O) = 6; résistivitb = 900 . cm“;
retention en eau = 360% du poids de maMe skhe).
Ils sont alors maintenus pendant 4 j, en serre, sous un double confinement assuré par une
mini-serre et une cloche de matiére plastique transparent (Fig. 6),à la température moyenne de 35” C ,
1’ hygrométrie variant de 70 à 100%. Durant les 7 jours suivants les plants débarassés de leur cloche
sont maintenus dans la miniserre, sous brumisation (3 fois 6 min tous les 24 h).
Les plants sont ensuite élevés en serre sous n&bulation à la température de 35” + 8” C et
sous le même rythme d’ arrosage (Fig. 7).
3.- Schéma expérimental
Pour chaque traitement des diverses expérimentations ci-dessus, on a utilisé 24 tubes
contenant chacun un expiant. Certains résultats ont été soumis à 1’ analyse de variante et dans ces
cas le test de Duncan (1955) a été employé. L’intervalle de confiance de la moyenne a été calculée à
la probabilit6 de 5%.
Les expressions caulogène et racinaire ont été évaluées par des paramètres consignés dans
les tableaux.
RESULTATS
Materiel juvénile
A. Caulogenèse
Les deux cytokinines testées (BAP et zéatine), induisent sur le
développement des rameaux axiliaires formés, des influences différentes suivant
leurs concentrations dans le milieu.
Le tableau 1 montre 1’ effet des concentrations en zéatine et en BAP sur le
développement caulogène des microboutures. Au bout de 60 j de culture, le
traitement “zéatine 5. 1 O-’ M” induit un meilleur développement caulogène que tous
les autres traitements et aboutit à la formation d’ un rameau de 36 mm de long en
moyenne; ce rameau comporte 4 noeuds et permet de produire 3 explants
bouturables. Plus de 79% des explants ayant subi ce traitement portent un rameau
développé de plus de 10 mm de long. En présence de concentrations en zéatine
plus élevées (1. 10e6 M et 5. 106 M), ce pourcentage diminue nettement ainsi que le
nombre d’explants bouturables mais le nombre de noeuds reste à peu près le
même. II y a donc diminution de la taille des entre-noeuds. A la base des
fragments, se sont développés des cals de volume moyen plus important (environ
566 mm3) avec 5. 10” M en zéatine, qu’avec les autres concentrations. La
prolifération du cal basa1 ne semble pas affecter le développement du rameau
axillaire. Aucun cal n’est observé chez le témoin, qui globalement, pour tous les
paramètres étudiés, a donné des résultats inférieurs.
Pour la BAP, c’est la concentration la plus élévée (5. 10.” M) qui fournit le
meilleur allongement du rameau des microboutures de première génération.
Toutefois cet allongement est très inférieur à celui obtenu avec la zéatine puisque
à 60 j de culture il n’atteint en moyenne que l5,5 mm au lieu de 36 mm. AU bout de
ce laps de temps et pour les trois concentrations de BAP, deux noeuds en
moyenne sont formés sur le rameau. Le pourcentage d’explants portant un rameau
de plus de 10 mm de long n’est que de 62 et non de 79 pour le cas précédent. Le
cal, inexistant pour la plus faible teneur en BAP (5. 10’ Mn) et pour le témoin atteint
en moyenne 32 mm3 à 1. 10e6 M et 103 mm3 à 5. 106 M.
B. Rhizogenèse
-Effet de l’apport minéral et vitaminique dans le milieu d’induction sur l’expression
racinaire (Tabl. 2)
Après la transplantation sur le milieu d’expression racinaire, les explants
de 28me génération provenant du milieu d’induction ” eau gélosée + ANA non
enrichie en macroéléments et vitamines”, où ils ont séjourné pendant 6 j, donnent
leur première racine en 10 j. Après 30 j, le pourcentage de plants enracinés atteint
60% en moyenne; le nombre de racines par explant enraciné 1,7; la taille du
rameau formé 10 mm. Le taux de multiplication de ces microboutures de deuxième
génération, c’est à dire le nombre d’explants uninodaux bouturables (longueur zz
10 mm) obtenus sur le rameau formé à partir d’un explant uninodal enraciné de
deuxième génération est de 1,5 en moyenne.
Lorsque le milieu d’induction a au contraire été enrichi en minéraux et en
vitamines, l’apparition des racines après transplantation sur le milieu d’expression
racinaire se fait en un temps beaucoup plus court : 5 j seulement. Cette première
amélioration de l’expression racinaire est suivie de l’amélioration de tous les
paramètres mesurés : en 30 j le pourcentage de plants enracinés atteint 100%
(Fig. 2), le nombre de racines par explant enraciné est de 3,5, la taille du rameau
formé est plus que triplée (34,5 mm) et le taux de multiplication lui même est plus
que doublé (3,5 au lieu de 1,5).
-Effet de la durée de passage dans le milieu d’induction sur l’expression racinaire
(Tabl. 3)
L‘intérêt d’incorporer des éléments minéraux et vitaminiques au milieu
d’induction déjà enrichi en ANA apparaît nettement dans l’expérience ci-dessus,
avec une durée d’induction de 6 j. Au bout de ce délai tous les explants sont
enracinés et 3 racines sont apparues en moyenne par explant. Cependant, la
prolongation de 6 nouveaux jours de cette durée d’induction, passant de 6 à 12
jours, améliore le nombre moyen de racines formées, pour chaque microbouture
de 133%. On note une amélioration du même ordre pour tous les paramètres
consignés dans le tableau 3.
Materiel adulte
Les conditions de propagation in vitro du matériel juvénile issu de graine
ayant été défini dans les expériences précédentes, il convenait de déterminer si la
multiplication in vitro de matériel végétal adulte, issu de rejets de pieds-mères
âgés de 4 à 5 ans, cultivés en serre, était possible et dans quelles conditions. En
effet, le végétal provenant de plantes adultes, même rajeunies par recépages
constants, n’aura pas forcément le même comportement in vitro que les
microboutures provenant de plantules issues de graines.
A. Caulogenèse
Sur le milieu de culture MS mod. contenant zéatine ou BAP aux
concentrations de 1. 10W7 M, 5. 10e7M, 1. 10.” M ou zéro (Témoin), une seule tige se
forme à partir du bourgeon axillaire; elle s’allonge pour produire plusieurs
fragments bouturables (Fig. 4). La longueur maximale atteinte en 60 j par cette tige
est plus important pour la zéatine (29,2 mm) que pour la BAP (17,2 mm); pour le
témoin sans cytokinine elle n’est que de 10,9 mm (Tabl. 4).
Pour les deux cytokinines les concentrations les plus efficaces ne sont pas
les mêmes. En effet, par rapport au témoin la longueur de la tige formée en
présence de zéatine s’accroit de 84% pour la concentration de 1. 1 Oe7 M, de 168%
pour 5. 10e7 M et seulement de 35% pour 1. 10e6 M. Par contre, en présence de
BAP, le seul accroissement significatif (+ 58%) est obtenu pour la concentration la
plus élevée (1. 1 Oe6 M).
Seules les tiges ayant atteint une longueur de 10 mm sont utiles pour
l’obtention d’ explants réellement bouturables. Si 1’ on considère le pourcentage
d’explants ayant, en 60 j, développé un rameau axillaire bouturable, on retrouve le
schéma précédent: les plus fortes concentrations de BAP et les faibles
concentrations de zéatine fournissent les meilleurs résultats (Tabl. 4). Ces
rameaux de longueur égale ou supérieure à 10 mm donnent chacun un ou
plusieurs fragments bouturables. Le meilleur taux de multiplication est 3.3; il est
obtenu avec la zéatine à la concentration de 5. 10e7 M. Cette cytokinine donne aux
concentrations utilisées des taux de multiplication supérieures à ceux obtenus
avec la BAP, pour laquelle le meilleur résultat est de 2.2 à la concentration de 1.
1 O+ M.
B. Enracinement
Tous les explants, après un traitement inducteur de la rhizogenèse par un
séjour de 12 jours dans le milieu de JN mod. à forte concentration d’ auxine (5. 10.”
M) ont donné des racines. On note un bon développement de leur rameau
axillaire, au bout de 60 j (Fig. 5).
Dans nos conditions expérimentales, il apparait clairement qu’il est possible
d’obtenir des microboutures de deuxième génération à la fois enracinées et ayant
développé un rameau vigoureux (Fig. 5) produisant en moyenne 4 microboutures.
DISCUSSION ET CONCLUSION
Développement caulogène
En règle générale, les cytokinines sont indispensables pour le
débourrement, la multiplication des pousses et leur croissance (Skoog et Miller,
1957). Parmi les cytokinines, c’ est, sans doute, la BAP qui est la plus utilisée chez
la plupart des espèces ligneuses comme Acacia koa (Skolmen et Mapes, 1976),
Sequoia sempervirens (Boulay, 1980) Ceratonia siliqua (Thomas et Metha, 1983),
Acacia albida (Duhoux et Davies, 1985), Leucaena leucocephala (Dhawan et
Bhojwani, 1985), Casuarina equisetifolia (Duhoux et a/. , 1986) ou Quercus robur
(Chalupa, 1988). La zéatine, substance naturelle, très peu signalée dans la
littérature, stimule la croissance des tiges des microboutures notamment chez Olea
europea (Canas, 1988) et induit le développement des bourgeons axillaires d’
apex de certains pommiers (Elliot, 1971).
En ce qui concerne Acacia senegal, la BAP s’ est montrée moins efficace
que la zéatine pour le débourrement des bourgeons et le croissance des rameaux
formés. La zéatine, utilisée à faible dose (5. 10w7 M), a permis un meilleur
développement des rameaux produits. Ce n’ est pas le cas pour le peuplier
hybride TT 32, chez lequel on observe une prolifération de bourgeons adventifs
sur les tiges avec l’augmentation de la concentration en zéatine dans le milieu
(Douglas, 1985).
Le mode de bourgeonnement -couramment décrit dans la littérature se
rapporte surtout à la prolifération des pousses en présence de cytokinines (Al Kai
et a/. 1984; Barghchi, 1987; Mittal et a/. 1989). Cela r-r’ est pas observé sur Acacia
senegal dans les conditions de notre expérience. A partir du bourgeon axillaire,
une seule tige parvient à s’allonger pour produire plusieurs fragments bouturables.
Ce mode de propagation a permis d’ atteindre à partir d’ explants aussi bien de
plantules que de jeunes rejets de pieds-mer-es âgés de 4 ou 5 ans, un coefficient
moyen de multiplication égal à 3 ou 4, relativement comparable à celui obtenu
chez Prosopis juliflora (Goya1 et Arya, 1984) et Pferocarpus santalinus (Patri et a/ .,
1988).
Enracinement et acclimatation
En soumettant les microboutures d’Acacia senegal à un traitement inductif
de courte durée, nous leur avons assuré un taux maximal d’ enracinement de
100%. Le transfert des pousses dans le milieu dépourvu de phytohormone a
permis un développement vigoureux des racines. D’ autres auteurs, en procédant
à la séparation des processus de rhizogenèse en différentes phases, sont arrivés à
des constatations analogues. C’ est le cas pour Depommier (1981) sur Eucalyptus
SP., Amerson et Mott (1982) sur Pinus monficola, Basbaa (1991) sur Gleditsia
triacan thos
Chez Acacia senegal, les racines, dans la phase d’ induction et d’ initiation,
développées à partir d’ un cal rhizogène, semblable à celui décrit par Skolmen et
Mapes (1978) sur Acacia koa, apparaissent deux fois plus tôt lorsque le milieu
contient des éléments minéraux; ce qui dénote l’importance de ceux-ci dans cette
étape. Au cours de la phase d’ élongation des racines, nous avons constaté que la
qualité de 1’ enracinement avait une influence considérable sur le développement
caulogène des explants. En effet, les rameaux portés par les explants enracinés se
sont développés beaucoup mieux que ceux obtenus sur des explants très peu
enracinés ou pas dutout. L’ élongation des rameaux réalisée en même temps gue
l’enracinement, au cours de cette étape en 1’ absence de phytohormone (Fig?&?),
offre sans aucun doute 1’ avantage de poursuivre la multiplication in vitro de 1’
Acacia senegal, tout comme chezG/editsia triacanthos (Basbaa, 1991).
L’ acclimatation des plants enracinés effectuée sans difficulté en serre, (Fig.
6 et 7) indique la fiabilité de la technique de la multiplication végétative in vitro
appliquée à 1’ espèce étudiée.
Les résultats obtenus sur matériel juvénile et adulte nous montre que la
propagation en’ masse de 1’ Acacia senegal, essence à fonctions multiples,
productrice de gomme arabique, peut être assurée par cette méthode
Remerciements
Ce travail a été réalisé grâce au support financier de la Société “Colloïdes
Naturels International” (C. N. 1.) de Rouen Les auteurs remercient Madame J
Bernard pour son assistance technique.
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Tableau 2 . Influence du milieu mineraf sur la rhizogcnèse.
30 jours aprés repiquage et sur fa
caulogenèse, 60 jours après repiquage sur milieu d’efongation racinaire (sans ANA).
Milieu induction
Cinétique
Plants
Nombre de
Taille du rameau
T M *
1’ racine
enracinés
racineslexplants
(mm)
(46)
enracinés
JOR/2 + ANA**
5 j
100,oo
3.5 III 0,8
34,5 k 5,6
3,5 z!I 0,3
E A U
+ ANA
10 j
6om
1,7 z!I 0,2
10,o f 3,3
1,5 rt 0,4
* TM (Taux de multiplication) = nombre d’explants uninodaux fxruturables de 10 mm ou plus par
microbouture primaire ayant développé un bourgcon égal ou supérieur à 10 mm.
+* L’ANA est utilise à fa concentration de 5.10-5 M.
JOW = Milieu de JORDAN dont la solution minérale est diluée de moitié.
Les valeurs sont Ctablies à partir de 24 microboutures de chaque lot.
Les erreurs standards ont Cré calculées au seuil de 5% (tes1 de “T”).
Tableau 3 . Influence de la dur& du sejour sur milieu d’induction avec auxine sur la rhizogenèse,
apres 30 jours sur milieu d’élongation.
Durée
Milieu
Plants
Diamètre
Nombre de
induction
enracinés
des racines*
racines par
(%>
expfants
6 jours
JORL! + ANA**
100.00
+ +
3,0 + 0.76
E A U + A N A
50.00
+
1,5 f 0,23
12 jours
JOR/2 + ANA
100,OO
+ + +
4,0 I!Z 0,8 1
E A U
+ ANA
66.00
+ +
2,0 f 0,27
*
Le diamétre des racines est csrimé à l’oeil nu : (+) racines fines, (+ +) racines moyennes,
(+ + +) racines grosses.
* * L’ANA est utilisé a fa concentration de 5.10-5 M.
JOfQ?= Milieu de JORDAN dont la solution minérale est diluée de moitié.
Les erreurs standards ont été cafculécs au seuil de 5% (test de “T”)
Tableau 4 . Influence, après 60 jours de culture in vitro, des concentrations de z&nine
et de BAP sur le développement des microboutures prClev& sur des plantes-mères
recepées d ’ Acacia senegal agkes de 4 ans.
Zéatine
B A P
Nombre de
Hauteur du rameau
Ekplants ayant dtveloppk
Taux de
survivants
formé issu de
un rameau égal ou supé-
multiplication
( Conc. mol. l-l )
bourgeon
rieur h 10 mm*
(TW**
(mm)
(%>
0
0
1 Q-24
10.90 f 4,18
38.88
1.14 + 0.31
1 10-7
0
17/24
20,lO + 9,22
47.05
1.87 + 0.81
5 10-7
0
17/24
29,20 k 4 . 7 8
41.17
3.28 i 1,02
1 104
0
22124
14,70 k 8,48
27.27
2.33 $r 0.54
0
1 10-7
19/24
11.92 f 8,34
3 1.57
1.50 zk 1,27
0
5 1 0 - 7
12/24
10.18 f 5.77
41.66
1,40 + 0.64
0
1 .10-6
16/24
17,25 + 7,76
50,cQ
2.12 f 0.52
*
Rapporte au nombre de survivants,
* * Taux de multiplication (TM) = nombre d’explants uninodaux bouturables
de 10 mm ou plus, par microbouture.
Chaque valeur représente la moycnnc pour 24 individus.
Les intervalles de confiance ont été calculé au seuil de 5% (test de “T”).
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