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-+s-5. - REPUBLIQUE DU SENEGAL
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MINISTERE DU ~DEVELOPPEMENT
RURAL
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/ INSTITUT SENEGALAIS DE RECHERCHES
--\\J(JoQ.-!! 4 fu-
AGRICOLES (1 .S.R.A.)
**********
DE+ARTEMENT DE RECHERCHES SUR LES
Pi%ODUCTIONS’ ET LA SANTE ANIMALES
l2
**********
1%” 6
: LABORATOIRE NATIONAL DE L’ELEVAGE
l
FT DE RECHERCHES VR-ERINAIRES
B.P. 2057
kj
. .
DAKAR - HANN
://,III1I/)/II
CONVENTION AIEAIISRA No 4975 PORTANT
SUR L’UTILISATION DE LA TECHNIQUE
ELISA DE DETECTION DES ANTIGENES
DANS L’ETUDE DE L’INCIDENCE DE
IA TRYPANOSOMIASE ANIMALE
EN ZONE D”ELEVAGE
DU DIAKORE
(CROISEMENT ZEBU NDAMA)
************
RAPPORT SUR L’EXECUTION DE LA
PREMIERE PHASE
DECEMBRE 1988 - JUIN 1989
Par
A. DIAITE, M. SEYE, A. MANE
ET Mme T. NDIAYE
REF. NQ24/PARASIT0.
AVRIL 1990.
PROGRAMME COORDONNE DE RECHERCHE SUR
mL’UTILISATION DU DlAGNOSTIC ET DE lA
SURVEILIANCE DES TRYPANOSOMIASES
ET AUTRES MALADIES A VECTEURS
BIOLOGIQUES DU BETAIL AFRICAIN
PAR L’USAGE DE MElHOW3
SERO-IMMUNOLOCIQUES”
************
CONVENTION AIEA/ISRA No4975 PORTANT SUR
L’UTILISATION DE LA TECHNIQUE ELISA DE
DETECTION DES ANTIGENES DANS L’ETUDE
DE L‘INCIDENCE DE LA TRYPANOSOMIASE
ANIMALE EN ZONE D’ELEVAGE
DU DIAKORE
(CROISEMENT ZEBU-NDAMA)
4
************
RAPPORT SUR L’EXECUTION DE IA PREMIERE PHASE
DECEMBRE 1988 - JUIN 1989
Par
A.DIAITE, M.SEYE, A.MANE et Mme T.NDIAYE
**********
INTRODUICTION
La région Centre-Sud du Sénégal possède d’abondants pâturages où. vivent des
zébus sensibles à la trypanosomiase et des Ndamo trypanotolérants. Le produit
du croisement de ces deux races, le Djakoré, possède également un certain
degré de tolérance.
Dans cette région essentiellement agricole, le Djakoré est largement utilisé pour
la traction animale, avec cependant les contraintes résultant de la présence
des tsé-tsé.
Le manque de moyens appropriés de diagnostic a conduit à un usage abusif
des trypanocides, avec, probablement, apparition de souches de trypanosomes
chimie-résistantes.
. . . / . . .
- 2 -
En conséquence, ii s’est avéré nécessaire de doter I’ISRA d’une technique
performante et fiable, qui permette un diagnostic spécifique de la trypanoso-
miase bovine. C’est l’objet de la présente convention.
Une enquête préliminaire, effectuée en décembre 1988, avait permis de localiser
les sites expérimentaux et de choisir les animaux cibles, en fonction de la pré-
sence des glossines. Les détails de cette enquête figurent dans le rapport ponc-
tuel du premier trimestre. Le présent rapport comporte un bref rappel des don-
nées de base, puis les résultats des analyses protozoologiques, hématologiques,
coprologiques et sérologiques.
Ces résultats sont ensuite discutés pour en tirer les premières conclusions.
1. MATERIEL ET METHODES
1.1 - Sites expérimentaux - Animaux cibles
Les villages de Karang (16O25 Ouest - 13’35 Nord) et de Keur Aliou GUEYE
(16O25 Ouest - 13O45 Nord) ont été retenus.
Ces deux villages sont limitrophes de forêts classées infestées par Clossina
morsitans submorsitans, avec une densité plus élevée à Karang.
La pluviométrie y est souvent abondante (800 à 1 000 mm) et la saison des
pluies y dure généralement 4 mois (de juin à septembre).
Dans chacun de ces deux villages, 20 bovins zébu Ndama ont été choisis et
numérotés à l’oreille.
Ces 40 animaux se repartissent comme suit :
-
5 mâles 3g6s
de 1 à 3 ans,
- 35 femelles de 2 a 9 ans.
Par souci de simplification, nous avons dénommé “prélèvements de Sokone (SK)
les échantillons sériques recueillis dans ces deux villages, Sokone étant I’agglti-
ration urbaine la plus proche.
I
/
. . . . . .
-3-
Les investigations ont porté également sur des zébus vivant à Dahra (15O50
Ouest - 1 SO20 Nord), une zone indemne de glossines. Là aussi, 40 bovins
appartenant à I’ISRA sont prélevés et servent de témoins négatifs pour les
épreuves sérologiques.
1.2 - Prélèvements - Analyses - Traitements
Sur chacun des 40 bovins de lazone à glossines, les prélèvements et analyses
ci-dessous ont été faits, à raison d’une mission par mois, sauf au mois d’avril
où des contraintes internes ont empêché le déplacement.
- Sang périphérique en tubes capillaires (2 tubes par animal), centrifugation
’
sur place et lecture du P.C.V. ;
- lecture de la parasitémie éventuelle de l’interphase ;
- confection de frottis ; coloration et lecture au laboratoire ;
- sang jugulaire en tubes vacutainer, centrifugation, récolte du sérum et
adjonction de 0,Ol p. 100 d’azide de sodium ; stockage à - 20°C jusqu’à
l’emploi ;
- épreuve ELISA de détection d’antigènes circulants en suivant le protocole
et à l’aide des réactifs FAO/AIEA/ILRAD.
Cette épreuve concerne également les sérums de la zone témoin, récoltés
%ne seule fois, en juin ;
- prélèvement de selles fraîches (tous les 3 mois) et coprologie au laboratoire .
- traitement immédiat des bovins positifs à Trypanosoma,
au Bérénil, 7 mg/kg,
I.M. ;
- traitement anthelmintique des bovins positifs en coprologie ;
- bain anti-tiques des animaux cibles et non-cibles des 4 troupeaux par suite
du diagnostic dEhrlichia bovis sur certains bovins ;
- traitement à la Terramycine Longue Action (T. L.A. ) des bovins porteurs
d’Ehrlichia.
. . . / . . .
*
- 4 -
,i
,.
Y
II. RESULTATS PROTOZOOLOCIQUES, HEMATOLOGIQUES ET COPROLOCIQUES
2.1 - Trypanosomes
I
KARANG
KEUR ALIOU CUEX
(forte densité de glossines)
Il
(faible densite de glossines)
I
1
ESPCES
Frequencea parasitaires absolues
Fréquences parasitaires aboslues
sur 20 bovins
sur 20 bovins
Janv. Fev.
Mars
Avril Juin
Janv.
F&I.
Mars
Avril
Juin
T. congolenee
1
0
0
0
1
0
0
0
1
4
T. brucei
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
T. vivax
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
T. theileri
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
Les trypanosomes sont rares de janvier à mars, période de saison sèche au
1.
Sénégal. S’en suit une hausse de la fréquence de T. amgolense au mois de
juin. C’est le début de la saison des pluies, avec son influence sur la densité
des glossines. On note aussi l’absence virtuelle de T. vivax, T. brucei et
T. theileri.
2. L - Hémoparasites autres que les trypanosomes
Ces parasites se sont montrés relativement rares en cette période de l’année.
Theileria mutans, Anaplawna marginale, Setaria IabiiWpapillosa et, dans une
moindre mesure, Ehrlïchia bovis, ont été quelquefois rencontrés.
2.3 - Hématocrite
Moyennes mensuelles % de l'hématrocrite + intervalle de confiance à 5 p.100
LOCALITE
Janvier
Février
Mars
Avril
Juin
I Karang
36,85 f 2,08
36,75 f 2,29
35,85 f 2,38
35,20 i 2,39
non relevC
l
I
I
l
l
I
Keur Aliou
GuEYJ3
34,90 f 4,18
37,95 f 2,47
34,lO f 2,02
33,lO f 2,42
non relevé
. . ./ .,.
1 c
-5-
Les moyennes que voilà sont, dans les deux groupes, Iégérement fluctuant
s’écartant ainsi plus ou moins de la norme raciale de 37,7 + 1 ,2 p, 100 calculée
par FRIOT et CALVET pour les métis zébu - taurins du Sénegal.
2.4 - Coprologie
LCT examens coprologiques révèlent de très faibles infestations par des Stron-
gles et des Coccidies.
III. EPREUVES ELISA
3.1 - Technique
Le protocole FAO/AIEA/ILRAD de détection d’antigènes circulants de T. cungo-
lense, T. bru& et T. vivax a et6 suivi. En voici les grandes lignes :
- Sensibilisation de la plaque avec l’anticorps monoclonal spécifique (T.c., T.b., ‘.
T.v.), 100 ul par cupule sauf la rangée verticale 1 servant de “blank”.
Scellage, homogénéisation par agitation douce puis incubation 1 nuit au moins
à +4OC.
- Rejet de l’anticorps non adsorbé et rinçage rapide de la plaque avec du tam-
pon PBS-tween 80, à 3 reprises. Séchage sur mouchoirs absorbants.
- Distribution de 100 ul de PBS-tween 80 dans chaque cupule sensibilisée,
puis adjonction des sérums (témoins et de terrain) à raison de 2 cupules par
s6rum et a la concentration suivante :
. plaques T.c. et T.v. : 10 ul de sérum dans 100 ul de tampon
. plaque T.b. : 5 ul de sérum
Scellage, homogéneisation
puis incubation 15 minutes à la température du
laboratoire (environ 2OOC).
- Vidange de la plaque, rinçage puis 2 trempages de 10 mn chacun dans PBS-
tween. Séchage sur mouchoirs.
. . . / . . .
I
t
e
-6-
*
* 4’
- Distribution du conjugué spécifique, 100 ul par cupule. Incubation 15 minutes
à la température du laboratoire.
- Vidange de la plaque, rinçage puis 3 trempages de 10 mn chacun. Séchage.
- Distribution du révélateur (ABTS) dans toutes les cupules, 100 ul par
cupule. Incubation 30 mn à la température du laboratoire et à l’obscurité.
- Lecture directe des résultats par “Multiskan ELISA Readerà 405 nm.
La figure sdonne
le schéma d’utilisation des plaques.
3 . 2 - Résultats
Les différents tableaux et figures ci-après donnent l’ensemble des résultats
sérologiques,
et aussi certains résultats obtenus à l’examen des lames (inter-
phase sur le terrain, frottis au laboratoire).
Un examen utile de ces figures et tableaux suppose la définition préalable d’un
seuil de séro-positivité fiable. Le protocole initial fixait ce seuil au double de
la densité optique (d.o.1 moyenne du témoin négatif. A la pratique, cette
procédure s’est avérée aléatoire. Les d. o. des sérums de la zone témoin (à prio-
ri négatifs) offrent en effet de très larges dispersions : 0,002 à 0,037 pour
-
T.Ç. ; 0,003 à 0,051 pour T.b. ; 0,010 à > 0,100 pour T.v. Or, chacun de ces
sérums aurait pu en principe servir de témoin négatif, avec alors un seuil de
positivité dépendant du seul hasard du choix. C’est pourquoi, au vu des résul-
tats des premiers essais et en accord avec 1’ LRAD, le seuil de 0,050 a été
retenu.
/
I
’
,
Sur cette base et concernant les 196 échantil ons sériques analysés dans la
zone à glossines (SKI, nous obtenons :
- Pour T. c0ngolense : 2 parasitémies sur 7 confirmées en sérologie, 43 faux
séro-positifs (microscopie négative, sérologie positive) et 5 faux séro-
gogatifs (microscopie positive, sérologie négative). Donc au total 48 sérums
. . ./ . . .
- 7 -
positifs à T.c.,
parmi lesquels 12 réagissent également avec l’anticorps T.b.,
10 avec T .v. et 2 avec les trois anticorps. Ce qui ramène à 21 les cas de
séro-positivité monospécifique à T.c.
c
- f. brucei n’a pas été visualisé ni sur le terrain, ni sur les lames colorées.
Alors que la sérologie en révèle 17 cas, dont 12 réagissent aussi avec TX.
Déduction faite des 2 sérums réagissant avec les 3 espèces, on obtient 3
réactions monospecifiques avec T.b.
!
1
13
:
1
>i
- Pour T. vivat, on note 32 séro-positifs, alors que l’examen des lames a été
invariablement négatif. 10 sérums parmi ces 32 font aussi des réactions croi-
I
I’
!
8
sées avec l’anticorps T.c. II n’y a pas eu de positivité croisée T.v. - T.b.
L1
,I
/
Au total donc 20 sérums positifs monospecifiques à T.v.
Pour la zone témoin, sur 40 échantillons on obtient : T.Ç. : 0 ; T.b. : 1,
:
s o i t 2,5 p.100 ; T.v. : 5 soit 12,5 p. 100. II n’y a pas eu de réactions croisées
avec ces sérums.
IV. DISCUISSION
L’interprétation de ces résultats doit se faire avec prudence en raison des
considérations suivantes :
Par suite de retard dans l’exécution de la convention (initiation du responsa-
ble à la technique ELISA et ensuite envoi des réactifs depuis I’ILRAD de
Nairobi), le protocole n’a pas été appliqué exactement comme prévu, à savoir i
traiter les animaux séro-positifs et apprécier l’incidence de ce traitement sur
la chute probable de la d.o.
En d’autres termes, la banque de sérum a été constituée avant le début des
:
épreuves sérologiques.
II n’y a pas une totale concordance entre les résultats des examens parasito- 1i
logiques et ceux des analyses sérologiques. Deux seulement parmi les 7 cas
;(
parasitologiquement positifs à T.c. ont été confirmes en sérologie ; de nom-
\\
breux cas négatifs par les lames sont set-o-positifs. Quelle explication valable ]
donner à cette discordance ?
. . . / . . .
-8-
A notre sens, cela s’expliquerait par le phénomène de variation antigénique
propre aux trypanosomes, qui entraîne une fluctuation de la parasitemie chez
les animaux qui ont un tant soit peu de résistance.
1. Parasitologie positive, sérologie négative : fausses réactions négatives
Ce phénomène peut apparaître lorsqu’il n’y a pas d’antigènes circulants libres,
par suite d’une saturation in vivo des sites antigéniques par les anticorps pro-
duits par l’organisme. La réaction ELISA supposant une réaction antigène-
anticorps in vitro, celle-ci est compromise lorsque les anticorps monoclonaux
n’ont plus de site libre pour se fixer.
2. Parasitologie négative, sérologie positive : fausses réactions positives
On pourrait imaginer ce phénomène se produire dans les cas de faibles parasi-
ternie avec production de quantités encore faibles d’anticorps. La parasitémie
;,
peut alors être illisible alors que les antigènes circulants seront décelables.
Ces cas seraient donc plus nombreux car pouvant se produire au début de
L
l’infection initiale ainsi qu’au début de chaque nouvelle vague parasitémique
issue d’un variant antigénique différent.
V. CONCLUSION
A la lumière de toutes ces observations et compte tenu des diverses possibilités
évoquées ci-dessus, la méthode ELISA de détection d’antigènes Trypanosoma
apparaît comme étant complémentaire de la technique parasitologique d’examen
direct du sang. La méthode peut contribuer à donner une idée plus juste des
infections,
dans une aire donnée, par des trypanosomes pathogènes.
-9-
Les méthodes de diagnostic sérologique de la trypanosomiase animale jusqu’à
.
présent utilisées ne permettaient pas de rapporter avec précision un état immuni-
taire contemporain de l’infection.
Avec l’élaboration des anticorps monoclonaux et la détection des antigènes circu-
lants, la sérologie et l’état d’infection peuvent être désormais corrélés.
Ce travail a été effectué à Sokone sur deux troupeaux de 40 têtes chacun.
Les méthodes parasitologiques et s6rologiques
sont comparées.
MOTS-CLES
Diagnostic, trypanosomiase, anticorps monoclonaux, antigènes circulants.
SUMUARY
The serology diagnosis methods in animal trypanosomiasis hitherto utilised did
not permit to correlate precisely the immune status with the infection.With
monoclonal antibodies for trapping circulating antibodies it is now possible
to correlate serology and current infection. This work has been carried out in
Sokcne within tvyo,
herds of 40 animais each. Results of parasitological and
-.
serological methods are compared.
KEY WORDS
Diagnosis, trypanosomiasis, monoclonal antibodies, circulating antigens.
5
i’
- I
-i
i-
Tableau 1 : Résultats de microscopie et de sérologie
SK- JANVIER
SK-FEVRIER
SK-MARS
SK-AVRIL
SK-JUIN
No
'j'.b. T.~. 'j-.c. T.b. T.v. T.c. T.b. T.v. T.c. T.b. T.V. T.C. T.b. T.V. T.c.
81
M*
82'
83
I
S
S
S
84
S
S
S
85
86
87
S
S
S
S
S
S
S
88
s
s
89
90
91
S
92
S
S
S
S
S
93
94
95
S
S
S
S
S
S
S
96
S
S
M*
97
S
S
98
5$
100
S
101
M*
S
102
103
S
S
S
S
S
S
S
S
104
S
S
S
S
S
S
105
S
S
106
M*
107
S
S
108
S
S
S
S
S
S
S
109
S
S
S
110
S
S
S
S
S
S
111
S
M*
112
S
S
S
S
S
. . . / . . .
- II
Tableau 1 : (Suite)
S
S
S
S
M*
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
M = Trypanosomes décelés au microscope
S = Séro-positif
* = Traitement trypanocide
<
- III
Tableau 2 : Comparaison microscopique - sérologie
/
I
Taux mensuels % de positivité
:
1
TECHNIQUE
ji;
Janvier
Février
Mars
Avril
Juin
T.b
0
0
0
0
0
Examens
microscopiques
T . V
0
0
0
0
0
T . C
235
0
0
235
13,5
I
T.b
10
2,5
531
22,5
297
l
!
Sérologie
T.V
12,5
17,5
15,3
20,o
16,2
/
T.C
22,5
32,5
17,9
20,o
18,9
Tableau 3 : Fausses réactions sth-ologiques
Faux skro-positifs
Faux h-o-négatifs
l
I
PERIODE
T.b.
T . V .
T.C.
T.b.
T.v.
T.c
Total %
Total %
Total %
Total %
Total %
Total %
Janvier (n = 40)
4
10,o
5
12,5
10 25,0
0
-
0
-
1
295
Février (n = 40)
1
2,2
7
17,5
13 32,5
0
-
0
-
0
-
Mars (n = 39)
2
5,l
6
15,3
7
17,9
0
-
0
-
0
-
Avril (n = 40)
9
22,5
8
20,o
7
17,5
0
-
0
-
0
-
Juin (n = 37)
1
2,7
6
16,2
6
16,2
0
-
0
-
4
10,8
, TOTAL SUR 196 ANALYSES
1 17
1 8,671 32
116,321
43 121,931
0 1 090 I 0
I o,o I 5 I 2,551
- IV
Tableau 4 : R6actions monospécifiques et réactions croisées
Nombre d'échantillons positifs avec l'un ou/et l'autre anticorps
PERIODE
T.b. seul
T.v. seul
T.c. seul T.b et T,v
T.b et T.c T.v et T.c T.b,T.v,T.c
Janvier
0
2
4
0
3
2
1
Février
0
3
8
0
1
4
0
Mars
0
3
3
0
1
2
1
Avril
3
7
1
0
6
1
0
Juin
0
5
5
0
1
1
0
Totaux
3
20
21
0
12
10
2
2. :e 196
analyses
1,53
10,20
10,71
6,12
5,lO
1,02
- V
05nm.
*
X%XX
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x
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x
0,07
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1
X
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Comparai5ot-t Qnlre zone infestée et zone indemne CDRJ
Plaques 1. brucai
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4
- VII
do. à.405 mn.
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MINISTERE DU ~DEVELOPPEMENT
RURAL
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/ INSTITUT SENEGALAIS DE RECHERCHES
--\\J(JoQ.-!! 4 fu-
AGRICOLES (1 .S.R.A.)
**********
DE+ARTEMENT DE RECHERCHES SUR LES
Pi%ODUCTIONS’ ET LA SANTE ANIMALES
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**********
1%” 6
: LABORATOIRE NATIONAL DE L’ELEVAGE
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FT DE RECHERCHES VR-ERINAIRES
B.P. 2057
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DAKAR - HANN
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CONVENTION AIEAIISRA No 4975 PORTANT
SUR L’UTILISATION DE LA TECHNIQUE
ELISA DE DETECTION DES ANTIGENES
DANS L’ETUDE DE L’INCIDENCE DE
IA TRYPANOSOMIASE ANIMALE
EN ZONE D”ELEVAGE
DU DIAKORE
(CROISEMENT ZEBU NDAMA)
************
RAPPORT SUR L’EXECUTION DE LA
PREMIERE PHASE
DECEMBRE 1988 - JUIN 1989
Par
A. DIAITE, M. SEYE, A. MANE
ET Mme T. NDIAYE
REF. NQ24/PARASIT0.
AVRIL 1990.
PROGRAMME COORDONNE DE RECHERCHE SUR
mL’UTILISATION DU DlAGNOSTIC ET DE lA
SURVEILIANCE DES TRYPANOSOMIASES
ET AUTRES MALADIES A VECTEURS
BIOLOGIQUES DU BETAIL AFRICAIN
PAR L’USAGE DE MElHOW3
SERO-IMMUNOLOCIQUES”
************
CONVENTION AIEA/ISRA No4975 PORTANT SUR
L’UTILISATION DE LA TECHNIQUE ELISA DE
DETECTION DES ANTIGENES DANS L’ETUDE
DE L‘INCIDENCE DE LA TRYPANOSOMIASE
ANIMALE EN ZONE D’ELEVAGE
DU DIAKORE
(CROISEMENT ZEBU-NDAMA)
4
************
RAPPORT SUR L’EXECUTION DE IA PREMIERE PHASE
DECEMBRE 1988 - JUIN 1989
Par
A.DIAITE, M.SEYE, A.MANE et Mme T.NDIAYE
**********
INTRODUICTION
La région Centre-Sud du Sénégal possède d’abondants pâturages où. vivent des
zébus sensibles à la trypanosomiase et des Ndamo trypanotolérants. Le produit
du croisement de ces deux races, le Djakoré, possède également un certain
degré de tolérance.
Dans cette région essentiellement agricole, le Djakoré est largement utilisé pour
la traction animale, avec cependant les contraintes résultant de la présence
des tsé-tsé.
Le manque de moyens appropriés de diagnostic a conduit à un usage abusif
des trypanocides, avec, probablement, apparition de souches de trypanosomes
chimie-résistantes.
. . . / . . .
- 2 -
En conséquence, ii s’est avéré nécessaire de doter I’ISRA d’une technique
performante et fiable, qui permette un diagnostic spécifique de la trypanoso-
miase bovine. C’est l’objet de la présente convention.
Une enquête préliminaire, effectuée en décembre 1988, avait permis de localiser
les sites expérimentaux et de choisir les animaux cibles, en fonction de la pré-
sence des glossines. Les détails de cette enquête figurent dans le rapport ponc-
tuel du premier trimestre. Le présent rapport comporte un bref rappel des don-
nées de base, puis les résultats des analyses protozoologiques, hématologiques,
coprologiques et sérologiques.
Ces résultats sont ensuite discutés pour en tirer les premières conclusions.
1. MATERIEL ET METHODES
1.1 - Sites expérimentaux - Animaux cibles
Les villages de Karang (16O25 Ouest - 13’35 Nord) et de Keur Aliou GUEYE
(16O25 Ouest - 13O45 Nord) ont été retenus.
Ces deux villages sont limitrophes de forêts classées infestées par Clossina
morsitans submorsitans, avec une densité plus élevée à Karang.
La pluviométrie y est souvent abondante (800 à 1 000 mm) et la saison des
pluies y dure généralement 4 mois (de juin à septembre).
Dans chacun de ces deux villages, 20 bovins zébu Ndama ont été choisis et
numérotés à l’oreille.
Ces 40 animaux se repartissent comme suit :
-
5 mâles 3g6s
de 1 à 3 ans,
- 35 femelles de 2 a 9 ans.
Par souci de simplification, nous avons dénommé “prélèvements de Sokone (SK)
les échantillons sériques recueillis dans ces deux villages, Sokone étant I’agglti-
ration urbaine la plus proche.
I
/
. . . . . .
-3-
Les investigations ont porté également sur des zébus vivant à Dahra (15O50
Ouest - 1 SO20 Nord), une zone indemne de glossines. Là aussi, 40 bovins
appartenant à I’ISRA sont prélevés et servent de témoins négatifs pour les
épreuves sérologiques.
1.2 - Prélèvements - Analyses - Traitements
Sur chacun des 40 bovins de lazone à glossines, les prélèvements et analyses
ci-dessous ont été faits, à raison d’une mission par mois, sauf au mois d’avril
où des contraintes internes ont empêché le déplacement.
- Sang périphérique en tubes capillaires (2 tubes par animal), centrifugation
’
sur place et lecture du P.C.V. ;
- lecture de la parasitémie éventuelle de l’interphase ;
- confection de frottis ; coloration et lecture au laboratoire ;
- sang jugulaire en tubes vacutainer, centrifugation, récolte du sérum et
adjonction de 0,Ol p. 100 d’azide de sodium ; stockage à - 20°C jusqu’à
l’emploi ;
- épreuve ELISA de détection d’antigènes circulants en suivant le protocole
et à l’aide des réactifs FAO/AIEA/ILRAD.
Cette épreuve concerne également les sérums de la zone témoin, récoltés
%ne seule fois, en juin ;
- prélèvement de selles fraîches (tous les 3 mois) et coprologie au laboratoire .
- traitement immédiat des bovins positifs à Trypanosoma,
au Bérénil, 7 mg/kg,
I.M. ;
- traitement anthelmintique des bovins positifs en coprologie ;
- bain anti-tiques des animaux cibles et non-cibles des 4 troupeaux par suite
du diagnostic dEhrlichia bovis sur certains bovins ;
- traitement à la Terramycine Longue Action (T. L.A. ) des bovins porteurs
d’Ehrlichia.
. . . / . . .
*
- 4 -
,i
,.
Y
II. RESULTATS PROTOZOOLOCIQUES, HEMATOLOGIQUES ET COPROLOCIQUES
2.1 - Trypanosomes
I
KARANG
KEUR ALIOU CUEX
(forte densité de glossines)
Il
(faible densite de glossines)
I
1
ESPCES
Frequencea parasitaires absolues
Fréquences parasitaires aboslues
sur 20 bovins
sur 20 bovins
Janv. Fev.
Mars
Avril Juin
Janv.
F&I.
Mars
Avril
Juin
T. congolenee
1
0
0
0
1
0
0
0
1
4
T. brucei
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
T. vivax
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
T. theileri
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
Les trypanosomes sont rares de janvier à mars, période de saison sèche au
1.
Sénégal. S’en suit une hausse de la fréquence de T. amgolense au mois de
juin. C’est le début de la saison des pluies, avec son influence sur la densité
des glossines. On note aussi l’absence virtuelle de T. vivax, T. brucei et
T. theileri.
2. L - Hémoparasites autres que les trypanosomes
Ces parasites se sont montrés relativement rares en cette période de l’année.
Theileria mutans, Anaplawna marginale, Setaria IabiiWpapillosa et, dans une
moindre mesure, Ehrlïchia bovis, ont été quelquefois rencontrés.
2.3 - Hématocrite
Moyennes mensuelles % de l'hématrocrite + intervalle de confiance à 5 p.100
LOCALITE
Janvier
Février
Mars
Avril
Juin
I Karang
36,85 f 2,08
36,75 f 2,29
35,85 f 2,38
35,20 i 2,39
non relevC
l
I
I
l
l
I
Keur Aliou
GuEYJ3
34,90 f 4,18
37,95 f 2,47
34,lO f 2,02
33,lO f 2,42
non relevé
. . ./ .,.
1 c
-5-
Les moyennes que voilà sont, dans les deux groupes, Iégérement fluctuant
s’écartant ainsi plus ou moins de la norme raciale de 37,7 + 1 ,2 p, 100 calculée
par FRIOT et CALVET pour les métis zébu - taurins du Sénegal.
2.4 - Coprologie
LCT examens coprologiques révèlent de très faibles infestations par des Stron-
gles et des Coccidies.
III. EPREUVES ELISA
3.1 - Technique
Le protocole FAO/AIEA/ILRAD de détection d’antigènes circulants de T. cungo-
lense, T. bru& et T. vivax a et6 suivi. En voici les grandes lignes :
- Sensibilisation de la plaque avec l’anticorps monoclonal spécifique (T.c., T.b., ‘.
T.v.), 100 ul par cupule sauf la rangée verticale 1 servant de “blank”.
Scellage, homogénéisation par agitation douce puis incubation 1 nuit au moins
à +4OC.
- Rejet de l’anticorps non adsorbé et rinçage rapide de la plaque avec du tam-
pon PBS-tween 80, à 3 reprises. Séchage sur mouchoirs absorbants.
- Distribution de 100 ul de PBS-tween 80 dans chaque cupule sensibilisée,
puis adjonction des sérums (témoins et de terrain) à raison de 2 cupules par
s6rum et a la concentration suivante :
. plaques T.c. et T.v. : 10 ul de sérum dans 100 ul de tampon
. plaque T.b. : 5 ul de sérum
Scellage, homogéneisation
puis incubation 15 minutes à la température du
laboratoire (environ 2OOC).
- Vidange de la plaque, rinçage puis 2 trempages de 10 mn chacun dans PBS-
tween. Séchage sur mouchoirs.
. . . / . . .
I
t
e
-6-
*
* 4’
- Distribution du conjugué spécifique, 100 ul par cupule. Incubation 15 minutes
à la température du laboratoire.
- Vidange de la plaque, rinçage puis 3 trempages de 10 mn chacun. Séchage.
- Distribution du révélateur (ABTS) dans toutes les cupules, 100 ul par
cupule. Incubation 30 mn à la température du laboratoire et à l’obscurité.
- Lecture directe des résultats par “Multiskan ELISA Readerà 405 nm.
La figure sdonne
le schéma d’utilisation des plaques.
3 . 2 - Résultats
Les différents tableaux et figures ci-après donnent l’ensemble des résultats
sérologiques,
et aussi certains résultats obtenus à l’examen des lames (inter-
phase sur le terrain, frottis au laboratoire).
Un examen utile de ces figures et tableaux suppose la définition préalable d’un
seuil de séro-positivité fiable. Le protocole initial fixait ce seuil au double de
la densité optique (d.o.1 moyenne du témoin négatif. A la pratique, cette
procédure s’est avérée aléatoire. Les d. o. des sérums de la zone témoin (à prio-
ri négatifs) offrent en effet de très larges dispersions : 0,002 à 0,037 pour
-
T.Ç. ; 0,003 à 0,051 pour T.b. ; 0,010 à > 0,100 pour T.v. Or, chacun de ces
sérums aurait pu en principe servir de témoin négatif, avec alors un seuil de
positivité dépendant du seul hasard du choix. C’est pourquoi, au vu des résul-
tats des premiers essais et en accord avec 1’ LRAD, le seuil de 0,050 a été
retenu.
/
I
’
,
Sur cette base et concernant les 196 échantil ons sériques analysés dans la
zone à glossines (SKI, nous obtenons :
- Pour T. c0ngolense : 2 parasitémies sur 7 confirmées en sérologie, 43 faux
séro-positifs (microscopie négative, sérologie positive) et 5 faux séro-
gogatifs (microscopie positive, sérologie négative). Donc au total 48 sérums
. . ./ . . .
- 7 -
positifs à T.c.,
parmi lesquels 12 réagissent également avec l’anticorps T.b.,
10 avec T .v. et 2 avec les trois anticorps. Ce qui ramène à 21 les cas de
séro-positivité monospécifique à T.c.
c
- f. brucei n’a pas été visualisé ni sur le terrain, ni sur les lames colorées.
Alors que la sérologie en révèle 17 cas, dont 12 réagissent aussi avec TX.
Déduction faite des 2 sérums réagissant avec les 3 espèces, on obtient 3
réactions monospecifiques avec T.b.
!
1
13
:
1
>i
- Pour T. vivat, on note 32 séro-positifs, alors que l’examen des lames a été
invariablement négatif. 10 sérums parmi ces 32 font aussi des réactions croi-
I
I’
!
8
sées avec l’anticorps T.c. II n’y a pas eu de positivité croisée T.v. - T.b.
L1
,I
/
Au total donc 20 sérums positifs monospecifiques à T.v.
Pour la zone témoin, sur 40 échantillons on obtient : T.Ç. : 0 ; T.b. : 1,
:
s o i t 2,5 p.100 ; T.v. : 5 soit 12,5 p. 100. II n’y a pas eu de réactions croisées
avec ces sérums.
IV. DISCUISSION
L’interprétation de ces résultats doit se faire avec prudence en raison des
considérations suivantes :
Par suite de retard dans l’exécution de la convention (initiation du responsa-
ble à la technique ELISA et ensuite envoi des réactifs depuis I’ILRAD de
Nairobi), le protocole n’a pas été appliqué exactement comme prévu, à savoir i
traiter les animaux séro-positifs et apprécier l’incidence de ce traitement sur
la chute probable de la d.o.
En d’autres termes, la banque de sérum a été constituée avant le début des
:
épreuves sérologiques.
II n’y a pas une totale concordance entre les résultats des examens parasito- 1i
logiques et ceux des analyses sérologiques. Deux seulement parmi les 7 cas
;(
parasitologiquement positifs à T.c. ont été confirmes en sérologie ; de nom-
\\
breux cas négatifs par les lames sont set-o-positifs. Quelle explication valable ]
donner à cette discordance ?
. . . / . . .
-8-
A notre sens, cela s’expliquerait par le phénomène de variation antigénique
propre aux trypanosomes, qui entraîne une fluctuation de la parasitemie chez
les animaux qui ont un tant soit peu de résistance.
1. Parasitologie positive, sérologie négative : fausses réactions négatives
Ce phénomène peut apparaître lorsqu’il n’y a pas d’antigènes circulants libres,
par suite d’une saturation in vivo des sites antigéniques par les anticorps pro-
duits par l’organisme. La réaction ELISA supposant une réaction antigène-
anticorps in vitro, celle-ci est compromise lorsque les anticorps monoclonaux
n’ont plus de site libre pour se fixer.
2. Parasitologie négative, sérologie positive : fausses réactions positives
On pourrait imaginer ce phénomène se produire dans les cas de faibles parasi-
ternie avec production de quantités encore faibles d’anticorps. La parasitémie
;,
peut alors être illisible alors que les antigènes circulants seront décelables.
Ces cas seraient donc plus nombreux car pouvant se produire au début de
L
l’infection initiale ainsi qu’au début de chaque nouvelle vague parasitémique
issue d’un variant antigénique différent.
V. CONCLUSION
A la lumière de toutes ces observations et compte tenu des diverses possibilités
évoquées ci-dessus, la méthode ELISA de détection d’antigènes Trypanosoma
apparaît comme étant complémentaire de la technique parasitologique d’examen
direct du sang. La méthode peut contribuer à donner une idée plus juste des
infections,
dans une aire donnée, par des trypanosomes pathogènes.
-9-
Les méthodes de diagnostic sérologique de la trypanosomiase animale jusqu’à
.
présent utilisées ne permettaient pas de rapporter avec précision un état immuni-
taire contemporain de l’infection.
Avec l’élaboration des anticorps monoclonaux et la détection des antigènes circu-
lants, la sérologie et l’état d’infection peuvent être désormais corrélés.
Ce travail a été effectué à Sokone sur deux troupeaux de 40 têtes chacun.
Les méthodes parasitologiques et s6rologiques
sont comparées.
MOTS-CLES
Diagnostic, trypanosomiase, anticorps monoclonaux, antigènes circulants.
SUMUARY
The serology diagnosis methods in animal trypanosomiasis hitherto utilised did
not permit to correlate precisely the immune status with the infection.With
monoclonal antibodies for trapping circulating antibodies it is now possible
to correlate serology and current infection. This work has been carried out in
Sokcne within tvyo,
herds of 40 animais each. Results of parasitological and
-.
serological methods are compared.
KEY WORDS
Diagnosis, trypanosomiasis, monoclonal antibodies, circulating antigens.
5
i’
- I
-i
i-
Tableau 1 : Résultats de microscopie et de sérologie
SK- JANVIER
SK-FEVRIER
SK-MARS
SK-AVRIL
SK-JUIN
No
'j'.b. T.~. 'j-.c. T.b. T.v. T.c. T.b. T.v. T.c. T.b. T.V. T.C. T.b. T.V. T.c.
81
M*
82'
83
I
S
S
S
84
S
S
S
85
86
87
S
S
S
S
S
S
S
88
s
s
89
90
91
S
92
S
S
S
S
S
93
94
95
S
S
S
S
S
S
S
96
S
S
M*
97
S
S
98
5$
100
S
101
M*
S
102
103
S
S
S
S
S
S
S
S
104
S
S
S
S
S
S
105
S
S
106
M*
107
S
S
108
S
S
S
S
S
S
S
109
S
S
S
110
S
S
S
S
S
S
111
S
M*
112
S
S
S
S
S
. . . / . . .
- II
Tableau 1 : (Suite)
S
S
S
S
M*
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
M = Trypanosomes décelés au microscope
S = Séro-positif
* = Traitement trypanocide
<
- III
Tableau 2 : Comparaison microscopique - sérologie
/
I
Taux mensuels % de positivité
:
1
TECHNIQUE
ji;
Janvier
Février
Mars
Avril
Juin
T.b
0
0
0
0
0
Examens
microscopiques
T . V
0
0
0
0
0
T . C
235
0
0
235
13,5
I
T.b
10
2,5
531
22,5
297
l
!
Sérologie
T.V
12,5
17,5
15,3
20,o
16,2
/
T.C
22,5
32,5
17,9
20,o
18,9
Tableau 3 : Fausses réactions sth-ologiques
Faux skro-positifs
Faux h-o-négatifs
l
I
PERIODE
T.b.
T . V .
T.C.
T.b.
T.v.
T.c
Total %
Total %
Total %
Total %
Total %
Total %
Janvier (n = 40)
4
10,o
5
12,5
10 25,0
0
-
0
-
1
295
Février (n = 40)
1
2,2
7
17,5
13 32,5
0
-
0
-
0
-
Mars (n = 39)
2
5,l
6
15,3
7
17,9
0
-
0
-
0
-
Avril (n = 40)
9
22,5
8
20,o
7
17,5
0
-
0
-
0
-
Juin (n = 37)
1
2,7
6
16,2
6
16,2
0
-
0
-
4
10,8
, TOTAL SUR 196 ANALYSES
1 17
1 8,671 32
116,321
43 121,931
0 1 090 I 0
I o,o I 5 I 2,551
- IV
Tableau 4 : R6actions monospécifiques et réactions croisées
Nombre d'échantillons positifs avec l'un ou/et l'autre anticorps
PERIODE
T.b. seul
T.v. seul
T.c. seul T.b et T,v
T.b et T.c T.v et T.c T.b,T.v,T.c
Janvier
0
2
4
0
3
2
1
Février
0
3
8
0
1
4
0
Mars
0
3
3
0
1
2
1
Avril
3
7
1
0
6
1
0
Juin
0
5
5
0
1
1
0
Totaux
3
20
21
0
12
10
2
2. :e 196
analyses
1,53
10,20
10,71
6,12
5,lO
1,02
- V
05nm.
*
X%XX
%IX
x
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x
0,07
x
X
0,06
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1
X
X
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x
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A
K
X
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X X
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x
X
L
Wmoins DR
Compaiaisoti entre zone +d+2 .st zone ind:~mneCmR)
Plaques T,, eon~olanse
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1
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