Institut Sédgalais de
Organkation des Nations Unies
pour 1 ‘Agriculture et
Recherches Agricoles
1 ‘Alimentation.
Laboratoire National d’Élevage
F.AO
et de rechen&es~ir&inaires
BP 2057 Dakar-Haun
Tel: 221832 36 781832 36 79
Fax: 221832 21 18
Emaik lnerv@syfedrefer.sn
RAPPORT DE MISSION
au Centre National de 1 ‘Elevage et de Recherches Wtérinaires de Nouakchott
du 12lO7 au 02/08/1999
Par Dr Yaya Thiongane
Consultant International (TCDC) pour le diagnostic de laboratoire de la fièvre de 1 a val& du Rift
TCP/MAU/89231E)
Août 1999

---

1. Introduction:
b fi&e de la V~I& du Rift (FVR ) est une maiadie vide, commune à l’homme et aux animauT transmise Par
les mol&ques (a&ovirose). P&ente essentiellement jusqu’ici sur le continent africain elle est classée Parmi par
les maladies emergentes et son impact économique et social est important
D&ite en 1912-1913, pour la Premiere fois, la FVR est signalée comme une hépatite nécroSante qui touche-
particuli&rement les élevages de &B domestiques (les ovins, les caprins et les bovins) de la vallée du Rift
au Kenya. Seuls quelques cas de fièvre grippale seront rapportes dans la population humaine vivant dans la zone
d’enzootie.
En 1977-1978, la FVR , SOUS une forme d’épizootie-épidémie.très mëurtrière, frappe la zone du Delta du Nil, en
Egypte. Elle touche 25 à 50 % des troupeaux de mminams domestiques. Lors de ce foyer, on dénombra Plus de
200 000 cas humains avec, au moins, 600 morts. Les modifications kologiques conskcutives à la mise en SaviCe
du barrage d’Assoua.n (extension des p&imètres irrigués, multiplication des sites favorables aux mOUStiqUeS,
afflux d&inta~ sensibles) seraient à .l’origine de cette épidémie dans cette partie de l’Afrique, jusque là
indemne.
Depuis lors, la FVR est classée parmi les maladies de la liste A de l’Office International des Epizooties (0.I.E).
En conséquence, les pays doivent suivre les règles du code zoo-sanitaire pour sa déclaration et son contrôle.
De plus, elle interesse l’Organisation Mondiale de la Sante (OMS) car elle fait partie de huit fièvres
hémorragiques virales humaines qui sont d’actualite dans le Monde. De nombreux foyers ont été signalés ces
dernieres annees à travers le continent : en Mauritanie-Sénégal en 1987, à Madagascar en 1991, au Kenya-
Somalie en 1997-1998 et de nouveau en Mauritanie, tr& rkemment, en 1998.
En Afrique de l’Ouest, l’épizootie-épidémie de Mauritanie-Sénégal de 1987 fut la Premiere dkcrite dans la Basse
vallée du Beuve. Elle s’est man&stee par un taux élevé (70 a 80%) d’avortements des femelles gravides (brebis,
chkvres et vaches), une forte mortalite (90-lOO%)des
jeunes animaux (agneaux, chevreaux et veaux). Pour les
animaux adultes, l’infection virale entraîne la mort (30%) ou un dépkissement (animal sans valeur économique)
r&uhant des desordres hepatiques et de l’ictère. Les populations d’éleveurs, vivant au contact des animaux
malades, ont été les plus touchees avec 1500 cas et plus de 200 décès. Parmi les causes expliquant l’apparition de
la FVR, on cite les facteurs suivants : la mise en eau du barrage anti sel de Diama sur le fleuve Sénégal, la
concentration animale et humaine dans les pâturages le long du fleuve, l’extension des pkimetres irrigués et la
prknce d’eau douce pendant toute l’annee dans les principaux marigots de la zone qui favorisent le
développement des moustiques vecteurs du virus.
Depuis cet épisode, les études menées dans les trois pays riverains du fleuve Sénégal (le Mali, la Mauritanie et le
SénégaI) ont montre que la FVR s’est définitivement installée dans le Bassin du fleuve Sénégal et constitue une
menace permanente pour le cheptel mais aussi pour les hommes dans les zones où les conditions &xkgiques
favorisent la pulhrlation des moustiques vecteurs de la maladie.
Le foyer de FVR survenu en Septembre-Dkembre 1998 dans le sudest de la Mauritanie corrobore ce point de
vue. Il a concerné à la fois les animaux (avortements chez les petits ruminants, les bovins et les dromadaires) et
les hommes (6 dé& à l’hôpital de Aioun) dans les r&ions de Hodh el garbi, Assaba et de Bi&na. Cette ré-
émergence de la FVR rend urgent la prise de mesures de lutte pour contrôler la maladie en Mauritanie et éviter
son extension à la faveur des mouvements d’animaux (de type commercial et traditionnel) entre les 3 pays du
Bassin du fleuve Sénégal (le Mali, la Mauritanie et le Sénégal).
La FAO sollicitke, a qs en place w programme d’appui (TCP / MALI / 8923 E) en Mauritanie avec comme
objectifs, entre autres, le renforcement des capacités de diagnostic de la FVR du Centre National de 1’Elevage et
de RecimAes Vétérinaires (C.N.E.RV) de Nouakchott pour que le diagnostic s&ologique et virologique de la
FVR iX.lkSe se faire à Nouakchott et éviter de perdre un temps précieux pour acheminer les pr&,vemenb vers m
laboratoire extérieur.
Ma-e mission s’est attachke.à évaluer la situation actuelle (activités, personnel, équipements, locaux), déterminer
les moyens IdceSsaireS aux ‘techniques de diagnostic de la FVR utilisables au niveau du laboratoire de virologie
(Anne= 1) d’une part et d’dpti part, a démarrer des tests simples de diagnostic de la FVR pour une prise en
charge effective de l’analyse de prelèvements provenant de l’activité de la surveillance pendant la présente
saison des pluies.
6
2. ConsidCrations générales:
2.1.
Le Centre National de FElevage et de Recherches Vétérinaires (CNERV) de Nouakchott est créé en
1974 et est le laboratoire national charge de la Recherche V&kaire et Zootechnique en Mauritanie. Il est place
sous la tutelle du Ministère du Developpement Rural et de l’Environnement (M.D.R.E.). Sa première mission est
d’assurer un appui aw actions de protection de la sante des troupeaux en menant des activités de diagnostic, des
etudes épidémiologiques et en proposant des moyens de lutte des maladies prioritaires enzootiques , nouvelles ou
rtkmergentes.
1

---

Parmi les maladies prioritaires, la FVR occupe une place importante comme en témoignent les nombreuses
études menées par le CNERV depuis 1985, notamment :
m
Enquête sérologique sur les avortements infectieux des petits ruminants en Mauritanie en 1985 (article
prévoyant le foyer de FVR de 1987)
-
Epid&niosurveilIance de la FVR en 1988 et 1989
-
Essai en station et sur le terrain de vaccin (MVPl2 et Smithbum) contre la FVR en 1988-1989.
Ces études ont été menées grâce a la coopkation internationale (convention CIRAD /Eh!IVT, FAO) et sous
régionale (Institut Pasteur de Dakar et LNERV de DakarkIamr pour les analyses de laboratoire ).
2.2.
Le service de pathologie inkctieuse qui r&uIte d’une .fusion nkente entre les services de bactériologie
et de virologie a la charge du diagnostic des maladies virales. En 1998, ses activités ont concerne la
s&osurveillance de la peste bovine (analyse par le test Elisa-compktition de 3833 s&ums avec 1513 positifs, soit
39,4% de séropositivité), le diagnostic de la rage (15 pr&vements analysés par test IF avec 09 positifs), la fièvre
aphteuse (virus de type A confirme par le laboratoire de Pirbright en Angleterre sur des pr&vements envoyts
par le CNERV), la séro-surveillance de la FVR (245 s&ums d’animaux du foyer de FVR de 1998 en cours
d’analyse à l’Institut Pasteur de Dakar). Le service dispose d’un équipement qui a permis d’isoler sur cuItures de
cellules des souches de la variole du dromadaire qui constituent présentement sa banque de virus.
2.3.
Le Dr Yaghouba. Kane, Chef de service, depuis janvier 1998, participe, avec 2-3 techniciens (Annexe
5), a la campagne de surveillance de la FVR par le suivi virologique, s&ologique et clinique de troupeaux de
rumina@ sentinelles. Apres l’épisode de FVR de 1998, une 1” mission de pr&vements (du 13 au 25/06/1999) a
permis de récolter 310 sérums des 9 troupeaux d’animaux sentinelles repartis dans les zones consid&es à
risque.
Une seconde mission de surveillance est en cours lors de notre mission (du 2/07 au 05/08/1999) doit apporter un
nombre équivalent de sérums.
De plus, une mission conjointe avec les entomologistes de I’IRD de Dakar, prévue en Août 1999, doit visiter le
foyer de FVR de 1998 et permettre d’évaluer l’activité du virus FVR (prktlence en anticorps IgG/.IghJ,
isolement de virus d’animaux et de pools de moustiques) pendant la présente saison des pluies dans le sud est de
la Mauritanie.
Localisation des troupeaux sentinelles en 1999.
R&ions
No troupeau/Site
Agent
Nbre de sérums récoltés
vétérinaire
(mission du 13-25/06/1999)
Hodh el Garbi 1/Wouguiss
Wone T
4 0
2fQarqara
Gaye S
30
Assaba
3rWorti
Ba A.S
3 0
4/Agoumaminel(kankossa)
Sali H.A
31
Gorgol
5/Moudaikhoul jeddah
Samake D
39
(wouro bathiourou)-
Braklla
OlSaradogou
San A..N
4 0
7/Lac Aleg
Baguily 0.L
3 0
Trama
8lDouzedauze
Thioune S
4 0
9lRosso ‘!
Diarra B
30
t.
Total :
310
6
Notons que ces localisations concernent les zones où la FVR a sévi en 1998 mais aussi une partie des zones de
l’enquête stkologique menée en 1996-1997 chez 1077 petits mminants dans six wilayas (ou régions). De plus,
nous constatons que la région de Guidimakha n’est pas concernée par la présente surveillance bien qu’elle soit
frontalière avec le Mali et le Sénégal et qu’elle fasse partie du Bassin du fleuve Sénegal.
2.4.
En Mauritanie, le système national de surveillance de la FVR implique, en plus du CNERV, plusieurs
autres partenaires comme la Direction de Ressources AgroPastorales @.RA.P), le Réseau Mauritanien
d’Epidémiologie des Maladies Animales (REMEMA) pour la surveillance de la FVR par les troupeaux
sentinelles et le Comité Paritaire pour le Suivi Sauitaire (CPSS) pour la surveillance des animaux au niveau des
2

---

points de vente. Cette collaboration a permis d’établir un importaut programme de collecte de prélèvements
(sang et organes) d’animaux des troupeaux sentinelles et des divers marchés à bétail de la Ville de Nouakchott.
En ce qui concerne le suivi des marches, il est pr&vu un rythme mensuel de pr&vements de 40 &ums
d’animaux de diverses espèces (ovins, caprins, bovins et camelms) à partir des differents marchés a b&aïL Les
prelevements ont débuté en Mars 99 et ont permis de stocker actuellement 300 sérums environ au CNERV:
Et, au niveau des troupeaux sentinelles, il est prévu de récolter environ 2500 à 3000 sérums et autres
prélèvements par an
Le laboratoire dispose ainsi d’un système est capable, s’il fonctionne r&ulièrement, de lui fournir les
prélèvements en nombre suffisant (avec 3500-4000 analyses possibles par an} pour une bonne &hration et une
surveillance de l’activité du virus de. la FVR dans les principales zones d’élevage de la Mauritanie.
2.5.
Le CNERV doit être en mesure de recevoir, d’analyser et de conserver les divers prékwements (&ums,
organes) d’animaux suspects de FVR. Une attention particulière doit être attirée sur le fait que les tissus des
animaux malades sont hautement infectieux et qu’il y a un risque élevé de contamination Des précautions toutes
particulières doivent être prises lors de l’autopsie, des prélèvements et pour l’expédition.
Les paquets contenant les pr&vements doivent être préparés selon les normes internationales afin
d’éviter tout risque de diffusion du virus.
Pour le traitement des prélévements, le CNERV dispose d’une salle d’autopsie bien conçue mais dont la s&uriti
doit être améliorée en ajoutant deux (2) lampes A lumière ultra violette stérilisante et une lampe attrape-insectes.
Cette amélioration vise a stériliser l’atmosphère de la salle d’autopsie et de détruire les moustiques vecteurs du
virus présents dans l’environnement imm&iat De plus, l’@ripement de cette salle doit être compléte par un
incinérateur pour détruire les cadavres par la chaleur en toute sécurité. Le CNERV est situé en zone d’habitations
et la destruction des cadavres par enfouissement ne doit pas être de mise avec des prélèvements suspects de
FVR.
2.6.
Le CNERV doit être en mesure de mettre en œuvre les techniques de diagnostic de la FVR qui sont : le
diagnostic virologique par l’isolement du virus à partir du sang ou d’organes d’animaux ou d’avortons sur
animaux de laboratoire et sur cultures de cellules, le diagnostic sérologique par le test Elisa, la séro-
neutralisation, l’immu.nofluorescence et le diagnostic histopathologique.
2.6.1.
Le diagnostic virologique : est la technique idéale de diagnostic de la FVR et consiste à isoler
et à identifier le virus sur des animaux de laboratoire (souris, hamster) ou sur cultures de cellules.
Mais cette technique présente des risques liés à la manipulation de matériels hautement infectieux et exige que
les conditions suivantes soient remplies :
- un personnel technique vacciné contre la fièvre de la vaMe (3 injections) et un rappel tous les ans.
- un laboratoire équipe de hotte niveau P2-P4 permettant de manipuler en toute securité,
- un usage de désinfectant à base d’hypochlorite auquel le virus est très sensible (eau javélisée à 5%)
et une attention particulière pour les personnes impliquées dans les opérations d’autopsie de cadavres d’animaux
suspects de FVR : travailler dans des conditions réduisant au maximun les risques de contamiwtion (utiliser des
gants, des masques ).
La technique d’isolement du virus de la FVR, la plus sensible, est celle qui utilise l’inoculation d’animaux
comme les souriceaux nouveaux nés: le hamster et l’agneau. L’inoculé est constitué d’une suspension à 20% de
tissu hépatique ou cérébral dans du PBS additionné d’antibiotiques. La présence de virus se manSeste par la mort
des souriceaux nouveaux nés 3-5 jours après l’inoculation par voie intracerébrale. Les fragments des animaux
morts ou ayant présenté des signes de maladie sont alors testés avec des sérums spécifiques connus.
La seconde technique d’isolement du virus utilise l’inoculation de cellules sensibles comme les celhrles V&o et
BBK. La présence de virus se manifeste en 3-5 jours par un effet cytopathogene caract&&tique. L.a
caractérisation peut se faire par immunofluorescence directe.
Le CNERV dispose d’un persomrel vacciné contre la FVR et est compétent pour traiter des produits infectieux
comme comme ceux suspects de rage mais cependant l’état de l’animalerie ne permet pas de garder les souris
inoculées en toute sécurité. L’étanchéite des salles r&ervées aux cultures de cellules et d’isolement de v& est
à parfaire (réfection des fenêtres et climatisation par split). La mise en œuvre des cultures de celhdes exige en
plus l’acquisition d’un incubateur à CO2 car ceux existants sont vétustes et défectueux pour la régulation de la
température.
Cette situation nous pousse à déconseiller le recours à cette technique d’isolement pour le diagnostic de la FVR
au CNERV et de recourir à la collaboration avec les laboratoires de Dakar. L’inoculation du viras de la FVR à
des systèmes sensibles entraîne une production massive de virus et augmente le risque de contamiuation pour le
personnel et de diffusion du virus dans l’environnement.

---

2.6.2.
Le diagnostic sérologique de la FVR utilise les tests suivants :
a)
La technique elisa : est la technique sérologique particuliérement recommand& en raison de sa
spécificité et de sa sensibilité. De plus, elle permet de traiter un grand nombre de skums (200-300) en un laps de
temps relativement court (24heures) et est capable de détecter differentes classes d’immunoglobulines (IgG et
IgM). Cette technique permet avec un seul sérum d’identifier une infection virale récente par la pmsence de IgM.
Le CNERV dispose de la chaîne complete elisa (lecteur, ordinateur logiciel EDI-2.3 elisa data interchange et
imprimante) et de la comp&ence nécessaire pour r&a.hser le test elisa. Nous rappelons qu’en 1998, 3833 sérums
de bovins ont été analysés au CNERV par cette technique pour établir la situation immunitaire vis à vis de la
peste bovine en h4kukmie. L’acquisition d’un distillateur d’eau permettra d’améliorer la quantite et la qualité
d’eau nkessaire a la mise en place de ce test
La mise en place definitive de ce test Elisa au CNERV est suspendue à l’acquisition de réactifs. Certains sont
disponibles sur le marché comme les conjugués, tampons et autres produits chimiques. Alors que des réactifs
comme les antigènes viraux ou les immuno-ascites sont , au contraire, encore détenus par divers laboratoires de
recherche franas (Institut Pasteur), africain (Laboratoire d’Gnderstepoort) et américain (CDC d’Atlanta). Ce
qui aboutit a une diversité de tests et qu’il n’y ait pas de kit disponibles actuellement dans le commerce pour le
diagnostic de la FVR par la technique elisa.
Des collaborations comme celle avec l’Institut Pasteur de Dakar doivent nous permettre de disposer des réactifs
nécessaires (antigène et immuno-ascite) à la mise en place de ce test Elisa en Octobre 1999 au CNERV. A cet
effet, le Chef de service de virologie, le Dr Kane sera en stage du 27/08 au 06/10/1999 sur les techniques
sérologiques de la FVR à Dakar (Institut Pasteur et LNERV ) et ramènera les réactifs nécessaires pour le
démarrage du diagnostic skologique de la FVR par elisa au CNERV en octobre 1999.
Par ailleurs, 1’AI.E. A est entrain de tester un kit elisa FVR du Laboratoire d’Gnderstepoort d’Afrique du Sud
avec les laboratoires nationaux du Mali et du SénégaI pour le distribuer ensuite. La collaboration avec l’agence,
déjà existante pour le diagnostic de la peste bovine au CNFRV, sera solIi&e clés que les r&itats des tests en
cours seront connus.
b)
La technique de séroneutmlisation: C’est la technique de référence pour la FVR car c’est la plus
spécifique et utilisable dés le 3’ jour de l’infection. Les anticorps détectes par ce test persistent 6 mois à 1 an (et
même plusieurs annees) a des titres éleves. Toutefois, cette technique nécessite l’utilisation de virus vivant et de
dhdes en cuhure.
Elle permet d’analyser les sérums quelque soit l’espke animale (ovine, caprine, bovine et cameline) avec les
mêmes rktifs et dans un laps de temps compris entre 4-5 jours.
Elle est d’un coût plus faible que la technique Elisa car les réactifs (antigènes, virus, anticorps), une fois acquis,
peuvent être produits par tout laboratoire ayant la capacité d’entretenir des cuhures de cellules.
Le CNFRV dispose, à l’exception d’un incubateur à C02, de tout le materiel nécessaire pour réaliser le test de
séro-neutralisation. Les 2 incubateurs actuels sont vétustes et leur fonctionnement est aléatoire (ditficulté d’avoir
une température stable). Certains réactifs notamment la souche virale Smithbum (souche utilisée également
comme vaccin pour les animaux contre la FVR) et le sérum de référence positif sont disponibles au CNERV et la
technique sera mise en route dés l’acquisition de l’étuve à CO2 et des milieux de culture pour cellules au plus
tard en Décembre 1999.
c>
La technique d’immunoflo~scence est une technique d’application facile et déjà utilisée au CNERV
pour le diagnostic de la rage. Trés spécifique, Pimmunofluorescence sur un étalement de foie, de rate ou de
cerveau d’animal sacrifié en hyperthermie permet d’avoir un diagnostic rapide de FVR . Ainsi, il peut être utilise
pour identifier la présence de virus dans les préltîvements d’organes d’animaux suspects mais aussi pour déceler
les anticorps anti virus de la FVR dans les sérums d’animaux.
Le CNERV dispose de l’équipement nécessaire mais a besoin de consommables le laboratoire : petit matériel
(lames , lamelles), de rktif&conjugu& marqués à la fluorescence).
Les réactifs (conjugués fluorescents a.&anticorps de mouton, sérum de référence de mouton anti virus de la
FVR) que nous avons apportés du LNFRV de Dakar-Hann nous ont permis de l’appliquer au CNERV s& des
cellules V&o infectées par la souche Smtihbum.
2.6.3.
La technique histo-pathologique est une technique pratique, rapide et très spécifique (donc
fiable) de diagnostic de la FVR. Elle s’applique sur des fragments de foie placés dans de l’eau physiologique
formolé à 10% et consiste à rechercher dans les cellules hépatiques des inclusions nucléaires, acidophiles,
caractéristiques de la FVR.
L’équipement pour cette technique existe au service de cytologie de 1’Hôpital de Nouakchott (Dr Nasserdine) et
Dr Kane, titulaire d’un Diplôme de 3’ cycle en Anatomie pathologie, Ecoles V&érinaires Françaises a les
4

---

compétences pour r&liser ces analyses. Le CNERV serait alors le seul laboratoire de la sous région à appliquer
cette technique et servirait de centre vr%inaire de référence pour le diagnostic histologique de la FVR
La mise en œuvre de l’examen histologique nécessite l’acquisition de consommables de laboratoire (réactifs et
petit matériel) car la collaboration avec l’hôpital de Nouakchott pour l’utilisation du matériel est déjà acquise.
2.7.
La liste de matériel propose (annexe 3) comporte des appareils permettant de disposer de l’eau de bonne
qualite et en quantite su%ante pour mettre en œuvre des techniques exigeantes comme l’elisa, les cultures de
cellules, la séroneutmlisation, la préparation de tampons et de milieux pour faire face a l’augmentation du
nombre-d’analyses pour la FVR et les autres maladies abortives.
Les réactifs pour les differents tests de diagnostic de FVR et des maladies abortives ont été précisées mais pour
les réactifs pour le test Elisa IgG&M demandent des informations supplémentaires (references du produit)
auprès de l’Institut Pasteur de Dakar qui pourrait fournir en antigene viral et en immuno-ascite spkcifîque FVR.
Pour tout matériel et les divers réactifs, les caractéristiques techniques et les prix moyens et des coordonnées de
5 fabricants ou fournisseurs ont eté précises.
2.8.
La formation en techniques de diagnostic de la FVR lors de la mission a concerne (Annexe 4):
a)
la technique de culture de cellules Véro et de rein de fœtus de mouton a été appliquée: quatre (4)
passages de cellules V&o de la banque de LNERV ont été réalisés, trois (3) embryons de fœurs de mouton
obtenus des abattoirs de Nouakchott ont été traités et mis en culture lors de notre mission au CNERV.
b)
La technique d’inoculation de la souche virale Smithburn sur les cellules V&o a éte également exécutée
et les récoltes de surnageant de cellules infectees ont permis de constituer une banque d’antigènes FVR au
CNERV.
Cl
La technique d’inoculation de la souche virale Smithbum aux souriceaux nouveaux nés (par la voie
intra&-ebrale) et aux souris adultes (par la voie intra-péritonéale) a été présentée.
4
La technique d%nmunofluorescence indirecte sur cellules V&o infectees a été réalisée.
e)
Les techniques sérologiques elisa et s&oneutralisation ont été discutées et le nécessaire (le materiel et
les réactifs) pour leur mise en œuvre au CNERV a été préciué (Annexe 3). Au moment où s’est déroulke la
mission, deux (2) des trois (3) techniciens du laboratoire étaient en formation sur les techniques de diagnostic
virologique au Laboratoire Central Vétérinaire de Bamako, au Mali.
Par ailleurs, le fonctionnement des appareils comme les hottes, les étuves a été présenté. Une réorganisation des
differentes salles du laboratoire de virologie a été préconisée pour une meilleure sécurite et efficacite des
manipulations. Des amenagements des locaux (laboratoire, animalerie et salle d’autopsie) ont été présentés et
leur coût évalué.
3. Conclusions et Recommandations:
1
La mise en place du diagnostic de la FVR au CNERV de Nouakchott est relativement aisée car le personnel
technique et scientifique du laboratoire de virologie est qualifié pour les techniques de base de virologie (culture
de cellules, techniques d’inoculation de cellules par des prelèvements suspects de variole de dromadaire,
technique d’immunofluorescence pour le diagnostic de la rage, élevage d’animaux de laboratoire :sotuis Swiss).
De plus, ce personnel est vaccine contre la FVR (3 injections effectuées après le foyer de 1998).
L’équipement actuellement psponible au laboratoire de virologie du CNERV, à l’exception des étuves, est
conforme aux normes internationales, notamment la chaîne elisa, les hottes à flux laminaire et les microscopes
inverse et à fluorescence (Annexe 6).
Le d&narrage effectif du diagnostic de la FVR au CNERV est actuellement lié surtout a la disponibiffte de
réactifs et réactifs chimiques spécifiques au virus mais au renouvellement de quelques appareils vétustes (étuve à
C02) ou de faible capacité (distillateur d’eau) et aux quelques aménagements de locaux nécessaires pour
arneliorer la sécurité du personnel et de l’environnement.
3.1.
Concernant les aménagements des locaux du laboratoire de virologie :
Ces aménagements visent à améliorer la sécurité lors de manipulation de prélèvements hautement infectieux et
concernent la salle d’autopsie (pose de lampe à lumière ultra violette et lampe anti moustiques, pose de
moustiquaires aux fenêtres), le laboratoire de virologie (&anchéité des fenêtres de la salle destinée, pose de
lampes W, climatisation par Split, installation d’un perron pour épousseter l’entrée du laboratoire ).
5

---

3.2.
Concernant les réactifs et les produits spécifiques de la FVR :
Ces r&ctifs doivent permettre la réalisation du diagnostic virologique (test d’immunofluorescence) et
sérologique (test d’Ehsa, de Séroneutralisation et d’Immunofluorescence) de la FVR.
L.e test Elisa, dejà couramment utilisée pour le diagnostic de la peste Bovine, nécessite des r&@.ifs comme
antigènes, sérums ami-FVR, conjugues, tampons, substrat, chromogène, etc.. pour sa mise en place au CNERV
qui dispose déjà d’une chaîne elisa complete et fonctionnelle. Tous les rt%ctifs ne sont pas encore disponibles
dans le commerce, notamment les antigènes et les &ums anti-FVR, et doivent être acquis auprès de laboratoires
de recherches. Les produits disponibles dans le commerce ont éte établis (Annexe 3) et la collaboration avec
l’Institut Pasteur de Dakar permettra de disposer des antigènes viraux et des hybridomes (sérum anti FVR) pour
la mise en route de ce test.
Le test de séroneutralisation nécessite, en plus de milieux de culture et divers produits chimiques, l’emploi d’une
souche virale et de cellules en culture. La souche virale Smithburn et les cellules Véro ont été mises à la
disposition du CNERV. Les milieux de culture, le petit matériel et les produits disponibles dans le commerce ont
été précisés (Voir annexe). Cette technique sera appliquée lorsque l’incubateur à CO2 sera disponible au
CNERV.
Le test immunofluorescence , déjci couramment utilisée pour le diagnostic de la rage, a été réalisé pour le
diagnostic de FVR sur cellules Uro infectees lors de notre mission grâce aux réactifs (conjugué fluorescent,
s&mn anti FVR) et matériels (lames pour immunofluorescence, microplaques) que nous avons apportés du
LNERV de Dakar-Hann
3.3.
Les techniques recommandees pour le diagnostic de la FVR au CNERV sont:
a) Le diagnostic virologique par mise en évidence d’antigenes viraux sur des étalements d’organes d’animaux
suspects de FVR par la technique d’immunofluorescence directe ou indirecte. Cette technique est en place
au CNERV et l’achat ‘de conjugués spkcifiques permettra de prendre en charge les prélèvements provenant
de la prknte campagne de surveillance de la FVR en Mauritanie.
b) Le diagnostic sérologique par elisa par mise évidence d’anticorps anti FVR IgG et IgM dans les skums
d’animaux des troupeaux sentinelles et des divers marchés a bétail de Nouakchott est particulièrement
recommandé. Il sera en place en Octobre 1999 avec la fourniture des réactifs provenant du commerce et de
l’Institut Pasteur de Dakar.
c) Le diagnostic sérologique par mise en évidence d’anticorps neutralisants dans les sérums d’animaux est une
technique de référence particulierement recommandée pour sa spécificité et son coût faible. L’acquisition
d’une étuve à CO2 permettra de mettre en place la technique en Décembre 99 au CNERV qui dispose déjà
de la technique de culture de cellules et de la souche virale Smithburn.
d) Le diagnostic sérologique par immunofluorescence indirecte pour mettre en évidence les anticorps anti FVR
dans les sérums d’animaux est recommande parce qu’elle est tres pratique, rapide, spécifique. Mise en place
en Juillet 99, la prise en charge des prélèvements de la présente campagne dépend de la disponibilité en
conjugué antiesp&ces (mouton, chèvre, bovin et camelin).
e) Le diagnostic histologique par mise en évidence dans les cellules hépatiques des inclusions nucléaires,
acidophiles, caractéristiques de la FVR. Cette technique permettra de traiter les organes (foie surtout)
d’animaux maladesa la place dela technique d’isolement de virus. Ainsi, tout prelèvement d’organes pourra
être analysé soit par l’anatomo-pathologique, soit par l’immunofluorescence, deux techniques très
spécifiques et moins risquées, utilisables à la place de la technique d’isolement du virus pour le diagnostic
de la FVR au CNERV.
En deftitive, ces techniques permettent d’analyser tout prélèvement (sénuns, organes) suspect de FVR et de
poser un diagnostic rapide etXable de la FVR au CNERV de Nouakchott. Mais, pour sauvegarder cet acquis, il
est indispensable de doter le laboratoire de virologie d’un budget de fonctionnement pour faire face à l’achat de
réactifs et de petit matériel de’laboratoire. C’est une étape importante pour la surveillance de l’activité du virus et
le contrôle de la maladie en Mauritanie, pays le plus expose à la FVR de la sous région. Toutefois, la menke de
la FVR est permanente pour les pays voisins en raison des échanges transfrontaliers et des mouvements
traditionnels et commerciaux d’animaux.
Au niveau de la sous région, le contrôle de la FVR passe par la mise en place d’un systeme d’alerte précoce
fonctionnel base sur la surveillance des troupeaux sentinelles, l’existence de laboratoires nationaux de diagnostic
vétérinaire fonctionnels et le suivi des modifications environnementales par l’imagerie satellitaire pour détecter,
en temps réel, les conditions~prklisposant à l’émergence de la FVR et ou poser le diagnostic de la FVR le plus
rapidement possible. De telles informations sont néoessaires pour qu’une décision de vacciner puisse être prise,
pour immuniser ainsi le cheptel et mettre l’homme hors de danger par contact avec les animaux infectés.

---

Annexe I:
‘fermes de référence pour le consultant international (TCDC) pour le diagnostic de laboratoire de la fièvre de la
vallée du Rift.
Sous la supervision technique du chef de service Sante auimale de la FAO et en collaboration avec le
coordonateur national du projet, le consuhant devra effectuer les tâches suivantes:
- Evaluer les capacités de diagnostic du CNERV, notamment pour le diagnostic de la fièvre de la val& du Rift,
- Etablir avec le personnel du CNERV et le coordonnateur du projet la liste du matériel nécessaire à la mise en
place d’une un@ de diagnostic de la fi&re de la val& du Rift,
- Faciliter la d&rance des réactifs et du materiel mkessaire à la mise en place de ces techniques,
- Effectuer la formation du personnel de laboratoire dans les diffiërentes techniques de diagnostic,
- Evaluer toute autre tâche, si nécessaire ;
Préparer un rapport de consultation concis suivant les normes de la FAO en format Word 7.0 (sur disquette ou
envoyé sous forme de pièce jointe par courrier électronique).
.

---

Annexe II
Emploi du temps de la mission.
13/07/1999:
- Arrivée à Rome à 8H (vol AZ639)
- Visite du service de santé animale au Siège de la FAO
14/07/1999:
- Arrivée à Nouakchott à 16H (vol AF 0764)
15/07/1999:
- Visite à la Représentation de la FAO en Mauritanie, rencontre de Mr Mou&line Kadra, Repr&xtant en
présence de Dr Lemrabot& coordonateur national du TCPMAU/8923(E),
- Visite à la Direction des Ressources Agro-Pastorales (DRAP), Dr Fall, Directeur adjoint de la DRAP et
int&imaire du Directeur national de la DRAP en mission hors de la Mauritanie.
- Visite au Centre National de YElevage et de Recherches V&érinaires(CNERV) de Nouakchott et rencontre de
Dr Idrissa Diarra, Chef du Service d’Epidémiologie et intérimaire du Directeur du CNERV en mission hors de la
Mauritanie, Dr F.Schneegans, Vét&inaire Coop&ant français et Conseiller en épidémiologie du service
d’Epidémiologie du CNERV, Dr P.Nabeth, M&~in Coopérant f?ançais et épidémiolgiste au Centre National de
I’Hygiène (C.N.H) de Nouakchott
- Visite du laboratoire de virologie du CNERV et Rencontre de E Isselmou, technicienne à la place du chef de
service en mission de prélèvements a Rosso, I-égion de Tmrza (région sud et frontalière avec le Sénegal).
Semaine du 17 au 22 10711999
17/07/1999:
- Visite à la DRAP et rencontre de Dr Doumbouya Baba au service de l’amélioration des ressources animales et
de Dr Eric Clua, Vétérinaire coopérant fiançais et conseiller technique du Directeur de la DRAP, Mr Abdoul
Aziz Camara Ingénieur des Travaux d’Elevage (I.T.E), Chef de la division Coopératives et Mr Sidy Bouna Ould
Gaouad, Responsable de ia communication du Projet Parc, Dr P. Formenty, Consultant FAO en mission en
Ma$tanie.
- Visite au CNERV et Rencontre de Dr Kane, Chef de service de Pathologies infectieuses, suivies de préparation
de matériels (lavage, stérlisation) pour la mise en place de la technique de culture de cellules au CNERV.
18/07/1999:
- Réunion au CNERV sur le protocole d’essai vaccinal avec les Drs Formenty (consultant FAO), Ltxnrabott(chef
de service Santé animale), Diarra (Chef de service Epidémiologie), Schneegans (Conseiller en Epidémiologie),
Kane (Chef de service de Pathologies Infectieuses) et E.Rua(conseillier technique a la DRAP).
- Visite à Rosso (ville frontalière avec le Sénégal) pour récupérer des réactifs en provenance du LNERV de
Dakar-Hamt(cellules Véro, souche smithburn, milieux de cultures, tampons, antibiotiques et de petits matériels
pour cultures de cellules) et rencontre de Dr Saleck Ould mahoumoud, Chef de service de la DRAP de Rosso.
19/0711999
- Trypsination (ou Passage) Mise en place de culture de cellules Vero (Trypsination ou passage des cellules) au
Laboratoire de virologie du CNERV
- Elaboration de la liste des r&xtif.s et des matériels nécessaires pour une unité de diagnostic de la FVR au
CNERV.
20/07/1999
I
- Visite aux abattoirs de’Nouakchott pour récolte de fœurs de mouton.
- Mise en place de cultures de cellules de reins de mouton (digestion enzymatique des fragments de reins et mise
en culture).
- Suivi des cellules Véro (renouvellement de milieu).
- Présentation de la liste du matériel et des réactifs en réunion avec les Drs Lenuabott, Formenty, IQme et Diarra,
- Finalisation de la liste et Envoi à Rome.
21/07/1999
- Suivi de l’évolution des cellules en culture (cellules véro, rein de mouton).
- Observation des cultures de cellules de reins de mouton.
6
- Présentation de la technique de culture de cellules primaires et de lignée.
- Discussion sur l’organisation des locaux du laboratoire de virologie aux fins de diagnostic de la FVR.
22/07/1999
- Suivi et manipulation des cultures de reins de mouton(renouvellement du milieu) et des cellules Vero
(trypsination).
- Visite de l’animalerie (élevage de souris) et préparation de souriceaux nouveaux nés
- Visite d’élevages pérjutbains (autour de Nouakchott) de Dromadaires laitiers atteints d’a&ction cutanée.

---

Sema& du 24 au 29 /7/1999 (production d’antigénes FW)
24/07/1999
- préparation de fcetus de mouton pour culture de cellules de mm
_ Utilisation des c&&s V&o (kchnique d’inoculation de cellules Véro avec la souche virale FVR srnithburn.
- Appui a la R&&ction de la communication aflïch& de Dr Kane sur la pathologie du charnelon en Mauritanie.
25/07/1999
- Util&&n des cellules V&o (Technique de Titrage de la souche virale FVR smithbtrm).
- Discussion sur les aménagements a r&diser aulaboratoire de Virologie pour assurer une meilleure étanchéité.
- Suivi des cellules de reins de mouton (renouvellement de milieu de culture).
26/07/1999
- Utilisation des cellules V&o (Récolte du surnageant de cellules Vero infectées par la souche Smithburn).
- Finalisation de la rédaction de la communication affichée.
27/07/1999
- Préparation de fœtus de mouton pour culture de rein de mouton
Rencontre de Mr Diakite Abdoul salam, Assistant d’Elevage, chef de la clinique vét&inaire de la DRAP
@elegation de Nouakchott), clinique située dans l’enceinte du CNERV.
- Participation a la DRAP à la r&mion de restitution de Dr Formenty (consultant FAO) avec Drs
Lemrabott(coordonnateur national du TCP), Dr Fall (Directeur adjoint de la DRAP), Dr Kane(Chef de service de
virologie du CNERV) et Mr Ahmeda Ould mohamed Ahmed, Charge de programme à la Représentation de la
FAO en Mauritanie.
28/07/1999
- Utilisation des cellules Véro(récolte de surnageant de cellules infectées).
- Utilisation des SO~~~CXZI~X nouveaux ries (Technique d’inoculation par la voie intracerebrale de la souche
smithbum).
29/07/1999
- Utilisation des cellules V&o (Présentation de la technique dimmunofluorescence sur microplaques à 96
CuPdeS et sur lames pour immunofluorescence à partir de cellules infectees par la souche Smithburn)
- Préparation de culture cellules de reins à partir d’embryon de mouton
- P&xWion des aménagements à effectuer à l’animalerie du CNERV(pose de moustiquaires, reparatron de
toiture).
Semaine du 3 1/07 au 05/07/1999 (Techniques de diagnostic FVR suite)
31/07/1999
- Prt5paration de culture cellules de reins d’embryon de mouton
- Utilisation des cellules V&o (Présentation de la technique d’immunofluorescence sur cellules véro infectees
(déposées sur lame porte objet pour JJ?).
- Rencontre de Dr MKane, Chef de la Division de la Recherche Vétérinaire et zootechnique, responsable du
programme national de formation des auxiliaires d’élevage.
1/08/1999.
- Utilisation des cellules Véro (Trypsination et renouvellement de milieu).
- Réunion de restitution de la mission à la DRAP avec le Drs D.Diagana (Chef de la Division de 1’Amelioration
des ressources Animales), Lemrabott (Coordonnateur national du TCP), Kane (Chef de service de virologie) et
de Mr Ahmeda (Char@ de programme à la FAO-Mauritanie).
2/08/99
- Départ pour Dakar et Arrivee à Dakar le 02/08 à 21H30mn (RKOll3).

---

.
Annexe Ill
Liste du matériel et des réactifs pour le diagnostic de la FVR et des maladies abortives au CNERV de
Nouakchott.
1. Pour le test Elisa [FVR]:
1.1 Microplaques B 96 cupules pour test Elisa avec couvercle@hmc, maxisorb ou Immulon)
Quantité: 200
Prix catalogue (FF) : 2500
1.2 Filtre 450 nm pour lecteur Elisa Immunoskan MS (BDSL)
Quantité : 2
Prix (FF): 6000
1.3 Sérums et réactifs pour 4 000 stknns environ
1.3.1Tampon bicarbonate, pH:9,2 en capsules
Réf : sigma C-3041
1.3.2 Tween 20, liquide
1.3.3 Lait écrémé en poudre
1.3.4 Hydrogen peroxide en tablettes
1.3.5 Grthophenylenediamine (OPD) en tablettes
1.3.6 Tampon Phosphate citrate en tablettes
1.3.7 Tampon PBS en capsules
1.3.8 Acide sulfurique 4N
1.3.9 sérums ami :
Sérum anti IgG de mouton marque à la péroxydase
Sérum anti IgG de chèvre marque a la péroxydase
Sérum anti IgG de bovin marqué à la péroxydase
Sérum anti IgG de dromadaire marqué à la pet-oxydase
Sérum ami IgM de mouton
Sérum anti IgM de Chèvre
Sérum anti IgM de Bovin
Serum anti IgM de Dromadaire
Sérum anti souris marqué à la péroxydase (Réf. Cappel55558)
1.4 Bidistillateur d’eau inox. production de 2 litres / heure
Caractéristiques :
Conductivité : 1.5 ps/cm
Fonctionnement automatique W
2 vannes ind+xul.antes en eau mono et bidistil&
Securite manque d’eau
Conforme à la pharmacopée européenne
Débit : 2 litres,
Consommation l/h:72 ‘.*
Consommation KW/~ : 3.5
Alimentation 220 Volts et 50 Hz
Dimensions : I-RP cm : 57x 55x 28
Poids kg 18-24
Avec accessoires :
Cartouche phosphatée et cartouche déchlorite
Prix catalogue approximatif (FF) : 33 000
1 0

---

.
1.5 Laveur de plaque manuel
Quantité: 1
Caractéristiques:
Utilisable pour des plaques 96 puits ponr ELISA, pour des modules 8 puits, des barrettes Nucléolink, des plaques
384 puits,
Utilsable pour des plaques à fond rond et plat, diametre du tuyau a raccorder: 5 à 8 mm
Livre avec kit de pièces de rechange
Prix(FF):4500
2. Pour le test de honeutralisation et isolement de virus F’VRz
2.1 Microplaques à 96 cupules à fond plat pour culture de cellules avec couvercle
Quantité: 200
Prix catalogue (FF) : 4000
2.2 Flacons de culture 25 cm2,
Qnantité :300
Prix catalogue (FF) : 2100
2.3 Flacons de culture 75 cm2
Qnantité : 100
Prix catalogue (FF) : 1400
2.4 Plaques à 6 puits, fond plat avec couvercle, surface 9,4 cm2
Quantité : 50
Prix catalogue (FF) : 850
2.5 Pipettes :
Pipettes en verre Pyrex graduées de 5 ml, non steriles
division 0,l ml
Quantité : 240
Prix catalogue (FF) : 600
Pipettes en polystyrène graduées de 5 ml, stériles et cotonnées
division 0,l ml
Quantité : 400
Prix catalogue (FF) : 1000
Pipettes en polystyrène gradukes de 10 ml, stériles et cotonnées
division 0,l ml
Quantité : 500
PrYrcatalogue(FF): 1 3 0 0 -
Pipettes en verre graduées de 10 ml, non stériles
Quantité : 120
Prix catalogue (FF) : 600
2.6 réactifs pour culture de cellules :
2.6.1 Milieu MEM Glasgow en poudre avec glutamine sans bicarbonate (NaHCO3):
4
Quantité : 50 litres (flacons de 5 litres)
Prix (FF): 800
2.6.2 Sérum de veau fœtal :
Qoantité : 5 litres (flacons de 100 ml)
Prix (FF): 3150
.
1 1

---

2.6.3 Antibiotiques :
Pénicilline/Streptomycine en solutions concentrées en flacons de 5 ml
Quantité : 100 flacons
Prix approximatif (FF): 4000
Antifongique(amphot&icine B)
Quantité : 100 flacons
Prix approximatif (FF):4500
2.6.4 Trypsine en poudre
2 Flacon de 100 g
Prix (FF) : 2400
2.6.5 EDTA (Ver&re) en poudre
Flacon de 100 g
Prix(FF) : 110
2.6.6 Produits pour Tampon PBS :
Chlorure de sodium (Nacl) :
Quantité : 5 kg
Prix(FF):302
Chlorure de calcium anhydre (Ca~l) :
Quantité : 5oog
Prix(FF):550
Chlorure de magn&.rm :
Quantité : 5oog
Prix(FF): 150
Chlorure de potassium :
Quantité : 1 Kg
Plix(FF) : 150
Phosphate disodique (Na2HPO4) :
Quantité : 2Kg
Prix (FF) :600
Phosphate monopotassique (KH2PO4):,
Quantité: 5oog
\\,
-.
Prix (FF) : 150
2.7 Etuve à CO2
Nombre : 1
Car~ristiques :
Chauffage direct des parois o&ant en rapport optimal volume utile/encombrement,
Volume interne de 15 1 litres, Y,
Le systeme de chauffage permet en outre de recouvrer la température de consigne après ouverture de porte, c
Mise en service automatique « Autostart »
Humidité relative élevée préservant les cultures de la déshydration,
PH stable par contrôle précis du CO2
Fonctions d’auto-diagnostic.
Message d’erreur en cas de prote mal fermé,
Filtre HEPA sur arrivée CO2
Cuve intérieur avec acier inoxydable
Avec accessoires disponibles :
Ecran de façade à 3 portes
Connexion pour surveillance centralisée
12

---

.
Passage de cloison
Interface RS 232 avec logiciel de documentation
Autres accessoires :
Etagères suppltmentaires inox.,
Manod&endeur CO2 avec olive 4x 6 mm
Dimensions exterieures: L x H x P = 6 15 x 855 x 677 mm
Dimensions intkieures : L x H x P = 470 x 607 x 530 mm
Volume = 15 1 litres
3
Etagères
3
Pi&ge Tempkamre : +6 à +50 “ C
Plage CO2 : 0 a 20 %
Humid&e relative > 95 %
Electricité : 220 Volts, 5060 Hz
Prix catalogue (FF): 40 000
2.8 Système de filtration
2.8.1 Pompe pkktaltique : modele à vitesse variable
Applications : répartition imm&iate de milieux de culture avec filtration en ligne
Caractéristiques
Diamètre interne tubes (mm): 1.6 ; 3.2 ; 4 ; 5
Electricité : 220 Volts 50 Hz
Pr& catalogue (FF) = 6 000
2.8.2 Unité de filtration :
Applications : destinée à clarifier et à stériliser des milieux de culture et autres solutions acqueuses de 100 ml à 3
litres. Ces unit& fonctionnent sous pression pour éviter la formation de la mousse.
Caractéristiques : membrane Express en PES à debit et rendement éleves et a faible adsorption protéique pour la
filtration st&ilisante des milieux de culture, avec cloche, sterile, porosité : 0.22 pm
Prixcatalogue(FF)pourles1OO=3OOO
3. Pour le test d’immunofluorescence (pour 200 sérums) [F’VR]:
3.1 Sérum anti IgG de mouton marqué à la fluoresceine
Ref Sigma : F-5137
3.2 Sérum anti IgG de chèvre marque à la fluoresceine
Ref Sigma : F-9012
3.3 Sérum anti IgG de bovin marqué à la fluoresceine
Ref Sigma : F-4387
4. Pour le test de fnation du complément (pour 1000 sérums environ) [F’ikre Q]
4.1 antigène
4.2 sérum de contrôle négatif
1
4.2 sérum de contrôle positif
4.3
tampon Veronal Calcium-Magnésium (4 x 1 litre) : 1 5 flacons
4.4
complement lyophilisé (2 x 3.5 ml) : 15 flacons
4.5
skum hémolytique <j x 2.5 ml) : 5 flacons
4.6 Solution Alsever : 15 flacons
4
4.7 100 microplaques
5. Pour le test de fixation du complément (pour 1000 sérums environ) [Chlamydiose]
5.1 antigene lyophilisé
5.2 sérum de contrôle négatif
l
5.3 sérum de contrôle positif
5.4 100 microplaques
1 3

---

6. Pour le test de fixation du complément : (pour 1000 sérums environ) [Brucellose h Brucella ovis]
Kit CNEVA (France)
7. pour le test Elisa BVB (pour 1000 sérums)
8. Fournisseurs possibles :
8.1 Bioblock scientific
Parc d’innovation
F-67403 Illkirch Cedex
France
E mail : htto://bioblock.com
8.2 Poly Labo
10, rue de la Durance
B.P. 36
67023 Strasbourg Cedex ; Tel : + 33 03 88 65 80 20 ; Fax : +33 03 88 39 74 41& +33 03 88 65 9167
E mail : http://www.polylabo.com
8.3 Sigma Chimie
Signa aldrich Chimie sa .r.l
L’isle D’abeau Chesnes
BP : 701
38297 Saint Quentin Fallavier
Cedex France
Tel : ,OS 21 14 08 (numéro vert) + 33 4 74 82 28 00
Fax : 05 03 10 52 (numéro vert) + 33 74 95 68 08
E mail : http://www.sigma.sial.com
8.4 Fisher Scientifïc S.A
ZAC Clé de St Pierre
12, avenue Gay Lussac ; BP 2
78996- Elancourt Cedex
France
Tel : +33 (0)130 13 24 00 ;
Fax :+ 33 (0)l 30 13 24 24 ;
E mail : export(@f?.fishersci.com
8.5 SYNBIOTICS EUROPE
299 Avenue Jean Jaures
69007 LYON
a
Tel : 33 (0) 4 72 72 33 84
Fax:33(0)472723430
8.6 BioMérieux s.a
69280 Marcy-l’Etoile (France)
Tel : 33 (0) 4 78 87 20 00
‘!
Fax : 33 (0) 4 78 87 20 94
:;
ldtu://~~~~~~.biomencus.com
.
14

---

Annexe IV:
Techniques de Diagnostic de la FVR au Centre National de 1’Elevage et de Recherches V&inaires (C.N.E.R.V)
de Nouakchott.
A. Les techniques de cultures de cellules:
l.Technique de culture de cellules primaires de rein de mouton
1.1. Mat&e1
Embryon de mouton de 30 cm (de 3-4 mois environ)
Milieuxetrkactifs
:.
..
Milieu de culture : MEMG
Sérum de veau nouveau né (SVF)
Antibiotiques : Pénicilline, Streptomycine et AmphotéricmeB
Solution de trypsine-HBSS
Solution de tampon de lavage (tampon CMFS)
Alcool A 9Y
fUcool iodé
Boîte d’instruments stériles :
3 paire de ciseaux droits
3 pinces à dents de souris
2 pinces mousse
3 lames de bistouris
1 manche de bistouri
1 cuillère à café
3 pinces à forcipressure
1 couteau de cuisine
Des gants en latex
Gaze et coton st&iIe
Verrerie :
4 boites de pétri moyenne
1 Erlemnyer de 100 , ou 250 ml avec barreau aimanté
1 Erlemneyer de 250 ml sans barreau aimante
1 Eprouvette graduéede 200 ml
1 entonnoir avec de la gaze stérile
Pipettes stériles de 5, 10 ml
Flacons de culture de 25 cm2,75 cm2
Tubes de centrifùgation de 50 ml
Cellule de Thoma
Equipements :
1 bec bensen
1 centrifugeuse r&igérée
1 microscope inversé
1 Hotte à flux laminaire, ~
w
1 etuve à CO2
1.2 Méthodes
PrCparation de l’embryon :
Choisir un embryon de 2 à 3 mois (de 30 cm de long au moins) dans son utérus d’aspect normal sans lésions de
congestion. L’utérus est transporté intact jusqu’au laboratoire où le fœtus est extrait avec des précautions
essentielles d’aseptie : C$&e< dans une salle sans courant d’air (ou mieux avec atmosphère désinfectée par un
aérosol antiseptique), Placer l*titerns gravide dans un bac en plastique contenant un antiseptique (eau javelisée à
3%),
6
Extraction de l’embryon sous la hotte:
Chrvrir les enveloppes fœtaIes avec un couteau de boucherie, Sortir le fœtus de ses enveloppes (vérifier l’espèce
animale par la longueur de la queue) et le suspendre par les jarrets au dessus du bac en plastique (manipuler avec
des gants), faire saigner le fœtus par section de la gorge et laisser saigner pendant 15 à 20 minutes environ,
Extraction des reins:
Désinfecter la sphère abdominale avec de l’alcool iodé ou de l’alcool à 90°, Inciser la paroi abdominale suivant
,
la ligne médiane et découper latéralement et Rabattre le volet du flanc droit pour dégager le rein droit, Saisir le
rein avec une paire de pinces à dents de souris et soulever, Découper le tissu conjonctif environnant (et autres
attaches) pour détacher le rein Placer le rein dans une boîte de pétri sterile et fermer rapidement la boîte,
15

---

Pn&der de la même façon pour le rein gauche, Placer les deux boîtes de pétri contenant les reins sous la hotte à
flux laminaire,
Dissection des reins sous la hotte & flux laminaire:
Anatomiquement, les rein du mouton et de la chèvre sont semblables et se présentent sous forme de grain de
haricot et ont une surface lisse. Au contraire, les reins de bovins sont multilobulés.
Inciser la capsule à l’aide du bistouri,
Décapsuler les reins en utilisant les pinces et les ciseaux,
Déshabiller le reins en sectionnant l’ensemble de l’enveloppe capsulaire à la base du hile du rein
Transférer les reins dans une boîte pétri neuve,
.
Dckouper le cortex r&al en fragments a l’aide d’une paire de ciseaux et pinces,
Rejeter la masse m&htllaire dégarnie,
Amincir les fragments de cortex en morceaux d’environ 2 mm de dimension en s’aidant de ciseaux et de
bistouris,
Transférer les menus fragments dans un erlemueyer de 250 ml a l’aide de la cuillière à café.
Lavage des fragments du cortex:
Mettre 100 ml de tampon CMFS dans l’erlemneyer contenant les fragments du cortex rénal,
Agiter à vitesse modérée pendant 10 mn a température ambiante,
Arrêter l’agitation, laisser décanter et eliminer le liquide surnageant,
Laver une 2O fois avec la solution de tampon CMFS pour éliminer toute trace de sang
Répéter le lavage jusqu’a ce que le liquide de lavage ou surnageant soit clair,
Trypsiuation des fragments du cortex:
Rejeter le liquide de lavage et le remplacer par 100 ml de solution de trypsine (THELSS)
Laisser agiter pendant 15 mn à la température ambiante ou à 37’C: c’est la pr&ypsination.,
Eliminer cette première solution de trypsine et la remplacer par 200 ml de solution fraîche de trypsine,
Placer I’Erlenmeyer à 37’C et laisser agiter pendant 1 heure,
Au bout d’une heure, les fragments du cortex sont digérés.
Filtrer le digestat sur un entonnoir recouvert de quatre couches de gaze stérile,
S’il reste des morceaux non digérk, on peut les faire digérer pendant 30 mn à 37OC dans une solution fraîche de
trypsine.
Ajouter 5% de sérum de veau au digestat pour arrêter l’action de la trypsine.
Mettre la suspension obtenue dans des tubes de centrifugation de 50 ml avec couvercle à vis,
Centrifuger pendant 5 mn à 2000 tours par mn à la température de 20 C”
Eliminer le surnageant et Noter le volume du culot cellulaire avec une pipette de 5 ml
Mise en culture des cellules de reins de mouton:
Mettre le culot cellulaire en suspension dans du milieu de croissance (MEMG à lO%SVF) dans un rapport de 1
ml de culot pour 100 ml de milieu de culture,
Repartir la suspension cellulaire ainsi obtenue dans des flacons de culture, à raison de 5 ml de suspension
cellulaire pour les flacons de 25 cm2, de 15 ml de suspension cellulaire pour les flacons de 75 cm2,
Observer au microscope inverse l’aspect de la suspension cellulaire
Placer les flacons à 37’C dans une étuve sèche ou à CO2
Observer les cellules au bout de 24 heures pour v&ifier la fixation des cellules ou fragments sur la paroi du
flacon et aussi l’absence ou présence ae contamination indesirable (bactérienne et fongique),
En cas d’absence de contamination, les flacons sont replaces à l’etme et observer tous les jours pour suivre
l’kvolution du tapis cellulaire.
En cas de contamination bactérienne et fongique, tous les flacons sont élimines et l’&uve désinfectée.
Evolution du tapis cellulaire:
Les flacons contenant des fragments et des cellules fixes sont incubes et le milieu surnag~t (MEMG a 10% de
SW) est renouvelé au bout de’48 OU 72 heures selon que la croissance des cellules est rapide 0~ non.
Le tapis peut être confluent au bout de 24 heures aprés ce renouvellement du milieu de culture.
6
16

---

Annexes pour culture de cellules de rein de fœtus de mouton:
1. Composition du tampon de lavage des fragments de reins de mouton et de cellules
(ou Calcium h4agnesimn Free Solution ou solution CMFS)
Chlorure de sodium :
80 g
Chlorure de potassium :
%
Phosphate disodique:
2%
Phosphate monopotassique:
2g
Eau distillée : Q.S pour
10 litres
Ajouter de la pénicilline: 1000 000 UI et de la streptomycine : 1 g
Filtrer ou autoclaver pendant 40 mn entre 100 et 115°C
Répartir en flacons de 500 ml, pH : 7.4 et Conserver à 4”C+
2. Composition de la solution de trypsine-versène
Utilisée pour dissocier les cellules en monocouche sur des surfaces de verre ou de plastique des différents flacons
de culture:
Glucose:
1000 mg
Chlorure de potassium:
400 mg
Chlorure de sodium:
8000 mg
Bicarbonate de sodium:
580 mg
Trypsine:
500 mg
Versène:
200 mg
Pénicilline:
200 000 ti
Streptomycine:
20 000
Rouge de phénol:
10 ml de 0.2% de solution
Eau distillée:
1000 ml
pH :17.4-7.6, Stkiliser par filtration (filtre 0.2 um)
Aliquoter II raison de 10 ml par tube et conserver à -20°C.
3. Composition de la solution de trypsine pour dissocier les menus fragments de reins ou autres tissus comme les
testicules (solution Trypsine Hanks-BSS) :
Chlorure de sodium:
8g
Chlorure de potassium:
%
Sulfate de Magnésium:
%
Chlorure de calcium:
0.2g
Dextrose:
lg
Bicarbonate:
0.58g
Eau distillée:
1000 ml
Trypsine:
32
Rouge de phénol:
10 ml de 0.2% de solution
Stériliser par fïltmtion (filtre 0.22 um)
RQartir en flacons de 100 ml
m
Conserver à +4Y.
17

---

2. Technique de culture de cellules de @née V&O:
2.1. Matériel
Flacon de culture de cellules V&o amf!hWeS
Milieux et rkactifs :
Milieu de culture : MEMG
Sérum de veau nouveau né (NF)
Solution de trypsine-Versène
Alcool à 95”
Alcool iodé
Des gants en latex
Verrerie: 2 flacons de 100 ml
1 Eprouvette graduéede 200 ml
Pipettes stériles de 5,lO ml
Flacons de culture de 25 cm2,75 cm2
Cellule de Thoma ou de malassez
Equipements :
1 bec bensen
1 microscope inverse
1 Hotte à flux kminaire,
1 étuve à CO2
2.2 Méthodes:
Examiner au microscope inverse l’état des cellules et ne retenir que les cellules qui presentent un tapis confluent
de 3 à 4 jours,
Vérifier l’absence de contamination bactérienne, mycoplasmique et fongique par le même examen
microscopique,
Placer la boîte dans une atmosphère stérile (dans la hotte à flux kminaire),
Réchauffer les milieux de cultures, sérum de veau, solution de trypsine à 37OC au bain marie,
Vider le milieu surnageant les cellules dans un récipient contenant un antiseptique (eau de javel ou détergent
domestique),
Mettre 3 ml de solution de TV dans le flacon de culture (flacon de 75 cm2), l’étaler sur le tapis cellulaire pendant
1 mn à la tempkrature ambiante (sous la hotte) et vider le flacon : c’est la pré-trypsination,
Mettre de nouveau 3 ml de TV dans le flacon de culture et laisser étaler la TV sur le tapis cellulaire pendant 1
mn sous la hotte et retirer 1.5 ml (la moitié) de la TV. Le reste de TV constitue un mince filet de liquide sur les
cellules et placer la boîte à 37°C dans l’étuve pendant 2 à 3 mn pour faire agir la trypsine,
Verifïer la dissociation des cellules au microscope au bout des 3 mn et tapoter sur le flacon pour le décollement
des cellules de la paroi du flacon,
Reprendre les cellules dans un milieu MEMG enrichi de 10% de SV,
Faire une mnmkation avec la cellule Zle Thoma ou de Malassez et ramener la concentration de cellules à 200 000
ou 300 000 cellules par ml,
Repartir la suspension de cellules ainsi obtenue dans des flacons de 75 cm2, à raison de 20 ml par flacon,
Observer les suspensions cellulaires au microscope : les cellules se déposent par gravité, se fixent sur la paroi du
flacon,
Placer les flacons 37OC à l’étuve : à cette température, les cellules se multiplient en une couche monocellulaire
pour former un tapis cellulairé au bout de quelques jours.
Observer tous les jours au mitioscope,
Renouveler le milieu de culture, si nécessaire, lorsque le pH devient trop acide (couleur jaune),
Constater que la tapis cellulaire est complet avant de procéder aux actions ultérieures notamment le passags des
trypsination ou le remplacement du milieu de croissance (MEMG à 10% de SV) par un milieu d’entretien
(MEMG à 5% de SV),
Utiliser le milieu d’entretien : il consiste au renouvellement du milieu de culture surnageant un tapis cellulaire
complet par un milieu à 5% de SV. Les flacons peuvent être placés dans une salle propre à la température
ambiante et à l’obscurité et les cellules ser
i-

---

Annexes pour cuiture de cellules V&o:
composition des milieux utilises pour déterminer la stérilité bactérienne, fongique et mycoplasmique.
1. Composition du Mycoplasma Broth base (recherche de mycoplasmes)
Beef heart infusion
690 g
Pancreatic digest of casein
x0 g
Yeast autolysate
530 g
S o d i u m chloride
50 g
Eau distUe
1000 ml
2 Composition de Tryptose Soya Broth (recherche de bactéries aérobies)
Hydrolysat Trypsique de caséine
1790 g
Peptone papainique de soja
320 g
Chlorure de sodium
5,o g
Dihydrogénophosphate de potassium
2,5 g
Glucose
2,5 g
Eau distillée
1000 ml
3. Composition du Bouillon sabouraud (recherche de champignons)
Peptone pancreatique de caséine (biotrypticase)
58 g
Peptone pepsique de viande (biotone)
58 g
Glucose
20 g
Eaudistillée
1000 ml
4. Composition du Bouillon Gourlay (recherche de mycoplasmes)
Bacto tryptose D&o
20 g
Glucose
5g
NaCl
5g
Phosphate disodique anhydre
2,5 g
Glycérol
5g
Extrait de levure
lg
Eau distUe
1000 ml
Pénicilline-Streptomycine
Sérum de cheval
Rouge de phénol
5. composition de Thioglycolate avec résazurin e (recherche de bactéries aérobies et anaérobies)
Bio tryptose
15 g
L cystine
035 g
Glucose
:
a
5!3
Extrait de levure
5g
Chlore de sodium
2,5 g
Eau distillée
1000 ml
19

---

3 . Technique de cryo-conservation de cellules de lignée V&o :
Elle consiste à conserver des cellules par congélation à la tempréature de -7OOC ou à celle de l’azote liquide (-
196Y) en prknce d’un cryprotecteur appel6 Di méthyl Sulfoxide (DMSO).
3.1. Matériel :
Culture de celhrles V&o de 24 à 48 heures
Solution de trypsie-Ver&te
Solution stérile de cryoprotecteur DMSO
Cryotube de 2 ml
Milieu MEMG
Sérum de veau
Azote liquide
Congélateur a -70°C
Bonbonne d’azote liquide
Alcool a 7o”
3.2. Méthodes :
3.2.1. Méthode de congelation :
Trypsiner la boîte de cellules véro
Num&er les cellules
Centrifuger les cellules
Reprendre les cellules dans un mélange extempomne du cryoprotecteur : MEMG : 70%, SV :20% et DMSO :
10% (place à+4OC) à raison de 10 millions de cellules par ml.
Pour chaque cryotube, mettre 1 ml de suspension cellulaire.
Placer le cryotubes pendant 24 à 48 heures à -7OOC avant de les placer dans l’azote liquide et il conserve les
celldes pendant des mees (tant que l’azote liquide est présent dans la bonbonne à un niveau suffisant).
ou
Placer uniquement les cryotubes à -7O’C et les cellules peuvent se conserver ainsi pendant des mois.
3.2.2. Méthode de decongélation :
Sortir le cryotube du congélateur ou de l’azote liquide,
Placer le tube pour le décongeler rapidement dans un becher de 100 ml contenant de l’alcool à 70’ réchauffé au
bain marie à 37OC,
Reprendre le contenu du cryotube dans du milieu de croissance (MEMG à 10 % de SV) : Mettre le contenu du
tubedans 15mldemiheu,
Placer le flacon de culture à 37OC pendant 4 à 6 heures et renouveler le milieu de culture,
Replacer le flacon de culture à 37°C pendant 24 à 36 heure pour avoir un tapis complet.
Faire un passage ou une trypsination.
B. Technique d’isolement du virus de la FVR :
Le virus de la FVR, comme la plupart des arbovirus, peut être isolé à partir de sang, d’organes(foie, rate, rein et
cerveau) de ruminants infect&. Ces pr&vements doivent être conserves sous froid jusqu’à leur utilisation au
laboratoire. Pour leur isolement, on utilise des animaux de laboratoire (hamster et souris) et diverses cellules en
culture comme les cellules véro ou les cellules primaires de ruminants.
1. Prkautions préalables
Un personnel formé aux techniques de base de la virologie doit être responsable des isolements du virus de la
FVR et il doit être vacciné avec le vaccin tué(subir 2 à 3 injections du vaccin),
Un laboratoire équipé de niveau P2 à P4 est recommandé
Une animalerie (souris et hamster) propre et pourvu de moustiquaire aux ouvertures (portes et fenêtres)
Un usage de dknfectant à base d’hypochlorite est nécessaire
Une attention particulière pour les personnes impliquées aux opérations d’autopsie de cadavres dkni&ux
suspects de FVR car le risque de contamiuation est grand : utiliser des gants , des masques et travailler dans des
conditions réduisant le risque d’infection (sous une hotte P2 au moins ).
2. Pdparation des prélèvements:
Les types de prélèvements utilisables pour l’isolement du virus sont :
2.1. Le sang sous anticoagulant (ou sang hépariné)
Le sang est prélevé chez des animaux hyperthermiques dans des tubes fermes ou scellés, identifiés et transportés
dans une glacière avec de la glace (+4’C) jusqu’au laboratoire.
20

---

Le sang est centrifugé et le plasma est recueilli(avec une pipette) sous la hotte dans un tampon de transport. Le
plasma est dilué au 1/5 dans ce tampon de transport et est réparti en aliquots de 1 à 2 ml dans des cryotubes qui
sont conservés à +4T ou à -7OT jusqu’à leur utilisation.
2.2. La rate, le foie ou organes d’avortons@lacenta, diverses membranes ).
Prélever 1 à 2 grammes de tissus et les placer dans un tube et un récipent de transport scellés et
solide (pour
&iter les risques de cassure). Les pr&vements sont transportés dans de la glace.
Au laboratoire, les pr&vements sont broyés (avec un mortier et un pilon ou un broyer &ctrique) avec du sable
stérile dans une solution de Hanks BSS additionné d’antibiotiques : pénicilline, streptomycine et amphotkitine
B sous une hotte à flux laminaire. Le pr&vement est repris dans le tampon PBS suivant un rapport de 1 g de
tissus pour 9 ml de tampon Hanks BSS.
Pendant le broyage, le pr&vement et le matériel doivent être dans de ia glace fondante(température de 0°C
environ). Le broyage doit être fait par des mouvements lents pour éviter un échauffement des tissus. Une
élévation de température des tissus pendant le broyage entraîne une destruction du virus.
Cette opération présente un risque de contamination pour le manipulateur et nécessite toutes les précautions
prévues au 5.1.
Le broyat est centigé à 400-6OOg à la tempkature de +4”C. Le surnageant est récupéré et est distribué en
aliqots de 1-2 ml dans des cryotubes et sont conservés à la température de +4OC ou à la température de - 70°C
jusqu’à leur utilisation.
La composition du milieu de transport est le Ha& BSS (Hanks Basic Salt Solution) avec 0.5% d’hydrolysat de
lactalbumine ou 0.75% de sérum albumine bovin à pH 7.4 avec 500 ui/ml de pénicillile et 500 ug de
streptomycine et 100 uiknl de Amphotéricine B .
2.3 Isolement du virus de la FVR sur animaux de laboratoire :
.
2.3.1. Sur hamster:
Le hamster est l’animal de choix pour le primo isolement du virus de la FVR à partir de prélévements provenant
d’animaux suspects de FVR.
Choisir deux animaux de 6-12 semaines par prélèvement,
Inoculer 0.1 ml par animal par la voie intrap&ito&le et les animaux peuvent succomber en moins de 48 heures
Observer les animaux pendant 5 jours mais les animaux peuvent succomber 48 heures après l’inoculation,
Récolter de façon sttkile le foie qui apparaît hypertrophié et de petits foyers de nécrose,
Broyer 0.5 à 1 g de foie et diluer à 10-4 et 10-6 pour effectuer un second passage sur hamster ou sur souris
Conserver les prélévements à -70°C ou dans de l’azote liquide
2.3.2.. Sur Souris:
Choisir 4-5 souris de 6 semaines ou plus âgées par prèlévement,
Inoculer 0.1 ml par animal par la voie intrapéritonéale et les animaux meurent entre 2 et 5 jours
Observer les animaux pendant 5 jours.
ou
Choisir des souriceaux nouveaux nés
Inoculer 0.02 ml par la voie intm-cérébrale et les animaux meurent entre 36 heures et 5 jours
Récolter le cerveau de façon stérile (sous la hotte )
Broyer le cerveau et diluer à 10-4 et 10-6 pour effectuer un second passage sur hamster ou sur souris
Conserver les prélèvements à -7O’C ou dans de l’azote liquide
2.4. Isolement du virus de la FVR sur culture de cellules:
2.4.1. Types de cellties
Une grande variété de cellules’sont sensibles au virus de la FVR.
Des cellules de I@n& comme les cellules Véro, BlZlK2 1, h4DBK sont utilisables .
Des cellules primaires de rein, de testicule, de poumon, d’endothélium, de muscle de mouton et de bovin’sont
sensibles au virus.
Des cellules provenant de moustiques sont utilisables aussi.
2.4.2. Technique d’inoculation des cellules:
Utiliser des cellules en culture confluente dans des tubes ou des flacons de 25 cnQ(petits flacons)
Faire deux dilutions de l’inocuhun : première dilution au l/lOe et une deuxième dilution au l/lOO”,
Faire un contact entre cellules et inoculum de 1 heure à 37’C,
Laver les cellules 3 foisavec du Hanks BSS avant de mettre du milieu de maintenance (MEMG à 5% de SV),
21

---

Incuber les cellules à 37’C et observer tous les jours pour voir l’apparition de l’effet cytopathogène (ECP)
provoque par le virus. Cet ECP apparaît au bout 24 à 48 heures pour les cellules tres sensibles comme les
cellules ver0 et il peut être plus tardif (au 5Ojour) sur les cellules primaires.
Le virus est récolté dans le surnageant cellulaire après un cycle de congélationdécongélation du tube ou flacon
de cellules infectées.
Un diagnostic rapide de la FVR peut être obtenu en utilisant des tubes avec lamelles car les cellules infectees
pour réveler l’antigéne viral au bout de 24 à 48 heures par la technique d’immunofluorescence.
3. Techniques d’identification du virus de la FVR :
Deux techniques sont présentées : la technique d’immunofluorescence et de séroneutralisation sur culture de
cellules Véro.
3.1. La technique d’immunofluorescence:
C’est la technique la plus pratique et la plus rapide (au bout de 12 à 24 heures) pour révéler la présence du virus
de la FVR dans des prelèvements suspects ou des cultures de cellules infectées.
Elle est appliquée sur les cellules V&o infectées d’une part et d’autre part, sur les cerveaux, foie, rate et les
reins d’animaux infectes par le virus.
Les meilleurs rkultats sont obtenus avec des cellules infectees : Ces cellules sont cultivees dans des tubes ou des
cupules avec lamelles et sont ensuite inoculées avec le prélévement suspect de FVR Ces lamelles avec cellules
infectées peuvent être examinees par immtmofluorescence 12 à 24 heures après leur inoculation avec du
pr&vement suspect.
Avant l’examen au microscope à fluorescence, les lamelles subissent le traitement suivant :
Les lamelles sont lavkes 3 fois avec du tampon PBS et sont séchées. Elles sont fixées à l’acétone (à -20°C)
pendant 10 mn , sont séchees et sont alors prêtes. Ces lamelles de cellules infectées ainsi traitees peuvent être
conservées à + 4’C pendant des semaines à l’obscurité avant leur utilisation en immunofluorescence directe ou
indirecte.
I
3.1.1. Technique d’immunofluorescence directe:
utilise des s&ums anti virus de la FVR marqués à la fluoresceine.
De tels sérums peuvent être prépares à partir de sérums hyper irmmms de lapin ou de cheval marqués avec la
fluoresceine. Le sérum anti FVR fluorescent est utilise à une dilution prédéterminée (dite dilution de travail) sur
les lamelles de cellules infectees par le virus et déjà fixées à l’acétone. Ces lamelles sont réhydratées (les plonger
dans de l’eau distilllée) avant d’être mises en contact avec le sérum anti pendant 40 mn à 37’C.
Les lamelles sont lavées 3 fois dans du PBS (5 mn par lavage ) et sont montées (face avec cellules infectées
collée à la lame prote objet) dans du tampon PBS avec glycerol. Elles sont observées au microscope à
fluorescence au grossissement X40 .
Les lamelles de cellules temoins non inkctkes ne présentent pas de fluorescence alors que le lamelles avec
cellules infectees présentent une fluorescence intracyplasmique. Cette fluorescence est plus importante sur des
cellules infectees de 48 ou 58 heures.
3.1.2. Technique d’immunofluorescence indirecte:
Cette technique utilise deux sérums : un sérum positif en anticorps ami-virus de la FVR d’un animal donné
(mouton, chèvre, bovin,. . .), un sérum anti espèce marqué à la fluoresceine.
Les lamelles avec cellules infectees avec le virus suspect sont réhydratees.
Le sérum anti FVR d’espèce est dilué (au 1120) et mis sur les lamelles de cellules infëctées et lamelles de
cellules témoin non infectees pendant 40 mn à 37”C(20 ul par spot).
Les lamelles sont lavées 3 fois dans du tampon PBS (5 mn par lavage ).
Le s&um anti sp&ce marqué à la fuoresceine est dilué (dilution de travail précisé par le fabricant) et mis sur les
lamelles pendant 30 mn.
Les lamelles sont lavées 3 fois dans du tampon PBS.
Les lamelles sont montées dans du tampon PBS glycérolé et observé au microscope à fluorescence.
Les lamelles avec cellules infectées présentent une fluorescence nette alors que les lamelles témoin resten@ans
fluorescence.
3.1.3. Quelques références pour conjugués fluorescents:
- Anti Goat IgG (whole molecule) FITC conjugate developed in Rabbit, Ref : F-90 12, IgG fi-action of ami serum
- Ami Sheept IgG (whole molecule) FITC conjugate developed in Rabbit, Ref : F-5137, IgG fraction of ami
serum
- Anti Bovine IgG (whole molecule) FITC conjugate developed in Rabbit, Ref : F-4387, IgG fraction of anti
serum
Adresse du fournisseur l :
SIGMA Chemical Compagny, P.O.BOX 14508. ST LOUIS. MO., 03 178, U.S.A
Tel : 3 14 7715750 (for orders), 3 14 7715765 (for customer)
22

---

3.2. La technique de séro-neutralisation sur cellules V&O:
Cette t&mique sert a la fois à identifier le virus de la FVR qui sera ainsi neutralise de façon spécifique par un
&um hyperimmun connu et à réveler le pouvoir neutralisant d’un s&um (serodiagnostic) provenant d’un animal
infecteparlevirusdelaFVR.
3.2.1.Matkiel:
Souche virale Smithburn titrant lOi6.5 DCPSO par ml
Cellule V&o: Flacon de 75 cm2 de culture confluente de 48 heures
Micropipette à 1 canal de 10 a 100 ul
Micropipette à 8 canaux de 50 à 390 ul
C!&es stériles
Bacs de dilution stkriles
Erlenmeyers st&iles de 250 ml
Ballons de 100 ml
Eprouvettes graduées stériles de 200 ml
Pipettes stériles de 5 et 10 ml
Microplaques à 96 cupules pour culture de cellules
Milieu MEMG
Sérum de veau
Solution Trypsine versène
Solution d’antibiotiques : pénicilline, Streptomycine & Amphotericine B
Hotte à flux laminaire
Etuve à CO2
Microscope inverse
Bainmarie3.2.2. Méthodes
3.2.2.1. Pour l’identification du virus : vise à démontrer la neutralisation d’un isolat de virus FVR par
un skrum hyperimmun ami-virus de la FVR. Cette technique peut utiliser les souris de laboratoire ou des cellules
en culture. Nous prkntons la technique de s&oneutralisation sur cellules Vero sur microplaques :
Prendre un isolat de virus dont on connaît le titre et déterminer la dilution d’utilisation qui donne 100 DCPSO par
50 ul,
Prendre un &um positif anticorps anti FVR et un s&um négatif en anticorps anti FVR,
Diluer le sérum positif au 1/20 dans les 4 cupules (Al-Dl) et le sérum négatif dans les cupules (El-Fl),
Poursuivre les dktions des deux sérums negatif et positif de 1/40 au 100240 (de la colonne 2 à la colonne 9),
Ajouter le virus dilue dans les cupules à raison de 50 ul (quantite de 100 DCPSO),
Incuber 1 heure à 37’C sous agitation,
Ajouter des cellules à raison de 50 uI par cupule et réserver les colonnes 10 à 12 pour témoins c&&s et t&noin
VilUS.
Incuber à 37 “ C dans une étuve à C02.
Noter l’évolution du tapis et l’apparition d’ECP au bout de 2 à 3 jours.
La présentation de neutralisation spécifique du virus se traduit par une absence d’ECP à la dihtion 1040 et
même plus selon le titre du sérum positif en anticorps anti FVR. Cette neutralisation indique que la souche tea&
est identique au virus dè la FVR
3.2.2.2. Pour le sérodiagnostic : recherche d’anticorps neutralisant le virus de la FVR dans les sérums
d’animaux infectés naturellement ou vaccinés.
Décomplementer les sérums à 56’C pendant 30 mn.
Diluer les sérums au 1/20 dans une microplaque à 96 cupules : 10 ul de sérum dans 190 ul de milieu de culture
On peut diluer 96 s&ums par microplaque.
Rediluer chaque sérum au 1/40e, 1/80” et 1/160” dans une autre microplaque :
Distribuer 50 ul de milieu MEMG dans tous les cupules d’une microplaque
d
Mettre 50 ul du sérum dilué au 1120” dans le 1 cupule pour obtenir 1/40”
Mettre 50 ul du sérum dilué au 1/40” dans le 2 cupule pour obtenir 1/80”
Mettre 50 ul du sérum dilué au 1/80” dans le 3 cupule pour obtenir 1/160”
On peut diluer ainsi 32 sérums d’animaux par microplaque.
Ménager des témoins &ums positif et n&uif, des témoins cellules et des témoins virus pour chaque
manipulation
,
Diluer la souche. de sorte à avoir 100 DCPSO dans 50 ul de milieu : il faut diluer la souche titrant lot6.5 au
1/1500” pour obtenir la concentration utilisable (de 100 DCP50150 ul).
Ajouter 50 ul du virus dilue au l/1500” aux s&ums dilués.
23

---

Incuber l’ensemble sérums + virus à 37°C pendant 1 heure.
Ajouter des cellules à raison de 100 ul par cupule d’une suspension de concentration égale à 200 000 tel. / ml
Incuber à 37’C à l’étuve à CO2
Observer les cultures de cellules tous les jours.
Lire les microplaques au bout de 3 à 4 jours et Noter les cupules présentant un effet cytopathogène.
R&ultats :
Un &um est négatif dans les cas suivants :
- lorsque l’effet cytopathogène est présent aux dilutions 1/40”, 1/80”, 1/160” (aucune activite neutralisante)
- lorsque l’effet cytopathogène est present à une des dilutions 1/40’, 1/80”, 1/160” .
Un s&um est positif lorsque l’effet cytopathogéne du virus n’est observé à une des dilutions 1/40”,1/80” et
1/160e.
Le témoin sérum positif de référënce ne doit pas présenter d’effet cytopatogène (témoin de l’activité
neutmlisante des anticorps sériques)
Le témoin cellules non inocul&~ doit être sans effet cytopathogéne (témoin de la bonne qualite du milieu et des
cellules utilisées).
Le témoin virus doit présenter un effet cytopathogène au niveau de toutes les cupules inoculees (témoin de la
sensibilité des cellules à la souche vitale utilisée).
C. Technique de titrage du virus de la FVRz
Cette technique vise à mesurer la quantite du virus présent dans un surnageant de cellules ou de broyats
d’organes d’animaux infectes.
l.Matériels:
Surnageant de cellules infectees,
Culture confluente de cellules V&o,
Milieu MEMG,
Skumdeveau,
Solutions d’antibiotiques,
Sohkon de trypsine versene,
Microplaque à 96 cupules,
Micropipette de 10-200 ul,
Tubes de 5 ml stériles
Z.Méthodes:
- Diluer le surnageant viral de 10-l à 10-S dans les tubes de 5 ml :
Mettre 0.2 ml de surnageant viral dans 1.8 ml de milieu dans le 1” tube pour obtenir une dilution au
l/lO” (10-l),
Ensuite 0.2 ml de la dilution au l/lO” dans 1.8 ml de milieu dans le 2” tube pour obtenir une dilution au
l/lOO” (10-2)
Continuer jusqu’à obtenir une dilution au 10-S dans le 8” tube
- Repartir chaque dilution dans 10 cupules d’une rangée de cupule, à raison de 100 ul par cupule :
Exemples :
la dilution 10-l dans les 10 cupules (A2-Al l), lO-2(B2-Bl l), lO-3(C2-Cl l), 10-4@2-Dl l),
10-5 (E2-E11),10-6
(F2-Fl l), lO-7(G2-Gl l), 10-S (F2-Fil).
Ajouter les cellules V&o dans toutes les cupules, à raison de 100 ul par cupule d’une suspension de 200 000
CXWml.
- Incuber à 37°C dans une étuve à CO2
- Observer tous les jours pour suivre l’évolution du tapis et notre les cupules présentant un effet cytopa&og&e
jusqu’au 7” jour.
-
Calculer le titre par la memode de Reed 8z Muench :
- Exemple de lecture:
-
10-l : les 10 cupules présentent un ECP : 100%
4
-
10-2 : les 10 cupules présentent un ECP : 100%
-
10-3 : les 10 cupules présentent un ECP : 100%
-
10-4 : les 8 cupules présentent un ECP : 80%
-
10-5 : les 4 cupules présentent un ECP : 40%
-
10-6 : les 10 cupules ne présentent pas un ECP : 0%
-
10-7 : les 10 cupules ne présentent pas un ECP : 0%
-
10-S : les 10 cupules ne prkntent pas un ECP : 0%
Le titre montre la quantité de virus qui détruit 50% du tapis cellulaire, ce titre se situe entre entre 10-4 et 10-5 .
24

---

La méthode de Reed & Muench permet de le calculer de façon précise:
@O-50)/(80-40) =30/40 = 0.75 d’où le titre 10+4+0.75 = 10+4.75 DCP50/100 ul ou 10+5,75DCp5O/lml
Le titre de virus est de 10+5.75 DCP par ml.
La quantite de la suspension virale est de 10 ml d’où on peut la quantité totale de virus :
10+5.75DCP50 x 10 (volume en ml ) = 10+6.75 DCPSO.
D.Technique Elisa de la FVRz
La tech$que est celle réalisée au Centre de Référence de I’OMS pour les Recherches sur les Arbovirus
(CRORA) de l’institut Pasteur de Dakar. Elle permet de révéler les anticorps anti FVR présents dans les s&tmrs
d’animaux infectés naturellement ou vaccinés contre le virus de la FVRElle permet de distinguer deux types de
classes d’immunoglobulines(Ig) : les Ig de la classe G (IgG) et M (IgMJ
1. Détection des IgG:
Deposer 100 ul de sérum anti virus de FVR dans les cupules de la microplaque à 96 cupules(le sérum est un
immuno ascite de souris dilué au l/lOOO” dans du tampon carbonate à pH 9),
Placer les microplaques à 4°C pendant une nuit,
Laver les plaques 3 fois dans du PBS+O.OS% tween 20,
Déposer 100 ul d’antigéne viral dilué au UlOO” dans du PBS+ 0.05 tween 20 +l% lait écrémé,
Incuber a 37°C pendant 1 heure,
Laver les plaques 3 fois dans PBS tween 20,
Deposer 100 ul du sérum suspect (contenant des IgG) dilué au l/lOO” dans PBS+O.OS% Tween 20+1% lait
écrémé,
Incuber à 37°C pendant 1 heure,
Laver les plaques 3 fois dans du PBS+O.OS%Tween
20,
D@oser dans les cupules 100 ul du conjugué au 1/500” dans du PBS-O.O5%Tween
20+1% Lait écrémé,
Incuber à 37’C pendant 1 heure,
Déposer 100 ul par cupule de substrat chromogène(orthotohkline),
Laisser agir pendant 5 mn pour faire apparaître la coloration bleue,
Bloquer la rkaction par d@ôt de 100 nl par cupule d’une solution d’acide sulfurique 2N,
Lire les DO au spectrophotomètre à la longueur d’onde de 450 nm.
2. Détection des IgM:
Déposer 100 ul des anticorps ami-virus de la FVR dans les cupules de la microplaque à 96 cupules
(immunoascite dilué au l/lOOO” dans du tampon carbonate à pH 9),
Placer les plaques à +4”C pendant une nuit,
Laver les plaques 3 fois dans du PBS+O.OS% de Tween 20,
Déposer 100 ul d’antigène viral dilué au l/lOO” dans du PBS+O.OS tween 20+1% lait écrémé,
Incuber à 37’C pendant 1 heure,
Laver 3 fois dans du PBS-Tween 20,
Déposer 100 ul du sérum suspect (contenant des IgM) dilué au l/lOO” dans du PBS +0.05% de Tween 20+1%
lait krémé,
a
Incuber à 37’C pendant 1 heure,
Laver les plaques 3 fois dans du PBS+O.OS% de Tween 20,
Deposer 100 ul de conjugue Ami-IgM d’espèce marqué à la péroxydase dilué au 1/500” dans du
PBS+O.OS%Tween
20+1% lait écrémé,
Incuber pendant une heure à 37°C
Laver 3 fois dans du PBS+Tween 20,
Déposer 100 ul par cupule du substrat chromogène (orthotoluidine),
Laisser agir pendant 5 mn pour pparition de coloration bleue,
Bloquer le réaction par dépôt de 100 ul par cupule d’une solution d’acide sulfurique 2N,
4
Lire les DO à la longueur d’onde de 450 mn.
3. Quelques références pour réactifs pour tests Elisa et Immunofluorescence:
-
Anti Goat IgG (whole molecule) Peroxydase conjugate, Antibody developed in Rabbit, AfXnity isolated
Antigen specifïc Antibody, Ref : A-3540.
-
Ami Sheep IgG (whole molecule) Peroxydase conjugate, Antibody developed in Donkey, Aflïnity isolated
Antigen specific Antibody Ref : A-34 15.
-
Ami Bovine IgG (whole molecule) Peroxydase conjugate, Antobody developed in Rabbit, Afhnity isolated
Antigen specific Antibody, Ref : A-7414,
25

---

Adresse du fournisseur :
SIGMA Chemical Compagny, P.O.BOX 14508. ST LOUIS. MO., 63 178, U.S.A
Tel : 314 771 5750 (for orders), 314 771 5765 (for customer)
4
.
26

---

Annexe V:
Liste du personnel du laboratoire de virologie du CNERV de Nouakchott:
Dr Yaghouba. Kane, Dr Vétérinaire, Chef de service
Mme Ekatarina Isselmou, Technicienne
Mr Doro Sow, Assistant d’Elevage, technicien
Mr Mohamed Radi ould Ethmane, Assistant d’Elevage, technicien
Mr Sidina Ould Mouhamed el Moctar, aide de laboratoire
Mr Sidy Moubamed ould moctar, aide de laboratoire
.
.
27

---

Annexe VI:
Liste du matériel existant au laboratoire de virologie du CNERV de Nouakchott
Bain marie (3)*
Bouteille à CO2 (1)
Agitateur magnétique (l), de plaque ( l), de tubes( 1)
Broyeur de tissus (1)
Porte filtre de 10 litres (l), de 5 litres (l),
Balance électronique (l),
Autoclave (l),
pH m&.re électronique (1)
Chaîne ELISA : Lecteur, micro-ordinateur immunokan MS+ imprimante,
Compresseur-Aspirateur Marison (1)
Microscope inverse (l),
Microscope à fluorescence (l),
Congélateur horizontal -20% electrolux (1)
Congélateur vertical-2OT (l),
Réfiigémteur (1)
Hotte à flux lankaire vertical (1)
Hotte à flux horizontal (1)
Etuve sèche Jouan (2)
Centrigeuse refrigérk. de paillasse (3)
Armoire vertical m&allique (1)
w
Distillateur d’eau (1)
Légende : (x)* = nombre de matériel fonctionnel
28

---

Annexe VII:
Carte de la localisation des troupeaux de rumiuants sentinelles dans le sud est et le sud de la Mauritanie pour la
surveillance clinique et sérologique de la fikvre de la vallée du Rift en 1998-1999.
29

---

Annexe VIII
Proposition d ‘organisation du Service de Virologie du CNERV
:
ae

j

. :
.Salle cult&e de
:;,’
-ll..lL
I
fi
,.. ::t:.
o-11, i.,c,c&l,:ri,.clu;;ii ‘..
Bureau des

---

.
,
.
,
,

---

Photo WI:
Marché de dromadaires à Nouakchott.
La suweillance des animau.. des difErents marchés de bétail (ovins, caprins bovins et camelins) à Nouakchott
fait partie du rkeau de smveillance des maladies animales en g&&al et de la fièvre de la vallk du Rift en
particulier. Un rythme mensuel de 40 pr&vements de sang est pr&ue entre les mois de Février et Décembre
1999 par le laboratoire de virologie. L.e CNERV pourra ainsi tiiser, avec les troupeaux sentinelles di&minés
dans les principales zones d’élevage, une importante c&cte de donnkes sanitaires utilisables par les
responsables de la santé animale (la Direction des Ressources Agro-Pastorales r~u DRAP) et des organisations de
producteurs (le Comité Paritaire de Suivi Sanitaire ou CPSS) de hkwritanie.
32

---

Photo NOII:
Hotte à flw lamina& vertical
Cette Hotte est un équipement de haute &uritd (classe C, BioHazard) permettant de travailler des produits
hautement infectieux comme ceux swpects de FVR au CNERV .De plus, elle est dotée d’un sas et d’un éclairage
Ultraviolet (KV) assurant la skxrité de l’ambiance, du pr&vement manipulé et du manipulateur.
Cette hotte est située dans une salle dont l’&anch&6 et la sttkilit6 doivent être améliorks par la pose de
climatiseur type Split et de lampes A lumière ultraviolette (UV) pour st&iliser l’atmosphére de la salle avant et
aprés la manipulation de pr&vements infectieux ou suqxcts de WR.
33

---

Photo No m:
Hotte à flux lankaire horizontal.
Cette Hotte est utilis6.e pour les produits non pathogènes comme les cultures de cellules saines (cellules V&o et
celluks primaires) et la préparation de milieux stériles. Elle est destinée & protbger les celluks des
conMons ext&ieures.
Cette hotte est sitube dans une salle qui présente les mêmes exigences d’&anchéité et de skmitc! que la salle
réservke au traitements de produits infectieux.
34

---

Photo N:
Chaîne Elisa.
Cet équipement comprend (de la gauche vers la droite) une imprimante, un micro-ordinateur (avec logiciel
d’analyse des r&ultats) et un lecteur. Il est utilisé actuellement pour la réalisation du test Elisa Peste bovine (test
Elisa compétition et immun~pture) au CNERV. Il pourra également prendre en charge les analyses elisa FVR.
35

---

Photo v:
Distillateur d’eau
Cet appareil donne uen eau de bonne qualité et permet actuellement de réaliser les test Elisa Peste Bovine au
CNERV. tkpendant, la mise en place de test elisa -FVR et les cultures de cellules exige d’acquhir un nouvel
appareil de plus grande capacité.
.
36

---

Photo VI:
Microscope A fluorescence
Ce microscope est utilisé pour le diagnostic de la rage. Il peut être employé pour le diagnostic rapide de la FVR
par examen de frottis d’organes suspeck en immunofluorescence directe.
Le dc2placement de cet appareil dans une chambre noire (voir plan du laboratoire prkconisé) facilitera l’examen et
I’interprtWion des rkmltats d’analyse au CNERV.
31

---

Photo VII:
Etuve skhe.
Cet appareil est destiné aux cultures de cellules mais P&ente des défaillances qui font que son remplacement
par une nouvelle étuve à CO2 est nécessaire pour la mise en place de la technique de cultures de cellules au
CNERV,
Q
38

---

t.
4
Photo VIE
Vue partielle de la salle &erv& à la sérologie
Cette salle est la plus spacieuse du laboratoire du CNERV et la pose d’une table centrale augmenterait utilement
la surface de travail. Elle peut recevoir le nouvel distillateur d’eau.
39

---