INSTITUT SENEGALAIS DE RECHERCHES ,sr;:I‘ '.,.+ ...
INSTITUT SENEGALAIS DE RECHERCHES
,sr;:I‘ '.,.+
r 4 .' REPUBLIQUE DU SENEGAL
AGRICOLES (1.S.R.A)
-----___--
-----------
DEPARTEMENT DE RECHERCHES SUR LES
MINISTERE DU DEVELOPPEMENT RURAL
PRODUCTIONS ET LA SANTE ANIMALES
RAPPORTS DE STAGE EFFECTUE AU ROYAUME UNI
DE GRANDE BRETAGNE ET D'IRLANDE DU NORD
Par
A. DIAITE
LABORATOIRE NATIONAL DE L'ELEVAGE
ET DE RECHERCHES VETERINAIRES
REF. N"SO/PARASITO.
BP 2057
DECEMBRE 1986.
DAKAR - HANN
TSETSE RESEARCH LABORATORY
UNIVERSITY OF BRISTOL
LANGFORD HOUSE, LANGFORD
BRISTOL BS18 7DU, UK
RAPPORT TRIMESTFLIEL
DE STAGE
Par
Docteur Amadou DIAITE
le 30 avril 1986
titre
informelle
sans participation à
l'application du
protocole.
L'avermectine,
produit de
fermentation de
l'actinomycete
Streptomyces avermitilis (Burg et al,
1979) possède une
action
antiparasitaire.
Le produit commercial se compose de 80% du 22,
23 dihydroavermectine Bla et d'au maximum 20% du 22, 23
dihydroavermectine Blb.
L'ivermectine est très efficace contre
les mématodes gastro intestinaux et les insectes parasites des
animaux
domestiques.
Certaines
études
ont
montré
que
l'ivermectine
accroissait
la
mortalité
de
Glossina palpalis palpalis
nourrie
sur des
chèvres
traitées.
Le
but de l'étude faite ici était d'évaluer l'effet
insecticide
de
l'ivermectine
sur
une
autre
espèce:
Glossina morsitans morsitans.
l'étude
a montré que,
après un repas sanguin contenant 0,l à
1,6 voire plus de 1,6 ug/ml,
toutes les
glossines,
ténérales,
adultes mâles et femelles sont tuées.
La concentration léthale
a
même pu
être réduite à 0,04 ug/ml dans le
cas de repas
réguliers pour les ténérales.
Les femelles ayant requ tout de
suite
après
avoir
déposé leur
larve, un repas
contenant
l'ivermectine
à la concentration de 0,08 ug/ml,
n'ont produit
aucune larve lors du cycle suivant.
Toute
cette
expérimentation s'étant faite avec
des
glossines
nourries
artificiellement à travers une membrane
siliconée et
2
avec du sang défribriné de porc,
la question restait de
savoir
quelle
application pratique pouvait en être faite?
Il fallait
dès lors nourrir les mouches sur des animaux traitées et là les
résultats ne sont pas aussi bons car on s'est rendu compte
qu'il
fallait 10 à 20 fois la dose thérapeutique requise chez l'animal
pour
avoir
un effet léthale chez les glossines et 2 fois
cette
même dose pour entrainer la stérilité chez les femelles.
II-2
Détermination de l'âge des glossines - 1.
Maudlin, P. A.
Langley.
11-2-I
Buts de la détermination de l'âge
Il
est
souvent important de connâitre la structure
de l'âge
d'une population de glossines car d'importants
renseignements
peuvent
être obtenus dans un but épidémiologique et dans
celui
de l'évaluation des résultats d'une campagne de lutte.
Sur le
plan épidémiologique,
il est évident que plus une population est
vieille plus il y'a risque qu'elle comporte des
individus
infectés,
donc d'avoir
un pouvoir de transmission
de l'agent
pathogène plus grand.
Sur le plan de la lutte antivectorielle,
la structure de l'âge après une campagne de lutte pourra
permettre de juger soit l'efficacité ou l'inefficacité de
l'insecticide employé, soit de la reinvasion des zones traitées.
11-2-2
Méthode utilisant l'usure des ailes
Elle
consiste
à fixer une aile de glossine sur une lame et à
l'observer au microscope.
En générale la méthode s'applique aux
mâles et
l'examen d'un échantillon d'au moins trente
(30)
3
individus
est
nécessaire.
Selon le degré
d'usure,
du bord
%
interne de l'aile,
chaque
échantillon
sera
rangé dans les
catégories
allant de 1 à 6,catégories s'appliquant d'abord
a u x
jeunes (1) puis et par order d'âge aux plus vieilles (6).
L e
nombre de mouches dans chaque catégorie est multiplié par le
numéro de la catégorie.
Puis tous les produits sont additionnés
et la somme divisée par le nombre de mouches examinées, le nombre
obtenu
représente la moyenne de
l'usure des ailes.
Cette
moyenne
renvoie à
un âge déterminé dans le
tableau
moyenne
d'usure/moyenne d'âge.
11-2-3
Etat anatomophysiologique des ovaires
Si
la méthode précédente nous donne un âge moyen d'un ensemble
donné d'individus,
celle
ci nous donne un
âge à
l'échelle
individuelle.
11 est important pour comprendre de rappeler la
structure
anatomique
de l'appareil génital de la femelle de
glossine.
Cet appareil comporte deux ovaires contenant
chacun
deux
ovarioles;
ces
ovaires
comporte
chacun un
oviducte
débouchant dans
l'utérus par de longs
canaux.
Sur
la face
dorsale de l'utérus débouchent aussi
les
deux
canaux
des
spermathèques
qui
stockent les spermatozoldes
nécessaires à
toute la vie sexuelle de la femelle.
Lors de dissection, il est
important de bien mettre en position supérieure les canaux des
spermathèques.
Cette position permet en effet de bien orienter
les
ovaires qui se trouvent alors à droite pour l'ovaire
droit
et à gauche pour l'ovaire gauche.
4
Ageing t s e t s e
ovaries
,
0
1
2
3
4
5
6
7
a
b
C
t
&Se
N.B.
F-Lies
category
FL.5
Les
ovarioles dans les ovaires ont été denommées A et B pour
l'ovaire
droit et C et D pour l'ovaire gauche.
A et C sont du
côté interne alors que B et D sont externes.
Selon un cycle de
10 jours à partir du 10ème jour de vie des oeufs sont
libérés
alternativement des ovarioles.
La première "ponte
ovulaire"
part de l'ovariole A ensuite l'ovariole C puis l'ovariole B et
enfin l'ovarioleg(voir figures jointes).
Apres
la ponte ovulaire,
l'ovariole restera avec une relique
folliculaire,
ce sont les reliques folliculaires qui permettront
de déterminer l'âge de la glossine.
Cette
méthode peut être d'une grande précision lorsqu'elle
est
bien maitrisée pour les quatre premières catégories d'âge
puis
elle
est
moins précise pour les catégories
suivantes.
Cette
lacune peut cependant être minimisée si
l'on
considère la
faible probabilité pour les mouches sauvages de survivre au déla
du stade 4.
La technique
consiste à
faire deux petites
incisions
tranversales au
tiers postérieur de
l'abdomen de la
glossine et
à l'aide de deux pinces tirer les
deux bouts de
façon opposée.
Déposer le bout postérieur contenant l'appareil
génital sur
une lame sur laquelle on aura préalablement
déposé
une goutte
de sérum physiologique,
le tout sous une loupe
binoculaire.
Isoler l'appareil génital en dilacérant la graisse
bien orienter les ovaires, extérioriser les ovarioles et observer
la présence ou l'absence de reliques folliculaires.
Se referer
au tableau de la page suivante pour donner l'âge.
5
I
11-2-4
Analyse du contenu en ptéridine des yeux.
Cette
méthode
développée recemment ici au TRL est basée sur la
simple constatation que plus les mouches vieillissaient plus leur
tête contenait de la ptéridine.
Ce contenu est donc extrait et
sa fluorescence lue et transmise à un ordinateur qui donnera un
âge précis à chaque taux de fluorescence.
11-2-4-l
Réactifs utilises
Disposer d'un mélange contenant
( 2 parts de méthanol
a =
( 1 part de chloroforme
Préparer le tampon
b =
0,l M NaoH/glycine
pH 10
11-2-4-2
Technique
Les
tètes
sèches
de glossines (tenues le plus possible à
l'abri de la lumière) sont écrasées individuellement dans des
tubes de verre contenant 1 ml de (a) en utilisant un petit
pilon
(en
verre) que l'on prendra soin de nettoyer soigneusement avant
de passer au tube suivant.
Ajouter ensuite 1,5 ml de
(b) et
bien mélanger en utilisant un mélangeur Vortex.
Centrifuger le
mélange à 3000 tours/mn pendant 5 mn.
Recueillir le surnageant
dans
des
tubes différents propres.
Lire la
fluorescence du
contenu de ces
tubes aux longueurs d'ondes 360 mn et
540 mn.
Selon
le taux de fluorescence
l'ordinateur
donnera
l"âge
correspondant.
6
La méthode
est hautement sensible et donne un
âge
individuel
aussi bien des femelles que des mâles.
L'équipement requis est
toutefois
sophistiquée
mais il
faut dire que
tous
les
échantillons qui seront envoyés ici feront l'objet d'une
analyse
tout à fait gratuite.
III-3
Identification de substances odorantes attractives
pour
les glossines - E. Bursell
Ici
encore
il s'agit d'explications précises du
professeur E.
Bursell sans que nous n'ayons eu a prendra part a l'application
du protocole.
Cette nouvelle voie de recherche a été entreprise
à
la suite de nombreuses observations faites sur le terrain au
Zimbabwé par G.
Vale sur le comportement des
glossines.
En
effet
il a été constatée que l'odeur de l'hôte jouait un
rôle
dans le processus d'attraction des glossines.
Mais quelle était
la substance précise responsable de cette attraction?
Pour
répondre à
cette question de nombreuses sources
d'odeur
font
Lobjet d'étude en vue de leur séparation par électroantennographie
(EAG) dans
le laboratoire de recherches tropicales de Londres.
Les substances sont ainsi au fur et à mesure identifiées
grâce
aux pics
sur
la courbe de 1'EAG puis isolées et envoyées à
Bristol où l'expérience sur les mouches est effectuée.
Cette
nouvelle
voie permettra une fois maitrisée de rendre
les
pièges
encore
plus
efficaces en
multipliant
le nombre de
captures
et cela sur des rayons beaucoup plus
importants.
En
clair
elle
permettra de retire le nombre de pièges à placer
7
dans une
zone déterminée mais en même
temps d'amplifier
les
captures.
III
PROTOZOOLOGIE
III-1
Définitions
Au laboratoire,
on sera souvent amené à manipuler
différents
types de populations de trypanosomes qu'il est très important de
différencer
dans le
but
de plus en
plus
requis de
standardisation.
- Isolement primaire:
Ce sont des organismes viables retrouvés
dans
le milieu de culture suite à la mise en culture d'un
échantillon provenant de l'hôte.
- Stock:
Trypanosomes dérivant de l'isolement primaire
après
plusieurs passages sans implication d'homogéniété.
- Lignée:
Dérivatif d'un stock de laboratoirelmaintenue dans
des conditions différentes ou des endroits différents.
- Stabilat:
Echantillons d'organismes
vivants
mais ne se
multipliant pas généralement et maintenue par froid.
- Clone:
Population
de trypanosomes provenant d'un seul et
unique individu.
III-2
Cryoconservation des trypanosomes - P. Dukes
Pour cela il faudra utilisér des animaux à parasitémie montante.
C'est à dire lorsqu'on atteint à peu près une parasitémie de 10'
trypanosomes/ml.
- Le
sang pourra provenir d'un hôte naturel ou de la saignée
d'un hôte de laboratoire.
- Ajouter un
volume
égal de PSG
(phosphate buffered saline
glucose) frais hépariné:
10 UI d'héparine/ml pour le sang de rat
et souris ou 50 UI/ml pour du sang récolté sur le terrain.
- Ajouter la glycérine a raison de 7,5% du volume final.
- A la température
du laboratoire remplir et
sceller des
ampoules ou des tubes capillaires.
- Réfrigerer
lentement l'C/mn toute la nuit avant de
transferer
dans l'azote liquide.
III-3
Culture de trypanosomes - P. Dukes
La culture de trypanosomes des animaux et des humains s'est faite
pendant très
longtemps in vivo en utilisant d'autres
animaux,
soit
rongeurs
de laboratoire
soit grands mammifères voire
parfois
l'utilisation de volontaires humains.
Cette
méthode
comporte un
certain
nombre de désavantages (coûts
élevés de
l'entretien des animaux,
opposition de plus en plus
ardue à
travers le monde des sociétés de protection des animaux) d'où la
nécessité
aujourd'hui de développer les méthodes dites
in vitro
qui permettent
de cultiver les trypanosomes
sur des
tissus
biologiques.
111-3-l
Cultures in vivo
Différents
types d'animaux sont employés,
les plus communs étant
cependant les rongeurs de laboratoire.
- Souris:
Lorsqu'elles
pèsent entre
20 et
25 g
elles
reçevront
0,2 à
0,5 ml en
injection
intraperitoneale, la
période
prépatente
est
très
variable.
Surveiller la
parasitémie
à partir du troisième jour en faisant des
frottis
9
fixés et
colorés ou utiliser les autres techniques,
examen de
l'interphase,
examen
direct d'une goutte de sang entre lame et
lamelle,
utilisation des mini-colonnes.
Pour faire apparaître
la
parasitémie
plus
rapidement on
peut
induire
une
immunosuppression
soit
chimique
par
utilisation de la
cyclophosphamide
300 mg/Kg maximum soit physique par irradiation
aux rayons X - 600 rads maximum.
- Rats:
Utiliser
0,2 à 0,s ml en
intrapéritonéal
pour
T. congolense
et T. gambiense l'immunosuppression
sera
induite
par utilisation de la cyclophosphamide à raison de 100 mg/Kg.
- Mastomys natalensis
est utilisé pour cultiver T. gambiense à
l'âge de 25 à
35 j à
la dose de
0,2 à 0,s ml en
intrapéritonéale.
- Lapins:
Par injection sous-cutanée ou intratesticulaire.
- Grands animaux
Porcs:
pour différencier T. simia_e et T. congolense
Singes et primates
Petits
ruminants
surtout pour cultiver T. vivax
qui
sauf
quelques
rares
cas
ne developpe aucune
parasitémie chez
les
rongeurs.
111-3-2
Culture in vitro
Cette technique permet en outre de cultiver des formes
sanguines
de trypanosomes telles que l'on les trouve dans l'hôte vertébré
et
des
formes
de développement
(trypomastigotes) présentes
seulement chez le vecteur (Glossine).
10
111-3-2-I
Récolte des trypanosomes
Lorsque la culture concerne des formes sanguines, la récolte peut
se faire directement sur l'hôte vertébré, ou encore à partir de
rongeurs
de laboratoire infectés par le vecteur.
Dans le
cas
où
on veut cultiver des formes de développement la
récolte se
fera
à partir du vecteur deux méthodes de récolte peuvent être
utilisée.
a)
Faire
saliver la mouche dans une goutte de
sérum
physiologique
placée
sur
une
lame portée par une
plaque
chauffante.
b)
Dissection de la mouche
- Proboscis pour rechercher T. vivax
- Proboscis et intestin moyen pour T. congolense
-
- Intestin moyen et glandes salivaires pour T. brucei
III-3-2-2
Tissus utilisés
- Embryon de mountain vole (Americain) ou Microtus
- Cellules de l'endothelium de l'aorte de bovin surtout pour les
cultures
de T. congolense qui possède un très
fort
vaisseau
tropisme
- Cellules du plexus choroide surtout pour T. brucei
- Fibroblaste de bovin
Ces
tissus seront selon le besoin cultivés d'abord à
37'C dans
une atmosphère à 5% de COU pendant 3 à 5 jours.
111-3-2-3 Milieux de culture
y
a)
Milieux TRL
Ce sont des milieux crées et utilisés ici par le laboratoire
11
.
- EBLB (Evans blood lysate broth)
- Cunningham's (forme de développement)
- SDM 79
b) Milieu disponible dans le commerce
- MEM
(minimum essential medium)
Ce milieu contient en outre:
glutamine, glucose, proline,
amino acides HEPES et antibiotiques,
généralement penicilline (100 UK/ml),
gentamycine (20-200 Ug/ml)
mais pas de streptomycine.
Ce milieu sert à la
culture de
forme sanguine.
111-3-2-4 Sérums utilises
Il est nécessaire d'ajouter du sérum au milieu pour l'enricher
- sérum de bovin (fibroblaste de bovin)
- sérums équin, de chèvre, de mouton, humain (Microtus)
- sérums équin et bovin (cellules de l'endothélium bovin)
A noter que les sérums de foetus de veau et équin sont en
outre
disponibles dans le commerce.
III-4
Test de chimiorésistance - J. J. McNamara
111-4-l
Introduction
Pour lutter contre les trypanosomiases animales africaines (TAA),
le thérapeute dispose actuellement d'une gamme très réduite de
trypanocides.
Ce sont essentiellement le trypamidium (Samorin)
dans
un but préventif et le B&éni1 à titre curatif.
A cause
de cette marge de manoeuvre réduite toute mauvaise utilisation de
ces drogues (sous-dosage, fraude) constitue une grave menace dans
la lutte
contre le nagana car
induisant
la chimiorésistance.
12
Cette
technique permet
en outre de tester
la sensibilité de
souches de trypanosomes à des trypanocides.
111-4-2 Technique
- Récolter
et purifier
les trypanosomes en
les passant à
travers une colonne de DEAE-cellulose.
- Introduire
ces trypanosomes dans un milieu de culture preparé
d'avance et y ajouter de l'adénosine
radioactive
à
la
concentration de 4 ul/ml de suspension de trypanosomes.
- Incuber à 37'C et dans une atmosphère à 5% de CO, pendant 30
mn à 1 heure.
- Distribuer
ensuite
la suspension en quantité égale
dans 6
rangées de puits d'une plaque à microtitration.
- Laver les
rangées de puits à des temps différents
avec de
l'eau distillée qui lyse en même temps les trypanosomes.
- L'appareil utilise ici est le "Ce11 Harvester 550" de Titertek
qui imprime sur un papier buvard des confettis de la solution de
trypanosomes lysés.
- Faire sécher le papier buvard.
- Le
lendemain
découper
les
confettis et
les
placer
individuellement dans des tubes.
- Introduire dans chaque tube 3 ml du liquide scintillant
éconofluor
qui
permet
la lecture de
la radioactivité
Par
l'appareil conEu à cet effet.
Cette
technique permettra en outre de juger de l'efficacité d'un
trypanocide avec des tests in vitro en mesurant la
concentration
d'adénosine radioactive en fonction du temps d'incubation.
13
IV
CONCLUSIONS
La
plupart
des
techniques
étudiées
jusqu'à présent
ici
nécessitent à vrai dire l'utilisation d'un matériel
sophistiqué
non
encore disponible dans les laboratoireSnationaux en Afrique.
Certaines de ces techniques, comme la détermination de l'âge des
glossines grâce au
contenu en ptéridine
de la tête,
font
intervenir un équipement très onéreux.
Par contre la
culture
de trypanosomes
in vitro à condition toutefois de
pouvoir se
ravitailler
en milieux de culture disponibles dans le
commerce,
peut
très bien se conduire dans les laboratoires moyennement
équipée.
Le test de chimiorésistance fait aussi intervenir un
matériel difficile
à trouver entièrement au sein d'un même
laboratoire
mais à notre avis,
certaines parties du
protocole
peuvent
très bien s'exécuter à l'aide d'un
matériel
beaucoup
plus
simple le reste de l'équipement pouvant être trouvé en
collaboration avec d'autres institutions au sein d'un même pays.
La
formation
reste
cependant bénéfique
car
elle
permettra
sûrement
de démarrer de nouveaux protocoles adaptés
toutefois
aux conditions locales de travail.
14
TSETSE RESEARCH LABORATORY
UNIVERSITY OF BRISTOL
LANGFORD HOUSE
LANGFORD
BRISTOL BS18 7DU
U K
RAPPORT FINAL DE STAGE
P A R
DOCTEUR AMADOU DIAITE
Le 15 juillet 1986
CONTENU
1
Introdu ction
II
Différenciation de souches de Trypanosomes par
utilisation
de la technique des isoenzymes.
D. G.
Godfrey, S. M.
Lanham, W. Gibson.
II.1
Definition
II.2
Structure des enzymes
II.3
Préparation du matériel (Trypanosomes) à
utiliser
11.3.1
Purification
11.3.2
Préparation de l'extrait aqueux de
trypanosomes
II.4
Technique utilisant l'étalement de gel en couche
fine
11.4.1
Introduction
II.4.2
Technique
11.4.3
Exemple pour quelques enzymes de tampon
et de temps d'electrophorèse et de voltage
utilisés
II.5
Technique
utilisant
les plaques
d'acetate d e
cellulose
11.5.1
Introduction
11.5.2
Technique
III. Protocole de travail personnellement executé.
P. Dukes.
III.1
Introduction
III.2
Souches utilisées
111.2.1
Formes sanguines
111.2.2
Formes procycliques
IV.
Conclusions générales
1.
Introduction
Le premier rapport trimestriel avait permis de voir les techniques avec
lesquelles le stagiaire s'est familiarisé. Ce présent rapport a trait au
.
deuxième aspect de la formation et tire les conclusions générales qu'elle
inspire.
Cette deuxième partie a donc trait essentiellement à la différenciation de
souches de trypanosomes grâce à la technique des isoenzymes par la comparai-
son des zymogrammes de différentes souches pour différents enzymes.
Les trypanosomes du groupe des Salivaria sont divisés en quatre sous-genres :
Sous genre Duttonella avec T. vivax et T. uniforme
II
Nannomonas avec T. congolense et T. simiae
II
Trypanozoon avec T.b. brucei, T.b. gambiense, T.b. rhodhesiense
-
principalement
SkJS GENRE PYCNOMONAS AVEC T. suis.
-
Le problème qui se pose depuis longtemps est celui de la différenciation entre
les espèces appartenant au même sous-genre car elles sont morphologiquement
identiques. En outre, le sous-genre Trypanozoon comporte des espèces pathogènes
soit aux animaux, soit à l'homme (maladie du sommeil) et qu'il est impossible
de différencier morphologiquement. Les espoirs suscités par la technique BIIT
(blood incubation infectivity test) se sont vite anéantis lorsque des souches
considérées comme strictement pathogènes aux animaux par le test, ont accidentelle-
ment infecté des humains. Toutes ces difficultés ont poussé les chercheurs à
s'orienter vers l'échelle moléculaire pour une caractérisation plus adéquate
des différences (isoenzymes, structure de 1'ADN).
II.
Différenciation des souches de trypanosomes par utilisation de la
technique des isoenzymes : D.G. Godfrey, S.M. Lanham, W. Gibson
II.2
Définition
Les enzymes sont de très puissants et spécifiques catalyseurs qui accélèrent
les réactions chimiques dans les systèmes biologiques. Ce sont des protéines
avec des structures très précises en rapport avec la très forte spécificité
de leur action comme toutes les protéines, cette structure est codée dans
1'ADN (acide désoxyribonucléique) du génome par un ou plusieurs gènes spécifi-
ques. La classification des enzymes est essentiellement basée sur leur fonc-
tion par exemple sur le substrat particulier sur lequel ils agissent et le
type de réactions qu'ils catalysent. Une fois, la base génétique de la
synthèse des protéines élucidées, il apparut que les formes multiples d'enzymes
ou isoenzymes pourraient être divisées en deux grandes catégories selon leur
origine.
.
Différences de structure pour des raisons génétiques:
Différence de
structure provenant de
modifications
post
translationnelles
de
sous
unités-homogènes
produites
initiallement par un seul gène.
II.2
Structure des enzymes
Tous les enzymes sont donc des protéines (protéines globulaires).
A partir de la forme structurelle de base:
polypeptide qui est
une chaine condensée d'acides aminés,
on définit les
structures
primaire,
secondaire,
tertiaire des
enzymes.
La
structure
primaire est la séquence des acides
aminés
dans
la chaine
polypeptidique;
chaque
acide
est formé par une
triplette de
bases
azotées appellées Codons et provenant de la combinaison de
quatre bases:
Adénine (A), Thymine (T), Guanine (G) et Cytosine
(C).
Lorsque la synthèse d'un polypeptide particulier est
requise,
l'information est transcrite du gène à 1'ARN messager
(acide
ribonucléique) qui la transporte du noyau
aux
ribosomes
sites
de la
synth*ese des polypeptides.
Les
structures
secondaires, tertiaires et quaternaires découlent de la structure
primaire lineaire grace à des liaisons variées et sont nettement
plus compliquées.
Certaines
protéines globulaires sont consituées par une
seule
unité
de polypeptides elles sont dites monomériques,
d'autres
contiennent
plusieurs
sous-unités et sont dites
oligomériques.
Le
nombre
de sous-unités détermine les
appellations de
dimériques, trimériques tetramériques, etc.
II.3 Préparation du matériel (Trypanosomes) à utiliser
11.3.1
Purification
Les trypanosomes peuvent etre obtenus soit à partir d'animaux
parasites soit à partir de culture in vitro.
-
-
-
Lorsque les trypanosomes proviennent d'animaux,
il faut d'abord
les
séparer des cellules sanguines en les passant à travers une
colonne
de DEA lavé auparavant cinq fois avec du PSDG Ph8.
Une grande attention sera accordée aux proportions de
phosphate
et de sucre (glucose) à mélanger selon le type d'animal à
partir duquel le sang provient.
Lorsque la majorité des trypanosomes est
collectée,
centrifuger
l'eluat
à 2500 tours/mn pendant 20mn à 4 C,
ensuite verser le
surnageant
et resuspendre le culot avec du PSG et
recentrifuger
à la meme vitesse et pendant le même temps.
Faire ce
lavage
à
cinq reprises pour éviter l'interférence d'enzymes
étrangers
(enzymes provenant de l'hôte).
11.3.2
Préparation d'extrait aqueux de trypanosomes.
4
.
Il faut pour lyser les trypanosomes une fois lavés,
préparer la
solution suivante:
a)
0.0308g dithiothreirol (DTT)
b)
0.0262g 2 acide aminocaprioque (AAC)
Ajouter
à a) 1 ml d'un solution 200mM EDTA (7,445g
dans
100ml
d'eau et ajuster le pH à 7 avec 1N NaOH.
Ensuite dissoudre b)
avec la première solution obtenue.
La solution finale obtenue
est le cocktail stabilisateur 100 fois concentré,
elle peut se
garder
au réfrigérateur pendant à peu près une
semaine.
Au
moment de l'emploi, diluer la solution ci-dessus au I/l00 avec de
l'eau distillée et ajouter un volume égal à celui
de la
suspension de trypanosomes.
Mélanger et garder îOmn dans la
glace
avant
de congeler pendant à peu près 24
heures.
Ensuite,
décongeler
(pour achever la lyse) et centrifuger à
10,000 tours pendant 30 mn et à 4 C.
Du surnageant, contenant
les enzymes en solution,
on formera des billes en faisant tomber
des gouttelettes de 15~1 dans l'azote liquide.
Ces billes sont
ensuite
gardées dans
l'azote
liquide jusqu'au
jour de leur
utilisation.
Cette
cryoconservation sera accompagnée par
des
informations précises consignées dans un registre exemple:
numéro de l'isolement
période d'infection de l'hote
type d'animal utilisé
date de séparation sur colonne
tampon utilisé et nombre de lavages effectués
volume initial de trypanosomes
temps et vitesse de centrifugation
code approprié de l'extrait
le numéro du lysat
exacte position dans l'azote liquide
Deux
méthodes sont utilisées pour l'étude du
isoenzymes.
Ce
sont:
l'étalement du gel en couche fine
des plaques d'acétate de cellulose
En générale,
pour
chaque souche l'étude du
zymogramme de 12
enzymes est nécessaire.
II.4
Technique utilisant l'étalement du gel en couche fine.
11.4.1
Introduction
Cette
technique introduite en premier par Smithies en 1955
aida
à démonstrer
la multiplicité de formes enzymatiques
dans
les
extraits
de tissue par la coloration de gels d'électrophorèse.
Elle consiste à
faire
déplacer des enzymes dans du gel à
travers léquel on fait passer un courant électrique.
Le gel est
en général de la farine de pomme de terre que l'on fait dissoudre
dans un
flacon
contenant le
tampon
approprié pour
l'enzyme
5
étudié.
11.4.2
Technique
Placer le flacon
au dessus d'une flamme de bec bunsen agiter
jusqu'à ce que le gel passe de la phase assez solide à la phase
plus fluide.
Boucher de l'ouverture supérieure du
flacon et
relier
l'ouverture latérale à une pompe à vide.
Le gel
est
prèt lorsque de grosses bulles blanches apparaissent.
Verser
rapidement
le gel sur une plaque et l'étaler aussitôt laisser
ensuite
solidifier dans l'obscurité.
A l'une des extrémités
(sens de la longueur) de la plaque,
on creusera
des
cuvettes
régulières et
alignées;
c'est dans ces cuvettes que l'on
placera
les
fils de coton prrealablement
imbibés
dans la
suspension d'enzyme provenant des billes.
Une plaque
permet
l'étude de huit souches de trypanosomes pour le même enzyme.
Les
plaques
sont
placées
ensuite
dans
des
chambres
d'électrophorèse
constamment refroidies par un générateur
pour
éviter la détérioration des enzymes (en général 8 C).
Le tampon
utilisé dans les chambres d'électrophorèse est le même que celui
utilisé pour suspendre le gel mais non dilué.
11.4.3
Exemples pour quelques enzymes de tampon,
de temps
d'électrophorèse et de voltage utilisés
(voir Tableau).
II.5
Technique utilisant les plaques d'acgtate de cellulose
11.5.1
Introduction
La
technique
permet
d'abouter
aux
memes
résultats
que
l'électrophorèse
sur gel mais la réalisation est beaucoup
plus
simple
et le temps d'électrophorèse plus court.
Les plaques
sont déja prètes et disponibles dans le
commerce.
Celles
utilisées
ici
sont fabriquées par les laboratoires
Helena de
Beaumont au Texas.
11.5.2
Technique
Les
plaques
sont d'abord imprégnées dans
la solution tampon
appripriée pour l'enzyme étudié.
Puis un tampon à huit pointes
imbibé dans
la solution d'enzyme est
appliqué
fermement à
quelques 2 cm de l'un des bouts (sens de la
longueur).
Placer
la plaque dans la chambre d'électrophorèse en s'assurant que les
échantillons se
trouvent du coté de
la cathode,
établir le
courant
électrique
régler le voltage et chronométrer
(ici les
temps d'électrophorèse sont beaucoup moins longs:
20 à 40 mn).
Il
est
nécessaire,
à cause de ce temps court de préparer le
developpeur
approprié suivant l'enzyme étudié avant de commencer
l'électrophorèse.
Ce developpeur est soit du gel,
soit du
papier
de couverture.
Après
l'électrophorèse,
couper le
courant passer
le developpeur sur la plaque et chronométrer.
Lorsque le developpement est optimum (10 mn) arreter et faire si
nécessaire des photographies.
La technique est simple et dure un
6
temps beaucoup
moins long avec des résultsts aussi fiables
dans le cas du gel en couche fine.
que
III.
Protocole de travail personnellement exécuté, P. Dukes.
-
III.1
Introduction
Ce protocole avait pour but la comparaisons de quatre souches de
trypanosomes (toutes
T.congolense) entre elles et ensuite
pour
chaque souche la comparaison des zymogrammes des formes sanguines
et formes procycliques.
III.2
Souches utilisées
Au départ
six
souches ont été
utilisées pour accroitre les
chances au niveau des cultures surtout in vitro:
- SI04
isolée
à partir d'une glossine disponible en
forme sanguine
- IVG45
isolée d'une vache à Baringo dans la province de
la Rift Valley au Kenya, disponible en forme
sanguine
- 1148
isolée à partir d'une glossine disponible en
forme sanguine
- 1564
provenant de 1'EATRO
- TREU 1457
formes sanguines
- TREU 1627
formes sanguines
Les
deux
dernières
souches
provenant de
l'Université
d'Edinburgh.
111.2.1
Formes sanguines
Pour obtenir les formes sanguines,
les souches sont inoculées à
des
rats dont la parasitémie est surveillée quotidiennement.
Lorsque
le pic 8,4 à 9 (puissance logarithmique)
est
atteint,
les rats sont sacrifiés,
le sang passé à travers une colonne de
DE 52.
Les trypanosomes recueillis dans l'eluat sont lavés 3
fois
par centrifugation resuspension du culot dans du PSG
(voir
11.3.2).
Certaines souches ont pu etre obtenues en billes mais
d'autres ont cultivé
très lentement et n'ont pu
aboutir
aux
billes.
111.2.2
Formes procycliques
Pour
obtenir les
formes procycliques,
des mouches ont été
nourries
de facon artificielle avec du sang virulent.
Après
deux à troi&%% mouches ont été affamées puis dissequées.
Un
morceau de l'intestin moyen a été isolé à chaque fois et
plongé
dans
un puits d'une
plaque de microtitration (de
96 puits)
contenant du milieu Cunningham's.
7
S104 six mouches positives sur les disséquées
1148 sept "
II
II
II
II
nG45 neuf "
II
II
II
II
Ces plaques ont été mises à incuber à 25°C pendant 3 jours avant d'être
transférées dabs ybe plaque à puits plus larges (5 points) et enfin dans
des flacons de 15 ml puis 25 ml. C'est à ce niveau qu'une mortalité énorme
a été observée rendant toute poursuite inutile car il aurait fallu alors
recommencer le processus depuis l'infection des mouches, ce qui était prati-
quement impossible avec le temps qu'il restait au stagiaire.
IV.
Cpnclusions générales
Même si le protocole personnel de recherche du stagiaire n'a pas abouti,
faute de temps, il a eu l'occasion de se familiariser longuement avec les
deux techniques d'électrophorèse pour l'étude des isoenzymes.
Cette tee hnique permettra d'élucider beaucoup de problèmes sur le terrain
en Afrique surtout pour le sous-genre Trypaozoon où il se pose surtout un
problème de santé publique. Il s'agira en ef'fet par la technique d'élucidler
l'existen ice de réservoir animal pour la maladie du sommeil à T.gambien se.
-
Il faudra aussi mener ces études dans les sous-genres Nannomas entre
T. Congo1 ense e t T. simiae (étude pa rtiellement faite) et dans le sous
genre Dut:tonell a où les études sont encore très timides entre T. vivax
et T. uni forme -(C.A. Hoare donne d'i ntéressantes références de biométr'ie)
et entre les so uches de T. vivax adaptées à des cultures in vitro sur
rongeurs et les souches non adaptées
Une telle étude a été envisagée avec le Dr D.G. Godfrey (superviseur de
l'étudiant à &ngford) si une source de financement était trouvée. Il
s'agira de la comparaison de modèles isoenzymatiques de soueches prove-
nant du nord du pays (voire de la Mauritanie) du centre et du sud ainsi
qu'une souche de 1'ILRAD adaptée aux rongeurs.
La technique de culture in vitro permettra de disposer d'un matériel de
travail abondant et indispensable à la réussite d'expérience de laboratoire.
8
C
TABLEAU
c
___--------------~--~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~-----------~-~~~~~~~~~~
VOLTAGE
TEMPS
ENZYMES
TAMPON DU GEL
D'ELECTRO-
PHORESE
___---_-----------------~~~~~~~--~-----~~---------~~-~~~~~~~~~~~~~
ALAT
0,18 M Tris )
Alanine amino-
,y; ~uK~y;$ pH gf 3
transférase
__-__-_-------_------------------------~-----~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~
PEP 1
0,8 M Tris )
300 v
Peptidase 1
0,02 M KH$O$ pH 9,3
3 heures
diluer au I/l0
________________--------------------------------------------------
PEP II
même tampon même dilution
300 v
Peptidase II
(différence dans les developpeurs) 3 heures
P G M
0,l M Tris
1
300 v
Phospho-
0,l M acide maléique) pH 7
3 heures
glucomutase
0,Ol M EDTA
) dilution
0,Ol M Mg acetate
l/lO
ASAT
0,15 M Glycine NaOH
PH 9,s
Aspartate amino- diluer au l/lO
transférase
__---_-_-_-----------------------------~-------------------------
GPI
0,038 M NarHLPOq)
300 v
Glucose
0,162 M Na&H P04) pH '7
3 heures
phosphate
diluer au I/l0
isomérase
__-------__-----------~~~~-~~~---------~--~------~-~~~~~~~~~~~~~~
M E
0,019 M NaH&PO,+)
Malic enzyme
0,081 M Na HPO4)
PH 7,4
diluer au 11 /lO
ICD
0,5 M NaLHPOLI
1
300 v
Isocytrate
0,007 M acide citrique)
P H 7
3 heures
deshydrogénase diluer au 1/5
---------------------------------------~-------------------------
M D H
O,O5 M
1
300 v
Malate
0,007 M NatHPOQ acidecitrique)
P H 7
3 heures
deshydrogénase diluer au 1/5
---------------------------------------~-------------------------
MPI
0,l M Tris )
250 V
Mannose
0,l M NaH&PO,,) pH 7,4
2à3
phosphate
diluer au l/lO
heures
isomérase
_________-______----____________________-------------------------
9
,sr;:I‘ '.,.+
r 4 .' REPUBLIQUE DU SENEGAL
AGRICOLES (1.S.R.A)
-----___--
-----------
DEPARTEMENT DE RECHERCHES SUR LES
MINISTERE DU DEVELOPPEMENT RURAL
PRODUCTIONS ET LA SANTE ANIMALES
RAPPORTS DE STAGE EFFECTUE AU ROYAUME UNI
DE GRANDE BRETAGNE ET D'IRLANDE DU NORD
Par
A. DIAITE
LABORATOIRE NATIONAL DE L'ELEVAGE
ET DE RECHERCHES VETERINAIRES
REF. N"SO/PARASITO.
BP 2057
DECEMBRE 1986.
DAKAR - HANN
TSETSE RESEARCH LABORATORY
UNIVERSITY OF BRISTOL
LANGFORD HOUSE, LANGFORD
BRISTOL BS18 7DU, UK
RAPPORT TRIMESTFLIEL
DE STAGE
Par
Docteur Amadou DIAITE
le 30 avril 1986
titre
informelle
sans participation à
l'application du
protocole.
L'avermectine,
produit de
fermentation de
l'actinomycete
Streptomyces avermitilis (Burg et al,
1979) possède une
action
antiparasitaire.
Le produit commercial se compose de 80% du 22,
23 dihydroavermectine Bla et d'au maximum 20% du 22, 23
dihydroavermectine Blb.
L'ivermectine est très efficace contre
les mématodes gastro intestinaux et les insectes parasites des
animaux
domestiques.
Certaines
études
ont
montré
que
l'ivermectine
accroissait
la
mortalité
de
Glossina palpalis palpalis
nourrie
sur des
chèvres
traitées.
Le
but de l'étude faite ici était d'évaluer l'effet
insecticide
de
l'ivermectine
sur
une
autre
espèce:
Glossina morsitans morsitans.
l'étude
a montré que,
après un repas sanguin contenant 0,l à
1,6 voire plus de 1,6 ug/ml,
toutes les
glossines,
ténérales,
adultes mâles et femelles sont tuées.
La concentration léthale
a
même pu
être réduite à 0,04 ug/ml dans le
cas de repas
réguliers pour les ténérales.
Les femelles ayant requ tout de
suite
après
avoir
déposé leur
larve, un repas
contenant
l'ivermectine
à la concentration de 0,08 ug/ml,
n'ont produit
aucune larve lors du cycle suivant.
Toute
cette
expérimentation s'étant faite avec
des
glossines
nourries
artificiellement à travers une membrane
siliconée et
2
avec du sang défribriné de porc,
la question restait de
savoir
quelle
application pratique pouvait en être faite?
Il fallait
dès lors nourrir les mouches sur des animaux traitées et là les
résultats ne sont pas aussi bons car on s'est rendu compte
qu'il
fallait 10 à 20 fois la dose thérapeutique requise chez l'animal
pour
avoir
un effet léthale chez les glossines et 2 fois
cette
même dose pour entrainer la stérilité chez les femelles.
II-2
Détermination de l'âge des glossines - 1.
Maudlin, P. A.
Langley.
11-2-I
Buts de la détermination de l'âge
Il
est
souvent important de connâitre la structure
de l'âge
d'une population de glossines car d'importants
renseignements
peuvent
être obtenus dans un but épidémiologique et dans
celui
de l'évaluation des résultats d'une campagne de lutte.
Sur le
plan épidémiologique,
il est évident que plus une population est
vieille plus il y'a risque qu'elle comporte des
individus
infectés,
donc d'avoir
un pouvoir de transmission
de l'agent
pathogène plus grand.
Sur le plan de la lutte antivectorielle,
la structure de l'âge après une campagne de lutte pourra
permettre de juger soit l'efficacité ou l'inefficacité de
l'insecticide employé, soit de la reinvasion des zones traitées.
11-2-2
Méthode utilisant l'usure des ailes
Elle
consiste
à fixer une aile de glossine sur une lame et à
l'observer au microscope.
En générale la méthode s'applique aux
mâles et
l'examen d'un échantillon d'au moins trente
(30)
3
individus
est
nécessaire.
Selon le degré
d'usure,
du bord
%
interne de l'aile,
chaque
échantillon
sera
rangé dans les
catégories
allant de 1 à 6,catégories s'appliquant d'abord
a u x
jeunes (1) puis et par order d'âge aux plus vieilles (6).
L e
nombre de mouches dans chaque catégorie est multiplié par le
numéro de la catégorie.
Puis tous les produits sont additionnés
et la somme divisée par le nombre de mouches examinées, le nombre
obtenu
représente la moyenne de
l'usure des ailes.
Cette
moyenne
renvoie à
un âge déterminé dans le
tableau
moyenne
d'usure/moyenne d'âge.
11-2-3
Etat anatomophysiologique des ovaires
Si
la méthode précédente nous donne un âge moyen d'un ensemble
donné d'individus,
celle
ci nous donne un
âge à
l'échelle
individuelle.
11 est important pour comprendre de rappeler la
structure
anatomique
de l'appareil génital de la femelle de
glossine.
Cet appareil comporte deux ovaires contenant
chacun
deux
ovarioles;
ces
ovaires
comporte
chacun un
oviducte
débouchant dans
l'utérus par de longs
canaux.
Sur
la face
dorsale de l'utérus débouchent aussi
les
deux
canaux
des
spermathèques
qui
stockent les spermatozoldes
nécessaires à
toute la vie sexuelle de la femelle.
Lors de dissection, il est
important de bien mettre en position supérieure les canaux des
spermathèques.
Cette position permet en effet de bien orienter
les
ovaires qui se trouvent alors à droite pour l'ovaire
droit
et à gauche pour l'ovaire gauche.
4
Ageing t s e t s e
ovaries
,
0
1
2
3
4
5
6
7
a
b
C
t
&Se
N.B.
F-Lies
category
FL.5
Les
ovarioles dans les ovaires ont été denommées A et B pour
l'ovaire
droit et C et D pour l'ovaire gauche.
A et C sont du
côté interne alors que B et D sont externes.
Selon un cycle de
10 jours à partir du 10ème jour de vie des oeufs sont
libérés
alternativement des ovarioles.
La première "ponte
ovulaire"
part de l'ovariole A ensuite l'ovariole C puis l'ovariole B et
enfin l'ovarioleg(voir figures jointes).
Apres
la ponte ovulaire,
l'ovariole restera avec une relique
folliculaire,
ce sont les reliques folliculaires qui permettront
de déterminer l'âge de la glossine.
Cette
méthode peut être d'une grande précision lorsqu'elle
est
bien maitrisée pour les quatre premières catégories d'âge
puis
elle
est
moins précise pour les catégories
suivantes.
Cette
lacune peut cependant être minimisée si
l'on
considère la
faible probabilité pour les mouches sauvages de survivre au déla
du stade 4.
La technique
consiste à
faire deux petites
incisions
tranversales au
tiers postérieur de
l'abdomen de la
glossine et
à l'aide de deux pinces tirer les
deux bouts de
façon opposée.
Déposer le bout postérieur contenant l'appareil
génital sur
une lame sur laquelle on aura préalablement
déposé
une goutte
de sérum physiologique,
le tout sous une loupe
binoculaire.
Isoler l'appareil génital en dilacérant la graisse
bien orienter les ovaires, extérioriser les ovarioles et observer
la présence ou l'absence de reliques folliculaires.
Se referer
au tableau de la page suivante pour donner l'âge.
5
I
11-2-4
Analyse du contenu en ptéridine des yeux.
Cette
méthode
développée recemment ici au TRL est basée sur la
simple constatation que plus les mouches vieillissaient plus leur
tête contenait de la ptéridine.
Ce contenu est donc extrait et
sa fluorescence lue et transmise à un ordinateur qui donnera un
âge précis à chaque taux de fluorescence.
11-2-4-l
Réactifs utilises
Disposer d'un mélange contenant
( 2 parts de méthanol
a =
( 1 part de chloroforme
Préparer le tampon
b =
0,l M NaoH/glycine
pH 10
11-2-4-2
Technique
Les
tètes
sèches
de glossines (tenues le plus possible à
l'abri de la lumière) sont écrasées individuellement dans des
tubes de verre contenant 1 ml de (a) en utilisant un petit
pilon
(en
verre) que l'on prendra soin de nettoyer soigneusement avant
de passer au tube suivant.
Ajouter ensuite 1,5 ml de
(b) et
bien mélanger en utilisant un mélangeur Vortex.
Centrifuger le
mélange à 3000 tours/mn pendant 5 mn.
Recueillir le surnageant
dans
des
tubes différents propres.
Lire la
fluorescence du
contenu de ces
tubes aux longueurs d'ondes 360 mn et
540 mn.
Selon
le taux de fluorescence
l'ordinateur
donnera
l"âge
correspondant.
6
La méthode
est hautement sensible et donne un
âge
individuel
aussi bien des femelles que des mâles.
L'équipement requis est
toutefois
sophistiquée
mais il
faut dire que
tous
les
échantillons qui seront envoyés ici feront l'objet d'une
analyse
tout à fait gratuite.
III-3
Identification de substances odorantes attractives
pour
les glossines - E. Bursell
Ici
encore
il s'agit d'explications précises du
professeur E.
Bursell sans que nous n'ayons eu a prendra part a l'application
du protocole.
Cette nouvelle voie de recherche a été entreprise
à
la suite de nombreuses observations faites sur le terrain au
Zimbabwé par G.
Vale sur le comportement des
glossines.
En
effet
il a été constatée que l'odeur de l'hôte jouait un
rôle
dans le processus d'attraction des glossines.
Mais quelle était
la substance précise responsable de cette attraction?
Pour
répondre à
cette question de nombreuses sources
d'odeur
font
Lobjet d'étude en vue de leur séparation par électroantennographie
(EAG) dans
le laboratoire de recherches tropicales de Londres.
Les substances sont ainsi au fur et à mesure identifiées
grâce
aux pics
sur
la courbe de 1'EAG puis isolées et envoyées à
Bristol où l'expérience sur les mouches est effectuée.
Cette
nouvelle
voie permettra une fois maitrisée de rendre
les
pièges
encore
plus
efficaces en
multipliant
le nombre de
captures
et cela sur des rayons beaucoup plus
importants.
En
clair
elle
permettra de retire le nombre de pièges à placer
7
dans une
zone déterminée mais en même
temps d'amplifier
les
captures.
III
PROTOZOOLOGIE
III-1
Définitions
Au laboratoire,
on sera souvent amené à manipuler
différents
types de populations de trypanosomes qu'il est très important de
différencer
dans le
but
de plus en
plus
requis de
standardisation.
- Isolement primaire:
Ce sont des organismes viables retrouvés
dans
le milieu de culture suite à la mise en culture d'un
échantillon provenant de l'hôte.
- Stock:
Trypanosomes dérivant de l'isolement primaire
après
plusieurs passages sans implication d'homogéniété.
- Lignée:
Dérivatif d'un stock de laboratoirelmaintenue dans
des conditions différentes ou des endroits différents.
- Stabilat:
Echantillons d'organismes
vivants
mais ne se
multipliant pas généralement et maintenue par froid.
- Clone:
Population
de trypanosomes provenant d'un seul et
unique individu.
III-2
Cryoconservation des trypanosomes - P. Dukes
Pour cela il faudra utilisér des animaux à parasitémie montante.
C'est à dire lorsqu'on atteint à peu près une parasitémie de 10'
trypanosomes/ml.
- Le
sang pourra provenir d'un hôte naturel ou de la saignée
d'un hôte de laboratoire.
- Ajouter un
volume
égal de PSG
(phosphate buffered saline
glucose) frais hépariné:
10 UI d'héparine/ml pour le sang de rat
et souris ou 50 UI/ml pour du sang récolté sur le terrain.
- Ajouter la glycérine a raison de 7,5% du volume final.
- A la température
du laboratoire remplir et
sceller des
ampoules ou des tubes capillaires.
- Réfrigerer
lentement l'C/mn toute la nuit avant de
transferer
dans l'azote liquide.
III-3
Culture de trypanosomes - P. Dukes
La culture de trypanosomes des animaux et des humains s'est faite
pendant très
longtemps in vivo en utilisant d'autres
animaux,
soit
rongeurs
de laboratoire
soit grands mammifères voire
parfois
l'utilisation de volontaires humains.
Cette
méthode
comporte un
certain
nombre de désavantages (coûts
élevés de
l'entretien des animaux,
opposition de plus en plus
ardue à
travers le monde des sociétés de protection des animaux) d'où la
nécessité
aujourd'hui de développer les méthodes dites
in vitro
qui permettent
de cultiver les trypanosomes
sur des
tissus
biologiques.
111-3-l
Cultures in vivo
Différents
types d'animaux sont employés,
les plus communs étant
cependant les rongeurs de laboratoire.
- Souris:
Lorsqu'elles
pèsent entre
20 et
25 g
elles
reçevront
0,2 à
0,5 ml en
injection
intraperitoneale, la
période
prépatente
est
très
variable.
Surveiller la
parasitémie
à partir du troisième jour en faisant des
frottis
9
fixés et
colorés ou utiliser les autres techniques,
examen de
l'interphase,
examen
direct d'une goutte de sang entre lame et
lamelle,
utilisation des mini-colonnes.
Pour faire apparaître
la
parasitémie
plus
rapidement on
peut
induire
une
immunosuppression
soit
chimique
par
utilisation de la
cyclophosphamide
300 mg/Kg maximum soit physique par irradiation
aux rayons X - 600 rads maximum.
- Rats:
Utiliser
0,2 à 0,s ml en
intrapéritonéal
pour
T. congolense
et T. gambiense l'immunosuppression
sera
induite
par utilisation de la cyclophosphamide à raison de 100 mg/Kg.
- Mastomys natalensis
est utilisé pour cultiver T. gambiense à
l'âge de 25 à
35 j à
la dose de
0,2 à 0,s ml en
intrapéritonéale.
- Lapins:
Par injection sous-cutanée ou intratesticulaire.
- Grands animaux
Porcs:
pour différencier T. simia_e et T. congolense
Singes et primates
Petits
ruminants
surtout pour cultiver T. vivax
qui
sauf
quelques
rares
cas
ne developpe aucune
parasitémie chez
les
rongeurs.
111-3-2
Culture in vitro
Cette technique permet en outre de cultiver des formes
sanguines
de trypanosomes telles que l'on les trouve dans l'hôte vertébré
et
des
formes
de développement
(trypomastigotes) présentes
seulement chez le vecteur (Glossine).
10
111-3-2-I
Récolte des trypanosomes
Lorsque la culture concerne des formes sanguines, la récolte peut
se faire directement sur l'hôte vertébré, ou encore à partir de
rongeurs
de laboratoire infectés par le vecteur.
Dans le
cas
où
on veut cultiver des formes de développement la
récolte se
fera
à partir du vecteur deux méthodes de récolte peuvent être
utilisée.
a)
Faire
saliver la mouche dans une goutte de
sérum
physiologique
placée
sur
une
lame portée par une
plaque
chauffante.
b)
Dissection de la mouche
- Proboscis pour rechercher T. vivax
- Proboscis et intestin moyen pour T. congolense
-
- Intestin moyen et glandes salivaires pour T. brucei
III-3-2-2
Tissus utilisés
- Embryon de mountain vole (Americain) ou Microtus
- Cellules de l'endothelium de l'aorte de bovin surtout pour les
cultures
de T. congolense qui possède un très
fort
vaisseau
tropisme
- Cellules du plexus choroide surtout pour T. brucei
- Fibroblaste de bovin
Ces
tissus seront selon le besoin cultivés d'abord à
37'C dans
une atmosphère à 5% de COU pendant 3 à 5 jours.
111-3-2-3 Milieux de culture
y
a)
Milieux TRL
Ce sont des milieux crées et utilisés ici par le laboratoire
11
.
- EBLB (Evans blood lysate broth)
- Cunningham's (forme de développement)
- SDM 79
b) Milieu disponible dans le commerce
- MEM
(minimum essential medium)
Ce milieu contient en outre:
glutamine, glucose, proline,
amino acides HEPES et antibiotiques,
généralement penicilline (100 UK/ml),
gentamycine (20-200 Ug/ml)
mais pas de streptomycine.
Ce milieu sert à la
culture de
forme sanguine.
111-3-2-4 Sérums utilises
Il est nécessaire d'ajouter du sérum au milieu pour l'enricher
- sérum de bovin (fibroblaste de bovin)
- sérums équin, de chèvre, de mouton, humain (Microtus)
- sérums équin et bovin (cellules de l'endothélium bovin)
A noter que les sérums de foetus de veau et équin sont en
outre
disponibles dans le commerce.
III-4
Test de chimiorésistance - J. J. McNamara
111-4-l
Introduction
Pour lutter contre les trypanosomiases animales africaines (TAA),
le thérapeute dispose actuellement d'une gamme très réduite de
trypanocides.
Ce sont essentiellement le trypamidium (Samorin)
dans
un but préventif et le B&éni1 à titre curatif.
A cause
de cette marge de manoeuvre réduite toute mauvaise utilisation de
ces drogues (sous-dosage, fraude) constitue une grave menace dans
la lutte
contre le nagana car
induisant
la chimiorésistance.
12
Cette
technique permet
en outre de tester
la sensibilité de
souches de trypanosomes à des trypanocides.
111-4-2 Technique
- Récolter
et purifier
les trypanosomes en
les passant à
travers une colonne de DEAE-cellulose.
- Introduire
ces trypanosomes dans un milieu de culture preparé
d'avance et y ajouter de l'adénosine
radioactive
à
la
concentration de 4 ul/ml de suspension de trypanosomes.
- Incuber à 37'C et dans une atmosphère à 5% de CO, pendant 30
mn à 1 heure.
- Distribuer
ensuite
la suspension en quantité égale
dans 6
rangées de puits d'une plaque à microtitration.
- Laver les
rangées de puits à des temps différents
avec de
l'eau distillée qui lyse en même temps les trypanosomes.
- L'appareil utilise ici est le "Ce11 Harvester 550" de Titertek
qui imprime sur un papier buvard des confettis de la solution de
trypanosomes lysés.
- Faire sécher le papier buvard.
- Le
lendemain
découper
les
confettis et
les
placer
individuellement dans des tubes.
- Introduire dans chaque tube 3 ml du liquide scintillant
éconofluor
qui
permet
la lecture de
la radioactivité
Par
l'appareil conEu à cet effet.
Cette
technique permettra en outre de juger de l'efficacité d'un
trypanocide avec des tests in vitro en mesurant la
concentration
d'adénosine radioactive en fonction du temps d'incubation.
13
IV
CONCLUSIONS
La
plupart
des
techniques
étudiées
jusqu'à présent
ici
nécessitent à vrai dire l'utilisation d'un matériel
sophistiqué
non
encore disponible dans les laboratoireSnationaux en Afrique.
Certaines de ces techniques, comme la détermination de l'âge des
glossines grâce au
contenu en ptéridine
de la tête,
font
intervenir un équipement très onéreux.
Par contre la
culture
de trypanosomes
in vitro à condition toutefois de
pouvoir se
ravitailler
en milieux de culture disponibles dans le
commerce,
peut
très bien se conduire dans les laboratoires moyennement
équipée.
Le test de chimiorésistance fait aussi intervenir un
matériel difficile
à trouver entièrement au sein d'un même
laboratoire
mais à notre avis,
certaines parties du
protocole
peuvent
très bien s'exécuter à l'aide d'un
matériel
beaucoup
plus
simple le reste de l'équipement pouvant être trouvé en
collaboration avec d'autres institutions au sein d'un même pays.
La
formation
reste
cependant bénéfique
car
elle
permettra
sûrement
de démarrer de nouveaux protocoles adaptés
toutefois
aux conditions locales de travail.
14
TSETSE RESEARCH LABORATORY
UNIVERSITY OF BRISTOL
LANGFORD HOUSE
LANGFORD
BRISTOL BS18 7DU
U K
RAPPORT FINAL DE STAGE
P A R
DOCTEUR AMADOU DIAITE
Le 15 juillet 1986
CONTENU
1
Introdu ction
II
Différenciation de souches de Trypanosomes par
utilisation
de la technique des isoenzymes.
D. G.
Godfrey, S. M.
Lanham, W. Gibson.
II.1
Definition
II.2
Structure des enzymes
II.3
Préparation du matériel (Trypanosomes) à
utiliser
11.3.1
Purification
11.3.2
Préparation de l'extrait aqueux de
trypanosomes
II.4
Technique utilisant l'étalement de gel en couche
fine
11.4.1
Introduction
II.4.2
Technique
11.4.3
Exemple pour quelques enzymes de tampon
et de temps d'electrophorèse et de voltage
utilisés
II.5
Technique
utilisant
les plaques
d'acetate d e
cellulose
11.5.1
Introduction
11.5.2
Technique
III. Protocole de travail personnellement executé.
P. Dukes.
III.1
Introduction
III.2
Souches utilisées
111.2.1
Formes sanguines
111.2.2
Formes procycliques
IV.
Conclusions générales
1.
Introduction
Le premier rapport trimestriel avait permis de voir les techniques avec
lesquelles le stagiaire s'est familiarisé. Ce présent rapport a trait au
.
deuxième aspect de la formation et tire les conclusions générales qu'elle
inspire.
Cette deuxième partie a donc trait essentiellement à la différenciation de
souches de trypanosomes grâce à la technique des isoenzymes par la comparai-
son des zymogrammes de différentes souches pour différents enzymes.
Les trypanosomes du groupe des Salivaria sont divisés en quatre sous-genres :
Sous genre Duttonella avec T. vivax et T. uniforme
II
Nannomonas avec T. congolense et T. simiae
II
Trypanozoon avec T.b. brucei, T.b. gambiense, T.b. rhodhesiense
-
principalement
SkJS GENRE PYCNOMONAS AVEC T. suis.
-
Le problème qui se pose depuis longtemps est celui de la différenciation entre
les espèces appartenant au même sous-genre car elles sont morphologiquement
identiques. En outre, le sous-genre Trypanozoon comporte des espèces pathogènes
soit aux animaux, soit à l'homme (maladie du sommeil) et qu'il est impossible
de différencier morphologiquement. Les espoirs suscités par la technique BIIT
(blood incubation infectivity test) se sont vite anéantis lorsque des souches
considérées comme strictement pathogènes aux animaux par le test, ont accidentelle-
ment infecté des humains. Toutes ces difficultés ont poussé les chercheurs à
s'orienter vers l'échelle moléculaire pour une caractérisation plus adéquate
des différences (isoenzymes, structure de 1'ADN).
II.
Différenciation des souches de trypanosomes par utilisation de la
technique des isoenzymes : D.G. Godfrey, S.M. Lanham, W. Gibson
II.2
Définition
Les enzymes sont de très puissants et spécifiques catalyseurs qui accélèrent
les réactions chimiques dans les systèmes biologiques. Ce sont des protéines
avec des structures très précises en rapport avec la très forte spécificité
de leur action comme toutes les protéines, cette structure est codée dans
1'ADN (acide désoxyribonucléique) du génome par un ou plusieurs gènes spécifi-
ques. La classification des enzymes est essentiellement basée sur leur fonc-
tion par exemple sur le substrat particulier sur lequel ils agissent et le
type de réactions qu'ils catalysent. Une fois, la base génétique de la
synthèse des protéines élucidées, il apparut que les formes multiples d'enzymes
ou isoenzymes pourraient être divisées en deux grandes catégories selon leur
origine.
.
Différences de structure pour des raisons génétiques:
Différence de
structure provenant de
modifications
post
translationnelles
de
sous
unités-homogènes
produites
initiallement par un seul gène.
II.2
Structure des enzymes
Tous les enzymes sont donc des protéines (protéines globulaires).
A partir de la forme structurelle de base:
polypeptide qui est
une chaine condensée d'acides aminés,
on définit les
structures
primaire,
secondaire,
tertiaire des
enzymes.
La
structure
primaire est la séquence des acides
aminés
dans
la chaine
polypeptidique;
chaque
acide
est formé par une
triplette de
bases
azotées appellées Codons et provenant de la combinaison de
quatre bases:
Adénine (A), Thymine (T), Guanine (G) et Cytosine
(C).
Lorsque la synthèse d'un polypeptide particulier est
requise,
l'information est transcrite du gène à 1'ARN messager
(acide
ribonucléique) qui la transporte du noyau
aux
ribosomes
sites
de la
synth*ese des polypeptides.
Les
structures
secondaires, tertiaires et quaternaires découlent de la structure
primaire lineaire grace à des liaisons variées et sont nettement
plus compliquées.
Certaines
protéines globulaires sont consituées par une
seule
unité
de polypeptides elles sont dites monomériques,
d'autres
contiennent
plusieurs
sous-unités et sont dites
oligomériques.
Le
nombre
de sous-unités détermine les
appellations de
dimériques, trimériques tetramériques, etc.
II.3 Préparation du matériel (Trypanosomes) à utiliser
11.3.1
Purification
Les trypanosomes peuvent etre obtenus soit à partir d'animaux
parasites soit à partir de culture in vitro.
-
-
-
Lorsque les trypanosomes proviennent d'animaux,
il faut d'abord
les
séparer des cellules sanguines en les passant à travers une
colonne
de DEA lavé auparavant cinq fois avec du PSDG Ph8.
Une grande attention sera accordée aux proportions de
phosphate
et de sucre (glucose) à mélanger selon le type d'animal à
partir duquel le sang provient.
Lorsque la majorité des trypanosomes est
collectée,
centrifuger
l'eluat
à 2500 tours/mn pendant 20mn à 4 C,
ensuite verser le
surnageant
et resuspendre le culot avec du PSG et
recentrifuger
à la meme vitesse et pendant le même temps.
Faire ce
lavage
à
cinq reprises pour éviter l'interférence d'enzymes
étrangers
(enzymes provenant de l'hôte).
11.3.2
Préparation d'extrait aqueux de trypanosomes.
4
.
Il faut pour lyser les trypanosomes une fois lavés,
préparer la
solution suivante:
a)
0.0308g dithiothreirol (DTT)
b)
0.0262g 2 acide aminocaprioque (AAC)
Ajouter
à a) 1 ml d'un solution 200mM EDTA (7,445g
dans
100ml
d'eau et ajuster le pH à 7 avec 1N NaOH.
Ensuite dissoudre b)
avec la première solution obtenue.
La solution finale obtenue
est le cocktail stabilisateur 100 fois concentré,
elle peut se
garder
au réfrigérateur pendant à peu près une
semaine.
Au
moment de l'emploi, diluer la solution ci-dessus au I/l00 avec de
l'eau distillée et ajouter un volume égal à celui
de la
suspension de trypanosomes.
Mélanger et garder îOmn dans la
glace
avant
de congeler pendant à peu près 24
heures.
Ensuite,
décongeler
(pour achever la lyse) et centrifuger à
10,000 tours pendant 30 mn et à 4 C.
Du surnageant, contenant
les enzymes en solution,
on formera des billes en faisant tomber
des gouttelettes de 15~1 dans l'azote liquide.
Ces billes sont
ensuite
gardées dans
l'azote
liquide jusqu'au
jour de leur
utilisation.
Cette
cryoconservation sera accompagnée par
des
informations précises consignées dans un registre exemple:
numéro de l'isolement
période d'infection de l'hote
type d'animal utilisé
date de séparation sur colonne
tampon utilisé et nombre de lavages effectués
volume initial de trypanosomes
temps et vitesse de centrifugation
code approprié de l'extrait
le numéro du lysat
exacte position dans l'azote liquide
Deux
méthodes sont utilisées pour l'étude du
isoenzymes.
Ce
sont:
l'étalement du gel en couche fine
des plaques d'acétate de cellulose
En générale,
pour
chaque souche l'étude du
zymogramme de 12
enzymes est nécessaire.
II.4
Technique utilisant l'étalement du gel en couche fine.
11.4.1
Introduction
Cette
technique introduite en premier par Smithies en 1955
aida
à démonstrer
la multiplicité de formes enzymatiques
dans
les
extraits
de tissue par la coloration de gels d'électrophorèse.
Elle consiste à
faire
déplacer des enzymes dans du gel à
travers léquel on fait passer un courant électrique.
Le gel est
en général de la farine de pomme de terre que l'on fait dissoudre
dans un
flacon
contenant le
tampon
approprié pour
l'enzyme
5
étudié.
11.4.2
Technique
Placer le flacon
au dessus d'une flamme de bec bunsen agiter
jusqu'à ce que le gel passe de la phase assez solide à la phase
plus fluide.
Boucher de l'ouverture supérieure du
flacon et
relier
l'ouverture latérale à une pompe à vide.
Le gel
est
prèt lorsque de grosses bulles blanches apparaissent.
Verser
rapidement
le gel sur une plaque et l'étaler aussitôt laisser
ensuite
solidifier dans l'obscurité.
A l'une des extrémités
(sens de la longueur) de la plaque,
on creusera
des
cuvettes
régulières et
alignées;
c'est dans ces cuvettes que l'on
placera
les
fils de coton prrealablement
imbibés
dans la
suspension d'enzyme provenant des billes.
Une plaque
permet
l'étude de huit souches de trypanosomes pour le même enzyme.
Les
plaques
sont
placées
ensuite
dans
des
chambres
d'électrophorèse
constamment refroidies par un générateur
pour
éviter la détérioration des enzymes (en général 8 C).
Le tampon
utilisé dans les chambres d'électrophorèse est le même que celui
utilisé pour suspendre le gel mais non dilué.
11.4.3
Exemples pour quelques enzymes de tampon,
de temps
d'électrophorèse et de voltage utilisés
(voir Tableau).
II.5
Technique utilisant les plaques d'acgtate de cellulose
11.5.1
Introduction
La
technique
permet
d'abouter
aux
memes
résultats
que
l'électrophorèse
sur gel mais la réalisation est beaucoup
plus
simple
et le temps d'électrophorèse plus court.
Les plaques
sont déja prètes et disponibles dans le
commerce.
Celles
utilisées
ici
sont fabriquées par les laboratoires
Helena de
Beaumont au Texas.
11.5.2
Technique
Les
plaques
sont d'abord imprégnées dans
la solution tampon
appripriée pour l'enzyme étudié.
Puis un tampon à huit pointes
imbibé dans
la solution d'enzyme est
appliqué
fermement à
quelques 2 cm de l'un des bouts (sens de la
longueur).
Placer
la plaque dans la chambre d'électrophorèse en s'assurant que les
échantillons se
trouvent du coté de
la cathode,
établir le
courant
électrique
régler le voltage et chronométrer
(ici les
temps d'électrophorèse sont beaucoup moins longs:
20 à 40 mn).
Il
est
nécessaire,
à cause de ce temps court de préparer le
developpeur
approprié suivant l'enzyme étudié avant de commencer
l'électrophorèse.
Ce developpeur est soit du gel,
soit du
papier
de couverture.
Après
l'électrophorèse,
couper le
courant passer
le developpeur sur la plaque et chronométrer.
Lorsque le developpement est optimum (10 mn) arreter et faire si
nécessaire des photographies.
La technique est simple et dure un
6
temps beaucoup
moins long avec des résultsts aussi fiables
dans le cas du gel en couche fine.
que
III.
Protocole de travail personnellement exécuté, P. Dukes.
-
III.1
Introduction
Ce protocole avait pour but la comparaisons de quatre souches de
trypanosomes (toutes
T.congolense) entre elles et ensuite
pour
chaque souche la comparaison des zymogrammes des formes sanguines
et formes procycliques.
III.2
Souches utilisées
Au départ
six
souches ont été
utilisées pour accroitre les
chances au niveau des cultures surtout in vitro:
- SI04
isolée
à partir d'une glossine disponible en
forme sanguine
- IVG45
isolée d'une vache à Baringo dans la province de
la Rift Valley au Kenya, disponible en forme
sanguine
- 1148
isolée à partir d'une glossine disponible en
forme sanguine
- 1564
provenant de 1'EATRO
- TREU 1457
formes sanguines
- TREU 1627
formes sanguines
Les
deux
dernières
souches
provenant de
l'Université
d'Edinburgh.
111.2.1
Formes sanguines
Pour obtenir les formes sanguines,
les souches sont inoculées à
des
rats dont la parasitémie est surveillée quotidiennement.
Lorsque
le pic 8,4 à 9 (puissance logarithmique)
est
atteint,
les rats sont sacrifiés,
le sang passé à travers une colonne de
DE 52.
Les trypanosomes recueillis dans l'eluat sont lavés 3
fois
par centrifugation resuspension du culot dans du PSG
(voir
11.3.2).
Certaines souches ont pu etre obtenues en billes mais
d'autres ont cultivé
très lentement et n'ont pu
aboutir
aux
billes.
111.2.2
Formes procycliques
Pour
obtenir les
formes procycliques,
des mouches ont été
nourries
de facon artificielle avec du sang virulent.
Après
deux à troi&%% mouches ont été affamées puis dissequées.
Un
morceau de l'intestin moyen a été isolé à chaque fois et
plongé
dans
un puits d'une
plaque de microtitration (de
96 puits)
contenant du milieu Cunningham's.
7
S104 six mouches positives sur les disséquées
1148 sept "
II
II
II
II
nG45 neuf "
II
II
II
II
Ces plaques ont été mises à incuber à 25°C pendant 3 jours avant d'être
transférées dabs ybe plaque à puits plus larges (5 points) et enfin dans
des flacons de 15 ml puis 25 ml. C'est à ce niveau qu'une mortalité énorme
a été observée rendant toute poursuite inutile car il aurait fallu alors
recommencer le processus depuis l'infection des mouches, ce qui était prati-
quement impossible avec le temps qu'il restait au stagiaire.
IV.
Cpnclusions générales
Même si le protocole personnel de recherche du stagiaire n'a pas abouti,
faute de temps, il a eu l'occasion de se familiariser longuement avec les
deux techniques d'électrophorèse pour l'étude des isoenzymes.
Cette tee hnique permettra d'élucider beaucoup de problèmes sur le terrain
en Afrique surtout pour le sous-genre Trypaozoon où il se pose surtout un
problème de santé publique. Il s'agira en ef'fet par la technique d'élucidler
l'existen ice de réservoir animal pour la maladie du sommeil à T.gambien se.
-
Il faudra aussi mener ces études dans les sous-genres Nannomas entre
T. Congo1 ense e t T. simiae (étude pa rtiellement faite) et dans le sous
genre Dut:tonell a où les études sont encore très timides entre T. vivax
et T. uni forme -(C.A. Hoare donne d'i ntéressantes références de biométr'ie)
et entre les so uches de T. vivax adaptées à des cultures in vitro sur
rongeurs et les souches non adaptées
Une telle étude a été envisagée avec le Dr D.G. Godfrey (superviseur de
l'étudiant à &ngford) si une source de financement était trouvée. Il
s'agira de la comparaison de modèles isoenzymatiques de soueches prove-
nant du nord du pays (voire de la Mauritanie) du centre et du sud ainsi
qu'une souche de 1'ILRAD adaptée aux rongeurs.
La technique de culture in vitro permettra de disposer d'un matériel de
travail abondant et indispensable à la réussite d'expérience de laboratoire.
8
C
TABLEAU
c
___--------------~--~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~-----------~-~~~~~~~~~~
VOLTAGE
TEMPS
ENZYMES
TAMPON DU GEL
D'ELECTRO-
PHORESE
___---_-----------------~~~~~~~--~-----~~---------~~-~~~~~~~~~~~~~
ALAT
0,18 M Tris )
Alanine amino-
,y; ~uK~y;$ pH gf 3
transférase
__-__-_-------_------------------------~-----~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~
PEP 1
0,8 M Tris )
300 v
Peptidase 1
0,02 M KH$O$ pH 9,3
3 heures
diluer au I/l0
________________--------------------------------------------------
PEP II
même tampon même dilution
300 v
Peptidase II
(différence dans les developpeurs) 3 heures
P G M
0,l M Tris
1
300 v
Phospho-
0,l M acide maléique) pH 7
3 heures
glucomutase
0,Ol M EDTA
) dilution
0,Ol M Mg acetate
l/lO
ASAT
0,15 M Glycine NaOH
PH 9,s
Aspartate amino- diluer au l/lO
transférase
__---_-_-_-----------------------------~-------------------------
GPI
0,038 M NarHLPOq)
300 v
Glucose
0,162 M Na&H P04) pH '7
3 heures
phosphate
diluer au I/l0
isomérase
__-------__-----------~~~~-~~~---------~--~------~-~~~~~~~~~~~~~~
M E
0,019 M NaH&PO,+)
Malic enzyme
0,081 M Na HPO4)
PH 7,4
diluer au 11 /lO
ICD
0,5 M NaLHPOLI
1
300 v
Isocytrate
0,007 M acide citrique)
P H 7
3 heures
deshydrogénase diluer au 1/5
---------------------------------------~-------------------------
M D H
O,O5 M
1
300 v
Malate
0,007 M NatHPOQ acidecitrique)
P H 7
3 heures
deshydrogénase diluer au 1/5
---------------------------------------~-------------------------
MPI
0,l M Tris )
250 V
Mannose
0,l M NaH&PO,,) pH 7,4
2à3
phosphate
diluer au l/lO
heures
isomérase
_________-______----____________________-------------------------
9