VÉTÉRINAIRE DES PAYS REVUE 1 MÉDECINE VÉ ...
VÉTÉRINAIRE DES PAYS
REVUE
1 MÉDECINE VÉ
DES PAYS TR
Utilisation d’une montmor
la terre de Bezenet, dans le d o
de la créatinine sangu
des ruminants domestique
par Cl. LABOUCHE
Tome XVI (nouvelle série)
No 1 - 1963
-~ VIGOT FRÈRES, ÉDITEUR
23, rue de l’École-de-Médecine,
ARIS-VI”
i
Utilisation d’une montm brillonite,
la terre de Bezenet, dans le Iosage sélectif
de la créatinine sari pine
des ruminants dome tiques
par C l . LABOUCHE
Au cours d’une étude de la filtration glomé-
Traversant If
Arrêté par
p. 100 du poids
rulaire rénale chez des ruminants domestiques,
tamis
le tamis
total de l’argile
nous avons dosé la créatinine du sérum sanguin
No
No
tamisée
selon JAFFE. Par cette méthode, une molécule
-
-
-
de créatinine sanguine s’unit à une molécule
4 5
0,06
d’acide picrique ainsi qu’à un nombre variable
4 5
6 0
L7
de molécules de soude et d’eau pour donner
6 0
8 0
46,8
des composés de couleur rouge.
8 0
100
30,4
La réaction n’est pas spécifique. L’acétone,
100
190
16,9
-
l’acide acétylacétique, le méthylglyoxal, l’acide
190
32
glycuronique, l’acide ascorbique, certains glu-
L a Jagolii
! est colorée en bleu par la
cides et divers protides peuvent la fournir. Des
benzidine er solution acétique, en vert clair
techniques de destruction de ces chromogènes
par I’aniline
en brun rouge par la paraphény-
ont été proposées, mais le plus souvent on pré-
Iènediamine.
a réaction est acide en présence
fère extraire la créatinine en I’adsorbant sur une
d’une solutio
Iqueuse d’hélianthine.
substance appropriée (réactif de LLOYD, ben-
Avant de I .iliser pour le dosage de la créa-
tonites commerciales) (1) (2). La créatinine éluée
tinine, nous ( 3ns envisagé les points suivants :
subit alors la coloration, à l’abri des interven-
- pouvoit
Idsorbant et influence de la gra-
tions parasites.
nulation
Les agents adsorbants classiques nous faisant
- action
r les spectres d’absorption lumi-
défaut, nous avons pensé qu’une argile mont-
neuse
morillonite, la terre de BEZENET (Allier) ou
- action 5 . la couleur des solutions alcalines
Jagolithe, dont MEUNIER avait autrefois proposé
d’acide picric
e
l’utilisation pour classer les huiles de poisson
- vérifica In de la loi de BEER-LAMBERT
suivant leur richesse en vitamine A (3) pourrait
- essais (
récupération des surcharges de
peut-être les remplacer.
créatinine
Cette terre, de couleur grise, est formée de
- sélectiv
de I’adsorption
grains de taille variable ainsi que le montre
l’essai de tamisage résumé ci-dessous.
1. -
Jde du pouvoir adsorbanf
de la Jagolithe
Rev. Elév. Méd. vét. Pays trop., 1963, no 1
On évalue
pouvoir adsorbant de l’argile en
Reçu pour publication : juillet 1962.
mesurant la )Ius petite quantité capable de
4 1
.
fixer un poids donné de créatinine en présence
lorsque I’adsorption est complète, la densité
d’acide sulfurique et de tungstate de sodium,
optique est supérieure à celle du témoin d’en-
agents déféquants habituellement préconisés dans
viron 10 p. 100.
le dosage de la créatinine sanguine. (1)
Dans des tubes à centrifuger coniques, on
b) Pouvoir odsorbant et granulation de lo lago-
place successivement :
lifhe.
Solution de créatinine (6 ou lOy/cm3). .
2 ml
Nous avons vérifié l’influence de la grosseur
Eau distillée.. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
3 ml
des grains d’argile sur le pouvoir adsorbant par
Na tungstate (solution à 10 p. 100) . . . .
1 ml
un protocole identique au précédent mais en
H, SO, (0,67 N). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
2 ml
utilisant des solutions à 10 Fg de créatinine au ml.
L’argile est passée à travers une série de tamis
Après homogénéisation du mélange, on ajoute
en bronze de numérotation : 60, 80, 100 et 190.
des quantités variables de terre de Bezenet. On
On a ainsi obtenu les fractions suivantes :
agite trois fois en dix minutes à l’aide d’une
A : traverse la maille 190
baguette de verre, puis on centrifuge à grande
vitesse pendant dix minutes. Le surnageant est
B. : traverse la maille 100 et est retenue par la
,
enlevé et les tubes sont retournés sur du papier
maille 190
filtre afin de réaliser un égouttage aussi parfait
C : traverse la maille 80 et est retenue par la
que possible du culot. Pendant ce temps on pré-
maille 100
pare un tube témoin contenant seulement deux
D : traverse la maille 60 et est retenue par la
centimètres cubes de la solution de créatinine
maille 80
et un « blanc » constitué par deux centimètres
E : est retenue par la maille 60
cubes d’eau distillée.
On ajoute ensuite à tous les tubes 7,5 cm3 de
Les pourcentages moyens de créatinine fixée
réactif picro-sodé ainsi que 2 cm3 d’eau distillée
en fonction du poids de l’argile et de la grosseur
à ceux contenant de l’argile afin de rétablir I’éga-
du grain de Jagolithe sont réunis dans le tableau
lité de volume avec le tube témoin et le blanc.
suivant.
Après agitation et dix minutes de contact, on
centrifuge pendant dix minutes. La densité
optique des surnageants est mesurée au spectro-
I Po:Lds dtargJIe en oentigrammea.
photomètre Beckman à 520 rnk et exprimée en
Raction
5
10
20
40
60
80
100
pourcentage de la densité optique du temoin.
A
86
95
101
56
a) Pouvoir odsorbant de la ]ogolithe non tamisée.
B
54
74
96
103
105
La solution de créatinine utilisée contenait
C
34
50
71
97,5 108
6y/cm3
D
40
51
80
85
85
60
Densité optique
E
55
85
81
86
74
Quantité
du surnageant
d’argile
(p. 100 de la densité
On remarquera :
(9)
optique du témoin)
-
-
10 Que la quantité d’argile nécessaire pour
0
100
adsorber 20 pg de créatinine est de 20 cg pour A,
QI
7 5
de 20 à 40 cg pour B, de 40 à 60 cg pour C.
0,2
1 1 1
20 Que les fractions les plus grossières (D et E)
0,4
109
Ile semblent pas permettre une fixation complète.
L’adsorption est complète à partir de 0,2 g.
30 Qu’un excès d’argile se traduit par une
L’activité est donc inférieure à celle du réactif
diminution du pourcentage de rétention (A, D,E,).
de Lloyd ou à celle des bentonites pour lesquels la
40 Que lorsque la récupération de lacréatinine
quantité maximale fixée est de 1 p. 100 du poids
:st complète, elle est légèrement supérieure à
de I’adsorbant. On remarquera également que
100 p 100.
42
Nous avons alors essayé de confirmer (20) et
3. - nfluence de la Jagolithe
(30) de la manière suivante : Le surnageant de la
sur la col ration de la solution alcaline
première centrifugation est recueilli et on y
d’acide picrique
ajoute 20 cg de la fraction A, quantité que nous
venons de vérifier comme suffisante pour adsor-
Au cours d
l’élution de la créatinine et du
ber la créatinine qui n’aurait pas été retenue.
développemer
de la coloration, un excédent
On opère ensuite comme précédemment. En
de réactif pic l-sodé reste inemployé. On peut
aucun cas, nous n’avons pu mettre en évidence
se demander
par conséquent, si sa couleur
la présence de créatinine dans les surnageants
propre ne pal ,t-ait pas être modifiée par contact
‘lorsqu’on utilise 40 cg de A, 60, 80, 100 cg de D
avec l’argile.
ou de E.
Nous avons donc comparé l’absorption lumi-
L’adsorption est donc dans tous les cas com-
neuse du réa1 if avant et après contact avec la
plète, mais les capacités d’absorption lumineuse
Jagolithe (20 g de fraction A pour 7,5 cm3 de
ont été sans doute modifiées.
réactif) le réa tif étant séparé ensuite de l’argile
par centrifug tion. On note alors une légère
2. - Influence de la Jagolithe
intensification
de la couleur, la solution ne
sur les spectres d’absorption
laissant alors asser que 98 p. 100 de la lumière
des complexes créatinine-acide picrique
traversant le I iactif seul.
II sera donc nécessaire de traiter les blancs de
La coloration a été développée à partir d’une
la même mar ère que les échantillons à doser.
solution pure de créatinine sans utilisation de
l’argile (coloration témoin) et après action de
,quantités variables de Jagolithe (fractions A,
4 . - Vérifica on de la loi de BEER-LAMBERT
D, 5)
avec des solutions pures de créatinine
La densité optique est déterminée pour des
lumières de longueur d’onde comprise entre
La technic je suivante à été suivie. Des
450 et 560 rnp, Pour chaque spectre, on égale la
gammes de concentrations
croissantes sont
densité optique maximale à 100, les autres D. 0.
ainsi réalisée
étant alors exprimées en pour cent du maximum
d’absorption.
Les résultats obtenus sont consignés dans le
tableau figuré à la page suivante :
mlutinn de a
Les spectres correspondants sont représentés
à 10 @al,ml
dans les figures 1, 2, et 3.
!L%u distïllée,
ml
3
On remarquera que le maximum d’absorp-
tion lumineuse situé à 480 rnp pour le témoin se
Na tungstats 1 p.lOO*ml
1
déplace vers les grandes longueurs d’onde en
ml
2
présence de l’argile. On note ainsi, suivant les
cas, des maxima d’absorption à 495, 500, 505,
510 rnp tandis que l’absorption vers les courtes
Suivant les cas, on utilise les quantités sui-
longueurs d’onde diminue.
vantes d’argil
Ces déformations spectrales permettent d’ex-
Fraition
..................
20 cg
pliquer que les récupérations de créatinine
Fraction
. . . . . . . . . . . . . . . . . .
40 cg
puissent être supérieures à 100 p. 100.
Fraction
. . . . . . . . . . . . . . . . . .
40 cg
En conséquence nous pouvons déjà dire que
Fraction
’. . . . . . . . . . . . . . . . . . .
60 cg
lors d’un dosage éventuel de la créatinine
Fraction
. . . . . . . . . . . . . . . . . . .
60 cg
au moyen de Jagolithe, les solutions étalons
devront être traitées par les mêmes quantités
On vérifie
ue I’adsorption est complète pour
d’argile de même qualité que les échantillons
les concentra lns les plus élevées de créatinine,
soumis aux dosages.
par la méthoc
! exposée en (2, b)
43
A
Fraction A
Fraction
lbaction B
Fraction E
9
tblloin
20 o-g
40 cg
40 c3g
og
60 80
40 60
cg
cg
80 cg
1 0 0 c g
40 c g
8 0 c g
1 0 0 c&
q
450
60
66
46
-
-
-
-
56
51
6
460
82
94
72
-
-
65 56
11
64
52
2
465
84
-
-
- 68
-
68
58
11
66
56
-
470
93
95
78
63
71
60
10
71
56
4
475
98
S@
81
68
73 60
13
74
58
-
480
100
97
77
74
79 69
27
81
68
21
485
99
95
69
86
89
89
83
57
89
82
51
490
96,5
99
87
95 96 93
78
96
93
74
495
93,5
100
90
99 99
99 99
99,5
91
99
97
88
500
89,5
99
95
~~JI&l
%,5
100
-
100
96
505
w
98
99
97 97 99
100
98
99
100
510
78
95
100
93 94
93 94
95,5
98,5
94
96
99
515
71
88
96
- 98
- 98
90,s
93
88
89
94
520
61
80
90
76 78 80
84
78
80
88
525
52
-
-
- 68
-
68
70
73
-
-
-
530
43
61
< 72
56 57
56 57
59
61
57
58
66
535
34
-
-
-
-
47
49
51
-
-
-
540
26
40
51
37 37 38
41
38
38
46
545
19
-
-
-
-
30 31
33
-
-
-
550
t4,5
26
37
24 24 25
26
24
24
32
560
8
-
c
15 15 16
17
8
16
22
%
1 0 0
9 0
8 0
7 0
6 0
Fit
1. - Modification du spectre d’ab-
SO+ >n lumineuse du complexe acide picri-
5 0
que-l
éatinine sous l’influence de quantités
varic
Iles de Jagolithe A.
4 0
3 0
2 0
1 0
500
550
rnt.t
F i 2 . -TiModiftcation du spectre d’ab-
sorF
o n lumineuse du complexe acide picri-
que.
réatinine sous l’influence de quantités
vari bles de Jagolithe E.
%
1 0 0
9 0
80
7 0
6 0
F
3. - Modification du spectre d’ab-
sort ion lumineuse du complexe acide picri-
5 0
que-
-éatinine
sous l’influence de quantités
vari’
Iles de Jagolithe E.
4 0
3 0
20
1 0
450
5 0 0
550
rnp
.
Les densités optiques sont mesurées à diffé-
La précision est bonne à toutes les longueurs
rentes longueurs d’onde et la droite de régression
d’onde et la droite de régression passe très près
concentration = f (densité optique) est calculée
de l’origine des axes de coordonnées.
D
par la technique des moindres carrés. Les
Par contre la concordance est moins satis-
valeurs calculées sont alors comparées aux
faisante entre les valeurs calculées et les valeurs
concentrations réelles et l’erreur relative est
réelles pour les granulations plus fortes et
évaluée.
l’erreur augmente avec la grosseur des grains,
A titre indicatif, nous reproduisons ici les
ainsi que le montre le tableau ci-dessous obtenu
résultats obtenus avec la Jagolithe A (20 cg). 1 pour ;ne ), = 470 mp.
Qmntité de créatinine par tube à essai, enw
x
Equation de régression
10
20
30
~I)I. yg Cr6atinine =f. (D.O.) quantité Erreur quantité Erreur quantité Erreur
calculée relative calculée relative calculée relative
w
%
w
%
J=
%
470 Cr =-0,12 + 82,7 D.O.
10,05
0,5
19,97
0,15
30,02
0,06
480
Cr =A,09 + 71,7 D.O.
10,09
0,9
20,1~2
0,6
29@
0,4
490 Cr =-0,05 + 70,5 D.O.
JO,03
0,3
a,11
0,5
29,91
0,3
500 ci‘ =4,10 + 73,6 D.O.
10,05
0,25
20,21
1
29,85
0,45
510 Cr =-0,02 + 84,5 D.O.
9,95
0,5
20,17
0,85
29,9
0,33
Qwntité de créatinhe par tube à essai, @~JJG
10
2 0
30
Equation de régression
Ehction
~g (bhthim =f*(D.O-) qumtité tireur
quantité Erreur
quantité Erreur
calculée relative cslci.llée
relative calculée relative
PG
z
w
z
)Lg
z
A Or = A,12 + 82,7 D.O.
10,05
0,5
19,97
0,15
30,02
0,06
B Cr = +0,15 + 80,6 D.O.
9,33
6,7
21,02
5,l
29,49
1,5
C Or ='+0,32 + 99.9 D.O.
9,'
8.9
21,l
595
29.5
1.5
D Cr = -0,91 +105 D.O.
11,l
10,6
20,o
416
=,9
393
E Cr = -1,ll + 97 D.O.
11,5
14,8
20,98
5
=,67
4,4
46
5. - Vérification de la loi
du sérum ne se traduit donc
de BEER-LAMBERT avec du sérum
te de Créatinine.
sanguin
éiectivité de I’adsorption
Au cours de cette vérification, des quantités
croissantes de sérum déféqué ont été mises en
uses substances qui peuvent
ceuvre, la déprotéination étant conduite de la
Jaffe positive, nous avons
manière suivante :
ent de l’acétone et du glucose.
Sérum sanguin.. . . . . . . . . . . . . . .
2 ml
substances ne sont pas adsor-
Eau distillée . . . . . . . . . . . . . . . . . .
3 ml
lithe.
Ajoutées à des solutions
Na tungstate à 10 p. 100 . . . . . . .
1 ml
ou aux sérums, elles ne
H, SO, (0,67 N) . . . . . . . . , . . . . . 2 ml
On récupère le surnageant obtenu par centri-
fugation et on le soumet à l’action de 20 cg de
hnique de dosage adoptée
Jagolithe A, puis à celle du réactif picro-sodé.
la créatinine sanguine
Les résultats obtenus sont les suivants :
Sérum sanguin
quantité calculée
re de créotinine :
utilisé, ml
m l
-
-
1
1,02
1,25
1,28
conserver
flacon teinté sous toluène.
1,50
1,50
créafinine à 10 pg/cm3 :
1,75
1,72
2
1,98
Par conséquent, qu’il s’agisse de solutions
e recristollisé de l’acide acétique :
pures de créatinine ou de sérum sanguin déféqué,
g d’acide picrique dans 150 m l
il existe une proportionnalité entre la densité
optique et les quantités de créatinine mises en
jeu.
filtre à plis dans un entonnoir
ecueillir le filtrat dans un flacon
6. - Essais de récupération
de surcharges de créatinine
Avant défécation, on ajoute au sérum des
oid. Continuer l’aspiration jus-
quantités croissantes de créatinine. Nous repro-
duisons ici des résultats d’un essai qui montrent
une récupération satisfaisante des surcharges
ainsi réalisées.
Surcharge réalisée
Surcharge récupérée
Fg Créatinine
pg Créatinine
-
-
0
0
2S
26
5
5,l
7,5
7,4
10
10,2
date, solution aqueuse 10 p. 100
1.5
15,l
8)
.
Préparation de la jagolithe A
C) Extraction de /a créatinine.
Placer l’argile pendant une nuit à l’étuve à
Introduire dans un tube à centrifuger conique
100-1050 C. Broyer finement au mixer. Tamiser
4 ml du liquide de centrifugation des sérums
s
et conserver la Jagolithe traversant la maille
déprotéinés.
1
de bronze no 190.
Ajouter dans tous les tubes (sérums dépro-
teinés et gamme étalon), 25 cg de Jagolithe A
B. - Technique :
(une mesure peut être confectionnée à cet effet).
Agiter avec une baguette de verre trois fois
a) défécation du sérum :
en dix minutes. Rincer l’agitateur. Centrifuger
Introduire dans un tube à centrifuger conique :
pendant 10 minutes. Rejeter le liquide surnageant,
laisser égoutter les culots de centrifugation.
Sérum . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
2 ml
*
Eau distillée . . . . . . . . . . . . . . . . . .
3 ml
d) Développement de /a coloration.
Na tungstate 10 76
1 ml
Ajouter dans chaque tube 7,s ml de réactif
H,SO,, 0,67 N . . . . . . . . . . . . . . . . .
2 ml
picro-sodé. Agiter pour remettre le culot en
suspension trois fois en dix minutes. Centrifuger
l
Mélanger avec un agitateur. Centrifuger 10
pendant dix minutes et recueillir le surnageant
minutes. Décanter le surnageant.
dont on détermine la densité optique à 520 rnp.
b) Préparation de la gamme étalon :
e) Calculs :
Introduire dans trois tubes à centrifuger
A l’aide de la gamme étalon, établir la formule
coniques :
de régression donnant la concentration en
tube0 tube1 tube2
fonction de la densité optique, (méthode des
-
-
-
moindres carrés). Utiliser cette formule pour le
Solution créatinine à
calcul des concentrations sanguines.
10 pg/cm3 . . . . . . . . . .
0
1 ml
2 ml
Eau distillée, ml . . . . . .
5
4
3
Laboratoire national de recherches véférinaires
Na tungstate 10 p. 100
1
1
1
de Dakar-Hann-Sénégal
H, SO,, 0,67 N, ml.
2 2
2
Laboratoire de biochimie.
RÉSUMÉ
La créatinine sanguine peut être électivement adsorbée sur une argile montmorillonite, la terre
de BEZENET (Jagolithe). Après élution, la créatinine peut être soumise à un dosage calorimétrique
basé sur la réactian de JAFFE. La méthode proposée repose sur les points expérimentaux suivants :
10 Le pouvoir adsorbant de l’argile est d’autant plus fort que la taille des grains est plus faible.
II est inférieur à celui du réactif de Lloyd.
20 Les spectres d’absorption lumineuse des complexes colorés créatinine-acide picrique dépen-
dent de la quantité et de la granulation de la Jagolithe utilisée. Avec une argile grossière le maximum
d’absorption se déplace vers les grandes longueurs d’onde tandis que l’intensité de cette absorption
diminue pour les courtes longueurs d’onde.
30 La coloration propre du réactif picro-sodé s’intensifie légèrement au contact de l’argile.
40 Les complexes colorés obtenus après élution suivent de très près da loi de BEER-LAMBERT
lorsqu’on utilise une argile traversant les tamis no 190. Avec des granulations plus fortes, les résultats
sont moins bons.
50 Avec le sérum sanguin déprotéiné (Na tungstate-SO,Hz) on note également une bonne
proportionnalité entre coloration et concentration.
60 Les surcharges de créatinine ajoutées au sérum sont quantitativement récupérées.
48
SUMMARY
Use of montmorillonite (the clay of Ben
.
in the selective dosage of the blood oreatinine of the
The blood creatinine cari be electively adsorbed upon a m tmorillonite, the clay of Benezet
(Jagolithe). After elution, the creatinine cari be estimated by the CO
etricdosage based on the reac-
tion of Jaffe. The proposed method is based on the following exp
10 The adsorbing capacity of the clay is the higher as the size
the grains is small. It is inferior
to one of the Lloyd’s reagent.
20 The spectra of luminous absorption of the coloured CO
exes creatinine-picric acid, a r e
dependent on the quantity and the granulation of the Jagolithe u
maximum absorption is seen with the long wave-lengthes whereas
ses for the short wave-lengthes.
30 The colouration itself of the reagent picro-sodic increases
40 The coloured complexes obtained after elution follow v
when the clay filtered through sieves no190 is utilized. The resu
nulations are used.
50 With the proteinless blood serum (Na tungstate-H$O,)
ween colouration and concentration.
60 The added overcharges of creatinine to the serum are q
RESUMEN
UtilizaciOn de una montmorillonita, la tie
en la dosificackn selectiva de la creatinina sanguina
rumiantes domésticos
La creatinina sanguina puede quedar electivamente absorb’
or una arcilla montmorilloni-
tica, la tierra de Benezet (Jagolithe). Previa elucion, la creatini
uede quedar sometida a una
dosificacion colorimétrica fundada en la reaccion de Jaffe. El m é
propuesto toma apoyo en 10s
puntos experimentales siguientes :
10 El poder adsorbente de la arcilla es tanto mas fuerte CU
mas reducida es la dimension
de 10s granos, siendo inferior al del reactivo de Lloyd.
20 Los espectros de absorcion luminosa de 10s complejos c
reados creatinina-Qcido picrico
dependen de la cantidad y de la granulation de la Jagolithe utiliza
Con una arcilla basta, la absor-
cion maxima se desplaza hacia las grandes longitudes de onda,
ientras que la intensidad de esta
absorcion disminuye para las cortas longitudes de onda.
30 La coloration propia del reactivo picro-sodado
se intensi
ligeramente al entrar en con-
tact0 con la arcilla.
40 Los complejos coloreados obtenidos después de la elucio
n muy semejantes a las condi-
ciones de la ley de Beer-Lambert cuando se utiliza una arcilla q
sa por la malla 190. Cuando
se opera con granulaciones mas fuertes, 10s resultados son meno
50 Con el suero sanguineo desproteinado (Na Tungstato-S
J se pone de manifiesto, asi-
mismo, una buena proporcionalidad entre coloration y concen
60 Las sobrecargas de creatinina aEadidas al suero quedan
uantitativamente recuperadas.
BIBLIOGRAPHIE
MOLITOR, (A). - Ann. Biol.
KAYSER, (F.), MOLITOR, (A). - Annales
VINET, (A). - Bull. Soc.
Phorm. Franc. (1956) 14,197. 208.
49
REVUE
1 MÉDECINE VÉ
DES PAYS TR
Utilisation d’une montmor
la terre de Bezenet, dans le d o
de la créatinine sangu
des ruminants domestique
par Cl. LABOUCHE
Tome XVI (nouvelle série)
No 1 - 1963
-~ VIGOT FRÈRES, ÉDITEUR
23, rue de l’École-de-Médecine,
ARIS-VI”
i
Utilisation d’une montm brillonite,
la terre de Bezenet, dans le Iosage sélectif
de la créatinine sari pine
des ruminants dome tiques
par C l . LABOUCHE
Au cours d’une étude de la filtration glomé-
Traversant If
Arrêté par
p. 100 du poids
rulaire rénale chez des ruminants domestiques,
tamis
le tamis
total de l’argile
nous avons dosé la créatinine du sérum sanguin
No
No
tamisée
selon JAFFE. Par cette méthode, une molécule
-
-
-
de créatinine sanguine s’unit à une molécule
4 5
0,06
d’acide picrique ainsi qu’à un nombre variable
4 5
6 0
L7
de molécules de soude et d’eau pour donner
6 0
8 0
46,8
des composés de couleur rouge.
8 0
100
30,4
La réaction n’est pas spécifique. L’acétone,
100
190
16,9
-
l’acide acétylacétique, le méthylglyoxal, l’acide
190
32
glycuronique, l’acide ascorbique, certains glu-
L a Jagolii
! est colorée en bleu par la
cides et divers protides peuvent la fournir. Des
benzidine er solution acétique, en vert clair
techniques de destruction de ces chromogènes
par I’aniline
en brun rouge par la paraphény-
ont été proposées, mais le plus souvent on pré-
Iènediamine.
a réaction est acide en présence
fère extraire la créatinine en I’adsorbant sur une
d’une solutio
Iqueuse d’hélianthine.
substance appropriée (réactif de LLOYD, ben-
Avant de I .iliser pour le dosage de la créa-
tonites commerciales) (1) (2). La créatinine éluée
tinine, nous ( 3ns envisagé les points suivants :
subit alors la coloration, à l’abri des interven-
- pouvoit
Idsorbant et influence de la gra-
tions parasites.
nulation
Les agents adsorbants classiques nous faisant
- action
r les spectres d’absorption lumi-
défaut, nous avons pensé qu’une argile mont-
neuse
morillonite, la terre de BEZENET (Allier) ou
- action 5 . la couleur des solutions alcalines
Jagolithe, dont MEUNIER avait autrefois proposé
d’acide picric
e
l’utilisation pour classer les huiles de poisson
- vérifica In de la loi de BEER-LAMBERT
suivant leur richesse en vitamine A (3) pourrait
- essais (
récupération des surcharges de
peut-être les remplacer.
créatinine
Cette terre, de couleur grise, est formée de
- sélectiv
de I’adsorption
grains de taille variable ainsi que le montre
l’essai de tamisage résumé ci-dessous.
1. -
Jde du pouvoir adsorbanf
de la Jagolithe
Rev. Elév. Méd. vét. Pays trop., 1963, no 1
On évalue
pouvoir adsorbant de l’argile en
Reçu pour publication : juillet 1962.
mesurant la )Ius petite quantité capable de
4 1
.
fixer un poids donné de créatinine en présence
lorsque I’adsorption est complète, la densité
d’acide sulfurique et de tungstate de sodium,
optique est supérieure à celle du témoin d’en-
agents déféquants habituellement préconisés dans
viron 10 p. 100.
le dosage de la créatinine sanguine. (1)
Dans des tubes à centrifuger coniques, on
b) Pouvoir odsorbant et granulation de lo lago-
place successivement :
lifhe.
Solution de créatinine (6 ou lOy/cm3). .
2 ml
Nous avons vérifié l’influence de la grosseur
Eau distillée.. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
3 ml
des grains d’argile sur le pouvoir adsorbant par
Na tungstate (solution à 10 p. 100) . . . .
1 ml
un protocole identique au précédent mais en
H, SO, (0,67 N). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
2 ml
utilisant des solutions à 10 Fg de créatinine au ml.
L’argile est passée à travers une série de tamis
Après homogénéisation du mélange, on ajoute
en bronze de numérotation : 60, 80, 100 et 190.
des quantités variables de terre de Bezenet. On
On a ainsi obtenu les fractions suivantes :
agite trois fois en dix minutes à l’aide d’une
A : traverse la maille 190
baguette de verre, puis on centrifuge à grande
vitesse pendant dix minutes. Le surnageant est
B. : traverse la maille 100 et est retenue par la
,
enlevé et les tubes sont retournés sur du papier
maille 190
filtre afin de réaliser un égouttage aussi parfait
C : traverse la maille 80 et est retenue par la
que possible du culot. Pendant ce temps on pré-
maille 100
pare un tube témoin contenant seulement deux
D : traverse la maille 60 et est retenue par la
centimètres cubes de la solution de créatinine
maille 80
et un « blanc » constitué par deux centimètres
E : est retenue par la maille 60
cubes d’eau distillée.
On ajoute ensuite à tous les tubes 7,5 cm3 de
Les pourcentages moyens de créatinine fixée
réactif picro-sodé ainsi que 2 cm3 d’eau distillée
en fonction du poids de l’argile et de la grosseur
à ceux contenant de l’argile afin de rétablir I’éga-
du grain de Jagolithe sont réunis dans le tableau
lité de volume avec le tube témoin et le blanc.
suivant.
Après agitation et dix minutes de contact, on
centrifuge pendant dix minutes. La densité
optique des surnageants est mesurée au spectro-
I Po:Lds dtargJIe en oentigrammea.
photomètre Beckman à 520 rnk et exprimée en
Raction
5
10
20
40
60
80
100
pourcentage de la densité optique du temoin.
A
86
95
101
56
a) Pouvoir odsorbant de la ]ogolithe non tamisée.
B
54
74
96
103
105
La solution de créatinine utilisée contenait
C
34
50
71
97,5 108
6y/cm3
D
40
51
80
85
85
60
Densité optique
E
55
85
81
86
74
Quantité
du surnageant
d’argile
(p. 100 de la densité
On remarquera :
(9)
optique du témoin)
-
-
10 Que la quantité d’argile nécessaire pour
0
100
adsorber 20 pg de créatinine est de 20 cg pour A,
QI
7 5
de 20 à 40 cg pour B, de 40 à 60 cg pour C.
0,2
1 1 1
20 Que les fractions les plus grossières (D et E)
0,4
109
Ile semblent pas permettre une fixation complète.
L’adsorption est complète à partir de 0,2 g.
30 Qu’un excès d’argile se traduit par une
L’activité est donc inférieure à celle du réactif
diminution du pourcentage de rétention (A, D,E,).
de Lloyd ou à celle des bentonites pour lesquels la
40 Que lorsque la récupération de lacréatinine
quantité maximale fixée est de 1 p. 100 du poids
:st complète, elle est légèrement supérieure à
de I’adsorbant. On remarquera également que
100 p 100.
42
Nous avons alors essayé de confirmer (20) et
3. - nfluence de la Jagolithe
(30) de la manière suivante : Le surnageant de la
sur la col ration de la solution alcaline
première centrifugation est recueilli et on y
d’acide picrique
ajoute 20 cg de la fraction A, quantité que nous
venons de vérifier comme suffisante pour adsor-
Au cours d
l’élution de la créatinine et du
ber la créatinine qui n’aurait pas été retenue.
développemer
de la coloration, un excédent
On opère ensuite comme précédemment. En
de réactif pic l-sodé reste inemployé. On peut
aucun cas, nous n’avons pu mettre en évidence
se demander
par conséquent, si sa couleur
la présence de créatinine dans les surnageants
propre ne pal ,t-ait pas être modifiée par contact
‘lorsqu’on utilise 40 cg de A, 60, 80, 100 cg de D
avec l’argile.
ou de E.
Nous avons donc comparé l’absorption lumi-
L’adsorption est donc dans tous les cas com-
neuse du réa1 if avant et après contact avec la
plète, mais les capacités d’absorption lumineuse
Jagolithe (20 g de fraction A pour 7,5 cm3 de
ont été sans doute modifiées.
réactif) le réa tif étant séparé ensuite de l’argile
par centrifug tion. On note alors une légère
2. - Influence de la Jagolithe
intensification
de la couleur, la solution ne
sur les spectres d’absorption
laissant alors asser que 98 p. 100 de la lumière
des complexes créatinine-acide picrique
traversant le I iactif seul.
II sera donc nécessaire de traiter les blancs de
La coloration a été développée à partir d’une
la même mar ère que les échantillons à doser.
solution pure de créatinine sans utilisation de
l’argile (coloration témoin) et après action de
,quantités variables de Jagolithe (fractions A,
4 . - Vérifica on de la loi de BEER-LAMBERT
D, 5)
avec des solutions pures de créatinine
La densité optique est déterminée pour des
lumières de longueur d’onde comprise entre
La technic je suivante à été suivie. Des
450 et 560 rnp, Pour chaque spectre, on égale la
gammes de concentrations
croissantes sont
densité optique maximale à 100, les autres D. 0.
ainsi réalisée
étant alors exprimées en pour cent du maximum
d’absorption.
Les résultats obtenus sont consignés dans le
tableau figuré à la page suivante :
mlutinn de a
Les spectres correspondants sont représentés
à 10 @al,ml
dans les figures 1, 2, et 3.
!L%u distïllée,
ml
3
On remarquera que le maximum d’absorp-
tion lumineuse situé à 480 rnp pour le témoin se
Na tungstats 1 p.lOO*ml
1
déplace vers les grandes longueurs d’onde en
ml
2
présence de l’argile. On note ainsi, suivant les
cas, des maxima d’absorption à 495, 500, 505,
510 rnp tandis que l’absorption vers les courtes
Suivant les cas, on utilise les quantités sui-
longueurs d’onde diminue.
vantes d’argil
Ces déformations spectrales permettent d’ex-
Fraition
..................
20 cg
pliquer que les récupérations de créatinine
Fraction
. . . . . . . . . . . . . . . . . .
40 cg
puissent être supérieures à 100 p. 100.
Fraction
. . . . . . . . . . . . . . . . . .
40 cg
En conséquence nous pouvons déjà dire que
Fraction
’. . . . . . . . . . . . . . . . . . .
60 cg
lors d’un dosage éventuel de la créatinine
Fraction
. . . . . . . . . . . . . . . . . . .
60 cg
au moyen de Jagolithe, les solutions étalons
devront être traitées par les mêmes quantités
On vérifie
ue I’adsorption est complète pour
d’argile de même qualité que les échantillons
les concentra lns les plus élevées de créatinine,
soumis aux dosages.
par la méthoc
! exposée en (2, b)
43
A
Fraction A
Fraction
lbaction B
Fraction E
9
tblloin
20 o-g
40 cg
40 c3g
og
60 80
40 60
cg
cg
80 cg
1 0 0 c g
40 c g
8 0 c g
1 0 0 c&
q
450
60
66
46
-
-
-
-
56
51
6
460
82
94
72
-
-
65 56
11
64
52
2
465
84
-
-
- 68
-
68
58
11
66
56
-
470
93
95
78
63
71
60
10
71
56
4
475
98
S@
81
68
73 60
13
74
58
-
480
100
97
77
74
79 69
27
81
68
21
485
99
95
69
86
89
89
83
57
89
82
51
490
96,5
99
87
95 96 93
78
96
93
74
495
93,5
100
90
99 99
99 99
99,5
91
99
97
88
500
89,5
99
95
~~JI&l
%,5
100
-
100
96
505
w
98
99
97 97 99
100
98
99
100
510
78
95
100
93 94
93 94
95,5
98,5
94
96
99
515
71
88
96
- 98
- 98
90,s
93
88
89
94
520
61
80
90
76 78 80
84
78
80
88
525
52
-
-
- 68
-
68
70
73
-
-
-
530
43
61
< 72
56 57
56 57
59
61
57
58
66
535
34
-
-
-
-
47
49
51
-
-
-
540
26
40
51
37 37 38
41
38
38
46
545
19
-
-
-
-
30 31
33
-
-
-
550
t4,5
26
37
24 24 25
26
24
24
32
560
8
-
c
15 15 16
17
8
16
22
%
1 0 0
9 0
8 0
7 0
6 0
Fit
1. - Modification du spectre d’ab-
SO+ >n lumineuse du complexe acide picri-
5 0
que-l
éatinine sous l’influence de quantités
varic
Iles de Jagolithe A.
4 0
3 0
2 0
1 0
500
550
rnt.t
F i 2 . -TiModiftcation du spectre d’ab-
sorF
o n lumineuse du complexe acide picri-
que.
réatinine sous l’influence de quantités
vari bles de Jagolithe E.
%
1 0 0
9 0
80
7 0
6 0
F
3. - Modification du spectre d’ab-
sort ion lumineuse du complexe acide picri-
5 0
que-
-éatinine
sous l’influence de quantités
vari’
Iles de Jagolithe E.
4 0
3 0
20
1 0
450
5 0 0
550
rnp
.
Les densités optiques sont mesurées à diffé-
La précision est bonne à toutes les longueurs
rentes longueurs d’onde et la droite de régression
d’onde et la droite de régression passe très près
concentration = f (densité optique) est calculée
de l’origine des axes de coordonnées.
D
par la technique des moindres carrés. Les
Par contre la concordance est moins satis-
valeurs calculées sont alors comparées aux
faisante entre les valeurs calculées et les valeurs
concentrations réelles et l’erreur relative est
réelles pour les granulations plus fortes et
évaluée.
l’erreur augmente avec la grosseur des grains,
A titre indicatif, nous reproduisons ici les
ainsi que le montre le tableau ci-dessous obtenu
résultats obtenus avec la Jagolithe A (20 cg). 1 pour ;ne ), = 470 mp.
Qmntité de créatinine par tube à essai, enw
x
Equation de régression
10
20
30
~I)I. yg Cr6atinine =f. (D.O.) quantité Erreur quantité Erreur quantité Erreur
calculée relative calculée relative calculée relative
w
%
w
%
J=
%
470 Cr =-0,12 + 82,7 D.O.
10,05
0,5
19,97
0,15
30,02
0,06
480
Cr =A,09 + 71,7 D.O.
10,09
0,9
20,1~2
0,6
29@
0,4
490 Cr =-0,05 + 70,5 D.O.
JO,03
0,3
a,11
0,5
29,91
0,3
500 ci‘ =4,10 + 73,6 D.O.
10,05
0,25
20,21
1
29,85
0,45
510 Cr =-0,02 + 84,5 D.O.
9,95
0,5
20,17
0,85
29,9
0,33
Qwntité de créatinhe par tube à essai, @~JJG
10
2 0
30
Equation de régression
Ehction
~g (bhthim =f*(D.O-) qumtité tireur
quantité Erreur
quantité Erreur
calculée relative cslci.llée
relative calculée relative
PG
z
w
z
)Lg
z
A Or = A,12 + 82,7 D.O.
10,05
0,5
19,97
0,15
30,02
0,06
B Cr = +0,15 + 80,6 D.O.
9,33
6,7
21,02
5,l
29,49
1,5
C Or ='+0,32 + 99.9 D.O.
9,'
8.9
21,l
595
29.5
1.5
D Cr = -0,91 +105 D.O.
11,l
10,6
20,o
416
=,9
393
E Cr = -1,ll + 97 D.O.
11,5
14,8
20,98
5
=,67
4,4
46
5. - Vérification de la loi
du sérum ne se traduit donc
de BEER-LAMBERT avec du sérum
te de Créatinine.
sanguin
éiectivité de I’adsorption
Au cours de cette vérification, des quantités
croissantes de sérum déféqué ont été mises en
uses substances qui peuvent
ceuvre, la déprotéination étant conduite de la
Jaffe positive, nous avons
manière suivante :
ent de l’acétone et du glucose.
Sérum sanguin.. . . . . . . . . . . . . . .
2 ml
substances ne sont pas adsor-
Eau distillée . . . . . . . . . . . . . . . . . .
3 ml
lithe.
Ajoutées à des solutions
Na tungstate à 10 p. 100 . . . . . . .
1 ml
ou aux sérums, elles ne
H, SO, (0,67 N) . . . . . . . . , . . . . . 2 ml
On récupère le surnageant obtenu par centri-
fugation et on le soumet à l’action de 20 cg de
hnique de dosage adoptée
Jagolithe A, puis à celle du réactif picro-sodé.
la créatinine sanguine
Les résultats obtenus sont les suivants :
Sérum sanguin
quantité calculée
re de créotinine :
utilisé, ml
m l
-
-
1
1,02
1,25
1,28
conserver
flacon teinté sous toluène.
1,50
1,50
créafinine à 10 pg/cm3 :
1,75
1,72
2
1,98
Par conséquent, qu’il s’agisse de solutions
e recristollisé de l’acide acétique :
pures de créatinine ou de sérum sanguin déféqué,
g d’acide picrique dans 150 m l
il existe une proportionnalité entre la densité
optique et les quantités de créatinine mises en
jeu.
filtre à plis dans un entonnoir
ecueillir le filtrat dans un flacon
6. - Essais de récupération
de surcharges de créatinine
Avant défécation, on ajoute au sérum des
oid. Continuer l’aspiration jus-
quantités croissantes de créatinine. Nous repro-
duisons ici des résultats d’un essai qui montrent
une récupération satisfaisante des surcharges
ainsi réalisées.
Surcharge réalisée
Surcharge récupérée
Fg Créatinine
pg Créatinine
-
-
0
0
2S
26
5
5,l
7,5
7,4
10
10,2
date, solution aqueuse 10 p. 100
1.5
15,l
8)
.
Préparation de la jagolithe A
C) Extraction de /a créatinine.
Placer l’argile pendant une nuit à l’étuve à
Introduire dans un tube à centrifuger conique
100-1050 C. Broyer finement au mixer. Tamiser
4 ml du liquide de centrifugation des sérums
s
et conserver la Jagolithe traversant la maille
déprotéinés.
1
de bronze no 190.
Ajouter dans tous les tubes (sérums dépro-
teinés et gamme étalon), 25 cg de Jagolithe A
B. - Technique :
(une mesure peut être confectionnée à cet effet).
Agiter avec une baguette de verre trois fois
a) défécation du sérum :
en dix minutes. Rincer l’agitateur. Centrifuger
Introduire dans un tube à centrifuger conique :
pendant 10 minutes. Rejeter le liquide surnageant,
laisser égoutter les culots de centrifugation.
Sérum . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
2 ml
*
Eau distillée . . . . . . . . . . . . . . . . . .
3 ml
d) Développement de /a coloration.
Na tungstate 10 76
1 ml
Ajouter dans chaque tube 7,s ml de réactif
H,SO,, 0,67 N . . . . . . . . . . . . . . . . .
2 ml
picro-sodé. Agiter pour remettre le culot en
suspension trois fois en dix minutes. Centrifuger
l
Mélanger avec un agitateur. Centrifuger 10
pendant dix minutes et recueillir le surnageant
minutes. Décanter le surnageant.
dont on détermine la densité optique à 520 rnp.
b) Préparation de la gamme étalon :
e) Calculs :
Introduire dans trois tubes à centrifuger
A l’aide de la gamme étalon, établir la formule
coniques :
de régression donnant la concentration en
tube0 tube1 tube2
fonction de la densité optique, (méthode des
-
-
-
moindres carrés). Utiliser cette formule pour le
Solution créatinine à
calcul des concentrations sanguines.
10 pg/cm3 . . . . . . . . . .
0
1 ml
2 ml
Eau distillée, ml . . . . . .
5
4
3
Laboratoire national de recherches véférinaires
Na tungstate 10 p. 100
1
1
1
de Dakar-Hann-Sénégal
H, SO,, 0,67 N, ml.
2 2
2
Laboratoire de biochimie.
RÉSUMÉ
La créatinine sanguine peut être électivement adsorbée sur une argile montmorillonite, la terre
de BEZENET (Jagolithe). Après élution, la créatinine peut être soumise à un dosage calorimétrique
basé sur la réactian de JAFFE. La méthode proposée repose sur les points expérimentaux suivants :
10 Le pouvoir adsorbant de l’argile est d’autant plus fort que la taille des grains est plus faible.
II est inférieur à celui du réactif de Lloyd.
20 Les spectres d’absorption lumineuse des complexes colorés créatinine-acide picrique dépen-
dent de la quantité et de la granulation de la Jagolithe utilisée. Avec une argile grossière le maximum
d’absorption se déplace vers les grandes longueurs d’onde tandis que l’intensité de cette absorption
diminue pour les courtes longueurs d’onde.
30 La coloration propre du réactif picro-sodé s’intensifie légèrement au contact de l’argile.
40 Les complexes colorés obtenus après élution suivent de très près da loi de BEER-LAMBERT
lorsqu’on utilise une argile traversant les tamis no 190. Avec des granulations plus fortes, les résultats
sont moins bons.
50 Avec le sérum sanguin déprotéiné (Na tungstate-SO,Hz) on note également une bonne
proportionnalité entre coloration et concentration.
60 Les surcharges de créatinine ajoutées au sérum sont quantitativement récupérées.
48
SUMMARY
Use of montmorillonite (the clay of Ben
.
in the selective dosage of the blood oreatinine of the
The blood creatinine cari be electively adsorbed upon a m tmorillonite, the clay of Benezet
(Jagolithe). After elution, the creatinine cari be estimated by the CO
etricdosage based on the reac-
tion of Jaffe. The proposed method is based on the following exp
10 The adsorbing capacity of the clay is the higher as the size
the grains is small. It is inferior
to one of the Lloyd’s reagent.
20 The spectra of luminous absorption of the coloured CO
exes creatinine-picric acid, a r e
dependent on the quantity and the granulation of the Jagolithe u
maximum absorption is seen with the long wave-lengthes whereas
ses for the short wave-lengthes.
30 The colouration itself of the reagent picro-sodic increases
40 The coloured complexes obtained after elution follow v
when the clay filtered through sieves no190 is utilized. The resu
nulations are used.
50 With the proteinless blood serum (Na tungstate-H$O,)
ween colouration and concentration.
60 The added overcharges of creatinine to the serum are q
RESUMEN
UtilizaciOn de una montmorillonita, la tie
en la dosificackn selectiva de la creatinina sanguina
rumiantes domésticos
La creatinina sanguina puede quedar electivamente absorb’
or una arcilla montmorilloni-
tica, la tierra de Benezet (Jagolithe). Previa elucion, la creatini
uede quedar sometida a una
dosificacion colorimétrica fundada en la reaccion de Jaffe. El m é
propuesto toma apoyo en 10s
puntos experimentales siguientes :
10 El poder adsorbente de la arcilla es tanto mas fuerte CU
mas reducida es la dimension
de 10s granos, siendo inferior al del reactivo de Lloyd.
20 Los espectros de absorcion luminosa de 10s complejos c
reados creatinina-Qcido picrico
dependen de la cantidad y de la granulation de la Jagolithe utiliza
Con una arcilla basta, la absor-
cion maxima se desplaza hacia las grandes longitudes de onda,
ientras que la intensidad de esta
absorcion disminuye para las cortas longitudes de onda.
30 La coloration propia del reactivo picro-sodado
se intensi
ligeramente al entrar en con-
tact0 con la arcilla.
40 Los complejos coloreados obtenidos después de la elucio
n muy semejantes a las condi-
ciones de la ley de Beer-Lambert cuando se utiliza una arcilla q
sa por la malla 190. Cuando
se opera con granulaciones mas fuertes, 10s resultados son meno
50 Con el suero sanguineo desproteinado (Na Tungstato-S
J se pone de manifiesto, asi-
mismo, una buena proporcionalidad entre coloration y concen
60 Las sobrecargas de creatinina aEadidas al suero quedan
uantitativamente recuperadas.
BIBLIOGRAPHIE
MOLITOR, (A). - Ann. Biol.
KAYSER, (F.), MOLITOR, (A). - Annales
VINET, (A). - Bull. Soc.
Phorm. Franc. (1956) 14,197. 208.
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