REPUBLIQUE DU SENEGAL -1"11-~~~~-" ...
REPUBLIQUE DU SENEGAL
-1"11-~~~~-"
I\\IINIST?ZRE DU DEVELOPPEt%NT RURAL
INSTITUT SENGALAX DE RECHERCHYS
AGRICOLES (I.S.R.,I.)
-wm--...m-LIPI
DEPARTEMENT DE RECHERCHES SUR LZS
PRODUCTIONS ET LA SANTE !iISIMf&ES
~"m.~d~~~1~--...
LOBORATOIRE !<JATIONAL DE LPELEVAGE
ET DE RECHERCHES VETEXINKIRES
B.P. - 2G57
DAKAR - HANN
COURS SUR LES DIAGNOSTICS DES HEMOPARASSTOSES
ANIKLES hVYC INSISTANCE SUF LI+S
TRYP?,NOSOt?IRSES OiXiWlSE PAR
L'ILRAD DU îw AU 26 MAL 1989
PFF
\\.i. .
No 53,'PARASITO.
SEPTEMBRE 1989,
P L A N
INTRODUCTION
I- ASPECTS GENERAUX SUR L D IMHUNOLOC;IE
1" 1 " L t immunite à media tion cellulaire
1- 2 - L f immunî té humcr&>
I-3 - Les antigènes
I-4 - Les anticorps
I-5 - Lc co@erner t
II- 1 - SEPAHHTION des trypanosomes du sang
II- 2 - Technique de maintenance des trypanosomes au laboratoire
II- 3 - Clônaga et stabilisntion des trypanosomes
II- 3-1 - c16nage
II- 3-2 - Stabilisation et conservation des trypanosomes
dans 1 D azote liquide
II- 4 - préparation d t antiserum
I I - 3- Immunodiffusion
I I - 0 - Immunoélectrophorése
II- 7 - Isolement et purification des immunoglobulines
II- 7 - 1 - Isolement des globulines
II- 7-2
- Puriîication des im~~unoglobulines
I I - 7-2-l - Filtration sur gel
I I - 7-2-2 - Chromatographi,-5 sur échangeur d’ions
II- 7-2-3 - Chromatcgraphie dPa.ffinité
I I - a - Frépzr$.tion d 7 antigènes
II- 8-1 -
Antigènes pour immunsfluorescence
II- 8-2 -
Antig ènes pour 1’FLISA
II- g - Préparation de conjugué pour l*ELISh
I I - Y-1 -
Préparation des iwdnoglobulines
II- g-2 -
Préparation de 1 p er.zyme I Oxydation)
*a. / . . .
II-g-3- Préparatiw crie conjugué
II - 10 - Techniques <e c!iagr?ostic s&ol@qae
II - 10-l - Irimunofluorescence
-s
II - 10-2 - ELISA
II _ 10-2-1- Détection dPanticorps
II - yi-J..,24- Detection des antigènes à prtir dvacticorps monoclonaus
II - IO-2-2- Techniq.le de de~ecticn c?3aiiti$mes circulants
CONCLUSION
-III-
REPIJZRCIEHWTS
--.m.-.---
INTRODUCTION
Le développement ùe l’industrie animale africaine a été de tout temps entra-
,
vc par les ~roblèmkX do pathologie et surtout les methodes irrationnelles de $?Stion
des troupe2ux qui ne sont ~33 toujours orientée s vers un objectif de production maxi-
mum. De nos jours, beaucoup de maladies virales ou baçteriennes economiquement impor-
tantes peuvent. être facilement contr21ées
par la méthode de vaccination. Cependânt,
1s situation est tout à fait differente pour ce qui concerne 11~~ hémoparasitoses ani-
males parce qu’il nlcxwL
iste aucune vaccination approuvée et efficace pour ce groupe de
maladies S
LgILRAD s9est donc vu assigné comme premier objectif de développer de manière
plus certaine desmesures de contrôle officacee LI et économiquement possibles des deux
plus importantes malndies du rhoptel que sont : la trypanosomiase animale africaine
et la l’heileriose à theiloria parv.: ou la fièvre de 12 vallk du Rift.
Ces doux m2ladies sont responsables de la mort d9,apprcxim~tivement 3 millions d’ani-
maux p3r an en Afrique et 12 fiévre de la vallée du Rift à elle seule est accus& de
la mortalit6 de 500.000 animaux par an en Afrique de l’Est. Pour rztteindre donc cet
ohjcctif, 1~ILRAD dont le finysctement est supporté par le Grouûe Consultatif pour 12
Recherche agricole intc;rnr~tionale/équip~ t, de r;mt6riel de haute. performance et d’un
personnel scicntifiquc et tcchniquc trè,= qualifi.6 en faisant ainsi un la50ratoire de ::;
référence. En vue de rspsndre 5. son second objectif qui est la forniztion, un progranlme
de cours basé esscntiellemcnt sur iw résultats acqui.s par les chercheurs et techni-
ciens et les innovati.cJns dans les méthodes de travail utili& d’une part, et 19expé-
riencc personnelle des urs o: &zs autres d’autre part est organis6 chaque annge par
lgunit& de formation du centre et, le cours que j’ai suivi sur proposition du Directeur
des &chepches
sur la Santé et les Productions finimales, s Cinscrit dans ce cadre.
Ce cours a été surtout ax6 autour de quelques généralités sur lvimmunologie et les
techniques de détection des diffkentes hémoparasitoses animales par les methodes
directes d ooxamen de sangs: frais, de frotd;is de sang, de ganglions lymphatiques, de :Y: 4:
cortex etc.. . ld’nbord, cnsuite les mbthodcs d e ciiagnostic s&oSsgiqw : immu2odiffusion
immunoélectro-phorese,
ii?XnuY~Gfluorcsocnce
directe et ELISA.
. . . / .*.
Tiuti~s ces techniqucsi ne pouvmt pas être traitees ckns ce rapport dont
l'objet est de rendre compte du d&oulement .!e ces cwrs seules celles étant les plus
habituellement
collicitées dans la conduite des recherches sur ces malndies seront
expo&s. 3ans une première partie seront rsppelies quelques nations en immunologie,
reçues sous forme d ~expos&s et de conférences tandis que 232s la deuxième partie seront
abord& les m6thodes dz prapsration des diffirents rhactifs et les techniques de
ltiur utilisation dans lrs diagnostics scrologiques.
Dans una troisième et dernière
partie seront tirdes le,- conclusions sur le cours.
1. - CSPECTS G%NEWUX SUR L'IMMUNOLOGIE
LVimmuno1ogi.e peut être d4finie comme étant l?étude de lvimrnunité vis-à-vis
des bactéries, mais cette d6finition peut être élargie par analogie aux rCactions
sp&ifiques ou non ù
-19 u-.
n antigeen tendant à éliminer des substances étrangères.
Les antigènes sont des substances qui réagissent spécifiquement avec des
anticorps ou des r%çepteurs cellulaires et sont capables dz stimuler une production
d'anticorps ou une rdaction cellulaire et la spkificité des antigènes 2. provcquer
une réaction imïîunitaire dZficit ltimnunog6n~kité,
Dans le système immunitaire, on
distingue deux types d'immunité
: 1°immunit6 à mediation cellulaire et ltimmunité
humoralo,
I.l- LtImmunité
.
à kdiation cellulaire
Elle est nssurdc par la lignée zle lymphocytes I d6veloppes et muris par le
thymus et spécifiqucmcnt sensibilist% venant au contact de l*antigène et y agissant
par cytotoxiciY6 directt ou Lib&ation de médizteurs non spécifiques de lvantig6nc.
cette forme dtimnunit6 est transmiss ible nis(tment par des transferts de cellules
mais ne l'est pas par le sérum.
s. 2 - Lv Imrwnité Humcrale :
Quant à ltimmunit4 humorale, elle est medi& pw des molécules spécifiques
de l'antigènti, les anz;icorps produits à distance de leur s_i.to dvaction et la produc-
tion de ces molécules est assurée par les lymphocytes l3 q,ui sont dapendants de la
Zourse de Fabricius chez les oiseaux, mais chez les nami;ifères, 15k2quivalcnt de la
Bourse de Fabricius demeure toujours inconnu.
. . . / l . .
“3”
1, - 3 - Les Antigènes
Ils pcuwnt Etre dCfinis comiic des molécules qui, introduites dans un organisme,
induiscnt une &ponse immunitaire par le déclcnchument *Apun processus biologiqus impli-
quant en pwtioulier 1s prolif&ration ~31: cellules lympho!ïdes et aboutissant à la syn-
thèse par ces dernieros de molkules de reconnaissance (anticorps ou &cepteurs), Cas
-nol&~lcs ont la. capacit& do se combiner spkifiquemênt in vive comme in vitro avec
1 I antigenis inducteur e t élimincr ainsi xx7 effet.
1. - 4 - LE~ Anticorps
Lorsqu’un animal recoit un antigène dans cwtaines conditions, ii peut produire
un antisérum spkifique ne rcagissant qu’avec cet 2.3 tigèna et contenant des protéines
responsables de cotte reconnaissance. Gfl dit alors que ces protsines sont douées d’une
“fonction anticorps” et sfest cecritère fonctionnel qui sert à dkignw ces prot6ines
sous le terme ci9 znticcrps DJ encore dgune naniéro plus gén?rale ttimmunoglobulinestl qui
peuvent être isol5cs des autres constitua,nts de sang par t.!es techr?iquss qui seront dé-
crites plus loin.
Ces immunoglobulines sont classks d ‘aprk leurs caractkes physico-chimiques et
leurs critères anti&nl.que s et sur la base dc critk-es &nkaczx, tous les individus d’une
même espèce don& ont en commun diverses cat6gories d * iamunoglobulines
appelées isoty-
PCS. Chez l’homme par exemple, on a defini 1G isotypcs réparties en 5 classes :
- Les IgG sont 12s immunoglobulines majoritaires du S&UI~ s ‘attaquant <aux micro-
organismes et aux toxines et sont capables de traverser le placenta ;
. les IgM apparai,,,;
qnnt trks tôt au d&but de In r<ponse immunitaire et constituent
donc la première barri&e contre les agressions mais disparaissent progressivement au
profit des IgG. Ils n’onV pas unti capacité transplacentairo mai s peuvent fixer le complé-
ment ;
- Les IgA sont trou& dans le sérum et dans les secrb b.L,,ns
:c; ,-
f colostrum surtout,
mucus intestinal oubronchique, lnrmcs etc...), ils participent 3.u revetement exerne du
corps ;
/
. . . .*.
-Les IgD : présente:; en faible quantite dans le S&Um et pouvant jouer un rjle de ré..
cepteurs sur les membrerles dcslymphccytes ;
Les IgE sont les moins représentkzs des immunoglobulinos sériyues et
jouent
un rôle très important en immunopathologie car elles sont Lt support des manifestations
d'hypcrsensibilit$ immkZate comme lc choc anaphylactique, l'asthme, lti rhume des foins.
1. - 5 - Le complément
C'est un systeme biologique qui intervient dans les procossus immunologiques en
se fixant sur le complexe specifique antigène-nnticorps formé, Il est composé de 9 Sé-
Quencesde C1 & Cg agissant s6parement les unes les autres, et dont ltt C3 le plus abondant
produit le C3a qui augmente la permkbilité vasculaire à lthistaminc ot qui est en même
temps chimiotactique pour les leucocytes polynucléaires. Le C b activé libère lc C
3
5 dont
le ($2 a les mêmes proprietés que le C3a
tandi:;que le C5b active le Ce et le Cy qui par-
ticipe à lri destruction .?o la membrane ?es cellules cnvahisseuses cntrainant ainsi leur
lyse.
1. - 5 - La réaction Antigene-Anticorps
La mise zn urkence
*
clPun antigene et de son anticorps correspondant produit un
complexe antigCne-anticcrps qtii se traduit par 17union de ces d eu:: &l<ments dpoù la no-
tion de spécificit< de cette réaction car un sdrum arki.-hCm;:ities de bovin par exemple
nz réagira qu'en présonce dVhématies de bovin uniquement et jamais en présence d'hématies
de mouton ou de chien. Il ne r&@rr non plus dtvent n'importe quel autre antigine mGme
si cet antigenc
est de provenance d'un bovin.
-% Elle subit l'influence de l'cnvircnncment at surtout des conditions thermiques
en ce sens qu'une temp&nturc à 40° peut modifier la confornation des antigènes et des
anticorps et enduire à de fausses kactions,
- La teneur ~~lcvc;So en sel ou snlinite du milieu dans kquel se produit la r&c-
tion amoindrit sensiblement son sff'ct alors
"y1:: faible teneur es sel le favorise
- Elle Jépend dans une très large mesure des conscntrations de l'antigène et de
l’anticorps et SC prokit très rapi:.iemcnt d’où Ik neccssi% et ltimportance d'éviter des
contaminations pouvant mener à des résultats très difficilement intcrprEtables.
- Son intensitb pe:.it être reduite en fonction de la variation du pH du milieu
dans lequel elle a lieu.
. . /. ..*
I I . - PARTIE PRATIQUE
Toutes les technique relaté6‘s sous cc chapitre ont et& d’abord. présentées au
cours SGUS fcrne d’expose avant dtôtre miscscn application pretiquû au laboratoire.
II. - 1 m Séparation des trypanosomes du sang
Elle 3 pour objectif 4 gextr3ire les trypanosomes du sang et B&+ pouvoir aussi les
ccnsentrcr en vue des préparations d?ai:tigènes destinés aux test sérologiques et 3. ce
titre deux techniques sont utilisées,
a) la m&tnode de Lanham : clla consiste ?3 faire passer le ~a:12 infostc de trypanosomes à
travers une colonne DYGZ cellulose.
Les hémilties ayant une f’orto charTe négative soni;
v
retenues par la colonne ct les trypanosomes chargés moins nCga tivement sont élues et
collectés dans un bêcher ;
Technique
m....-
- Fixer un entonnoir oi? porcelaine sur t!n support ou a défaut dc l’entonnoir utiliser
corps d’uno seringw ;
- ijett;rc du DEAC cellulose dilue avec du P.S.G. pH C.0 (500mgr do DE 52 pour 2 litres
de P.S.G.) dans l’entonnoir ou le corps do la seringue puis laisser se tasser
- Placer un papier filtre :&oup& suivant lc dimension de lvuntonnoir et verser du tam-
pon P.S.G. dcssus pour ouvrir ït23 pores du filtre, rincer la preparation, et laisser 2
rouveau
.
s e tasser
- Verser lentement le sang préleve sur ru?ticoagulsnt et contenant les trypanosomes sur
le filtre selon la proportio n d Oun volume de sang pour 3 volumes de DEA
et laisser
s q infiltrer
- Verser 2 nouveau du P.2.G. et laisser éluor
. l’élvat est recueilli dans un bêcher plac6 sous la sortie
de 1 * en tonnoir
- Afin de s’assurer du passage des trypanosomes prelcvcr règulièrement une goutte de
lf(-luaS, à 1:% s o r t i e Je 1Varitonnoir et, observer entre ~XK+ 2.t lamelle au microscope et
dès que la prkencc d*hématic sera constatée arrêter l’opération et transvaser le pro-
duit de la récolte dans un tube à essai
- Centrifuger 6. froid ci, raiscn de 1, WO tourskn
pcn\\iant 15 m22 en vue r?e consentrer I es
trypanosom3.s ainsi récolt&.
l . . / . . .
-6-
II. 2 - Tec!lnique de maintenarce des trypanosomes au l~borstoirc
Les trypanosomes pcuvent Ztre maitenus soit sur des animrux vivants de labora-
toire : souris, rats, lapi.ns,cobayes ou sur C?c petits ruminants : imU~Gils, chévre en in-
jectant à ces animaux du sang contenant les parasites, soit sur des tsAts6 en les fai-
sant nourrir avec ‘du sang dvun animal porteur (de trypanosim8ds,
soit sous forme corig&e
et conservés dans lqazote liquide.
II. 3 - Clônage et stabilisation des trypanosomes
-
-
II. 3-1 - Clônage
Le principe du clEnege consiste A d6vcloppcr chez un animal une souche de trypa-
nosome dont la pOpUl2YiCXI qui en sera issw proviendra d vu~ seul et ;Gme trypanosome et
pour ce faire deux techniqzs pwvent être utilisées :
a 1 - la première consiste i procéc’4r à un.: sQrie do dilutions progressives du sang para-
sita partant de 108 trypano/!zl. pour deboucher vers une concentration de 1 trypsnosome/ml;
Pr6lcver un ml de cette 5ilution, lp injecter en 1-V. 5 une souris : 3p.r
I
la veine caudale
et suivre l’évolution rie la parasitemie
b) - la deuxième td?chniqas quant à elle, prést?nt.e beaucoup glus de certitude par le
procédé dqisolenent d’un seul trypanosome i partir de la métho..:.~ sl:ivant :
- pr6lever du sang infeste !c!e trypanosomes dons un tube hépwink
- à l’ai& dquné aiguiil<S trCs f i n e , ~rClcv3r unr trlute petit: goutta _Ie sang et la dépo-
scr dans le godet 11 q une kme crwse ou lr:m<: d p entomologie,
- Gposer quelques gouttes de &.y&~;1 tout w tour du creux
. I
,Je la lame afin ZPéviter
1 qassèchement de la goutte de sang et recowrir d’une lamelle 22 x 22,
- examiner la préparation au microscopt: et s 2 assurer qu 1 on rtca coi t qu’un sel11 trypenoso-
Ei
me dans toute la 5répzration etkel est le cas
- retirer la lamelle et ajouter une ou deux gouttes de glycérol à la préparation pour
la diluer.
- aspirer la totulité C~L cette prepar:tic;n lkns uné seringue T: insulin St injecter tout
le contenu en I.V. à une souris par 12. veine caudale co3~ne pr&e<e:~mant
- garder 12 souris en &vage et procciider à des examens quoti:lie:s Je sang en vue de con-
trôlcr la sortie de trypanosomes.
l . . / ..#
-7-
Dans lc; Cas d'Uiî &sUltat poSitlî tCUt IC? sang de Ccitte 3xris pCR.VP2 ?QV
prc%vé et cons.erG dans lvazcte liquide après avoir p&alableml;nt stabilisé les trypano-
somes qu’il contient.
II. 3 - 2 - Stabilisation et crnservstion des trypsosoicas sns 1 t Azote liquide
----*
La stabilisation d.krit 1.q &tho?c, de conservation :!cs tryponosomes bans 19a-
zota liquide tout en &ita;flt de leur faire subir un choc pouvant conc!uirc 2 leur alter+
tion,
.. Prelever une quantité de sane hépzriné à pwtir dpun donneur fortement parasitk( con-
sentration finale d’héparinti 5-10 unitE p:li ml de sang;)
- Ajouter quelques gouttes r?e glycerol jusqu 'ZI une conswïtration de lO%
- Laisser pendant 1511x2 pour équilibrer
- Pr2ndre une ran&e de micr::kubes et à l paide d’une piYpctte prstecr , remplir chaque mi-
crotube à moiti.6 (enviror: 70 oicrolitres/tube 1
- Laisser un cspncc vide aux &XX extr6mités de chaque tube puis les boucher chacune avec
du plasticine
- transfarer les microtubes dans de petits tubes à essai en matiere pl?.stique et intro-
duir~.; à lPint4rieur un morceau DDE papier portant toutes les inbications relatives au pré-
lèvement : nL, :lak, origine. Puis .:n se servant Gvunc grosse aig-uille pratiquer des
trous à chaque extri$mité C!U tube pour permettre l’infiltration de lTazote liquide à lPin-
térieur
-- Introduire les tube:: à essai ccntenw t les mic:wtubcs
c?ans une bx~W.lla en plastique
et X lar,se ouverture am&a&e a cet effet prtr un système cl9 iscl2tion, en la recourant C:l
d vune couche 2s plasticin~e ;!‘uno eprzisseur tIP 1 cm envir: ,n wintanue tout autour avec du
sparadrap.
. 1$3intêd,r la bouteille er: suspension dans le container G~nzotc~; liquide afin quvelle
soit entièrement recouverte par les vapeurs pendant 2 heures pour refroiC5.r
. Après refrcidissemcnt i;iTX~Sf’5rCP lC:s tubes à essai contenant les micrctubes clans les
canisters adu ccntainer dlazoto liquide.
Le transfert devra Ctre op6rC à l’entr& du container ou 32 UFiliSc?i?t
un bain d’azote
liquide pour éviter un-: hussa de 12 teri:pSratu.r~~
.zt c?,rj&c: ?x.loi 7 ':q
*
'1X
.'
canisters sont plongés
entièrement dans 1 ‘azote.
..* /
.*.
,*
c
- Extraire un micrctube, 10 rechauffer , le couper et Gposer une goutto entre lam? et
iamclle, puis crbservcr au microsccrpe pow s13ssuror de 13 survie tics trÿp~nosx?es.
II. 4 - PREPARRTIOI\\T DPANïISERUM
--.a-
lvinjection rép&t$e à 'un admal d9une certaine dcsc dPimmunoglobulincs en prove-
ninw dpunG espke differer,tc 5 pour effet chez lvanin!al qui rer,cit cet entigone 1~ prc-
duction ?Panticorps specifiques dirigés contre ces irnmunoglobulines et clCsign?s sous le
nom d'anti-imrwnoglobulines
qu90n retrwve dans lc S&U~ de cet animal qui porte ainsi
15 ncm d9antis&um.
Technique : '1O : &ulsionner à pwties égales une solution d9immunoglobulines
titrant 20ugr/ml avec dc ïvar:juvar,t complet de Frct8nd pnis injecter 2ml 5u prcduit à la
plante du pied d'un lapin en rcpxkissnnt 19 d5c.t--: en deux endroits diff6rents (le ContrC-
lc ;ivunc benne Gmulsirtn peut svop&er e?l dép<>SZn t une g:jutte ilte cette Gmulsion dans un
bêcher c,xter,ant de lpti~:u.
Paix le cas dtune réassite, 17. gwtte reste intacte et
fl9ttc 5 la sur I-,ce dce l"ëaii tandis quvelle fond et s& rlissipr w cas ,-le for: réussite et
ainsi lvopérntion dcvrs
être pcursuivid jusquvà lPobte:\\tion d7ur, bon résultat)
20 : 15 jours apr&s &pétw 12 même injection et xix mêmes w:kùits ti vune 2utre émulsion
faite avec cette fois-ci l'adjuvant incomplet & Freuni’: et titrant 15 ughl.
3" : IF, jours après, l-! ~:leüxiène injection reprendre comme pwr lc? lereinjection
4O : IC jours après, prélcvw environ 15ml iu .sc?nc de cc même lapin pnr ponction veineu-
se, réccl'cer 15 scrum et 1.2 tcstcr en immunodiffusion ;xd immuno&lectr~phorèse pour déce-
ler à présence :<vanticorps anti-immunoglobulines.
II. -Ej- Il%lUWODIFFUSïOI:
Le princirx ?e lvimmunodiffusion est la I+ctection directe d9snticorps contenus
clans un serum donné en mettant cz Grum en contact avec lvZntigènc; pour lequel les xnti-.
corps sont rechcrch&s.
Technique
-
-
- Etder une couche d9agerosC à O,'l5% sur la lame + 0,05% ~?e i%?J2 puis ldsser sécher
- Pratiquer 4 ou 5 creux a la su-fxe <fu ,gei
_ !!v2garr=se d'abord, et tout sutour i;e chacun
ci9eux ensuite ci-wsw bes puits <!Pur~ diamètre be;-.ucoup plus petit que celui des premiers.
. . . / . . .
- 10 -
- Déposer ltantigène dilu-2 dans chaque creux tandis que les sérums 5 tester sont dispo-
sés dans les petits puits situt
autour
- Incuber pendant 24 heres a 37 O Zans une boite de petri contenant O,O% de %a'42
- Lt?s rkultsts positifs c'est à <ire les ~~~ru~~scontecarii;l~rlnticorps
s;kifique de l'an-
tig@ne se traduisent p7.r des arcs de precipitation visible-s 5 lqocil nu et dont l'inten-
sité est variable selon la teneur du skwm en immunoglcbulines.
II. - 6 - IMMUI\\rO~LECT;30P!IORI7SE
-e-w
Le principe ds l:i~!ununoélectrophorése est le même que celui de 19immuno5iffusion
à la différence que dans cette technique on fait migrer
l'enti.g&e dans une chambre
ilectrophorétique.
TSCHNIQUE :
Etaler une couche d'agwose 5. 0,15% et 0,01X de thiomarsalate
Creuser des puits en surface toujours dms le sens de la lOIT@JE.!AÏ Cd3 12 lame.
Déposer lqnntigène Ans chaque: puits puis laisser migrw Ans une chambre slectropho-
retique pendant 1 nuit
II. 7 *m ISOLEklENT ET PüRIFICpiTIG?! DES II+lMUNGGLO:';ULIP!i:L,
--- --
- -
.--
II. - 7 " 1, - Isolement das globulines
----l-P
La m<i;E?o(ie utilisées est 12 mi:thotle )?e précipitatioi: pr:r la sulfate JPnmmonium
qui permet d-e s+.rer 1~s i>lobulincs ou anti-j.mnün~olobulinas tics autres composants <lu
sang.
TECHNIQUE :
--
Prendre ~;n volume don& (le sérum auquel on ajoute goutte à soutte un égal volume
d'uiw solution satur6o c.ie sulfate dFammonium (soit SF;G gr NH4 SO21 en agitant tout dou-
cement. laisser 30 mn a 1 heure a la tely&ature ambiante Tdis cer!trifui:,sr il froid à
raison Ze 3.GGO tours/ïw pandant 15mn. rcdisscudre le culot de centrifugation dans un
volume $, q eau ,:lis tj.ll& a<.;,: 1. YJ volume de sérum initial utilisé. Renouveler la w&i.pi.ta-
tien une deuxième puis u.nd2 twisikm fois guis cj.i.~oucfx~ 1~2 (qt?r~~-l' Culot cian> cl11
. ../...
- 11 -
PDS 5M PI-I 3,8 à un v,l.w:-. 6;::~.1 a la moitiés du v?lumc- de s&um initic:l, Dialyser contre
le tampon PSS et vériÎier 1: prCscnce de .l~ammonium en m<lanC;eant
1 ml Zu rro?uit
.A
de
dialyse 2 un &g,al volumi: ::'unc soluti?n ? l:C!Sk de chlorure de bar:. ,m. L,L virage au trou-
bic de ce mélxge témoi;gw de ln pt&3cncc dpions ilfe
,
'
dmmonlum et r?ans co cas, 17: ::ia1yse
devra Ztrc poursuivie jusquf$ la rkaction négative cfsst-5-s.!ire ltcbtention d'un mslan-
gc clair,
II. 7 - 2 - Purification des immunoglobul:int.:s
---.
Tandis que lz, pr&ipitaiAon pérmot :!tisvler la totalité &s globulines sériques,
Z'autres techniques sont utilisées pour -5limir-w la sulfate ::?-dmmonium ou bien pour ot-
tenir ux, classe ou une subclassc dPirxxxx~globulines.
II. 7 - 2. 1 - Filtraticn sur gel
_I
Le principe consiste à eluer 1~ substxnce desir&?+. travers une colonne de Sépha-
dex G 25 par le grincipc ~~*cxploitation ('es différences dc <!imensions :?é mol<cuics pvr-
mettant de faire passw rapi~.:ement l.-~c*
cIU unes pendant que le p3ssaSe t'es autres est retar-
dé.
TECHNïOUE
- Mettre du gel de Séphadcx G 25 préainblement &quilibré avec un tampon TX3 SM 3. un pH
7,8 dans une colonne de chromztographic
v& laisser se tasser.
- Rincer la prép aration en ajoutant du. P,C.S, puis laisser Q-outtor
- Verser lentement la solutic:1 Ue zlobulirws enx surface, ajouter du tampon PDS pour
diluer et laisser élurr
- L*elu?t ccnstituant la fraction ~~Pimmunogl~~bulincs est recueilli dans des tubes et
chaque tube devra &re contrôli peur vérifiw 1:: présence de xulfaté d7ammonium comre
préc&!erment en ajoutant du chlorure de barium.
Ii, 7 - 2. 2 - Chr~matographie sur khangeur dvions
En faisant pousser une substance c? chnrlr;<: &ctrique dG?Yl& a tra-vers un gel ci
charge contraire, on cr:%: un effet de rétention de la substance par 1~: o;el sous forme
.*. /
..*
- 12 -
de liaison. Cette liaison gel-substance peut etre rompu: lorsq~~.'on ajouto un tampon ci?
charqe electrique de m$m<; nature mais plus forte quo celle r)e 1~. substance retenue.
Et c'est suivant ce pro&6 que les Io C,, Ig (ii2 et Ig ‘1 Sont. isolk.
TECHNIQUE
_-
- Mettre du DB 52 k@X.5r~ 2 un pH 7,5 #avec du tampon ?O 5
4 id dans une colonne de
chronatogrzphic
connrct~k à. un collecteur et laisser se tasser.
- Ajouter la même tampon pour rincer le contenu (le la cclonno 61; laisser egouter avec
le même tampon.
Verser lertement la solution de glcbulines Cr~is 1;: colanna
. I
puis ajouter l!r Campon
PG4 et laisser éluer. Les IgQ2 sont élu?&3 en premier lieu et sont recueillis dans les
tubes dispos& au fliVcZ:l CIIl COlleCtSlt.
- Ajouter du tampon P04 10 M pour faire elucr 10 premier pic correspondant alu 1 QG
J 1 jus-
q!i'à épuisement complet.
- Ajouter du tampon PO4 50 I! pour -avoir une dernière 6lution corxspondant à un mslange
d'un ler gic d'J+C, et TgG2 puis d9un deuxième pic dvIgM ot (391 p l
9 1
II. 7 - 2 - 3 - Chromatogrephic dPAffinit6
_I-^.--IIY--
Lc principe consisk à coupler un gel appel6 mr:tri.cc: i: un ce1 biospkiîiquo
appel6 ligant ct capable de se lier &lecti&ment avec 1~. fr2lction
iluFon désire isoler
d9une substance donke. Cette fraction peut constituer 1 Pélfkknt à retenir ou ?lorr
19él&~ent a rejeter. Dans le cas ou 19élément ést à retenir OJ alors l'el~me-nt à reje-
ter. Dans le cas 06 1~6lCment est 5 retenir, l2 liaison avx li: ligt.iit devra Ztrc réver-
sible afin de pouvoir 19;~iu~:r se:.1 après. Dans 1~: 5:s cc il dwra $tre écwté, cette
revwsibilité n'est plus neccsseire puisque seul l'&lSmont dkir& aura travers& la co-
lonne.
TECHNIQUE
m--.
- Prendre du se1 de S6phzroso constituant la mrt.ri.cc cciüpl~é avec do lc? proikine A qui
est le ligwt.
- Equilibrer avec un tampon PBS 0,01 renfermant 0,2% ciPazide ci\\: sodim,
.*. /
. . .
- ‘13 -
-- Mettre dans une colonne connectes à un collecteur.
- Verser 12 solution $2 ;;lcbtilincs ;3t apr+s leur absorption totale pzr le gel faire éluer
avec du tampon NaH2 PG4 9,1 M pH 5,9, Pour obtenir le Ier Tic >'es IgG2
- Après le premier pic, a2outer du tampon AaH2P04 0,l Y pH 5,0 pour obtenir le second
pic des IgG,
Les 2 pics sont colloctEs séparemont et corksponkn t aux fractions IgG2 et IgG,.
La densit6 optique dt! chaque pic est d&tarminée par une kcture au spectrophotomètre en
vue du calcul cIes taux de proteines skiques fractionn6es.
II. 8 - PREPARATION D9ZJJTIGENES
Les préparations r!'antigènes utilis6s dans les Bpreuves sér?,lo,giques varient 2n
fonction dc la technique de diagnostic envisagee. Et c'est ainsi qw 13anti$ne destiné
à la technique d9immunofluorescence
et compo& dîune suspension de trypanosomes sera
clifférent de celui de 17ZLISA cu les trypancsomes
doivent subir une desintégrztion par
le procér!é de la sonification,
II. a - 1 -Antigènes pour immuncfluorescence
-11_1_
- Saigner des animaux dont 1.~ sang est fo:rtez5nt parasité sur anticr:agulant.
- Centrif+uger le sang ainsi reweilli à 2.00 tours/mn pendant 15 mn à froid.
- Verser les 2/3 du surnageant et recueillir lPinterphase.
- Diluer le surnageant au 1/2 avec du tampon P.S.G. pH 8,O.
- Séparer les trypanosomes c?u reste du sa.rlg par la metho& ce lanhnm <écrite plus haut.
- Centrifuger l'éluat 2 trypanosomes recueilli a raison de 2.OGO tours/mî pendant 20mfl
à froid pour CCX@entrer les paraSiteS
- prendre un volume dlcau physiologique représentant 10 fois celui du vclume de sang
initial et remettre le culot <je centrifugation en suspension
- Fixer de la maniere suivante :
1 volume de suspension de trypsyiosomes pour
2 volumes de fixateur puis placer sur un agitateur magnetique pendant 1 mn et laisser
fixer une
nuit à - 2C°C.
..a /
. . .
- 14 -
Composition du fixateur :
Acétone réfri;;&C : 80 ml
FOPKGI.
: 0,25 ml
Nac1 à c3 ‘, 0
: 19,75 ml
(le fixL.
.r davra être une greparation extemporanée)
- Centrifuger a 1.500 tours/mn pendant 15mn à + 4*C afin dPéliminer le fixateur.
- Resuspendre le culot rie try‘Janosomes dans d- lveau physiologique à raison de 2 fois
le volume initial de sang.
- centrifuger à 2 _
.5G3 tours/mn pendant 15 mn à 4*C puis répéter 3 fois cette op&ation
afin d’eliminer entièrement toute trace de fixateur.
-. Recueillir le dernier culot de lavage ot suspendre dans du P .U. S. 0,Ol M pH 7,2 ren-
fermant 0,2 04 d 7azide de sodium.
- L’antigène ainsi préparé , peut être stocké soit à 4*C, soit à la tempercture ambiante
après avoir 6t6 titr6 puis reparti dans des flacons de 1 ml.
II. - i7,. - 2 - Antigène pour 1’ELISA
-1_11_
- RÉcolter et isoler les trysanosùmes comme precédemmect.
- Arès centrifugation, remettre 12 culot en suspension dans un tampon tris Hcl pH 8,û
contenant 1 iq de PMSF (Phenyl-m6thyl-sulfcny-fluorido} et 5 7~1 U91c. “z-&tamide selon un
volume égal au I/l0 du volume initial de sang et r&&er cette operation jusquv& lqob-
tention dvun volume à -eu près de 20 ml. ci? culot do centrifugation
- sonifier 11 préparation jusqu”à la lyse complète Ces trypancsomes dans de la glace
avec un o.ppareil de sonificatiûn.
- Centrifuger le s0nics.t à 3.00 tOU?S/lTXI per&nt 15 i!lIl à. 4*C.
- Recueillir le surnzi;eant, centri.fugw 5 nouveau ; 15,O::G twrs/mn pendant 30 mn 1A.s
filtrer le surnageant à travers un filtre milliporc.
Ultracentrifuger le filtrat 2 40.000 tours/mn pendant 3G mn.
Recueillir lc surnagc:c?nt ct lu mettre à dialyser contre un tampon tris 5rJ PI pH 3 ,O
puis lyophiliser le produit de dialyse ainsi obtenu.
- Déterminer le taux de ?wt6ines, Fuis titrer ‘et stocker a - 2OOC.
. . . / . . .
- 151
II. - 9 - PREPARATIOW DE CONJIJGUE POUR ELISA
Le test dtELI% requiert l'utilisation d'un conju=& ?r&par6 en couplant la mo-
léculc d'anticorps avec l'enzyme, horseradish peroxykse (H.Z.P.1 et, il est utilisé
dans les analyses sérologiques dsune large gamme de maladies arlimaltts. Cette technique
est le plus souvent utilisée %tns les m&tho,:!es indirectes de ditection de 1: présence
d'anticorps spécifiques ,q'un nnti&ne connu. La méthode de conjugaison decrite ci-
dessous conserne spécialement la p¶tion dvun ccnju& dPantis&um do chèvre anti-
immunoglobulines de bovin, toutefois cette procédure de conjugaison peut k%re utilisée
pour le couplage dtantigobulinw produits dans une large variété dPespèces animales.
II.9 - 1. - Préparation des immunoglobulines
.-
Les fractions immunoglobuliniques de l'antisérum sont précipftoes p-r une solu-
tion saturée de sulfate dvammonium à 50%
- Les slobulinos précipit&s sont lavées deux fois avec une solution L:e sulfate d'amtno-
nium à 50% puis dissout@ddans un tampon PO4 10 M pH 7,G
- Ensuite dialyser lwgement contre le même tampon une nuit à 4*
- Fractionner les zlcbulines an faisant passer le produit de dialyse à travers une co-
lonne DEhE 52 cellulose (comme décrit precédetmnent)
- Tester en immuno&~ffusi.cn les fractions obtenues et colles qui prkentent des bandes
de. précipitation sont consentrées
- Déterminer au spectrophotomètre le taux de proteines &cntuellement présentes dans
les fractions.
II. 9 - 2 - Pre-Laration de 1'Enzyme (OXYDATION)
w - . - - -
-..-
- Mettre 10 mn de HRP dans un fiole
- Ajouter 1,8 ml d'eau distillée
- Ajouter 200 ml d'une preparation toute fraîche de sodium périodate (32mgr/ml goutte
par gouttejet
laisser r&langer 9u fur et tï mesur~avec un agitateur magneti-
que pendant 30 mn a la temperature
ambiante pour permettrelbxydation de lpenzymec
- Dialyser contre un tai!pon sodium acetate 1 M pH 4.4 pendant une nuit a 4O.
. . . / . . .
- 15 -
IX. g - 3 - Preparation du conjugué
- I - w - -
- Pren!re 12 Ml de 13 soluZ.on dpenzym~tr ainsi obtenue auxquels on ajoute 2ml de tampon
carbonate 0,2 M pH 9,G.
- Ajouter 30 mgr de In sclution d'immunozlobulines (proportion dpl part dfenzyme pour
3 parts de globulines) et laisser melanger pendent 2 heures 2 la température ordinaire.
- Ajusttir le pH de 1~. sclution à 7 ,2 mec du Na2 1-I Pc),, il,1 m et laisser à 4O pondant
1 nuit au repos.
- Bjouter 2 ml dsune solution frniche 'de glycine (rl mgr f.1~ ,r;lyc,inc dans IDOml de PBS
fJ,Ol M pH 7,2) ou borohydrate de sodium et laisser ,'i ncuvoau a~1 repos penclant 2 heures
a la tcmpirature ambiante.
- Séparer 1~ conjug& de prot6incs du rGsti2,
en le faisant p:zssor à travers une colon-
ne séphadex G 100 apros une nuit de dialyse,
- Filtrer l'éluat ainsi recueilli 5 travers une membrane filtranto O,45 u et mettre
dans une bouteille sombre pour protèger contre la lumière.
- Ajcuter 0,25 ml dgazi3e de sodium pour la consentration finale
- Filtrer puis stocker à..2V"
Conjugué pOUY immunofluoréscence :
- - -
Le conjugué pour 1~ :ests dgimmunofluorascence est prGpar6 à partir dOun coupla-
ge d~immunc~lobulines avec 19isnthiocy~nate du fluorescoinc.
- Prendre un volume l!onx~C: de solution de protéines titrant IF msr/ml et lt: diluer dans
un autre volume 2e tampon carbonate O,O5 M pR Ij,6
- Prendre: lt: fois le volume du même tampon de .%.lution des immun{o@obulin,:s et dans
lequel on diluera 13 fluorcsceine à raison cl91 mgr/ ml de tampon.
- Dialyser la solution de protkincs pendant une nuit 5 Lt0 contre du tampon carbor;ate
bicarbonate pTI 9>fi.
- Transferer la membrane de dialyse contenant les pwtéines clans la solution de fiuo-
rescéine et procéder à une seconde dia1ys.e de 24H pour faire la conjugaison proprement
dite.
.". /
. . .
- F i l t r e r a tiTVerS une csl~mne ie &phatlex G.56 pwr $lirnin::r lSds traces d e fluores-.
ceini; yi.on fixiks.
Les dluats c!ont ce ra?pwt est CWlpi~iS entre? 2,s <.:t 7 constituent lt-s fractions
5 retenir et ;rinsi tous les autres se ’sI.tuant hws <!e ces bimittis s:mt élimirGs,
- Faire passer 5 travers UI? î,iltre et njwter C!,?j d 9iizi.k C:C SGdiüm $!iY d i l u e r 3J 1/2
avec cte la glycérine pure, puis titrer et stocker à -20°
II. 70 - TECHNIQUES DE DIACNDSTIC SEIIOLC)GIQUE
---.-
L t im3-wnofluore~cénce indirwte et 1’ELISrS. sont à l’heure act:uell~ lzs deux m&
tho=les 3e diagnostic
sérolo,~ique 1~s plus utilisées e:~ raison de leur sensibilité,
IltJ
leur aspect prc?tique permet tan t 4 *effCctger i:e@d 7dnlysas ~.!ifPéiG?S c;t surtout
1:~ leur hautespécificit5.
II. - 10 Y> 1 - Immunof luorescencc
Lc principe consiste 5 mettre en évidër!ce la grGscncc iPanticorgs scriques per
contact gdvun sérum suspect avez lv 7ntiC;ènc agent de 1,: mal3:lic consi~&5r&, ré&16 en-
suite par un antisérum spécifique de ce s&um conjugu:: CI 1. s iscthiocyancte de flüwos-
chine.
TECHNIQUE
- Diluer lDantigén~~ dans un tsmpon I?X O,Gl K pH 7,% ot lt: ?éposw claw 12s cercles
~dpun~ l?.mc à imz?unafluoroscence (di~peniblc c!nns li: mwch;i puis lG.sscr séchw 15 à
29 mn 5 In ternp&uturc zm!d.c33t,e 3u 5 5 10 mn (A ?“OC.
-3 ;“:bsorber l e s&um d,ans ;lu lysat de lymphtcytes à raison d’un vOlurne C!e SérUm pO3r
39 volumes cte lysct et laisser 3cSm-1 2~ la ten?p&ature aï:bi:xte.
sil Dilutiw ICS sérums 5 testar i-ians !du tzqon ‘E%S pH 7,3 ad~!itionnk de &PU~,: +lbumine
de bovin à 2 74.
-8époser dzns C!12tTlleiti CrPclc: 25 ul de Jilaltion 6.e s&um corrcs~cn~~nt et lzisser 39 mn
en atmosphère humide 5 1~ tunpératuro ambiante.
Y Monter une 1c:melle 22 x 59 5 l’r?i:!e r17un5 ?r6parntion ?i parties +$.a de r$.ycérini;-
et PBS gE; 8 ,a3 guis lire :L*u miçrcmcope ; ultraviolet.
Les rt&t&is positives sont r&îélées pZti2 une flUoresCc?nc0 des trypanosomes
constituant 19antigèno et Sur L:uquc:i.s s’est îixé l’aritico;-;JS li6 rli 17z9tisérum marqué.
Les r&xtions n-a’,‘,;al;ives par contre sont sombres.
II. 10 - 2 - ELIS;1
Le Crincipe de 1- ? ELISA comme celui de 1Qi?INiXXü:'lUOK2sCWX~ décrit ci-dessus
consiste à décel.cr 13 prkence 6 9 anticcrps ou d ‘anti.$ncs circulacts ;:~~~~S un sérum
cOnsicGr4 2ar le même s~stkiz de r6aetion antigCrX-anticcv::s révélée ensuite par une
substance chromOg&e
II. lG - 2, - 1 - Détection d’anticorw
p.-
-I-
Cettt teclaiquu sert EL
détecter des anticorps cirxukwts dans un s&um sus-
pect permetttlnt i.imi C~:E: 3ire si l’animal. a étt< au mcins unu foi,s eii contact nvec 17an-
tigène cl.~ 1~. malx!iû recherchée au mA>me!:t du prél&emcnt cîyazt alors provoqué la pro-
duction d ganticorp; 5irigis contre 1 Vantigènc de cette mnladie,
. . . / . . .
TECHIXQUE
- Sensibilisation de plaques de microtitragc :
ou 20 ugr/ml
- Diluer lqanti&x~ 5 1: cvnsentration requise : 5 u&iil 1C: uer/ml/avec u:x solution
de P13S O,Ol M ?H 7‘2 contenant 3,22X d!azide de sndium
- Emplir chaque puits do la plaque avec 100 ul dfantiC;ènti c?iluC,
%- Incuber la plaque à 37O pendant 2 heures puis transf&r h 4" pendant une nuit.
- Verser lqanti&x: puis l:.vcr 32s pl-ques 3 fois successives avec du tampon de lavnge
mGlang6 a du tween 20 à S,l% : remplir chaque puis jusqu'aux bords avec 1~; tampon,
laisser 3 - 5minutes en contact puis verser et sèchor,
- Rloquor 11~ parois ~10 la p?:quc avec une prot&,x de provenance diffèrcnte de celle
de lfcspGce aximlfl~ pour l::queile 1~ &rum est nnalysé (albumine C?C chèvre, moutxn,
lapin, etc...) à unt concentration de O,2 01.D -lr
L.i distribuant 200 ul du tampon de blocage
dans chaque cupv.1~ et incuber pendant 30 mn à 37O. '.coutcfois, ce blocage peut i:tre
omis mais dans ce cas, le sérum à tester devra Vtre Cil& dans un tampon à O,F;n/o de
protéine, L'interêt dc cette pratiqu:>L est C!i-; saturer lr: plaque un f?.isant occuper tous
lés pores laissés libres p-r la protéine de sorte à Eviter toute 5~~5s~; réaction,
Y Remplir 1;: plaque avec des sérums ds: contr6l.e ct 1~s s&ums j tester dilu<s à I/l00
avec du tampon de diluts.on nuis incuber 3 37O peudant li heur? GI. à la temperature am-
biante pendant 2 heures.
Il est en outre rccomrxand6 de tester aussi bien 12s serums do contrôle que ceux
destinés t: être analys&s en dr;ublc c'est 5 cliro cn utilisent 2 puits par s&um, et de
remplir 1~ rangét; 1 de A h H avec du tampon de dilution si on doit utiliser unlecteur
multiskan pour mesurer les densités optiques
- Laver 1~. plaquti 3 fvis successives com~fie précédemment
- kjou%er lC.6 ul de conjugu6 dilué en fonction de son titre de travai* dans du tampon
de dilution et incuber pendant 1 h à 30" ou 2 heures à la tempdrature ambiante,
- Laver 3 fois de suite de la même manière avec du t.ampon de lavage et sècher.
- Diluer le substrat G-phenylendiamine & une consentration do 1 mgJm1 dans un tampon
citrate G,G5 M pi-I 5,5 auquel on a ajoutL 1% dvhydr?,$ne pcroxydose.
- Remplir tsus 1s.~ puits .wec If:! ul de cette preparztion pour révéler et incuber 15 à
31kn S. 37O et dans lPobscurite puis arrêter la réaction en a,j%tant 25 ul d*acide sul-
furique 2 N dans chaque pui+ .
- Mesurer l*absorbence au spectrophotomètre et i une vitesse de 492 nm
II. 10. 2 - 2. - Détection tks Antigènes a Partir d'Anticorps Monoclonaux
.I_.--
Un anticorps mc>no&.kal est un anticorps produit 2 partir d'un seul clone de
cellule. Par consSquent, 52 spécificité est qufil est diri.g@ vers un épitope à l'oppo-
s.5 de lvsntis&ua produit chez les animaux par immunisation qui contient un melange
d'anticorps dirigés vers plusieurs épitopes de lvanti&ne immunisant. En raison de
cette specificit6, les antigitnes monoclonûux constituent un excellent moyen pour 10s
analyses de mélange d9anti&nes en vue d'identifier et de purifier les antigènes qui
conviennent pour un besoin donné.
L'application dos anticorps monoclonaux est en hausse non seulement à cause de
leur grande spécificité mais aussi la facilité selon laquelle ils peuvent Gtre standar-
disés et le fait que les cellules hydrides produisant les anticorps monoclonnux peuvent
être conservk de manière permanente.
Ces ar;ticorps monoclonaux d*utilisation réct;ntç,pormetterrt la détection dPanti-
gènes circulants dans le sêrum d'un animal donné et d9avoir ainsi des précisions sur
lvktat pathologique de cet animal à la période tixacte selon laquelle le prelévement
de sang a 6té effectué.
. . /. ..*
- 21 -
La technique d’utilisation des anticorps monoclonaux dans les méthodes de
diagnostic sérologique est à peu prés semblable à celle décrite pour la détection
d q anticorps pzr ELISA.
II. 10, - 2 2 - 1 - Fréparakion d9anticorps Monoclonaux
a) Immuniser un animal (rat- souris etc . ..) avec lvantigène qu’on veut rechercher dans
sérums à tester et vérifier si la production d’anticorps est abondante en utilisatn
par exemple la méthode d’immunodiffusion
et en cas de réaction positive
b) sacrifier lvanimal, prélever fa rate puis la macerer en vus de pouvoir fusionner
les cellules spleniques avec des cellules cencereuscs incapables de synthétiser leur
propre immunoglobuline et la proportion cellules spleniques : cellules cancereuses
est de 10 : 1
c) La fussion est assurée par du polycthylene glycol ou du SandiVirus. Dans LE? cas
d’une bonne fusion la cellule cancereuse sPapproprie le pouvoir immunogène du lympocy-
te.
d) Distribuer le mélange de cellules ainsi obtenu dans les puits d’une plaque de cnl-
ture tissulaire.
e) Faire pousser les cellules pendant 10 à 14 jours dans un milieu de culture selectif
qui permet la survie des cellules fusionnees tandisque celles restées libres meurent.
f) Remplacer le milieu par un autre quifavorisele développement ra pide des cellules,
avant de tester la présence dPanticorps contre l’antigène immunisant,,lc choix du test
ayant été opéré avant de procéder à la fusion des cellules.
g) Les cellules cortenues dans des puits dont le surnagent composé du liquide de cul-
ture présentent, urw activité anticorps sont ensuite transfé&s dans des flacons de
culture tissulaire et développées.
1) Les cellules ainsi développées sont ensuite clônés par la méthode de dilution ou
en utilisant
de 19agarose. Ensuite on termine avec une population de cellules prove-
na:?t d’une seule cellule appelé clône de cellultis. L’anticorps synthétisé par ce clône
prend alors le nom d9anticorps monoclônal.
l . . / . . .
- 22 -
II. 10 a* 2-2 . . TECHMIQUE DE D!ZTECTTON DES ANTIGENES CIiiCULA?J'B
- ------.
I-.--e
Le test peut Ztre effectué sur une plaque à micrctitra~e préalablement sensibi-
lisée par l'anticcrps monoclônal pour lP&tude d'un grand nombre de &runBou dans de
petits tubes à essai dans le cas de diagilostic a titre individ!!el.
Lorsque 19antigène est présent dais le sérum à tester, cet an&--ène est retenu
par l'anticorps et lrs éléments non fixés sont é?.iminRs par lnvage, Pour &véler la fixa-
tion de lvantigène, on ajoutc le même anticorps qui a servi a se~isibiliser la pïaauc
mais cette fois-ci conjugué à une enzyme qui va se fixer ii lPantigène et former ainsi
un complexe. Cette combinaison antigène-anticorps est ensuite révélk par addition dpun
indicateur approprié, J.Jn chan,gomcnt de couleur se produit p;ir un virage au vert do sé-
rums positifs alors que leoL1 sérums n&gatifs restent claires, La lecture de la densité9
optique des plaques au spectrophotomètre donne d:?s indications sur le pourcentage d'an-
tigène présent dans l*échai~tillon.
1 - Sensibiliser 12 plaque avec 1°anticorps monocl'kl
2 - Laver avec du P.U.S .
3 - Ajouter 50 ul de s&um à tester et laisser incuber pendant 15 mn à la temp&
rature ambiaato
4 - Vider la pieque et laver avec du tampon do lavage
5 - Ajouter 1GG ul i,e conjugué et laisser incuber 15 mn à la température ambiante,
6 - Laver et rincer 3 fois
6 - Ajouter 100 ul de substrat et laisser incuber pour obtenir lc, coloration.
Les serums positifs sont colorés en vert tandis que 1;~ négatifs restent ciaires,
. . /. ..,
- 23 -
COMCLUSIOM
Les cours suivis pendant la période qu’a duré le stage ont permis non setile-
ment d’enrichir les connaissances théoriques dans les domaines scientifique et techni-
que mais surtout de manipuler des appareils de laboratoire hautement perfectionnés et
de pratiquer des méthodes de diagnostics sérologiqutis de pointe.
Le détection des antigènes circulants â partir d’anticorps monoclônux qui en
est la plus récente présente un avantage certain puisqu 9~Lle pcrmtt dPeffectuer des
diagnostics très précoces en ce sens que leur présence dar s le sérum est contemporaine
à le maladie. la détection des anticorps quant t‘r elle, n9est possible qüe doux semaines
au moins après qu.e la maladi’~tr se soit installée et et peut se Prolonger jusqu’à 3 mois
après la guérison de Ilanimal.
De telles techniques représentent donc un outil très utile da:ls 12s méthodes
de diagnostic séro7ogiqü e i cause de leur rapidité d9exécution et surtout de 12 fiabi-
lité des résultats quvils donnent.
Les autres techniques de laboratoire étudiées dans le même cours (préparation
de réactifs surtout) offrent égalcmknt un int6rêt sûr car m&k si certains de ces réec-
tifs sont disponibles dans lu marché, Leur prGparation sur place permet de mieux mai-
triser leurs perforrn~zwzs,
Cependant, la mise en application de toutes ces techniques pour la plupart
requiert l’utilisation au minimum dPun matériel. de haute pr;rfection qui doit consti-
tuer une mesure d’accompagnement étroitement liée, même si des accomodations peuvent
être opérées au niveau de certaines exécutions pratS.ques.
l . . / . . .
. 24 -
Pendant tout le temps qu9a duré le cours nous avons et6 Ifobjet drune attention
toute particulière de la part des autorités de LOILRAD et à ct: sujet, nous tenons à
adresser nons vifs remerciements :
Au Dr. GRAY Directeur de 191LRAD pour lvaccueil chaleureux qu’il nous rl. réserv& et le
suivi conskant qu9il a su assurer au bon dkoulement du stage.
Au Dr. Jim LEMMUJ, Coordonateur de l’unité de formation pour 19e:ccelente organisation
et la richesse du programrk0 de cours et surtout 19assi~tance continue qu’il a toujours
eue à notre égard.
Au Dr. MUSOKE, Directrice du cours pour sa disponibilité,
son dévouement et sa modestie
qu’elle n’a jamais ménagés afin de nous assurer un séjour très riche dqenseignements.
Au Dr, Mody TOTJRE responsable des relations scientifiques avec LES pr:ys francophones
pour l’intéressement qu’il a manifesté à l’organisation et au déroulement du stage,
A tout le personnel scientifique et technique de lvILRAD qui a témoigné d9un haut ni-
veau de connaiss‘axes necessaires ou parfait djroulement des cours.
A tout le personnel administratif pour les facilités accordées à toutes nos sollicita-
tions quotidiennes.
-1"11-~~~~-"
I\\IINIST?ZRE DU DEVELOPPEt%NT RURAL
INSTITUT SENGALAX DE RECHERCHYS
AGRICOLES (I.S.R.,I.)
-wm--...m-LIPI
DEPARTEMENT DE RECHERCHES SUR LZS
PRODUCTIONS ET LA SANTE !iISIMf&ES
~"m.~d~~~1~--...
LOBORATOIRE !<JATIONAL DE LPELEVAGE
ET DE RECHERCHES VETEXINKIRES
B.P. - 2G57
DAKAR - HANN
COURS SUR LES DIAGNOSTICS DES HEMOPARASSTOSES
ANIKLES hVYC INSISTANCE SUF LI+S
TRYP?,NOSOt?IRSES OiXiWlSE PAR
L'ILRAD DU îw AU 26 MAL 1989
PFF
\\.i. .
No 53,'PARASITO.
SEPTEMBRE 1989,
P L A N
INTRODUCTION
I- ASPECTS GENERAUX SUR L D IMHUNOLOC;IE
1" 1 " L t immunite à media tion cellulaire
1- 2 - L f immunî té humcr&>
I-3 - Les antigènes
I-4 - Les anticorps
I-5 - Lc co@erner t
II- 1 - SEPAHHTION des trypanosomes du sang
II- 2 - Technique de maintenance des trypanosomes au laboratoire
II- 3 - Clônaga et stabilisntion des trypanosomes
II- 3-1 - c16nage
II- 3-2 - Stabilisation et conservation des trypanosomes
dans 1 D azote liquide
II- 4 - préparation d t antiserum
I I - 3- Immunodiffusion
I I - 0 - Immunoélectrophorése
II- 7 - Isolement et purification des immunoglobulines
II- 7 - 1 - Isolement des globulines
II- 7-2
- Puriîication des im~~unoglobulines
I I - 7-2-l - Filtration sur gel
I I - 7-2-2 - Chromatographi,-5 sur échangeur d’ions
II- 7-2-3 - Chromatcgraphie dPa.ffinité
I I - a - Frépzr$.tion d 7 antigènes
II- 8-1 -
Antigènes pour immunsfluorescence
II- 8-2 -
Antig ènes pour 1’FLISA
II- g - Préparation de conjugué pour l*ELISh
I I - Y-1 -
Préparation des iwdnoglobulines
II- g-2 -
Préparation de 1 p er.zyme I Oxydation)
*a. / . . .
II-g-3- Préparatiw crie conjugué
II - 10 - Techniques <e c!iagr?ostic s&ol@qae
II - 10-l - Irimunofluorescence
-s
II - 10-2 - ELISA
II _ 10-2-1- Détection dPanticorps
II - yi-J..,24- Detection des antigènes à prtir dvacticorps monoclonaus
II - IO-2-2- Techniq.le de de~ecticn c?3aiiti$mes circulants
CONCLUSION
-III-
REPIJZRCIEHWTS
--.m.-.---
INTRODUCTION
Le développement ùe l’industrie animale africaine a été de tout temps entra-
,
vc par les ~roblèmkX do pathologie et surtout les methodes irrationnelles de $?Stion
des troupe2ux qui ne sont ~33 toujours orientée s vers un objectif de production maxi-
mum. De nos jours, beaucoup de maladies virales ou baçteriennes economiquement impor-
tantes peuvent. être facilement contr21ées
par la méthode de vaccination. Cependânt,
1s situation est tout à fait differente pour ce qui concerne 11~~ hémoparasitoses ani-
males parce qu’il nlcxwL
iste aucune vaccination approuvée et efficace pour ce groupe de
maladies S
LgILRAD s9est donc vu assigné comme premier objectif de développer de manière
plus certaine desmesures de contrôle officacee LI et économiquement possibles des deux
plus importantes malndies du rhoptel que sont : la trypanosomiase animale africaine
et la l’heileriose à theiloria parv.: ou la fièvre de 12 vallk du Rift.
Ces doux m2ladies sont responsables de la mort d9,apprcxim~tivement 3 millions d’ani-
maux p3r an en Afrique et 12 fiévre de la vallée du Rift à elle seule est accus& de
la mortalit6 de 500.000 animaux par an en Afrique de l’Est. Pour rztteindre donc cet
ohjcctif, 1~ILRAD dont le finysctement est supporté par le Grouûe Consultatif pour 12
Recherche agricole intc;rnr~tionale/équip~ t, de r;mt6riel de haute. performance et d’un
personnel scicntifiquc et tcchniquc trè,= qualifi.6 en faisant ainsi un la50ratoire de ::;
référence. En vue de rspsndre 5. son second objectif qui est la forniztion, un progranlme
de cours basé esscntiellemcnt sur iw résultats acqui.s par les chercheurs et techni-
ciens et les innovati.cJns dans les méthodes de travail utili& d’une part, et 19expé-
riencc personnelle des urs o: &zs autres d’autre part est organis6 chaque annge par
lgunit& de formation du centre et, le cours que j’ai suivi sur proposition du Directeur
des &chepches
sur la Santé et les Productions finimales, s Cinscrit dans ce cadre.
Ce cours a été surtout ax6 autour de quelques généralités sur lvimmunologie et les
techniques de détection des diffkentes hémoparasitoses animales par les methodes
directes d ooxamen de sangs: frais, de frotd;is de sang, de ganglions lymphatiques, de :Y: 4:
cortex etc.. . ld’nbord, cnsuite les mbthodcs d e ciiagnostic s&oSsgiqw : immu2odiffusion
immunoélectro-phorese,
ii?XnuY~Gfluorcsocnce
directe et ELISA.
. . . / .*.
Tiuti~s ces techniqucsi ne pouvmt pas être traitees ckns ce rapport dont
l'objet est de rendre compte du d&oulement .!e ces cwrs seules celles étant les plus
habituellement
collicitées dans la conduite des recherches sur ces malndies seront
expo&s. 3ans une première partie seront rsppelies quelques nations en immunologie,
reçues sous forme d ~expos&s et de conférences tandis que 232s la deuxième partie seront
abord& les m6thodes dz prapsration des diffirents rhactifs et les techniques de
ltiur utilisation dans lrs diagnostics scrologiques.
Dans una troisième et dernière
partie seront tirdes le,- conclusions sur le cours.
1. - CSPECTS G%NEWUX SUR L'IMMUNOLOGIE
LVimmuno1ogi.e peut être d4finie comme étant l?étude de lvimrnunité vis-à-vis
des bactéries, mais cette d6finition peut être élargie par analogie aux rCactions
sp&ifiques ou non ù
-19 u-.
n antigeen tendant à éliminer des substances étrangères.
Les antigènes sont des substances qui réagissent spécifiquement avec des
anticorps ou des r%çepteurs cellulaires et sont capables dz stimuler une production
d'anticorps ou une rdaction cellulaire et la spkificité des antigènes 2. provcquer
une réaction imïîunitaire dZficit ltimnunog6n~kité,
Dans le système immunitaire, on
distingue deux types d'immunité
: 1°immunit6 à mediation cellulaire et ltimmunité
humoralo,
I.l- LtImmunité
.
à kdiation cellulaire
Elle est nssurdc par la lignée zle lymphocytes I d6veloppes et muris par le
thymus et spécifiqucmcnt sensibilist% venant au contact de l*antigène et y agissant
par cytotoxiciY6 directt ou Lib&ation de médizteurs non spécifiques de lvantig6nc.
cette forme dtimnunit6 est transmiss ible nis(tment par des transferts de cellules
mais ne l'est pas par le sérum.
s. 2 - Lv Imrwnité Humcrale :
Quant à ltimmunit4 humorale, elle est medi& pw des molécules spécifiques
de l'antigènti, les anz;icorps produits à distance de leur s_i.to dvaction et la produc-
tion de ces molécules est assurée par les lymphocytes l3 q,ui sont dapendants de la
Zourse de Fabricius chez les oiseaux, mais chez les nami;ifères, 15k2quivalcnt de la
Bourse de Fabricius demeure toujours inconnu.
. . . / l . .
“3”
1, - 3 - Les Antigènes
Ils pcuwnt Etre dCfinis comiic des molécules qui, introduites dans un organisme,
induiscnt une &ponse immunitaire par le déclcnchument *Apun processus biologiqus impli-
quant en pwtioulier 1s prolif&ration ~31: cellules lympho!ïdes et aboutissant à la syn-
thèse par ces dernieros de molkules de reconnaissance (anticorps ou &cepteurs), Cas
-nol&~lcs ont la. capacit& do se combiner spkifiquemênt in vive comme in vitro avec
1 I antigenis inducteur e t élimincr ainsi xx7 effet.
1. - 4 - LE~ Anticorps
Lorsqu’un animal recoit un antigène dans cwtaines conditions, ii peut produire
un antisérum spkifique ne rcagissant qu’avec cet 2.3 tigèna et contenant des protéines
responsables de cotte reconnaissance. Gfl dit alors que ces protsines sont douées d’une
“fonction anticorps” et sfest cecritère fonctionnel qui sert à dkignw ces prot6ines
sous le terme ci9 znticcrps DJ encore dgune naniéro plus gén?rale ttimmunoglobulinestl qui
peuvent être isol5cs des autres constitua,nts de sang par t.!es techr?iquss qui seront dé-
crites plus loin.
Ces immunoglobulines sont classks d ‘aprk leurs caractkes physico-chimiques et
leurs critères anti&nl.que s et sur la base dc critk-es &nkaczx, tous les individus d’une
même espèce don& ont en commun diverses cat6gories d * iamunoglobulines
appelées isoty-
PCS. Chez l’homme par exemple, on a defini 1G isotypcs réparties en 5 classes :
- Les IgG sont 12s immunoglobulines majoritaires du S&UI~ s ‘attaquant <aux micro-
organismes et aux toxines et sont capables de traverser le placenta ;
. les IgM apparai,,,;
qnnt trks tôt au d&but de In r<ponse immunitaire et constituent
donc la première barri&e contre les agressions mais disparaissent progressivement au
profit des IgG. Ils n’onV pas unti capacité transplacentairo mai s peuvent fixer le complé-
ment ;
- Les IgA sont trou& dans le sérum et dans les secrb b.L,,ns
:c; ,-
f colostrum surtout,
mucus intestinal oubronchique, lnrmcs etc...), ils participent 3.u revetement exerne du
corps ;
/
. . . .*.
-Les IgD : présente:; en faible quantite dans le S&Um et pouvant jouer un rjle de ré..
cepteurs sur les membrerles dcslymphccytes ;
Les IgE sont les moins représentkzs des immunoglobulinos sériyues et
jouent
un rôle très important en immunopathologie car elles sont Lt support des manifestations
d'hypcrsensibilit$ immkZate comme lc choc anaphylactique, l'asthme, lti rhume des foins.
1. - 5 - Le complément
C'est un systeme biologique qui intervient dans les procossus immunologiques en
se fixant sur le complexe specifique antigène-nnticorps formé, Il est composé de 9 Sé-
Quencesde C1 & Cg agissant s6parement les unes les autres, et dont ltt C3 le plus abondant
produit le C3a qui augmente la permkbilité vasculaire à lthistaminc ot qui est en même
temps chimiotactique pour les leucocytes polynucléaires. Le C b activé libère lc C
3
5 dont
le ($2 a les mêmes proprietés que le C3a
tandi:;que le C5b active le Ce et le Cy qui par-
ticipe à lri destruction .?o la membrane ?es cellules cnvahisseuses cntrainant ainsi leur
lyse.
1. - 5 - La réaction Antigene-Anticorps
La mise zn urkence
*
clPun antigene et de son anticorps correspondant produit un
complexe antigCne-anticcrps qtii se traduit par 17union de ces d eu:: &l<ments dpoù la no-
tion de spécificit< de cette réaction car un sdrum arki.-hCm;:ities de bovin par exemple
nz réagira qu'en présonce dVhématies de bovin uniquement et jamais en présence d'hématies
de mouton ou de chien. Il ne r&@rr non plus dtvent n'importe quel autre antigine mGme
si cet antigenc
est de provenance d'un bovin.
-% Elle subit l'influence de l'cnvircnncment at surtout des conditions thermiques
en ce sens qu'une temp&nturc à 40° peut modifier la confornation des antigènes et des
anticorps et enduire à de fausses kactions,
- La teneur ~~lcvc;So en sel ou snlinite du milieu dans kquel se produit la r&c-
tion amoindrit sensiblement son sff'ct alors
"y1:: faible teneur es sel le favorise
- Elle Jépend dans une très large mesure des conscntrations de l'antigène et de
l’anticorps et SC prokit très rapi:.iemcnt d’où Ik neccssi% et ltimportance d'éviter des
contaminations pouvant mener à des résultats très difficilement intcrprEtables.
- Son intensitb pe:.it être reduite en fonction de la variation du pH du milieu
dans lequel elle a lieu.
. . /. ..*
I I . - PARTIE PRATIQUE
Toutes les technique relaté6‘s sous cc chapitre ont et& d’abord. présentées au
cours SGUS fcrne d’expose avant dtôtre miscscn application pretiquû au laboratoire.
II. - 1 m Séparation des trypanosomes du sang
Elle 3 pour objectif 4 gextr3ire les trypanosomes du sang et B&+ pouvoir aussi les
ccnsentrcr en vue des préparations d?ai:tigènes destinés aux test sérologiques et 3. ce
titre deux techniques sont utilisées,
a) la m&tnode de Lanham : clla consiste ?3 faire passer le ~a:12 infostc de trypanosomes à
travers une colonne DYGZ cellulose.
Les hémilties ayant une f’orto charTe négative soni;
v
retenues par la colonne ct les trypanosomes chargés moins nCga tivement sont élues et
collectés dans un bêcher ;
Technique
m....-
- Fixer un entonnoir oi? porcelaine sur t!n support ou a défaut dc l’entonnoir utiliser
corps d’uno seringw ;
- ijett;rc du DEAC cellulose dilue avec du P.S.G. pH C.0 (500mgr do DE 52 pour 2 litres
de P.S.G.) dans l’entonnoir ou le corps do la seringue puis laisser se tasser
- Placer un papier filtre :&oup& suivant lc dimension de lvuntonnoir et verser du tam-
pon P.S.G. dcssus pour ouvrir ït23 pores du filtre, rincer la preparation, et laisser 2
rouveau
.
s e tasser
- Verser lentement le sang préleve sur ru?ticoagulsnt et contenant les trypanosomes sur
le filtre selon la proportio n d Oun volume de sang pour 3 volumes de DEA
et laisser
s q infiltrer
- Verser 2 nouveau du P.2.G. et laisser éluor
. l’élvat est recueilli dans un bêcher plac6 sous la sortie
de 1 * en tonnoir
- Afin de s’assurer du passage des trypanosomes prelcvcr règulièrement une goutte de
lf(-luaS, à 1:% s o r t i e Je 1Varitonnoir et, observer entre ~XK+ 2.t lamelle au microscope et
dès que la prkencc d*hématic sera constatée arrêter l’opération et transvaser le pro-
duit de la récolte dans un tube à essai
- Centrifuger 6. froid ci, raiscn de 1, WO tourskn
pcn\\iant 15 m22 en vue r?e consentrer I es
trypanosom3.s ainsi récolt&.
l . . / . . .
-6-
II. 2 - Tec!lnique de maintenarce des trypanosomes au l~borstoirc
Les trypanosomes pcuvent Ztre maitenus soit sur des animrux vivants de labora-
toire : souris, rats, lapi.ns,cobayes ou sur C?c petits ruminants : imU~Gils, chévre en in-
jectant à ces animaux du sang contenant les parasites, soit sur des tsAts6 en les fai-
sant nourrir avec ‘du sang dvun animal porteur (de trypanosim8ds,
soit sous forme corig&e
et conservés dans lqazote liquide.
II. 3 - Clônage et stabilisation des trypanosomes
-
-
II. 3-1 - Clônage
Le principe du clEnege consiste A d6vcloppcr chez un animal une souche de trypa-
nosome dont la pOpUl2YiCXI qui en sera issw proviendra d vu~ seul et ;Gme trypanosome et
pour ce faire deux techniqzs pwvent être utilisées :
a 1 - la première consiste i procéc’4r à un.: sQrie do dilutions progressives du sang para-
sita partant de 108 trypano/!zl. pour deboucher vers une concentration de 1 trypsnosome/ml;
Pr6lcver un ml de cette 5ilution, lp injecter en 1-V. 5 une souris : 3p.r
I
la veine caudale
et suivre l’évolution rie la parasitemie
b) - la deuxième td?chniqas quant à elle, prést?nt.e beaucoup glus de certitude par le
procédé dqisolenent d’un seul trypanosome i partir de la métho..:.~ sl:ivant :
- pr6lever du sang infeste !c!e trypanosomes dons un tube hépwink
- à l’ai& dquné aiguiil<S trCs f i n e , ~rClcv3r unr trlute petit: goutta _Ie sang et la dépo-
scr dans le godet 11 q une kme crwse ou lr:m<: d p entomologie,
- Gposer quelques gouttes de &.y&~;1 tout w tour du creux
. I
,Je la lame afin ZPéviter
1 qassèchement de la goutte de sang et recowrir d’une lamelle 22 x 22,
- examiner la préparation au microscopt: et s 2 assurer qu 1 on rtca coi t qu’un sel11 trypenoso-
Ei
me dans toute la 5répzration etkel est le cas
- retirer la lamelle et ajouter une ou deux gouttes de glycérol à la préparation pour
la diluer.
- aspirer la totulité C~L cette prepar:tic;n lkns uné seringue T: insulin St injecter tout
le contenu en I.V. à une souris par 12. veine caudale co3~ne pr&e<e:~mant
- garder 12 souris en &vage et procciider à des examens quoti:lie:s Je sang en vue de con-
trôlcr la sortie de trypanosomes.
l . . / ..#
-7-
Dans lc; Cas d'Uiî &sUltat poSitlî tCUt IC? sang de Ccitte 3xris pCR.VP2 ?QV
prc%vé et cons.erG dans lvazcte liquide après avoir p&alableml;nt stabilisé les trypano-
somes qu’il contient.
II. 3 - 2 - Stabilisation et crnservstion des trypsosoicas sns 1 t Azote liquide
----*
La stabilisation d.krit 1.q &tho?c, de conservation :!cs tryponosomes bans 19a-
zota liquide tout en &ita;flt de leur faire subir un choc pouvant conc!uirc 2 leur alter+
tion,
.. Prelever une quantité de sane hépzriné à pwtir dpun donneur fortement parasitk( con-
sentration finale d’héparinti 5-10 unitE p:li ml de sang;)
- Ajouter quelques gouttes r?e glycerol jusqu 'ZI une conswïtration de lO%
- Laisser pendant 1511x2 pour équilibrer
- Pr2ndre une ran&e de micr::kubes et à l paide d’une piYpctte prstecr , remplir chaque mi-
crotube à moiti.6 (enviror: 70 oicrolitres/tube 1
- Laisser un cspncc vide aux &XX extr6mités de chaque tube puis les boucher chacune avec
du plasticine
- transfarer les microtubes dans de petits tubes à essai en matiere pl?.stique et intro-
duir~.; à lPint4rieur un morceau DDE papier portant toutes les inbications relatives au pré-
lèvement : nL, :lak, origine. Puis .:n se servant Gvunc grosse aig-uille pratiquer des
trous à chaque extri$mité C!U tube pour permettre l’infiltration de lTazote liquide à lPin-
térieur
-- Introduire les tube:: à essai ccntenw t les mic:wtubcs
c?ans une bx~W.lla en plastique
et X lar,se ouverture am&a&e a cet effet prtr un système cl9 iscl2tion, en la recourant C:l
d vune couche 2s plasticin~e ;!‘uno eprzisseur tIP 1 cm envir: ,n wintanue tout autour avec du
sparadrap.
. 1$3intêd,r la bouteille er: suspension dans le container G~nzotc~; liquide afin quvelle
soit entièrement recouverte par les vapeurs pendant 2 heures pour refroiC5.r
. Après refrcidissemcnt i;iTX~Sf’5rCP lC:s tubes à essai contenant les micrctubes clans les
canisters adu ccntainer dlazoto liquide.
Le transfert devra Ctre op6rC à l’entr& du container ou 32 UFiliSc?i?t
un bain d’azote
liquide pour éviter un-: hussa de 12 teri:pSratu.r~~
.zt c?,rj&c: ?x.loi 7 ':q
*
'1X
.'
canisters sont plongés
entièrement dans 1 ‘azote.
..* /
.*.
,*
c
- Extraire un micrctube, 10 rechauffer , le couper et Gposer une goutto entre lam? et
iamclle, puis crbservcr au microsccrpe pow s13ssuror de 13 survie tics trÿp~nosx?es.
II. 4 - PREPARRTIOI\\T DPANïISERUM
--.a-
lvinjection rép&t$e à 'un admal d9une certaine dcsc dPimmunoglobulincs en prove-
ninw dpunG espke differer,tc 5 pour effet chez lvanin!al qui rer,cit cet entigone 1~ prc-
duction ?Panticorps specifiques dirigés contre ces irnmunoglobulines et clCsign?s sous le
nom d'anti-imrwnoglobulines
qu90n retrwve dans lc S&U~ de cet animal qui porte ainsi
15 ncm d9antis&um.
Technique : '1O : &ulsionner à pwties égales une solution d9immunoglobulines
titrant 20ugr/ml avec dc ïvar:juvar,t complet de Frct8nd pnis injecter 2ml 5u prcduit à la
plante du pied d'un lapin en rcpxkissnnt 19 d5c.t--: en deux endroits diff6rents (le ContrC-
lc ;ivunc benne Gmulsirtn peut svop&er e?l dép<>SZn t une g:jutte ilte cette Gmulsion dans un
bêcher c,xter,ant de lpti~:u.
Paix le cas dtune réassite, 17. gwtte reste intacte et
fl9ttc 5 la sur I-,ce dce l"ëaii tandis quvelle fond et s& rlissipr w cas ,-le for: réussite et
ainsi lvopérntion dcvrs
être pcursuivid jusquvà lPobte:\\tion d7ur, bon résultat)
20 : 15 jours apr&s &pétw 12 même injection et xix mêmes w:kùits ti vune 2utre émulsion
faite avec cette fois-ci l'adjuvant incomplet & Freuni’: et titrant 15 ughl.
3" : IF, jours après, l-! ~:leüxiène injection reprendre comme pwr lc? lereinjection
4O : IC jours après, prélcvw environ 15ml iu .sc?nc de cc même lapin pnr ponction veineu-
se, réccl'cer 15 scrum et 1.2 tcstcr en immunodiffusion ;xd immuno&lectr~phorèse pour déce-
ler à présence :<vanticorps anti-immunoglobulines.
II. -Ej- Il%lUWODIFFUSïOI:
Le princirx ?e lvimmunodiffusion est la I+ctection directe d9snticorps contenus
clans un serum donné en mettant cz Grum en contact avec lvZntigènc; pour lequel les xnti-.
corps sont rechcrch&s.
Technique
-
-
- Etder une couche d9agerosC à O,'l5% sur la lame + 0,05% ~?e i%?J2 puis ldsser sécher
- Pratiquer 4 ou 5 creux a la su-fxe <fu ,gei
_ !!v2garr=se d'abord, et tout sutour i;e chacun
ci9eux ensuite ci-wsw bes puits <!Pur~ diamètre be;-.ucoup plus petit que celui des premiers.
. . . / . . .
- 10 -
- Déposer ltantigène dilu-2 dans chaque creux tandis que les sérums 5 tester sont dispo-
sés dans les petits puits situt
autour
- Incuber pendant 24 heres a 37 O Zans une boite de petri contenant O,O% de %a'42
- Lt?s rkultsts positifs c'est à <ire les ~~~ru~~scontecarii;l~rlnticorps
s;kifique de l'an-
tig@ne se traduisent p7.r des arcs de precipitation visible-s 5 lqocil nu et dont l'inten-
sité est variable selon la teneur du skwm en immunoglcbulines.
II. - 6 - IMMUI\\rO~LECT;30P!IORI7SE
-e-w
Le principe ds l:i~!ununoélectrophorése est le même que celui de 19immuno5iffusion
à la différence que dans cette technique on fait migrer
l'enti.g&e dans une chambre
ilectrophorétique.
TSCHNIQUE :
Etaler une couche d'agwose 5. 0,15% et 0,01X de thiomarsalate
Creuser des puits en surface toujours dms le sens de la lOIT@JE.!AÏ Cd3 12 lame.
Déposer lqnntigène Ans chaque: puits puis laisser migrw Ans une chambre slectropho-
retique pendant 1 nuit
II. 7 *m ISOLEklENT ET PüRIFICpiTIG?! DES II+lMUNGGLO:';ULIP!i:L,
--- --
- -
.--
II. - 7 " 1, - Isolement das globulines
----l-P
La m<i;E?o(ie utilisées est 12 mi:thotle )?e précipitatioi: pr:r la sulfate JPnmmonium
qui permet d-e s+.rer 1~s i>lobulincs ou anti-j.mnün~olobulinas tics autres composants <lu
sang.
TECHNIQUE :
--
Prendre ~;n volume don& (le sérum auquel on ajoute goutte à soutte un égal volume
d'uiw solution satur6o c.ie sulfate dFammonium (soit SF;G gr NH4 SO21 en agitant tout dou-
cement. laisser 30 mn a 1 heure a la tely&ature ambiante Tdis cer!trifui:,sr il froid à
raison Ze 3.GGO tours/ïw pandant 15mn. rcdisscudre le culot de centrifugation dans un
volume $, q eau ,:lis tj.ll& a<.;,: 1. YJ volume de sérum initial utilisé. Renouveler la w&i.pi.ta-
tien une deuxième puis u.nd2 twisikm fois guis cj.i.~oucfx~ 1~2 (qt?r~~-l' Culot cian> cl11
. ../...
- 11 -
PDS 5M PI-I 3,8 à un v,l.w:-. 6;::~.1 a la moitiés du v?lumc- de s&um initic:l, Dialyser contre
le tampon PSS et vériÎier 1: prCscnce de .l~ammonium en m<lanC;eant
1 ml Zu rro?uit
.A
de
dialyse 2 un &g,al volumi: ::'unc soluti?n ? l:C!Sk de chlorure de bar:. ,m. L,L virage au trou-
bic de ce mélxge témoi;gw de ln pt&3cncc dpions ilfe
,
'
dmmonlum et r?ans co cas, 17: ::ia1yse
devra Ztrc poursuivie jusquf$ la rkaction négative cfsst-5-s.!ire ltcbtention d'un mslan-
gc clair,
II. 7 - 2 - Purification des immunoglobul:int.:s
---.
Tandis que lz, pr&ipitaiAon pérmot :!tisvler la totalité &s globulines sériques,
Z'autres techniques sont utilisées pour -5limir-w la sulfate ::?-dmmonium ou bien pour ot-
tenir ux, classe ou une subclassc dPirxxxx~globulines.
II. 7 - 2. 1 - Filtraticn sur gel
_I
Le principe consiste à eluer 1~ substxnce desir&?+. travers une colonne de Sépha-
dex G 25 par le grincipc ~~*cxploitation ('es différences dc <!imensions :?é mol<cuics pvr-
mettant de faire passw rapi~.:ement l.-~c*
cIU unes pendant que le p3ssaSe t'es autres est retar-
dé.
TECHNïOUE
- Mettre du gel de Séphadcx G 25 préainblement &quilibré avec un tampon TX3 SM 3. un pH
7,8 dans une colonne de chromztographic
v& laisser se tasser.
- Rincer la prép aration en ajoutant du. P,C.S, puis laisser Q-outtor
- Verser lentement la solutic:1 Ue zlobulirws enx surface, ajouter du tampon PDS pour
diluer et laisser élurr
- L*elu?t ccnstituant la fraction ~~Pimmunogl~~bulincs est recueilli dans des tubes et
chaque tube devra &re contrôli peur vérifiw 1:: présence de xulfaté d7ammonium comre
préc&!erment en ajoutant du chlorure de barium.
Ii, 7 - 2. 2 - Chr~matographie sur khangeur dvions
En faisant pousser une substance c? chnrlr;<: &ctrique dG?Yl& a tra-vers un gel ci
charge contraire, on cr:%: un effet de rétention de la substance par 1~: o;el sous forme
.*. /
..*
- 12 -
de liaison. Cette liaison gel-substance peut etre rompu: lorsq~~.'on ajouto un tampon ci?
charqe electrique de m$m<; nature mais plus forte quo celle r)e 1~. substance retenue.
Et c'est suivant ce pro&6 que les Io C,, Ig (ii2 et Ig ‘1 Sont. isolk.
TECHNIQUE
_-
- Mettre du DB 52 k@X.5r~ 2 un pH 7,5 #avec du tampon ?O 5
4 id dans une colonne de
chronatogrzphic
connrct~k à. un collecteur et laisser se tasser.
- Ajouter la même tampon pour rincer le contenu (le la cclonno 61; laisser egouter avec
le même tampon.
Verser lertement la solution de glcbulines Cr~is 1;: colanna
. I
puis ajouter l!r Campon
PG4 et laisser éluer. Les IgQ2 sont élu?&3 en premier lieu et sont recueillis dans les
tubes dispos& au fliVcZ:l CIIl COlleCtSlt.
- Ajouter du tampon P04 10 M pour faire elucr 10 premier pic correspondant alu 1 QG
J 1 jus-
q!i'à épuisement complet.
- Ajouter du tampon PO4 50 I! pour -avoir une dernière 6lution corxspondant à un mslange
d'un ler gic d'J+C, et TgG2 puis d9un deuxième pic dvIgM ot (391 p l
9 1
II. 7 - 2 - 3 - Chromatogrephic dPAffinit6
_I-^.--IIY--
Lc principe consisk à coupler un gel appel6 mr:tri.cc: i: un ce1 biospkiîiquo
appel6 ligant ct capable de se lier &lecti&ment avec 1~. fr2lction
iluFon désire isoler
d9une substance donke. Cette fraction peut constituer 1 Pélfkknt à retenir ou ?lorr
19él&~ent a rejeter. Dans le cas ou 19élément ést à retenir OJ alors l'el~me-nt à reje-
ter. Dans le cas 06 1~6lCment est 5 retenir, l2 liaison avx li: ligt.iit devra Ztrc réver-
sible afin de pouvoir 19;~iu~:r se:.1 après. Dans 1~: 5:s cc il dwra $tre écwté, cette
revwsibilité n'est plus neccsseire puisque seul l'&lSmont dkir& aura travers& la co-
lonne.
TECHNIQUE
m--.
- Prendre du se1 de S6phzroso constituant la mrt.ri.cc cciüpl~é avec do lc? proikine A qui
est le ligwt.
- Equilibrer avec un tampon PBS 0,01 renfermant 0,2% ciPazide ci\\: sodim,
.*. /
. . .
- ‘13 -
-- Mettre dans une colonne connectes à un collecteur.
- Verser 12 solution $2 ;;lcbtilincs ;3t apr+s leur absorption totale pzr le gel faire éluer
avec du tampon NaH2 PG4 9,1 M pH 5,9, Pour obtenir le Ier Tic >'es IgG2
- Après le premier pic, a2outer du tampon AaH2P04 0,l Y pH 5,0 pour obtenir le second
pic des IgG,
Les 2 pics sont colloctEs séparemont et corksponkn t aux fractions IgG2 et IgG,.
La densit6 optique dt! chaque pic est d&tarminée par une kcture au spectrophotomètre en
vue du calcul cIes taux de proteines skiques fractionn6es.
II. 8 - PREPARATION D9ZJJTIGENES
Les préparations r!'antigènes utilis6s dans les Bpreuves sér?,lo,giques varient 2n
fonction dc la technique de diagnostic envisagee. Et c'est ainsi qw 13anti$ne destiné
à la technique d9immunofluorescence
et compo& dîune suspension de trypanosomes sera
clifférent de celui de 17ZLISA cu les trypancsomes
doivent subir une desintégrztion par
le procér!é de la sonification,
II. a - 1 -Antigènes pour immuncfluorescence
-11_1_
- Saigner des animaux dont 1.~ sang est fo:rtez5nt parasité sur anticr:agulant.
- Centrif+uger le sang ainsi reweilli à 2.00 tours/mn pendant 15 mn à froid.
- Verser les 2/3 du surnageant et recueillir lPinterphase.
- Diluer le surnageant au 1/2 avec du tampon P.S.G. pH 8,O.
- Séparer les trypanosomes c?u reste du sa.rlg par la metho& ce lanhnm <écrite plus haut.
- Centrifuger l'éluat 2 trypanosomes recueilli a raison de 2.OGO tours/mî pendant 20mfl
à froid pour CCX@entrer les paraSiteS
- prendre un volume dlcau physiologique représentant 10 fois celui du vclume de sang
initial et remettre le culot <je centrifugation en suspension
- Fixer de la maniere suivante :
1 volume de suspension de trypsyiosomes pour
2 volumes de fixateur puis placer sur un agitateur magnetique pendant 1 mn et laisser
fixer une
nuit à - 2C°C.
..a /
. . .
- 14 -
Composition du fixateur :
Acétone réfri;;&C : 80 ml
FOPKGI.
: 0,25 ml
Nac1 à c3 ‘, 0
: 19,75 ml
(le fixL.
.r davra être une greparation extemporanée)
- Centrifuger a 1.500 tours/mn pendant 15mn à + 4*C afin dPéliminer le fixateur.
- Resuspendre le culot rie try‘Janosomes dans d- lveau physiologique à raison de 2 fois
le volume initial de sang.
- centrifuger à 2 _
.5G3 tours/mn pendant 15 mn à 4*C puis répéter 3 fois cette op&ation
afin d’eliminer entièrement toute trace de fixateur.
-. Recueillir le dernier culot de lavage ot suspendre dans du P .U. S. 0,Ol M pH 7,2 ren-
fermant 0,2 04 d 7azide de sodium.
- L’antigène ainsi préparé , peut être stocké soit à 4*C, soit à la tempercture ambiante
après avoir 6t6 titr6 puis reparti dans des flacons de 1 ml.
II. - i7,. - 2 - Antigène pour 1’ELISA
-1_11_
- RÉcolter et isoler les trysanosùmes comme precédemmect.
- Arès centrifugation, remettre 12 culot en suspension dans un tampon tris Hcl pH 8,û
contenant 1 iq de PMSF (Phenyl-m6thyl-sulfcny-fluorido} et 5 7~1 U91c. “z-&tamide selon un
volume égal au I/l0 du volume initial de sang et r&&er cette operation jusquv& lqob-
tention dvun volume à -eu près de 20 ml. ci? culot do centrifugation
- sonifier 11 préparation jusqu”à la lyse complète Ces trypancsomes dans de la glace
avec un o.ppareil de sonificatiûn.
- Centrifuger le s0nics.t à 3.00 tOU?S/lTXI per&nt 15 i!lIl à. 4*C.
- Recueillir le surnzi;eant, centri.fugw 5 nouveau ; 15,O::G twrs/mn pendant 30 mn 1A.s
filtrer le surnageant à travers un filtre milliporc.
Ultracentrifuger le filtrat 2 40.000 tours/mn pendant 3G mn.
Recueillir lc surnagc:c?nt ct lu mettre à dialyser contre un tampon tris 5rJ PI pH 3 ,O
puis lyophiliser le produit de dialyse ainsi obtenu.
- Déterminer le taux de ?wt6ines, Fuis titrer ‘et stocker a - 2OOC.
. . . / . . .
- 151
II. - 9 - PREPARATIOW DE CONJIJGUE POUR ELISA
Le test dtELI% requiert l'utilisation d'un conju=& ?r&par6 en couplant la mo-
léculc d'anticorps avec l'enzyme, horseradish peroxykse (H.Z.P.1 et, il est utilisé
dans les analyses sérologiques dsune large gamme de maladies arlimaltts. Cette technique
est le plus souvent utilisée %tns les m&tho,:!es indirectes de ditection de 1: présence
d'anticorps spécifiques ,q'un nnti&ne connu. La méthode de conjugaison decrite ci-
dessous conserne spécialement la p¶tion dvun ccnju& dPantis&um do chèvre anti-
immunoglobulines de bovin, toutefois cette procédure de conjugaison peut k%re utilisée
pour le couplage dtantigobulinw produits dans une large variété dPespèces animales.
II.9 - 1. - Préparation des immunoglobulines
.-
Les fractions immunoglobuliniques de l'antisérum sont précipftoes p-r une solu-
tion saturée de sulfate dvammonium à 50%
- Les slobulinos précipit&s sont lavées deux fois avec une solution L:e sulfate d'amtno-
nium à 50% puis dissout@ddans un tampon PO4 10 M pH 7,G
- Ensuite dialyser lwgement contre le même tampon une nuit à 4*
- Fractionner les zlcbulines an faisant passer le produit de dialyse à travers une co-
lonne DEhE 52 cellulose (comme décrit precédetmnent)
- Tester en immuno&~ffusi.cn les fractions obtenues et colles qui prkentent des bandes
de. précipitation sont consentrées
- Déterminer au spectrophotomètre le taux de proteines &cntuellement présentes dans
les fractions.
II. 9 - 2 - Pre-Laration de 1'Enzyme (OXYDATION)
w - . - - -
-..-
- Mettre 10 mn de HRP dans un fiole
- Ajouter 1,8 ml d'eau distillée
- Ajouter 200 ml d'une preparation toute fraîche de sodium périodate (32mgr/ml goutte
par gouttejet
laisser r&langer 9u fur et tï mesur~avec un agitateur magneti-
que pendant 30 mn a la temperature
ambiante pour permettrelbxydation de lpenzymec
- Dialyser contre un tai!pon sodium acetate 1 M pH 4.4 pendant une nuit a 4O.
. . . / . . .
- 15 -
IX. g - 3 - Preparation du conjugué
- I - w - -
- Pren!re 12 Ml de 13 soluZ.on dpenzym~tr ainsi obtenue auxquels on ajoute 2ml de tampon
carbonate 0,2 M pH 9,G.
- Ajouter 30 mgr de In sclution d'immunozlobulines (proportion dpl part dfenzyme pour
3 parts de globulines) et laisser melanger pendent 2 heures 2 la température ordinaire.
- Ajusttir le pH de 1~. sclution à 7 ,2 mec du Na2 1-I Pc),, il,1 m et laisser à 4O pondant
1 nuit au repos.
- Bjouter 2 ml dsune solution frniche 'de glycine (rl mgr f.1~ ,r;lyc,inc dans IDOml de PBS
fJ,Ol M pH 7,2) ou borohydrate de sodium et laisser ,'i ncuvoau a~1 repos penclant 2 heures
a la tcmpirature ambiante.
- Séparer 1~ conjug& de prot6incs du rGsti2,
en le faisant p:zssor à travers une colon-
ne séphadex G 100 apros une nuit de dialyse,
- Filtrer l'éluat ainsi recueilli 5 travers une membrane filtranto O,45 u et mettre
dans une bouteille sombre pour protèger contre la lumière.
- Ajcuter 0,25 ml dgazi3e de sodium pour la consentration finale
- Filtrer puis stocker à..2V"
Conjugué pOUY immunofluoréscence :
- - -
Le conjugué pour 1~ :ests dgimmunofluorascence est prGpar6 à partir dOun coupla-
ge d~immunc~lobulines avec 19isnthiocy~nate du fluorescoinc.
- Prendre un volume l!onx~C: de solution de protéines titrant IF msr/ml et lt: diluer dans
un autre volume 2e tampon carbonate O,O5 M pR Ij,6
- Prendre: lt: fois le volume du même tampon de .%.lution des immun{o@obulin,:s et dans
lequel on diluera 13 fluorcsceine à raison cl91 mgr/ ml de tampon.
- Dialyser la solution de protkincs pendant une nuit 5 Lt0 contre du tampon carbor;ate
bicarbonate pTI 9>fi.
- Transferer la membrane de dialyse contenant les pwtéines clans la solution de fiuo-
rescéine et procéder à une seconde dia1ys.e de 24H pour faire la conjugaison proprement
dite.
.". /
. . .
- F i l t r e r a tiTVerS une csl~mne ie &phatlex G.56 pwr $lirnin::r lSds traces d e fluores-.
ceini; yi.on fixiks.
Les dluats c!ont ce ra?pwt est CWlpi~iS entre? 2,s <.:t 7 constituent lt-s fractions
5 retenir et ;rinsi tous les autres se ’sI.tuant hws <!e ces bimittis s:mt élimirGs,
- Faire passer 5 travers UI? î,iltre et njwter C!,?j d 9iizi.k C:C SGdiüm $!iY d i l u e r 3J 1/2
avec cte la glycérine pure, puis titrer et stocker à -20°
II. 70 - TECHNIQUES DE DIACNDSTIC SEIIOLC)GIQUE
---.-
L t im3-wnofluore~cénce indirwte et 1’ELISrS. sont à l’heure act:uell~ lzs deux m&
tho=les 3e diagnostic
sérolo,~ique 1~s plus utilisées e:~ raison de leur sensibilité,
IltJ
leur aspect prc?tique permet tan t 4 *effCctger i:e@d 7dnlysas ~.!ifPéiG?S c;t surtout
1:~ leur hautespécificit5.
II. - 10 Y> 1 - Immunof luorescencc
Lc principe consiste 5 mettre en évidër!ce la grGscncc iPanticorgs scriques per
contact gdvun sérum suspect avez lv 7ntiC;ènc agent de 1,: mal3:lic consi~&5r&, ré&16 en-
suite par un antisérum spécifique de ce s&um conjugu:: CI 1. s iscthiocyancte de flüwos-
chine.
TECHNIQUE
- Diluer lDantigén~~ dans un tsmpon I?X O,Gl K pH 7,% ot lt: ?éposw claw 12s cercles
~dpun~ l?.mc à imz?unafluoroscence (di~peniblc c!nns li: mwch;i puis lG.sscr séchw 15 à
29 mn 5 In ternp&uturc zm!d.c33t,e 3u 5 5 10 mn (A ?“OC.
-3 ;“:bsorber l e s&um d,ans ;lu lysat de lymphtcytes à raison d’un vOlurne C!e SérUm pO3r
39 volumes cte lysct et laisser 3cSm-1 2~ la ten?p&ature aï:bi:xte.
sil Dilutiw ICS sérums 5 testar i-ians !du tzqon ‘E%S pH 7,3 ad~!itionnk de &PU~,: +lbumine
de bovin à 2 74.
-8époser dzns C!12tTlleiti CrPclc: 25 ul de Jilaltion 6.e s&um corrcs~cn~~nt et lzisser 39 mn
en atmosphère humide 5 1~ tunpératuro ambiante.
Y Monter une 1c:melle 22 x 59 5 l’r?i:!e r17un5 ?r6parntion ?i parties +$.a de r$.ycérini;-
et PBS gE; 8 ,a3 guis lire :L*u miçrcmcope ; ultraviolet.
Les rt&t&is positives sont r&îélées pZti2 une flUoresCc?nc0 des trypanosomes
constituant 19antigèno et Sur L:uquc:i.s s’est îixé l’aritico;-;JS li6 rli 17z9tisérum marqué.
Les r&xtions n-a’,‘,;al;ives par contre sont sombres.
II. 10 - 2 - ELIS;1
Le Crincipe de 1- ? ELISA comme celui de 1Qi?INiXXü:'lUOK2sCWX~ décrit ci-dessus
consiste à décel.cr 13 prkence 6 9 anticcrps ou d ‘anti.$ncs circulacts ;:~~~~S un sérum
cOnsicGr4 2ar le même s~stkiz de r6aetion antigCrX-anticcv::s révélée ensuite par une
substance chromOg&e
II. lG - 2, - 1 - Détection d’anticorw
p.-
-I-
Cettt teclaiquu sert EL
détecter des anticorps cirxukwts dans un s&um sus-
pect permetttlnt i.imi C~:E: 3ire si l’animal. a étt< au mcins unu foi,s eii contact nvec 17an-
tigène cl.~ 1~. malx!iû recherchée au mA>me!:t du prél&emcnt cîyazt alors provoqué la pro-
duction d ganticorp; 5irigis contre 1 Vantigènc de cette mnladie,
. . . / . . .
TECHIXQUE
- Sensibilisation de plaques de microtitragc :
ou 20 ugr/ml
- Diluer lqanti&x~ 5 1: cvnsentration requise : 5 u&iil 1C: uer/ml/avec u:x solution
de P13S O,Ol M ?H 7‘2 contenant 3,22X d!azide de sndium
- Emplir chaque puits do la plaque avec 100 ul dfantiC;ènti c?iluC,
%- Incuber la plaque à 37O pendant 2 heures puis transf&r h 4" pendant une nuit.
- Verser lqanti&x: puis l:.vcr 32s pl-ques 3 fois successives avec du tampon de lavnge
mGlang6 a du tween 20 à S,l% : remplir chaque puis jusqu'aux bords avec 1~; tampon,
laisser 3 - 5minutes en contact puis verser et sèchor,
- Rloquor 11~ parois ~10 la p?:quc avec une prot&,x de provenance diffèrcnte de celle
de lfcspGce aximlfl~ pour l::queile 1~ &rum est nnalysé (albumine C?C chèvre, moutxn,
lapin, etc...) à unt concentration de O,2 01.D -lr
L.i distribuant 200 ul du tampon de blocage
dans chaque cupv.1~ et incuber pendant 30 mn à 37O. '.coutcfois, ce blocage peut i:tre
omis mais dans ce cas, le sérum à tester devra Vtre Cil& dans un tampon à O,F;n/o de
protéine, L'interêt dc cette pratiqu:>L est C!i-; saturer lr: plaque un f?.isant occuper tous
lés pores laissés libres p-r la protéine de sorte à Eviter toute 5~~5s~; réaction,
Y Remplir 1;: plaque avec des sérums ds: contr6l.e ct 1~s s&ums j tester dilu<s à I/l00
avec du tampon de diluts.on nuis incuber 3 37O peudant li heur? GI. à la temperature am-
biante pendant 2 heures.
Il est en outre rccomrxand6 de tester aussi bien 12s serums do contrôle que ceux
destinés t: être analys&s en dr;ublc c'est 5 cliro cn utilisent 2 puits par s&um, et de
remplir 1~ rangét; 1 de A h H avec du tampon de dilution si on doit utiliser unlecteur
multiskan pour mesurer les densités optiques
- Laver 1~. plaquti 3 fvis successives com~fie précédemment
- kjou%er lC.6 ul de conjugu6 dilué en fonction de son titre de travai* dans du tampon
de dilution et incuber pendant 1 h à 30" ou 2 heures à la tempdrature ambiante,
- Laver 3 fois de suite de la même manière avec du t.ampon de lavage et sècher.
- Diluer le substrat G-phenylendiamine & une consentration do 1 mgJm1 dans un tampon
citrate G,G5 M pi-I 5,5 auquel on a ajoutL 1% dvhydr?,$ne pcroxydose.
- Remplir tsus 1s.~ puits .wec If:! ul de cette preparztion pour révéler et incuber 15 à
31kn S. 37O et dans lPobscurite puis arrêter la réaction en a,j%tant 25 ul d*acide sul-
furique 2 N dans chaque pui+ .
- Mesurer l*absorbence au spectrophotomètre et i une vitesse de 492 nm
II. 10. 2 - 2. - Détection tks Antigènes a Partir d'Anticorps Monoclonaux
.I_.--
Un anticorps mc>no&.kal est un anticorps produit 2 partir d'un seul clone de
cellule. Par consSquent, 52 spécificité est qufil est diri.g@ vers un épitope à l'oppo-
s.5 de lvsntis&ua produit chez les animaux par immunisation qui contient un melange
d'anticorps dirigés vers plusieurs épitopes de lvanti&ne immunisant. En raison de
cette specificit6, les antigitnes monoclonûux constituent un excellent moyen pour 10s
analyses de mélange d9anti&nes en vue d'identifier et de purifier les antigènes qui
conviennent pour un besoin donné.
L'application dos anticorps monoclonaux est en hausse non seulement à cause de
leur grande spécificité mais aussi la facilité selon laquelle ils peuvent Gtre standar-
disés et le fait que les cellules hydrides produisant les anticorps monoclonnux peuvent
être conservk de manière permanente.
Ces ar;ticorps monoclonaux d*utilisation réct;ntç,pormetterrt la détection dPanti-
gènes circulants dans le sêrum d'un animal donné et d9avoir ainsi des précisions sur
lvktat pathologique de cet animal à la période tixacte selon laquelle le prelévement
de sang a 6té effectué.
. . /. ..*
- 21 -
La technique d’utilisation des anticorps monoclonaux dans les méthodes de
diagnostic sérologique est à peu prés semblable à celle décrite pour la détection
d q anticorps pzr ELISA.
II. 10, - 2 2 - 1 - Fréparakion d9anticorps Monoclonaux
a) Immuniser un animal (rat- souris etc . ..) avec lvantigène qu’on veut rechercher dans
sérums à tester et vérifier si la production d’anticorps est abondante en utilisatn
par exemple la méthode d’immunodiffusion
et en cas de réaction positive
b) sacrifier lvanimal, prélever fa rate puis la macerer en vus de pouvoir fusionner
les cellules spleniques avec des cellules cencereuscs incapables de synthétiser leur
propre immunoglobuline et la proportion cellules spleniques : cellules cancereuses
est de 10 : 1
c) La fussion est assurée par du polycthylene glycol ou du SandiVirus. Dans LE? cas
d’une bonne fusion la cellule cancereuse sPapproprie le pouvoir immunogène du lympocy-
te.
d) Distribuer le mélange de cellules ainsi obtenu dans les puits d’une plaque de cnl-
ture tissulaire.
e) Faire pousser les cellules pendant 10 à 14 jours dans un milieu de culture selectif
qui permet la survie des cellules fusionnees tandisque celles restées libres meurent.
f) Remplacer le milieu par un autre quifavorisele développement ra pide des cellules,
avant de tester la présence dPanticorps contre l’antigène immunisant,,lc choix du test
ayant été opéré avant de procéder à la fusion des cellules.
g) Les cellules cortenues dans des puits dont le surnagent composé du liquide de cul-
ture présentent, urw activité anticorps sont ensuite transfé&s dans des flacons de
culture tissulaire et développées.
1) Les cellules ainsi développées sont ensuite clônés par la méthode de dilution ou
en utilisant
de 19agarose. Ensuite on termine avec une population de cellules prove-
na:?t d’une seule cellule appelé clône de cellultis. L’anticorps synthétisé par ce clône
prend alors le nom d9anticorps monoclônal.
l . . / . . .
- 22 -
II. 10 a* 2-2 . . TECHMIQUE DE D!ZTECTTON DES ANTIGENES CIiiCULA?J'B
- ------.
I-.--e
Le test peut Ztre effectué sur une plaque à micrctitra~e préalablement sensibi-
lisée par l'anticcrps monoclônal pour lP&tude d'un grand nombre de &runBou dans de
petits tubes à essai dans le cas de diagilostic a titre individ!!el.
Lorsque 19antigène est présent dais le sérum à tester, cet an&--ène est retenu
par l'anticorps et lrs éléments non fixés sont é?.iminRs par lnvage, Pour &véler la fixa-
tion de lvantigène, on ajoutc le même anticorps qui a servi a se~isibiliser la pïaauc
mais cette fois-ci conjugué à une enzyme qui va se fixer ii lPantigène et former ainsi
un complexe. Cette combinaison antigène-anticorps est ensuite révélk par addition dpun
indicateur approprié, J.Jn chan,gomcnt de couleur se produit p;ir un virage au vert do sé-
rums positifs alors que leoL1 sérums n&gatifs restent claires, La lecture de la densité9
optique des plaques au spectrophotomètre donne d:?s indications sur le pourcentage d'an-
tigène présent dans l*échai~tillon.
1 - Sensibiliser 12 plaque avec 1°anticorps monocl'kl
2 - Laver avec du P.U.S .
3 - Ajouter 50 ul de s&um à tester et laisser incuber pendant 15 mn à la temp&
rature ambiaato
4 - Vider la pieque et laver avec du tampon do lavage
5 - Ajouter 1GG ul i,e conjugué et laisser incuber 15 mn à la température ambiante,
6 - Laver et rincer 3 fois
6 - Ajouter 100 ul de substrat et laisser incuber pour obtenir lc, coloration.
Les serums positifs sont colorés en vert tandis que 1;~ négatifs restent ciaires,
. . /. ..,
- 23 -
COMCLUSIOM
Les cours suivis pendant la période qu’a duré le stage ont permis non setile-
ment d’enrichir les connaissances théoriques dans les domaines scientifique et techni-
que mais surtout de manipuler des appareils de laboratoire hautement perfectionnés et
de pratiquer des méthodes de diagnostics sérologiqutis de pointe.
Le détection des antigènes circulants â partir d’anticorps monoclônux qui en
est la plus récente présente un avantage certain puisqu 9~Lle pcrmtt dPeffectuer des
diagnostics très précoces en ce sens que leur présence dar s le sérum est contemporaine
à le maladie. la détection des anticorps quant t‘r elle, n9est possible qüe doux semaines
au moins après qu.e la maladi’~tr se soit installée et et peut se Prolonger jusqu’à 3 mois
après la guérison de Ilanimal.
De telles techniques représentent donc un outil très utile da:ls 12s méthodes
de diagnostic séro7ogiqü e i cause de leur rapidité d9exécution et surtout de 12 fiabi-
lité des résultats quvils donnent.
Les autres techniques de laboratoire étudiées dans le même cours (préparation
de réactifs surtout) offrent égalcmknt un int6rêt sûr car m&k si certains de ces réec-
tifs sont disponibles dans lu marché, Leur prGparation sur place permet de mieux mai-
triser leurs perforrn~zwzs,
Cependant, la mise en application de toutes ces techniques pour la plupart
requiert l’utilisation au minimum dPun matériel. de haute pr;rfection qui doit consti-
tuer une mesure d’accompagnement étroitement liée, même si des accomodations peuvent
être opérées au niveau de certaines exécutions pratS.ques.
l . . / . . .
. 24 -
Pendant tout le temps qu9a duré le cours nous avons et6 Ifobjet drune attention
toute particulière de la part des autorités de LOILRAD et à ct: sujet, nous tenons à
adresser nons vifs remerciements :
Au Dr. GRAY Directeur de 191LRAD pour lvaccueil chaleureux qu’il nous rl. réserv& et le
suivi conskant qu9il a su assurer au bon dkoulement du stage.
Au Dr. Jim LEMMUJ, Coordonateur de l’unité de formation pour 19e:ccelente organisation
et la richesse du programrk0 de cours et surtout 19assi~tance continue qu’il a toujours
eue à notre égard.
Au Dr. MUSOKE, Directrice du cours pour sa disponibilité,
son dévouement et sa modestie
qu’elle n’a jamais ménagés afin de nous assurer un séjour très riche dqenseignements.
Au Dr, Mody TOTJRE responsable des relations scientifiques avec LES pr:ys francophones
pour l’intéressement qu’il a manifesté à l’organisation et au déroulement du stage,
A tout le personnel scientifique et technique de lvILRAD qui a témoigné d9un haut ni-
veau de connaiss‘axes necessaires ou parfait djroulement des cours.
A tout le personnel administratif pour les facilités accordées à toutes nos sollicita-
tions quotidiennes.