C. R. Acad. SC. Paris, t. 274, p. 768-771 (31 janvier...
C. R. Acad. SC. Paris, t. 274, p. 768-771 (31 janvier 1972)
1
Série D
CANCÉROLOGIE. -Synthèse in vitro d’a FoetoProt
) par le foie humain
cancéreux en culture. Note (*) de Mme Simone Que
MM. Michel Rioche,
Yves Bresson et René Masseyeff, présentée par M
Des cultures sont faites à partir de fragments hépatiques prov
de malades atteints de
cancer primitif du foie (CPF). Certaines produisent de l’a FP ; la synt
e novo de la protéine est
démontrée par incorporation d’acides aminés radioactifs et analyse
-radioimmunologique des
milieux de culture.
L’a FP, cqnstituant spécifique du sérum fœtal,
araît après la nais-
sance C(l), (“)] ; sa réapparition chez
cancer hépatocellulaire [(3), (4), (“)]
ramment utilisée pour le diagnostic de la maladie (“).
La preuve directe que la synthèse de l’a FP est bien
fœtale ou néoplasique, peut être apportée par l’étude
fluorescence ainsi que l’ont montré Gitlin (‘), Gousse
Par ailleurs, Abelev (l’), Irlin (“) et Hull (“), utilis
raux de rat, souris et singe, observent que les cellules
tiques animales sont
capables de synthétiser l’a FP in vitro.
Nous nous sommes proposés d’entreprendre d
humains cancéreux, dans le but de préciser la n
d’or FP et les facteurs pouvant influer sur sa sécrétion.
MÉTHODES. - 1. Matériel. Cultures. -*Ceux-ci ont
t l’objet d’une précé-
dente communication (‘“).
II. Recherche de l’a FP. - Les milieux de c
semaine sont filtrés, dialysés puis concentrés sous vide à 4
: les échantillons sont
analysés par analyse immuno-électrophorétique
l’aide d’un antisérum spécifique anti-a FP selon le procédé
Deckers et Abelev (14)
en utilisant comme témoins des sérums avec et
ture vierge.
II. Incorporation d’acides aminés radioactifs.
avons utilisé la méthode d’Hochwald et coll. (‘“).
sans lysine ni leucine ces mêmes acides aminés
2 pCi/ml. L’incorporation de ces acides aminés dans les
téines est vérifiée par
autoradiographie des plaques d’immunodiffusion à l’aide de m « Kodak Tri X Pan-
4194 » 320 ASA.
Résultats : Ils sont résumés dans le tableau 1.
Trois essais nous semblent d’un intérêt particulier :
1. No 6 : prélevées chez un malade a FP+, les cellules
rément dans deux milieux, à 30 ‘A de sérum humain :
- milieu 1 : Hank’s balanced salt solution + 0,5 %
bumine + 0,l % d’extrait de levure (Yeastolate Difco) + 1
- milieu 2 : minimum Essentiel de Eagle + 1 mg/ ‘A d
(2)
TABLEAU I
11 Cultures à
Toutes sont a FP - bien que 9
f
““” --+ proviennent de malades a FPS
25 Echantillons mis
18 Cultures
6 a FF + provenant toutes de
en culture
l
réussies
7 Cultures à
f malades a FP +
<L
szpce <
1 a FP - provenant d’un malade
b à sérum très faiblement a FP +
Nous constatons que dans le milieu 1, la croissance des cellules est très active et
se prolonge un mois alors qu’el!e est faible et fugace dans le milieu 2 ; Le tableau II
montre, de plus, un parallélisme étroit entre la production d’a FP et la multiplication
cellulaire.
TABLEAU 11
Essai no 6 : activité de la culture et production d’a FP
Milieu 1
Milieu II
Nombre
_ _ - .--a---- .-._ _---
de jours
Multiplication
Production
Multiplication
Production
de culture
cellulaire (*)
d’a FP (*‘h)
cellulaire
d’a FP
-
-
6
Importante
+-t+ C**l
Faible
-t -t
11
-
+++
-
4
1 6
-
+ t +
Nulle
-
1 9
Moyenne
-t- i
-
-
25
-
-t f-
27
FaibIe
-t
36
Nulle
-
(*) Appréciée d’après l’augmentation apparente de la densité cellulaire.
(**) +-i- + : Précipitation intense ; + + : Précipitation nette ; i- : Précipitation faible ; - : Absence
de précipitation ; toutes conditions étant égales par ailleurs.
2. NO 26 : malade dont le sérum contient des traces d’a FP ; malgré une multi-
plication intense des cellules pendant un mois et demi, l’a FP n’est jamais décelée
dans les milieux de culture.
EXPLICATION DE LA PLANCHE
Fig. 1. - Incorporation d’acides aminés marqués au 14C. Immunodiffusion double en gel d’agarose :
A. Lame colorée au Noir Amide ; B. Autoradiographie de la même lame. Trou central : sérum de
lapin anti a FœtoProtéine Humaine ; Trou 1 : sérum humain normal adulte ; Trous 2, 4, 6 : sérum
d’un malade atteint de CPF contenant de l’a FœtoProtéine ; Trou 5 : milieu de culture CPF 3p (cul-
ture en prêsence d’acides aminés marquk) ; Trou 3 : milieu de culture CPF 31 (culture sans acides
aminés marqués).
Fig. 2. - Incorporation d’acides ami& marqués au WZ. Analyse immunoélectrophorétique en gel d’aga-
rose : A. Lame colorée au Noir Amide ; 3. Autoradiographie de la même lame. Trou central : milieu
de culture CPF 31 (avec acides aminés marqués) ; Réservoir supérieur : sérum de lapin anti a Fœto-
Protéine Humaine ; Réservoir inférieur : sérum de cheval anti-protéines sériques humaines.
PLANCJXE 1.
Mme SIMONE QUELIN.
c
2
6
3
5
4
Fig. 1
------------+-Y
-.-_
,’
. .
’
’
Fig. 2
3. No 31 : malade à sérum CI FP+ ayant subi une hé atectomie partielle. A
partir du lobe excisé, sont effectuées séparément :
P
- des cultures d’explants de foie non cancéreux (préle és loin de la tumeur) ;
- des cultures d’explants cancéreux.
Les cultures d’explants cancéreux synthétisent l’a FP
t un mois et demi
alors que les autres n’en produisent à aucun moment.
Dans cet essai, la synthèse de novo de l’a FP est dé
par incorporation
d’acides aminés radioactifs. En outre, des essais prélimin
s faits selon la même
technique montrent que les cellules cancéreuses synthétis
res protéines dont
certaines ont été identifiées (albumine, transferrine, fibri
DISCUSSION. - 1. Réalité de lu culture d’hépatocyt
. - Comme cela
a été évoqué dans notre précédent article (13), cert
(cellules multinucléées, polymorphisme) et l’aspect
tion en amas, autoaggrégation spontanée des cellu
cellules cultivées sont bien cancéreuses. Leur capacit
considérée comme une preuve de leur nature hépatocytai
En effet, à la suite
d’expériences de transplantation in vivo, ou d’étu
majorité des auteurs admettent que l’a FP est syn
fœtale ou tumorale et non par des cellules hématopoïétiques.
2. Synthèse de novo de E’a FP. - Outre la mis
dans les milieux de culture, après incorporation d’acides
inés radioactifs deux
arguments nous autorisent à conclure qu’il y a sy
a. Proportionnalité, lorsque la sécrétion a lie
cation cellulaire et la quantité d’a FP produite.
b. Synthèse se prolongeant plusieurs semaines.
3. Facteurs qui gouvernent la synthèse d’a FP au nive
cellulaire. - D’après
nos expériences, seuls les hépatocytes cancéreux provenant d
alades à sérum riche
en a FP synthétisent cette protéine in vitro.
Ces études confirment les conclusions de tra
corrélation entre cancérisation et présence d’a F
tains CPF n’élaborent pas d’a FP sérique ; dans le foie d’un
ade à sérum a FP +,
tous les nodules ne sont pas sécréteurs, enfin, dans les nod
sécréteurs, toutes les
cellules ne sécrètent pas en même temps. Peut-on conclure
la capacité de syn-
thèse de l’a FP est génétiquement transmise par les cellules
caractère ne serait
pas modifié par la culture et correspondrait à une altération
anente de l’expres-
sion génétique.
Ces essais ne permettent pas de trancher e
portant sur des cellules déjà différenciées et ce11
cancérisation porte sur des cellules souches n’ayant pas en
e perdu leur capacité
de synthèse de l’a FP [(16), (“)J. Il est difficile d
(4)
active d’a FP in vitro résulte d’une production maximale de la protéine par un
nombre limité de cellules ou d’une synthèse modulée sur l’ensemble des cellules. Des
études en immunofluorescence pourraient nous renseigner à ce sujet.
L’origine des cellules et l’intensité de leur multiplication paraissent les deux fac-
teurs majeurs déterminant la synthèse d’a FP.
i
(*) Séance du 20 décembre 1971.
M. le Professeur M. Sankale, doyen de la Faculté de Médecine de Dakar, M. le Professeur M. Gruet,
MM. les Docteurs Bernard, Robin, Derrien, Hôpital principal, M. le Docteur 1. Seck, Faculté de Méde-
cine et M. M. Jacquesson, Hôpital Le Dantec nous ont fourni les prélèvements nécessaires. Le sérum
humain nous a été fourni par M. le Professeur Linhard, directeur du Centre de Transfusion. Nous
sommes redevables au CEA pour la fourniture gracieuse d’acides aminés marqués.
(1) D. GJ~LIN et M. BOESMAN, J. Clin. Znvest., 45, 1966, p. 1826.
(2) Y. S. TATARINOV et A. AFANASYEVA, Bull. Exp. Bioi. Med., 59, 1965, p. 65.
(3) Y. S. TATARINOV, Vopr. Med. Khim., 10, 1964, p. 90.
(4) M. STANISLAWSKI-BIRENCWAJG,
3. URIEL et P. GRABAR, Ccmcer Res., 27, 1967, p. 1990.
(5) E. W. HULL, P. P. CARBONE, 1). GITLIN, R. W. Q’GARA et M. G. KELLY, J. Nat. Cancer Znst., 12,
1969, p. 1035.
(6) G. T. O’CONOR, Y. S. TATARINOV, G. 1. ABELEV et J. URIEL, Cancer, 25, 1970, p. 1091.
(7) D. GITLIN, J. KITZES et M. BOESMAN, Nature, 215, 1967, p. 534.
(8) A. 1. GOUSSE~, N. V. ENGELHARDT, R. MASSEYEFF, R. CAMAIN et B. BASTERIS, Znt. J. Cancer, 7,
1971, p. 207.
(9) D. T. PUR~LO et E. J. Yums, Fed. Proc., 30, 1971, p. 634.
(10) G. 1. ABELEV et R. BAKIROV, Vopr. Med. Khim., 13, 1967, p. 378.
(11) 1. S. IRLIN, S. D. PEROVA et G. 1. ABELEV, Znt. J. Cancer, 1, 1966, p. 337.
(12) E. W. HULL, R. W. Q’GARA, C. F. SMITH et P. P. CARBONE, Proc. Amer. Assoc. Cancer Res., 10,
1969, p. 41.
(1s) M. RI~CHE, S. QUELIN, 1. SECK, M. JACQUESSON, B. BASTERIS et R. MASSEYEFF, Comptes rendus,
271, Série D, 1970, p. 1148.
(14) C. DECKERS et G. 1. ABELEV, in : H. PEETERS, Frotides of the Biological Fluids, Elsevier, Amster-
dam, 10, 1962, p. 312.
(1s) G. M. HOCHWALD, G. J. THORBECKE et R. ASOFSKY, .Z. Exp. Med., 114, 1961, p, 459.
(16) G. 1. ABELEV, Cancer Res., 28, 1968, p. 1344.
(17) J. URIEL, Pathol. BioL, 17, 1969, p. 877.
Faculté de Médecine de Dakar,
Laboratoires de Biochimie et Physique Médicale ;
IEMVT, Laboratoire National de YElevage et de Recherches Vétérinaires,
Service des Cultures de Tissus, B. P. no 2057, Dakar;
Ecole Nationale de Médecine de Nice,
Laboratoires d’immunologie et de Biochimie, 06-Nice, Alpes-Maritimes.
5. - Imp. JOUVE, 12, rue de Tournon, Paris (61
Imprimé en France
1
Série D
CANCÉROLOGIE. -Synthèse in vitro d’a FoetoProt
) par le foie humain
cancéreux en culture. Note (*) de Mme Simone Que
MM. Michel Rioche,
Yves Bresson et René Masseyeff, présentée par M
Des cultures sont faites à partir de fragments hépatiques prov
de malades atteints de
cancer primitif du foie (CPF). Certaines produisent de l’a FP ; la synt
e novo de la protéine est
démontrée par incorporation d’acides aminés radioactifs et analyse
-radioimmunologique des
milieux de culture.
L’a FP, cqnstituant spécifique du sérum fœtal,
araît après la nais-
sance C(l), (“)] ; sa réapparition chez
cancer hépatocellulaire [(3), (4), (“)]
ramment utilisée pour le diagnostic de la maladie (“).
La preuve directe que la synthèse de l’a FP est bien
fœtale ou néoplasique, peut être apportée par l’étude
fluorescence ainsi que l’ont montré Gitlin (‘), Gousse
Par ailleurs, Abelev (l’), Irlin (“) et Hull (“), utilis
raux de rat, souris et singe, observent que les cellules
tiques animales sont
capables de synthétiser l’a FP in vitro.
Nous nous sommes proposés d’entreprendre d
humains cancéreux, dans le but de préciser la n
d’or FP et les facteurs pouvant influer sur sa sécrétion.
MÉTHODES. - 1. Matériel. Cultures. -*Ceux-ci ont
t l’objet d’une précé-
dente communication (‘“).
II. Recherche de l’a FP. - Les milieux de c
semaine sont filtrés, dialysés puis concentrés sous vide à 4
: les échantillons sont
analysés par analyse immuno-électrophorétique
l’aide d’un antisérum spécifique anti-a FP selon le procédé
Deckers et Abelev (14)
en utilisant comme témoins des sérums avec et
ture vierge.
II. Incorporation d’acides aminés radioactifs.
avons utilisé la méthode d’Hochwald et coll. (‘“).
sans lysine ni leucine ces mêmes acides aminés
2 pCi/ml. L’incorporation de ces acides aminés dans les
téines est vérifiée par
autoradiographie des plaques d’immunodiffusion à l’aide de m « Kodak Tri X Pan-
4194 » 320 ASA.
Résultats : Ils sont résumés dans le tableau 1.
Trois essais nous semblent d’un intérêt particulier :
1. No 6 : prélevées chez un malade a FP+, les cellules
rément dans deux milieux, à 30 ‘A de sérum humain :
- milieu 1 : Hank’s balanced salt solution + 0,5 %
bumine + 0,l % d’extrait de levure (Yeastolate Difco) + 1
- milieu 2 : minimum Essentiel de Eagle + 1 mg/ ‘A d
(2)
TABLEAU I
11 Cultures à
Toutes sont a FP - bien que 9
f
““” --+ proviennent de malades a FPS
25 Echantillons mis
18 Cultures
6 a FF + provenant toutes de
en culture
l
réussies
7 Cultures à
f malades a FP +
<L
szpce <
1 a FP - provenant d’un malade
b à sérum très faiblement a FP +
Nous constatons que dans le milieu 1, la croissance des cellules est très active et
se prolonge un mois alors qu’el!e est faible et fugace dans le milieu 2 ; Le tableau II
montre, de plus, un parallélisme étroit entre la production d’a FP et la multiplication
cellulaire.
TABLEAU 11
Essai no 6 : activité de la culture et production d’a FP
Milieu 1
Milieu II
Nombre
_ _ - .--a---- .-._ _---
de jours
Multiplication
Production
Multiplication
Production
de culture
cellulaire (*)
d’a FP (*‘h)
cellulaire
d’a FP
-
-
6
Importante
+-t+ C**l
Faible
-t -t
11
-
+++
-
4
1 6
-
+ t +
Nulle
-
1 9
Moyenne
-t- i
-
-
25
-
-t f-
27
FaibIe
-t
36
Nulle
-
(*) Appréciée d’après l’augmentation apparente de la densité cellulaire.
(**) +-i- + : Précipitation intense ; + + : Précipitation nette ; i- : Précipitation faible ; - : Absence
de précipitation ; toutes conditions étant égales par ailleurs.
2. NO 26 : malade dont le sérum contient des traces d’a FP ; malgré une multi-
plication intense des cellules pendant un mois et demi, l’a FP n’est jamais décelée
dans les milieux de culture.
EXPLICATION DE LA PLANCHE
Fig. 1. - Incorporation d’acides aminés marqués au 14C. Immunodiffusion double en gel d’agarose :
A. Lame colorée au Noir Amide ; B. Autoradiographie de la même lame. Trou central : sérum de
lapin anti a FœtoProtéine Humaine ; Trou 1 : sérum humain normal adulte ; Trous 2, 4, 6 : sérum
d’un malade atteint de CPF contenant de l’a FœtoProtéine ; Trou 5 : milieu de culture CPF 3p (cul-
ture en prêsence d’acides aminés marquk) ; Trou 3 : milieu de culture CPF 31 (culture sans acides
aminés marqués).
Fig. 2. - Incorporation d’acides ami& marqués au WZ. Analyse immunoélectrophorétique en gel d’aga-
rose : A. Lame colorée au Noir Amide ; 3. Autoradiographie de la même lame. Trou central : milieu
de culture CPF 31 (avec acides aminés marqués) ; Réservoir supérieur : sérum de lapin anti a Fœto-
Protéine Humaine ; Réservoir inférieur : sérum de cheval anti-protéines sériques humaines.
PLANCJXE 1.
Mme SIMONE QUELIN.
c
2
6
3
5
4
Fig. 1
------------+-Y
-.-_
,’
. .
’
’
Fig. 2
3. No 31 : malade à sérum CI FP+ ayant subi une hé atectomie partielle. A
partir du lobe excisé, sont effectuées séparément :
P
- des cultures d’explants de foie non cancéreux (préle és loin de la tumeur) ;
- des cultures d’explants cancéreux.
Les cultures d’explants cancéreux synthétisent l’a FP
t un mois et demi
alors que les autres n’en produisent à aucun moment.
Dans cet essai, la synthèse de novo de l’a FP est dé
par incorporation
d’acides aminés radioactifs. En outre, des essais prélimin
s faits selon la même
technique montrent que les cellules cancéreuses synthétis
res protéines dont
certaines ont été identifiées (albumine, transferrine, fibri
DISCUSSION. - 1. Réalité de lu culture d’hépatocyt
. - Comme cela
a été évoqué dans notre précédent article (13), cert
(cellules multinucléées, polymorphisme) et l’aspect
tion en amas, autoaggrégation spontanée des cellu
cellules cultivées sont bien cancéreuses. Leur capacit
considérée comme une preuve de leur nature hépatocytai
En effet, à la suite
d’expériences de transplantation in vivo, ou d’étu
majorité des auteurs admettent que l’a FP est syn
fœtale ou tumorale et non par des cellules hématopoïétiques.
2. Synthèse de novo de E’a FP. - Outre la mis
dans les milieux de culture, après incorporation d’acides
inés radioactifs deux
arguments nous autorisent à conclure qu’il y a sy
a. Proportionnalité, lorsque la sécrétion a lie
cation cellulaire et la quantité d’a FP produite.
b. Synthèse se prolongeant plusieurs semaines.
3. Facteurs qui gouvernent la synthèse d’a FP au nive
cellulaire. - D’après
nos expériences, seuls les hépatocytes cancéreux provenant d
alades à sérum riche
en a FP synthétisent cette protéine in vitro.
Ces études confirment les conclusions de tra
corrélation entre cancérisation et présence d’a F
tains CPF n’élaborent pas d’a FP sérique ; dans le foie d’un
ade à sérum a FP +,
tous les nodules ne sont pas sécréteurs, enfin, dans les nod
sécréteurs, toutes les
cellules ne sécrètent pas en même temps. Peut-on conclure
la capacité de syn-
thèse de l’a FP est génétiquement transmise par les cellules
caractère ne serait
pas modifié par la culture et correspondrait à une altération
anente de l’expres-
sion génétique.
Ces essais ne permettent pas de trancher e
portant sur des cellules déjà différenciées et ce11
cancérisation porte sur des cellules souches n’ayant pas en
e perdu leur capacité
de synthèse de l’a FP [(16), (“)J. Il est difficile d
(4)
active d’a FP in vitro résulte d’une production maximale de la protéine par un
nombre limité de cellules ou d’une synthèse modulée sur l’ensemble des cellules. Des
études en immunofluorescence pourraient nous renseigner à ce sujet.
L’origine des cellules et l’intensité de leur multiplication paraissent les deux fac-
teurs majeurs déterminant la synthèse d’a FP.
i
(*) Séance du 20 décembre 1971.
M. le Professeur M. Sankale, doyen de la Faculté de Médecine de Dakar, M. le Professeur M. Gruet,
MM. les Docteurs Bernard, Robin, Derrien, Hôpital principal, M. le Docteur 1. Seck, Faculté de Méde-
cine et M. M. Jacquesson, Hôpital Le Dantec nous ont fourni les prélèvements nécessaires. Le sérum
humain nous a été fourni par M. le Professeur Linhard, directeur du Centre de Transfusion. Nous
sommes redevables au CEA pour la fourniture gracieuse d’acides aminés marqués.
(1) D. GJ~LIN et M. BOESMAN, J. Clin. Znvest., 45, 1966, p. 1826.
(2) Y. S. TATARINOV et A. AFANASYEVA, Bull. Exp. Bioi. Med., 59, 1965, p. 65.
(3) Y. S. TATARINOV, Vopr. Med. Khim., 10, 1964, p. 90.
(4) M. STANISLAWSKI-BIRENCWAJG,
3. URIEL et P. GRABAR, Ccmcer Res., 27, 1967, p. 1990.
(5) E. W. HULL, P. P. CARBONE, 1). GITLIN, R. W. Q’GARA et M. G. KELLY, J. Nat. Cancer Znst., 12,
1969, p. 1035.
(6) G. T. O’CONOR, Y. S. TATARINOV, G. 1. ABELEV et J. URIEL, Cancer, 25, 1970, p. 1091.
(7) D. GITLIN, J. KITZES et M. BOESMAN, Nature, 215, 1967, p. 534.
(8) A. 1. GOUSSE~, N. V. ENGELHARDT, R. MASSEYEFF, R. CAMAIN et B. BASTERIS, Znt. J. Cancer, 7,
1971, p. 207.
(9) D. T. PUR~LO et E. J. Yums, Fed. Proc., 30, 1971, p. 634.
(10) G. 1. ABELEV et R. BAKIROV, Vopr. Med. Khim., 13, 1967, p. 378.
(11) 1. S. IRLIN, S. D. PEROVA et G. 1. ABELEV, Znt. J. Cancer, 1, 1966, p. 337.
(12) E. W. HULL, R. W. Q’GARA, C. F. SMITH et P. P. CARBONE, Proc. Amer. Assoc. Cancer Res., 10,
1969, p. 41.
(1s) M. RI~CHE, S. QUELIN, 1. SECK, M. JACQUESSON, B. BASTERIS et R. MASSEYEFF, Comptes rendus,
271, Série D, 1970, p. 1148.
(14) C. DECKERS et G. 1. ABELEV, in : H. PEETERS, Frotides of the Biological Fluids, Elsevier, Amster-
dam, 10, 1962, p. 312.
(1s) G. M. HOCHWALD, G. J. THORBECKE et R. ASOFSKY, .Z. Exp. Med., 114, 1961, p, 459.
(16) G. 1. ABELEV, Cancer Res., 28, 1968, p. 1344.
(17) J. URIEL, Pathol. BioL, 17, 1969, p. 877.
Faculté de Médecine de Dakar,
Laboratoires de Biochimie et Physique Médicale ;
IEMVT, Laboratoire National de YElevage et de Recherches Vétérinaires,
Service des Cultures de Tissus, B. P. no 2057, Dakar;
Ecole Nationale de Médecine de Nice,
Laboratoires d’immunologie et de Biochimie, 06-Nice, Alpes-Maritimes.
5. - Imp. JOUVE, 12, rue de Tournon, Paris (61
Imprimé en France