&STITüT SEÎdEG&!.IS I" f%CHERCF!ES ...
&STITüT SEÎdEG&!.IS I" f%CHERCF!ES
a\\. AGRICOLES (I.S.R.A.)
..---------
L,!WRA'IDIRE NATIONAL DE L'ELEVAGE
ETDE REXHFtRCHES VETERINAIRES
FICHE TECHNIQU
L'HEMAGGLUTINATION ET L'INHIBITION )E L'HEMAGGLUTINATION
DU VIRUS PARA-INFLUEN 4 TYPE 3
Par P.C. LEFEVRE
Service de Virologie - Lh RV
REF. No 95/VIRO.
SEPTEMBRE 1982.
INTRODUCTION
/
Le virus para-influenza type 3 est un virus
lativemnt récent en médecine
. . *<.
G5tétiinaim : il n'a été iSolé la premiè~"f*iS'
dpwïe @LAdle respira-
toire de bovins. Par la suite, de nombreuses ét
isolerkt'ou énqu&ess&&o-
giques) ont mntré qu'il était f*iiemrlt impli
é.dans des tmubles~pulmnaixes
de notireus~s espèc~s:$omstiques. En Afrique s
lier-me, son r6le dans les
':_. 'I
"pneumpatiies des petits ruminants" a 6té scsugq
s plusieu&'années.
-;..
.'._
En dehors d'isolements syst&atiques lors
seule une enquête basée
sur la réaction d'inhibition de l'hémagglutinat
n peut d'évaluer la ptivalence
de l'infection et par con&
:*
..,
k virus para-influenza type 3 possèdi-
inine &&à-vis des
hématies de cobayes et de mutons.
sOuvent noyée dans
l'enveloppe lipopmtéique et un tmiterwnt des
rus est nécessaire pour
aupnter le titre.
Les t'actions d'héma~glutinat
l'hémagglutination ont
,été décrites et codifiees par plusieurs auteurs.
.- ,.:
Cette note a pour Qut,gF
le, rapide flin que les
résultats obtenus d'une année
s pays d'tiique soieti
.' :
" .'
compar*le.~..
1 -TRAITEMENT IYJ VIRUS
D E L'HEMAGGUITINATION
., .._.-
..
nucléocapside, projections souvent noyées 'dans "enGei@pe lipopmtéique (voir
.<
'. <.
:
schh).
t
----A. .
'W
1::.
..a'
,; . .
.._.. __.. - _
:
_, (
Le but du traiterrent est d'augmenter le tik hémagglutinanten dC%apant
l'enveloppe du virus:
I
. .
1
/
. . . . . .
':Techniaue
- cUlture.du virus (souche SF4 ou IM) sur cellules de rein de mouton jusqu'à
: " ‘ ECP,cor@et (25 jours)
..'. ,, - Trois cycles de congélation - décongélation
- Ajouter 0,125 ml de T'&en 80 pour 100 CL de suspension virale. La&ser 15' à
température ambiante
- Ajouter de l'éther à volume égal à celui de la suspension virale. Laisser
1 h à 4O en agitant de temps en temps
-Centrifuger à 1500tpmpendant10'
- Récupérer l'antigène sans détruire Aa couche de ?tYeen SO qui se fo?xe à
lasurface
- Evaporer l'éther sous vide pendant 1 heure.
:
Résultats
Une wnparaison entre antigène trait& et antigène non traité a été effectuée
.i
'et les r&iLta~s'c&lligés'dans le'tableau suivant':
.;'
;
'.
Titre
départ (1)
1 rfois
2 mois
3 rrks
Conservation
T; TE
: 256 (2)
2 5 6
256
256
Nr
32
16
CongGiateur
NF
:'NF
,.'
:
:'
:
il
'.T:TE
256
256
NF
128
NT
3 2
NF
.'
NF:
NF
Réfrigérateur
,'
<
(1) "yenne de 5 titrages au moins .'
(2) inverse de la dilution donnant une HA totale
'
NFznon fait
Conclusions
.'.
',
4, h
IR traitement au *en-éther auente le titre de l'antigène de 3 à 4 dilu-
tiens et permet une conservation de plusieurx; m&s sans baisse importante du
j-i-.'
-,
'f
':
<j
y
z:'
,:,:,,:
'I,
_,
. .:
/
. . . . . .
-3
II - REACTIONS D'HEMAGGLUI'INATION ET D"INHIBITION DE
'XMAGGLUTINATI'
WVIRUS PARA-IM'LUENZATYPE 3
:.
. :
INTRODUCTION
Les 2 réactions peuvent se faire soit en t1
zs, soit en kx-oplaques
(micmtiter - Dynatech corporation).
A- PEACTIOW
1 - En tubes
Réaction
d'héqagglutination
tubes
1
2
3 ..o....<
12
PBS
0,4
Virus
GR 0,8 %
.
072
032
0,2.......,
OJ
OY?
1/8
17TF
.D,...I
.-..._.
Dilutiok
17G. ..
."' 17509'6
TGR
Réactions d'inhibition de l'hémagglutination
tubes
1
2
3 0.0.....
: 9
10 11 12
PBS
0
0,2
O;%.......
. . 092
$2
0,4
0,2
II sérums
. . 72
IllO
o,~./dy+o>2,c>~,~*....~..
O,2..
-
-
(voir plus !'
.' :
r”;
loin)
I;'
dilution
sém
l/lO
1/20
lAO...,..
. .
1/25bO
TS
TGR TV
virus
(4u HA)
092
032
q,2
..0..*
. . ..0,2
032
lh ?i 37'
GR 0,8 %
032
0,2.
,Q,2:. 'i'
092
0,2
052
0,2
.*. /
. . .
-4
2 - En tiropkqueç
y. .
,.
. . ._ .
-
Réaction d'hkmg&utination
Mat&iel = plaques à fonds ronds
+’
Mica-dilution de 0,05 mI
.
Mic&-pipefte de 0,05 ml (1 gg)
cupules
1
2
3 ..,UI........ 11
PBS
Cl,05
CI,05 ,1..-0 . . . . .0,05
w
0,05
0,05
0,05
-.
Virus
091
GR 0,8 %
0,05
0,05
o,ov.......... O,O5
0,05
Réaction d'inhibiti&'Xe i'h&mgglutination
cupules
1
2
3 0...d0.00... 9
10 11
12
--~.~
PBS
0,025
0,025 ‘*o*e.*r,. 0,025
0,025
o,OV 0,025
0,025
0,025
0,025
sém l/lO
0,os
0,025 -- -
(1 gg)
Virus (4ü HA
0,025)
0,025
0,025
0,025.......... 0,025
. . .
Dilution sérum
l/lO
1/2cJ
1/4O ..,.ee.,.. 1/2560 1 TS TGR TV
lh 30 à -tmp&ature ambiante
GR 0,8 %
0,os 0,05
0,05 *.E..,*.*. 0,05
0,05
0,05 0,o:i
Matériel' = plaques c1 fonds ronds
'
micro-diltiteur de 0,025 nil
micro-pipettes de 0,05 ml
.
pipettes de Duclaux = 1 gg = 0,05 ml.
. . /. ..*
K
- Y
.
l.-:-La:&action en microplaque permet le tmiterr
t d'un grand nombre de sérums
avec 1 minimum de travail
:
- la distribution du s&ug~ traité peut se fa e à la pipette Duclaux (1 gg =
: :.
0,05 ml)
- le micro-diluteur de 0,025 ml n'a pzs besc
-&s.L.-....~ sém* Il suffit de plongea.-1 micru-diluteur..~~~_lf-du
distill& et verifier le volume Zi l'aide d n buvard GO - NOGCY ,'
. .._
;.,- ). ',,
- les microplaques à fonds ronds pemt-t~t
e meilleure app&iation des
r&xiLtats intermédiaires (2 t 3 + ou 4 t que les plaques à fonds coniques.
2 - Des exp&iences (LEF'EVRE - Rapport Fmcha 19
-1380) ont mont& I
- que le PBS ph 7,2 est aussi bon diluant que
VAD (virus adjusting diluant)
- que le pH doit être compris entre Gi8 et 754
- que la lecturi? est plus rapide à 37O
- que la concentr&ion optimum des GR est de 7
B- T.RAIm\\lT DES SERUMS
<’
Pour la~~&acticn d'HA, il est recomnd~ de raiter les sém, pour éliminer
., .'
.les ,inhibiteum rmn spécifiques ,(traitement.au k
i-.
lin) où les hC&g@xtinines
.: I I ':::
non spécifiques (traitemmt aux GR).
BERNfRD s'appuyant SUI? les r&ultats de-PRO
ST et BORREIXN'esi$rie que le
traitement au kaolin est inutile, les ii-Cbiteur
non spécifiques disparaissent
,
:
au 1/40è.
:
. . . .'
:
.:<
.-
Les exp&iences ,du service de Vim,logie pc: nt sür un petit nombre de
sérums tout vemnt : 16 sérums de moutons et ch& es'pr&levés ;i D-Ai.
1 - Résultats
1) Traitement au kaolin
Nombre de xitifs au
./lO
1/20
40
?/8Q
l/ 160
sérums'tr&tés au kaolin
12
4
2
1
1
Sérunas non traités
16
16
3
1
1
I
l . . /
. . .
I
-
“- 6
La di~cxxdance est nette au 1/2Oè où semble que les inhibiteuxs non
il
spécifiques aient disparu ap&s traitenxwt. Au 1/4Oè, 6 sérums non trait& sont
lus positifs contre 2 seulement apr+s txaitement.
:
1~ traiterrent au kaolin est donc n&essaire.
2) Trwitmt awE GR
N é g a t i f s
+ 1/40è
+ l/4OG et plus
traites
6
5
5
(K+G?)
4
7
5
non -trait&
Il apparaît qu'en revanche, les h&agglutini.nes non spécifiques n'in-ter
viennent pas.
2- Traite=nt des sérums
a> au kxLin = suspension de kaclin lavé aux acides à '25 g pou? 100 ml d'eau
distillée
PBS
= 0,4 ml
skum = 0,l ml.
Kaolin = 0,5 ml
_
.
20' à temp@ratu~ ordi.naixe avec agitation périodique centrifugation 1 500
:
tpm pendant 15 JITI.
”
Le surnageant est considè& être la dilution au !!/lO du &I%L
.,.
b) Si néccssair~~ ('pour les petits xwxinants, ce Qxitement est inutile)
Suspension de GR de cobayes à 50 p.100
.
.Ajouter 0,l nii_ au surnageant du traiteswnt au kaolin. Laisser 1 F.
.
à 4O.C avec agitation périodique. CentrifugeT.
.
.._
.“.
.
.
,-
.,
I .
:
:
:
.I
-7
Pour standardiser la tectique au niveau dt bratoire et pour une compa-
raison possible des kultats, il est proposé de Fa& les tiactions HA et IHA :
- en micmplaques (plaques à fonds ronds)
- avec du PBS pF1'7 ou 7,2
- avec un antigène traité au Tween-éthw
- après traiteront des s&xms au L~olir,
- et prise en consid&wt5.m des &sultats au 1/1 1 -2t-
.<
NOTA
Une runara,ue in-portante doit être faite :
Il n'y a pas cm2-&iation entre le titre en antir
rps inhibant l'h&m&&tination
et en anticorps neutralisant.
Par consêqwnt, la présence dvanticorps Ii% ne . aduit qu'un contact prkédent
avec le virus Fa 3 sans ptijuger de lc6ta% d': munité des ankux.
. _. ,_
B I B L I O G R A P H I E
.:, ':
.."
..,,!
. .
JOHN (T.J.1 i FULGINITI (V.A.) - Para-înfluenm 2 virus : Increase in hm.!Zlu-
tinin titer on trmtmnt with T&er! 80 and Ether.
Pr-oc. Soc. exp. Biol.. Med., 1966, 121 : 109-111.
BERNARD (G.) .I Etude de 1'immnité nature?.ïe c;u acquise du tmupeau sk&@is
vis-à-vis de la peste bovins et des rmladies apparentées. Thèse Doctorat
Université de bkar.
1..
PFOVOST (A.), BORREDON CC.1 -- Rzpport mnuel du Ltimtoire de Fada, 1965 :
p. 60 et 61..
,,’
a\\. AGRICOLES (I.S.R.A.)
..---------
L,!WRA'IDIRE NATIONAL DE L'ELEVAGE
ETDE REXHFtRCHES VETERINAIRES
FICHE TECHNIQU
L'HEMAGGLUTINATION ET L'INHIBITION )E L'HEMAGGLUTINATION
DU VIRUS PARA-INFLUEN 4 TYPE 3
Par P.C. LEFEVRE
Service de Virologie - Lh RV
REF. No 95/VIRO.
SEPTEMBRE 1982.
INTRODUCTION
/
Le virus para-influenza type 3 est un virus
lativemnt récent en médecine
. . *<.
G5tétiinaim : il n'a été iSolé la premiè~"f*iS'
dpwïe @LAdle respira-
toire de bovins. Par la suite, de nombreuses ét
isolerkt'ou énqu&ess&&o-
giques) ont mntré qu'il était f*iiemrlt impli
é.dans des tmubles~pulmnaixes
de notireus~s espèc~s:$omstiques. En Afrique s
lier-me, son r6le dans les
':_. 'I
"pneumpatiies des petits ruminants" a 6té scsugq
s plusieu&'années.
-;..
.'._
En dehors d'isolements syst&atiques lors
seule une enquête basée
sur la réaction d'inhibition de l'hémagglutinat
n peut d'évaluer la ptivalence
de l'infection et par con&
:*
..,
k virus para-influenza type 3 possèdi-
inine &&à-vis des
hématies de cobayes et de mutons.
sOuvent noyée dans
l'enveloppe lipopmtéique et un tmiterwnt des
rus est nécessaire pour
aupnter le titre.
Les t'actions d'héma~glutinat
l'hémagglutination ont
,été décrites et codifiees par plusieurs auteurs.
.- ,.:
Cette note a pour Qut,gF
le, rapide flin que les
résultats obtenus d'une année
s pays d'tiique soieti
.' :
" .'
compar*le.~..
1 -TRAITEMENT IYJ VIRUS
D E L'HEMAGGUITINATION
., .._.-
..
nucléocapside, projections souvent noyées 'dans "enGei@pe lipopmtéique (voir
.<
'. <.
:
schh).
t
----A. .
'W
1::.
..a'
,; . .
.._.. __.. - _
:
_, (
Le but du traiterrent est d'augmenter le tik hémagglutinanten dC%apant
l'enveloppe du virus:
I
. .
1
/
. . . . . .
':Techniaue
- cUlture.du virus (souche SF4 ou IM) sur cellules de rein de mouton jusqu'à
: " ‘ ECP,cor@et (25 jours)
..'. ,, - Trois cycles de congélation - décongélation
- Ajouter 0,125 ml de T'&en 80 pour 100 CL de suspension virale. La&ser 15' à
température ambiante
- Ajouter de l'éther à volume égal à celui de la suspension virale. Laisser
1 h à 4O en agitant de temps en temps
-Centrifuger à 1500tpmpendant10'
- Récupérer l'antigène sans détruire Aa couche de ?tYeen SO qui se fo?xe à
lasurface
- Evaporer l'éther sous vide pendant 1 heure.
:
Résultats
Une wnparaison entre antigène trait& et antigène non traité a été effectuée
.i
'et les r&iLta~s'c&lligés'dans le'tableau suivant':
.;'
;
'.
Titre
départ (1)
1 rfois
2 mois
3 rrks
Conservation
T; TE
: 256 (2)
2 5 6
256
256
Nr
32
16
CongGiateur
NF
:'NF
,.'
:
:'
:
il
'.T:TE
256
256
NF
128
NT
3 2
NF
.'
NF:
NF
Réfrigérateur
,'
<
(1) "yenne de 5 titrages au moins .'
(2) inverse de la dilution donnant une HA totale
'
NFznon fait
Conclusions
.'.
',
4, h
IR traitement au *en-éther auente le titre de l'antigène de 3 à 4 dilu-
tiens et permet une conservation de plusieurx; m&s sans baisse importante du
j-i-.'
-,
'f
':
<j
y
z:'
,:,:,,:
'I,
_,
. .:
/
. . . . . .
-3
II - REACTIONS D'HEMAGGLUI'INATION ET D"INHIBITION DE
'XMAGGLUTINATI'
WVIRUS PARA-IM'LUENZATYPE 3
:.
. :
INTRODUCTION
Les 2 réactions peuvent se faire soit en t1
zs, soit en kx-oplaques
(micmtiter - Dynatech corporation).
A- PEACTIOW
1 - En tubes
Réaction
d'héqagglutination
tubes
1
2
3 ..o....<
12
PBS
0,4
Virus
GR 0,8 %
.
072
032
0,2.......,
OJ
OY?
1/8
17TF
.D,...I
.-..._.
Dilutiok
17G. ..
."' 17509'6
TGR
Réactions d'inhibition de l'hémagglutination
tubes
1
2
3 0.0.....
: 9
10 11 12
PBS
0
0,2
O;%.......
. . 092
$2
0,4
0,2
II sérums
. . 72
IllO
o,~./dy+o>2,c>~,~*....~..
O,2..
-
-
(voir plus !'
.' :
r”;
loin)
I;'
dilution
sém
l/lO
1/20
lAO...,..
. .
1/25bO
TS
TGR TV
virus
(4u HA)
092
032
q,2
..0..*
. . ..0,2
032
lh ?i 37'
GR 0,8 %
032
0,2.
,Q,2:. 'i'
092
0,2
052
0,2
.*. /
. . .
-4
2 - En tiropkqueç
y. .
,.
. . ._ .
-
Réaction d'hkmg&utination
Mat&iel = plaques à fonds ronds
+’
Mica-dilution de 0,05 mI
.
Mic&-pipefte de 0,05 ml (1 gg)
cupules
1
2
3 ..,UI........ 11
PBS
Cl,05
CI,05 ,1..-0 . . . . .0,05
w
0,05
0,05
0,05
-.
Virus
091
GR 0,8 %
0,05
0,05
o,ov.......... O,O5
0,05
Réaction d'inhibiti&'Xe i'h&mgglutination
cupules
1
2
3 0...d0.00... 9
10 11
12
--~.~
PBS
0,025
0,025 ‘*o*e.*r,. 0,025
0,025
o,OV 0,025
0,025
0,025
0,025
sém l/lO
0,os
0,025 -- -
(1 gg)
Virus (4ü HA
0,025)
0,025
0,025
0,025.......... 0,025
. . .
Dilution sérum
l/lO
1/2cJ
1/4O ..,.ee.,.. 1/2560 1 TS TGR TV
lh 30 à -tmp&ature ambiante
GR 0,8 %
0,os 0,05
0,05 *.E..,*.*. 0,05
0,05
0,05 0,o:i
Matériel' = plaques c1 fonds ronds
'
micro-diltiteur de 0,025 nil
micro-pipettes de 0,05 ml
.
pipettes de Duclaux = 1 gg = 0,05 ml.
. . /. ..*
K
- Y
.
l.-:-La:&action en microplaque permet le tmiterr
t d'un grand nombre de sérums
avec 1 minimum de travail
:
- la distribution du s&ug~ traité peut se fa e à la pipette Duclaux (1 gg =
: :.
0,05 ml)
- le micro-diluteur de 0,025 ml n'a pzs besc
-&s.L.-....~ sém* Il suffit de plongea.-1 micru-diluteur..~~~_lf-du
distill& et verifier le volume Zi l'aide d n buvard GO - NOGCY ,'
. .._
;.,- ). ',,
- les microplaques à fonds ronds pemt-t~t
e meilleure app&iation des
r&xiLtats intermédiaires (2 t 3 + ou 4 t que les plaques à fonds coniques.
2 - Des exp&iences (LEF'EVRE - Rapport Fmcha 19
-1380) ont mont& I
- que le PBS ph 7,2 est aussi bon diluant que
VAD (virus adjusting diluant)
- que le pH doit être compris entre Gi8 et 754
- que la lecturi? est plus rapide à 37O
- que la concentr&ion optimum des GR est de 7
B- T.RAIm\\lT DES SERUMS
<’
Pour la~~&acticn d'HA, il est recomnd~ de raiter les sém, pour éliminer
., .'
.les ,inhibiteum rmn spécifiques ,(traitement.au k
i-.
lin) où les hC&g@xtinines
.: I I ':::
non spécifiques (traitemmt aux GR).
BERNfRD s'appuyant SUI? les r&ultats de-PRO
ST et BORREIXN'esi$rie que le
traitement au kaolin est inutile, les ii-Cbiteur
non spécifiques disparaissent
,
:
au 1/40è.
:
. . . .'
:
.:<
.-
Les exp&iences ,du service de Vim,logie pc: nt sür un petit nombre de
sérums tout vemnt : 16 sérums de moutons et ch& es'pr&levés ;i D-Ai.
1 - Résultats
1) Traitement au kaolin
Nombre de xitifs au
./lO
1/20
40
?/8Q
l/ 160
sérums'tr&tés au kaolin
12
4
2
1
1
Sérunas non traités
16
16
3
1
1
I
l . . /
. . .
I
-
“- 6
La di~cxxdance est nette au 1/2Oè où semble que les inhibiteuxs non
il
spécifiques aient disparu ap&s traitenxwt. Au 1/4Oè, 6 sérums non trait& sont
lus positifs contre 2 seulement apr+s txaitement.
:
1~ traiterrent au kaolin est donc n&essaire.
2) Trwitmt awE GR
N é g a t i f s
+ 1/40è
+ l/4OG et plus
traites
6
5
5
(K+G?)
4
7
5
non -trait&
Il apparaît qu'en revanche, les h&agglutini.nes non spécifiques n'in-ter
viennent pas.
2- Traite=nt des sérums
a> au kxLin = suspension de kaclin lavé aux acides à '25 g pou? 100 ml d'eau
distillée
PBS
= 0,4 ml
skum = 0,l ml.
Kaolin = 0,5 ml
_
.
20' à temp@ratu~ ordi.naixe avec agitation périodique centrifugation 1 500
:
tpm pendant 15 JITI.
”
Le surnageant est considè& être la dilution au !!/lO du &I%L
.,.
b) Si néccssair~~ ('pour les petits xwxinants, ce Qxitement est inutile)
Suspension de GR de cobayes à 50 p.100
.
.Ajouter 0,l nii_ au surnageant du traiteswnt au kaolin. Laisser 1 F.
.
à 4O.C avec agitation périodique. CentrifugeT.
.
.._
.“.
.
.
,-
.,
I .
:
:
:
.I
-7
Pour standardiser la tectique au niveau dt bratoire et pour une compa-
raison possible des kultats, il est proposé de Fa& les tiactions HA et IHA :
- en micmplaques (plaques à fonds ronds)
- avec du PBS pF1'7 ou 7,2
- avec un antigène traité au Tween-éthw
- après traiteront des s&xms au L~olir,
- et prise en consid&wt5.m des &sultats au 1/1 1 -2t-
.<
NOTA
Une runara,ue in-portante doit être faite :
Il n'y a pas cm2-&iation entre le titre en antir
rps inhibant l'h&m&&tination
et en anticorps neutralisant.
Par consêqwnt, la présence dvanticorps Ii% ne . aduit qu'un contact prkédent
avec le virus Fa 3 sans ptijuger de lc6ta% d': munité des ankux.
. _. ,_
B I B L I O G R A P H I E
.:, ':
.."
..,,!
. .
JOHN (T.J.1 i FULGINITI (V.A.) - Para-înfluenm 2 virus : Increase in hm.!Zlu-
tinin titer on trmtmnt with T&er! 80 and Ether.
Pr-oc. Soc. exp. Biol.. Med., 1966, 121 : 109-111.
BERNARD (G.) .I Etude de 1'immnité nature?.ïe c;u acquise du tmupeau sk&@is
vis-à-vis de la peste bovins et des rmladies apparentées. Thèse Doctorat
Université de bkar.
1..
PFOVOST (A.), BORREDON CC.1 -- Rzpport mnuel du Ltimtoire de Fada, 1965 :
p. 60 et 61..
,,’