M.P. DOU@?E (x) et B. TOURE (xx) L'emploi dr...
M.P. DOU@?E (x) et B. TOURE (xx)
L'emploi dr matériel 'Wicrotiter" a ccnnu oes dernières ann&s une
large diffusion, auwi bien en sérologie virsle qu'en sérologie bactkienne (2,3).
En France, en pathologie vétérinaire, certains laboratoires utilisent, d'une fa-
çon routinière,lestechniques detimoréactims
aucouzs des travaux. de diag-m-
tics ou de recherches que ces orgtisms poursuivent. C'est ainsiqu'auSer&e
de Pathologie de la Reprodwkion de 1'I.N.R.A. Clburs-L'Orfiasière), les sérolo-
gies de labruœllase (9), de la cbkmydicse et de la fièvre Q sa& exécutées en
faismtappel a cette ti-thode fidèlequi penret de manipûlermpidemnt
de grardes
s&ies d'échantillcns, en éccncmisantles -réactifs parfois coûteux.
Lasérologie delapéripneummie
bovine, tout parliculi&renent en
Australie et en Afrique tmpioale, a donnélieuà de norrbreux dévelcppemnts au
aws des récentes décennies. Les &hodes présentées parles auteurs, troprmt-
breuxpourêtre cités, mttoutes mtribué, peuoupmu, à faciliter le diagncs-
ticdelamladie et à mieux connaftrela cynétique des anticorps oule devenir
des s&stances mti&niques élabo&es lors de l'évolution de l'affection. Dans
œt emetile, la fixation du conplérrent (CFT) derm.ma le test ùe plus commun&ent
pratiqué, il a rendu etmeà rendre de grands serviœs lorsque s'irrpcsent la
néœssité da pr&iserl'exterki.on d'un foyer, de suivre le démulemmt d'une
épreuw d'immmité (expérienœ conta& de type a~tmlien), etc...
Si l'ai. excepte la &action d'hém&utinatim indirecte décrite par
PERREAU (6), celle de fixaticn du mrplément selm CAMPBELL et TURNER,de PROVOST
(7,8) ou œlle de MT (5) ou de SCUDMRE (lO), la sérologie sur plaques n'a
pas encore ccumu, seablet-il, une utilisatim aussi g&&al.iséeque les néthcdes
mettant en jeu, dars des tubes, des velums de réactifs plts inportants.
( x> : Chef du Service de Bactériologie au Laboratoire Naticnal de 1'Elevas
et de Re&er&es Vétérinaires (I.S.R.A.).
OCK) : Techniciensupérieur, Service de Bactériologie, LabmatoireNational de
1'Elevage et de Recherches Vétérinaires (I.S.R.A.).
2
La présente ptilicaticn apourbut de p&senter une technique de mi-
cm&acztion defixaticn ducmple~reti, déri&edu test classique de KCWR, dcsnt
l~exémtion est rendue possible par l'emploi du matériel Wicrwtiter" (x),
Il cmprendessentiellen-ent (photo 1) :
- des plaques de 8 mn&s de 12 qules en U, en lucite (A),
- des ccmpte-gouttes de 25 a 50 microlitres (if-,) en polypropylène
rmulé,à pointe en acierimx (B) pour la &p&ion des fiactifs,
- des coqte-gouttes à usage unique (dispq@ble) enplastique de
25 et 50,l. (F; pour la répartition cks sérms à la dilution du
l/5 kn fait, apr& nettoyage, rinçage et&&agrr, ces corrpte-
gouttes peuvent Etre riutilisés) ,
- des micro-dilutem WJI.~~~' de 25 à 50,l. CE), encore appel&
tulipes,
- le mandée pour ticro-diluteurs llMultif' CE),
- des buva& spéciaux dits ltgo-no-gol', pour tester les micro-dilu-
teurs de 25 à SO,1 . CD),
- l'adhésif auto-collant, le distributeurdla&ésif, le rouleau
pour appliquer parfaitment l'a&&if et la ian-e mntée pour le
axper CG),
- le rricm-agiteur AM69 pour 4 plaques (Micmtiter) ou le vibreur
(dit aussi vibrateur) pur 4 pl4ues ticmtitration (Luckham btd,
Burgess Bill, Smsex, England) (photo 2). Appareil essentiel pum
la fixation du cmplémnt en pé-ripnemmie, l'agitation manuelle
dans unplanhorizontal étantinsuffismte pourlabcnne diffusim
des &actifs et du couple hémlytique,
- unbain-marieor&naire
(ex.MAMMEHT),
- le rrcimir de lecture CC),
. . . / . . .
(x) :Cmke Engineering Corrpq, Medioal Research Division, 735 North Saint Asaph
Street, Alexandria, Virginia 22314. Représenté en France par Poly-Labo,
Paul Block et Cie, 305 Route de Colmar, 67023 Stmsbaurg Cédex.
des portoirs divers peuvent être ajcxxtés (B),
un frigidaire ou une chan-bre froide à t 4OC.
remarquzà s'imposent :
ltutilisation du matériel (micro-diluteurs) et scn entretien
(lav- des plaques) cbéissent à des &gles strictes, anmnc&s
par le fabricant, qui doivmt être irnpérativemnt respect&,
le prix de revient peut apparaître élevé, mais la rmltiplicité
des titrages r&LisabLes, pour de na-rbreuses affections, lui
donne en fait le caractèred'un 6quipexentdebase de tout
laboratoiremxderne,
Produits biologiques et réactif :
- sérums à tester : les prises de sang doivent être effectuées le
plus stérilemnt possible pour dkinuer au mxirmmle mrbre des
sérum antiromplémntaires (VEIDWUBES, VACUI'AINEPS, matériel
PPELVEX-COOPER). Les sérum; sont sépar& au Laboratoire par cen-
trifugaticn,
- tarrpon véronal-calcium-magnésium (B.DJ?ERIEUX, OXOID) ,
- antigène : préparé selm la technique de CAMPELL et TURNER (1)
par le Service de Microbiologie de 1'I.E.M.V.T. (x1,
- cmplémmt: lycphilisé Urstitut Pasteur, B.D. MERIEUX) ou
frais mais de ben titre.,
- sémmhémlytique de lapin ami-hématies de mcuton (Institut
Pasteur~
- hématies de mton :le protocolesuivantestprGmisé (4) :
utiliser toujours la mêm brebis ; avec une seringue de 50 ml.,
ccxstenant 25 ml. de solution d'AIsever, récolter stérilemmt
25 ml. desang; mettre les 50 ml. dam un balle stérile.
Attendre au reins 3 jcxrs avant d'utiliser les hématies, les la-
ver alors 3 fois parcentrifugatims successives entarrpon.
Q-~utilise dans laréactim une suspemionà environ 3pourlOO. Pour
plus ck prkisicn, il est reommandé de standardiser la suspen-
sicm en prwédant aux opérations qui suivent :
-à partir de 5 ml.de culotd'hémties, après lavage, préparer
50 niL. de suspension d'hématies,
- utiliser le spectmpho~mètre (au laboratoire de Dakar : BECWAN,
.., / . . .
(xl : L'antigène p&par6 àpartirdusurmgeantduproduitprépar6parleSemice
de Bactériologie de lvI.E.M.V.T. (lot ancien) est tout particulii
recQmnandé.
mode1 25, USA) à 540 QJ de longueur d'ande, étalcmerle 0 avec
une solution de carknate de sodium (N32CO~) au 1 p.1000,
- msur?er1'absorbance de :
suspemicn d'h&mties
0,l ml.
so3.rti.m Na$ZOs
4,8 IL
L'absorkmce finale cbit êix de 135 2 5.
Le volume V de las~pemîcn d'hématies à préparerpour obtenir
135 est ainsi calculé :
absorbanœ lue
v =
xvAn-r~ delasuspensicnà titrer.
Lorsque i&3&spensim définitive d%maties est obtenue, vérifier
que :
suspersicn définitive d'hérmties
0,l ml.
solution NazCOg
4,8 ml.
ont une absorbanœ de 135 2 5. Faire &XIX lectures.
Conserverà latenpérature dufrigidaireœttesuspensicn
d'hémties.
B - MEXHODE
Dans un but de clarté, pour exposer une &I%ode bien plus facile à
ex6cuter qu'à décrire, la fycm de disposer les plaques de micmtitmtion face à
l'opérateur a été qualifiée :
- d'!%mizmtàle" ¶ lorsque la longueur est placée de gauche à droite.
Ainsiuneplaque cwtie 8 rangées '?horizmtales" del2 cupules allant de Aà H
ou 12 rangées "verticalesf', de8 etpiLes allarrt delà i2.
- de lrverticalc “, lorsque la largeur de la plaque se trouve de gau&e
à droite. Alors une plaque comporte 12 rang&s "horizontales" de 8 cupules sL1an-t
delà 12,ou8 ran&s "verticales" de H à A (fig. 1).
1 - Titrage du systèm hémalytique : Le titrage d'un sémmhémlytique s'est r&é-
lé très diffîdle à r&liser en micmtiter. Apris différents essais, le sérum
hémlytique de 1'Insfitut Pasteur de Paris est employé a la dilutîm de Ip.1000
. . /. .*.
5
pour une suspension d'hématie s de nxxton présentant une absorbante de 135 t'5.
La sensibilisation des h&naties est effectuée en r&langeant à volumes égaux sé-
rum hemolytique au 1 2.1000 et suspension d'h&aties 3 135 + 5 d'absorbance,
Bien agiter. Dans toutes les fiactions le couple hémlytique est ajouté sous un
volume de 25 ~1.
2 - Titrage du,compl,&nt (photo 3 et fig,Z)
Le protocole proposé permet d'économiser au maximum le compl&tent (4):
- préparer 3 tubes à hemolyse contenant 0,8 ml de tampon,
- ajouter 0,2 ml de complément frais ou reconstitué dans le ler tube,
on obtient 1 ml de solution au 1/5,
- p&lever 0,2 ml de la solution au 1/5, ajouter dans le second tube, on
obtient 1 mil de solution au 1/2S,
- p&lever 0,4 mil de la solution au 1/5, ajouter dans le troisikne tube,
on obtient 1,2 ml de solution au U-15,
- ajouter 1,2 ml de tampon au 0,4 ml restant de la solution au 1/5, on
obtient 1,6 mil de solution au 1/20.
Dilution du complément :
La plaque est tenede façon verticale.
- partager la plaque en 3 zones en traçant au crayon feutre 2 lignes entre
les rangées 4 et 5 et 8 et 9 (fig.1 et photo 31,
- distribuer 50 ~1 de tampon dans toutes les cupules sauf celles de la ran-
gée "verticale" H,
- distribuer 50 ~1 de complément dans les deux premières rangées "verti-
cales" H et G :
- au 1/15 dans ies cupules G9, GlO, Gll, G12 et H9, HlO, I-Ill, X12,
- au 1120 dans les cupules 65, G6, G7, 68 et H5, H6, H7, H8,
- au 11s dans les cupules Gl, 62, 63, 64 et Hl, H2, H3, HY,
- diluer avec les micrûdiluteurs de 50 ~1, montés sur le manche, de la
rangée G à la rangée A, en passant par les rangées "verticales" intermé-
diaires" F, E, D......A.
Ainsi de gauche à droite, dans la zone 1, le complément se -ixwve
r&arti à des dilutions multiples du 1/15 (1/30, 1/60..,.1/1280) sous un volume
de 50 ~1, à raison de 4 cupules pour chaque dilution; dans la zone 2, à des
dilutions multiples du 1/20 (1140, 1/80.....1/2560); dans la zone 3, à des dilu-
tions rrslltiples du 1/25 (1/50, l/lOO..... 1/3200).
6
Titrage :
- ajouter dans chaque cupule : 25 ~1. de tampon,
25 ~1. d'antigke titi (1/20, voir plus
loin),
- recouvrir la plaque d'adhésif auto-collant,
- placer quelques secondes sur le vibreur,
- incuber 1 h. à 37*C. au bain-marie,
- ajouter 25 1~1. de système hérrolytique par cupule,
- recouvrir la plaque d'adhésif auto-collant,
- placer quelques secondes sur le vibreur,
- incuber lh à 37*C au bain-marie,
-lire 2 à 3 hapr& aumiroir de lecture.
Le titre du complément correspond à la dilution maximm dans les
4 cupules où l'hémlyse est totale (ex. : titre au 1/80 : cupules F5, F6, F7,
F8; au l/lOO : F9, FlO, Fil, F12; au 1/60 : cupules Fl, F2, F3, F4, etc...).
On utilise, pour la réaction, le complémmt à 2 unités. Par exemple,
si le titre est le 1/80, utiliser le 1/40.
3 - Titrage de l'antigène (fig.31
La plaque est tenue de façon horizontale.
Disposer d'un sérum étalon décorrrplémenté de titre connu (ex.1/640).
P&parer la dilution 1/5 de ce sérum décomplémnté.
- distribuer 25 ~1. de t-n dans toutes les cupules, sauf celles de la
rangée "verti.cUe" 1,
- distribuer 25 ~1. de sérum étalon au 1/5 dans les deux premières rangées
'verticales" 1 et 2,
- diluer avec 8 microdiluteurs de 25 ~1, mntés sur le manche, de la rangée
"verticale" 2 à la rangée 12, en passant par les rangées "verticales"
intermédiaires 3, 4, 5......12.
La nangée verticale 1 contient donc 25 ~1. de sérum étalon à la dilu-
tion du 1/5; la rangée 2,25 fi. à la dilution du l/lO, etc...; la rangée
verticale 12, 25 ~1. à la dilution du 1/10240.
tiparer 8 dilutions d'antigène situées de part et d'autre d'une
dilution supposée optimum, ex. : 1/5, l/lO, 1/20.....1/640.
. ./ . .
7
- répartir 25 ~1. par cupule de l'antigsne au 1/640 dpans la rang& "hori-
zontale" H; 25 ~1. par cupule de lkntigène au 1/320 d‘ans la rangée
"horizontale" G, etc... 25 ~1. par cupule de l'antigène au 1/5 dans la
rangée horizontale A,
- ajouter le complément a un titre moyen (2U) sous un volume de 50 ~1. par
- recouvrir la plaque d'adhésif auto-collant,
- placer quelques secondes sur le vibreur,
- incuber 1 h. à 37OC au bain-marie,
- ajouter 25 ~1. de système hémolytique par cupule,
- recouvrir la plaque d'adhésif auto-collant,
- placer quelques secondes sur le vibreur,
- incuber 1 h, à 37OC au bain-marie,
- lire 2 à 3 h. après au miroir de lecture.
k titre de l'antigène correspond à la plus forte dilution donnant
le titre exact du sérum étalon, sans hémlyse dans les premières cupules de la
rangée horizontale.
La figure 3 représente un timge d'antigène réalisé COIIHTKZ ci-dessus,
les rangées A et R révèlent un excès d'antigène, les rangées D, E, F, G un naan-
que d'antigène croissant, avec hémlyse dans les premières cupules. Le titre
exact correspond à la ligne D, soit à la dilution du 1/20 de l'antigène. L'anti-
gène utilisé à une dilution supérieure dans la réalisation de la réaction en-
tr&nwait la formation d'un "faux phénomène de zone" pour les basses dilutions
du sérk.lm. La oX??be classique a été surimposée SUT la figure, L'utilisa-
tion de dilutions plus serrées de I'antigène, trop proches du 1/20, n'aurait
pas permis la mise en évidence des différentes zones (excès d'antigène, opti.nuIm,
mue d'antigène).
4 - Exécution de la Action
Deux solutions sont proposées :
- exécution de la réaction avec un seul témoin sérum Cà la dilution du
l/lO). Dans ce cas, la recherche des anticorps se poursuit jusqu'à la
dilution 1/5120.
- exécution de la réaction avec un témin sérum pour chaque dilution.
Dans cc cas, la recherche des anticorps ne dépasse pas la dilution 1/160
(à mins que l'on accepte de placer des plaques bout à bout).
.* /. .
8
En effet, en peripneumnie bovine et dans les conditions de r&olte
des prélèvemnts en brousse, il arrive souvent qu'un sérm, anticomplémmtaire
aw basses dilutions (l/lO, 1/20), soit positif et non anticomplémsntaire aux
dilutions supérieures.
a> Exécution de la Aaction avec un seul témin sém (2 la &lution du
l/lO) (fig.41 :
- diluer les s&ums au 115 dans du tcurlpon et décomplémnter cette dilu-
tion (30 mn à 58-60°C),
- la plaque est tenue de façon 'horizontale" (les sérum étant supposés
fortement positifs, 7 drums + 1 sérum positif de &férence sont étu-
diés par plaque , jusqu'à la dilution du 1/5120, dans le cas contraire,
la plaque peut être tenue de façon "verticale" et permet de traiter
11 sérums + 1 sérum positif de référence, jusqu'à la dilution du 1/320),
- distribuer (à l'aide des compte-gouttes en plastique "disposable") pour
chaque sérum 25 ~1. de la dilution au 1/5 dans la première cupule
(ex. : Al), dans la seconde cupule (.A21 et dam le dernière (A31 (té-
min sérum anticomplémcnttiire) d'une même rangée "horizontale",
- le second sérum se place en Bl, B2, B12, etc...
- ne pas oublier le ou les sérum de référence,
- ajouter 25 ~1. de tampon dans chaque cupule, sauf celles de la rangée
"ve.rticaley 1,
- diluer avec 8 micmdilutem de 25 pl., montés SUT manche, de la rangée
"verticale" 2 à la rangée 11, en passant par les rangées "verticales"
inter-&diaires 3, 4, 5.... 11. (il est évident que si la plaque avait été
tenue de façon "verticale", 12 microdiluteurs auraient été employés de
la rangée “verticale" G à la rangée B, la rangée A contenant les témoins
sérum> )
- ajouter 25 ~1. d?antigène titré (1/20) dans toutes les cupules, sauf
celles appartenant à la dernière mngée "verticale's 12,
- distribuer 50 ~1. de complémnt au titre choisi (2U) dans toutes les
cupules. Cette opération doit être faite en fin de journée ouvrable, le
com$érrent non fixé risquant d'être détruit le lendemain rmtin, mal&
la mise à +4OC, s'il a é-t-6 distribué trop tôt.
- recouvrir la plaque d'adhésif auto-collant,
- placer la plaque quelques secondes sur le vibreur,
- Laisse~~ incuber une nuit à ++OC,
- le lendemin mtin, ajouter? 25 ~1. de système hémlytique par cupule,
- placer quelques secondes la plaque sur le vibreur,
/
. . . .
9
- incuber 30 mn. au bain-marie 2 37*C ,
' "
- lire 2 à 3 heures a?rGs au mimi r de lecture. Bien observer le compor-
terrent des témoins sérums au 1110 (rangée "verticale" 12).
b) Exécution de la r&ction avec un témoin sérum pour chaque dilution
(photo 4 et kg.51 :
Bans ce cas, la plaque est tenue obligatoirement de façon "hori-
zontale".
- distribuer (compte-gouttes en plastique "dispsable"),pour chaque sérum,
25 ~1 de la dilution au 1/5 dans les 4 pretières cupules (ex. : Al, A2,
A3, A4) d'une mke rangée "horizontale",
- le second sérum se place en Bl, B2, B3, B4, etc...
- ne pas oublier le ou les sérums de réfk-ence,
- ajouter 25 ~1 de tampon dans chaque cupule, sauf celles de la rangée
"verticale" 1 et 2,
- diluer avec 8 microdiluteurs de 25 111, montés sur rraache, de la rangée
"verticale" 3 à la rangée "verticale" 11, en passant ,par les rangées
"verticales" intermédiaires 5, 7, 9. Rincer et sécher à la flamme les
microdiluteurs, puis effectuer une nouvelle s&ie de dilutions de la
rangée "verticale" 4 à la rangée "verticale" 12, en passant par les
rangées "verticales" intermédiaires 6, 8, 10,
- ajouter 25 ~1 d'antigène au titre choisi (1/20) dans toutes les cupules
des rangées "verticales" impaires,
- ajouter 25 ~1 de -t-n dans toutes les cupules des rangées 'verticales"
mes y
- distribuer 50 ~1 de complément au titre choisi (2U) dans toutes les
cupules.
. . . ..a. la suite des wtnipulations corrune ci--dessus (a),
IXI'ER'BETATION DES RESULTATS
L'interprétation des résultats est identique à celle déjà connue de
la fixation du compléa:ent en tubes, selon la méthode de l6lmer, à savoir :
est considéré cormne positif tout sérum +++t au 1/80 et douteux, tout sérum
tt++ au 1/40.
.* ! . .
10
CONCLUSIONS
AVANTAGES ET INCOIWENIENTS
DE LA METHODE
Les avantages apparaissent évidents : rapidite d'exécution de réac-
tions grâce à la rklisation automatique des dilutions, d'où possibilité de
tmiter en un temps minimum un nombre de s6m élevé, d'autant plus élevé, que
l'on s'attache à quelques dilutions bien déterminées, les plaques pouvant être
fracticnnées selon la volonté de l'opérateur, Les manipulations sont faciles
à réaliser et un technicien ordinaire acquiert très rapidement le "coup de main"
que réclame l'emploi du rmt&iel "microtit~17 (pipettes, microdiluteurs, etc..,)
La standardisation diminue les risques d'erreur. La &thode est sensible et
fidèle.
Au chapitre des inconvénients, le coût du mtériel ne doit pas être
retenu, l'amortissement étant assuré par la multiplicité des usages auxquels
il se prête (ex. : en péripneumnie bovine, exécution de la -réaction d'hémagglu-
tination indirecte utilisant cm-me antigène les hématies de mouton forrmlées
sensibilisées par le galactane de Mycoplasma -ides). Par contre, au passif,
on doit admttre que ce type de microréaction, qui réClame le confort, le calme
et l'équipement général d'un laboratoire, ne peut &zre pratiqué sur le terrain.
Laboratoire national de L'Elevage
et de Recherches vétérinaires
(1.S.R.A.)
B I B L I O G R A P H I E
(1) CAMPBELL, (A.D.), TURNER (A.W.).- Studies on contagious pleuropneumonia
of cattle. An improved complement-fixation test.-
The Austr.vet.J., 1953, 29 (6) : 154-163.
-
(2) coNJ?ATH, (T.B.),- Handbcok of microtiter procedures, Dynatech Corpor.,
Cambridge, Mass., 1972, 475 p.
(3) ELLIS (E.M.1 .- Microtiter serologic techniques for diagnostic bacteriology.
Proceedings 77th Annual Meet. ofthe IJ.S.Anim,Hlth A~S., 1973 (pu-
blié 1974) 77 : 563-581.
-
(4) FENSTERBAM( (R.I.- Com.pers., 1975.
(51 YMST (O.).- Contagious bovine pleuropnemnia : a plate complement fixa-
tion test employed at the Federal Department of Veterinary Research,
Vom.- Bull.Epiz.Dis.Afr., 1970, 18 (1) : 5-11.
-
(6) PERREAU (P.1, PROVOST (A.), REGNCULT (R.), @RUE (J.).- Valeur de la &ac-
tion d'h&agglutination indirecte dans la péripneumonie bovine.
Rev.Elev.Méd.&t.Pays trop,, 1964, 17 (1) : S-14.
(7) PROVOST (A,).- Adaptation sur plaques de Ia &action de fixation du complé-
ment : application à la décentralisation du diagwstic.- Rapport à la
IVème Réunion Groupe Experts FAOlOIE/OlJA sur la p6~~prm.tmni.e bovine
contagieuse,
Paris, 15-20, 1971, 14 p.
(8) PROVOST (A.).- Recherches immunologiques sur la péripneurrrsnie. XlV. Des-
cription de deux techniques applicables sur le terrain pour le dia-
gnostic de la maIadie.- Rev.Elev,Méd.vét.Pays trop., 1972, 25 (4) :
475-496.
(9) RENOUX (G.1, PLOMMET CM.), PHILIPFQN.- Microréactions d'agglutination et
de fixation du cor@&nt pour le diagnostic des brucelloses,- Ann.
Rech.vét., 1971, 3 (2) : 263-269.
(10) SCUDMRE (J.M.).- Evaluation of the field Cl?T in the diagnostic and con-
trol of CBPP.- Trop.anim.Hlth & F'rod., 1975, 7 (2) : 73-79.
Lematériel Y+ticrwtiter" estenplcyé àlar&JLisatim
d1unen-àcmr6-
dctiOn de fixation du ccmplhmt. ks acœssoires, les réactifs, les différents
temps delamé-%ode fontl'abjet d'une desczipticn d6taillée.
Cette miczmttique sensible et fidèle, très standardisée, d'exécu-
tien rapideet aisée,nepeutétmenplcyéeque
dan~lecadred~unlaboratoire
norrralerrerrt: équipé etm dans les cmditions difficiles dumilieumral.
&ieof'%IicrotiterV systemin cmplerrentfixakiontestin
ccntagîous
bovine pleurqpnewxnia,
Wicrutîterl' systemis u3ed in a cmplemnt fixation micmte&ni.que.
The acœssories,thereagenti caidthevtious stages ofthete&nicalprmess are
describedin cwtails. The sensitive aid mnstant mhwtedmique canbe easily
perfomdand &llcws serialsemlog;ical diag~cc;is onlyintie îitits oftheacti-
vities of anonnally equipped labomtoxy. Application in the fieldis beymd
possibilities.
L'emploi dr matériel 'Wicrotiter" a ccnnu oes dernières ann&s une
large diffusion, auwi bien en sérologie virsle qu'en sérologie bactkienne (2,3).
En France, en pathologie vétérinaire, certains laboratoires utilisent, d'une fa-
çon routinière,lestechniques detimoréactims
aucouzs des travaux. de diag-m-
tics ou de recherches que ces orgtisms poursuivent. C'est ainsiqu'auSer&e
de Pathologie de la Reprodwkion de 1'I.N.R.A. Clburs-L'Orfiasière), les sérolo-
gies de labruœllase (9), de la cbkmydicse et de la fièvre Q sa& exécutées en
faismtappel a cette ti-thode fidèlequi penret de manipûlermpidemnt
de grardes
s&ies d'échantillcns, en éccncmisantles -réactifs parfois coûteux.
Lasérologie delapéripneummie
bovine, tout parliculi&renent en
Australie et en Afrique tmpioale, a donnélieuà de norrbreux dévelcppemnts au
aws des récentes décennies. Les &hodes présentées parles auteurs, troprmt-
breuxpourêtre cités, mttoutes mtribué, peuoupmu, à faciliter le diagncs-
ticdelamladie et à mieux connaftrela cynétique des anticorps oule devenir
des s&stances mti&niques élabo&es lors de l'évolution de l'affection. Dans
œt emetile, la fixation du conplérrent (CFT) derm.ma le test ùe plus commun&ent
pratiqué, il a rendu etmeà rendre de grands serviœs lorsque s'irrpcsent la
néœssité da pr&iserl'exterki.on d'un foyer, de suivre le démulemmt d'une
épreuw d'immmité (expérienœ conta& de type a~tmlien), etc...
Si l'ai. excepte la &action d'hém&utinatim indirecte décrite par
PERREAU (6), celle de fixaticn du mrplément selm CAMPBELL et TURNER,de PROVOST
(7,8) ou œlle de MT (5) ou de SCUDMRE (lO), la sérologie sur plaques n'a
pas encore ccumu, seablet-il, une utilisatim aussi g&&al.iséeque les néthcdes
mettant en jeu, dars des tubes, des velums de réactifs plts inportants.
( x> : Chef du Service de Bactériologie au Laboratoire Naticnal de 1'Elevas
et de Re&er&es Vétérinaires (I.S.R.A.).
OCK) : Techniciensupérieur, Service de Bactériologie, LabmatoireNational de
1'Elevage et de Recherches Vétérinaires (I.S.R.A.).
2
La présente ptilicaticn apourbut de p&senter une technique de mi-
cm&acztion defixaticn ducmple~reti, déri&edu test classique de KCWR, dcsnt
l~exémtion est rendue possible par l'emploi du matériel Wicrwtiter" (x),
Il cmprendessentiellen-ent (photo 1) :
- des plaques de 8 mn&s de 12 qules en U, en lucite (A),
- des ccmpte-gouttes de 25 a 50 microlitres (if-,) en polypropylène
rmulé,à pointe en acierimx (B) pour la &p&ion des fiactifs,
- des coqte-gouttes à usage unique (dispq@ble) enplastique de
25 et 50,l. (F; pour la répartition cks sérms à la dilution du
l/5 kn fait, apr& nettoyage, rinçage et&&agrr, ces corrpte-
gouttes peuvent Etre riutilisés) ,
- des micro-dilutem WJI.~~~' de 25 à 50,l. CE), encore appel&
tulipes,
- le mandée pour ticro-diluteurs llMultif' CE),
- des buva& spéciaux dits ltgo-no-gol', pour tester les micro-dilu-
teurs de 25 à SO,1 . CD),
- l'adhésif auto-collant, le distributeurdla&ésif, le rouleau
pour appliquer parfaitment l'a&&if et la ian-e mntée pour le
axper CG),
- le rricm-agiteur AM69 pour 4 plaques (Micmtiter) ou le vibreur
(dit aussi vibrateur) pur 4 pl4ues ticmtitration (Luckham btd,
Burgess Bill, Smsex, England) (photo 2). Appareil essentiel pum
la fixation du cmplémnt en pé-ripnemmie, l'agitation manuelle
dans unplanhorizontal étantinsuffismte pourlabcnne diffusim
des &actifs et du couple hémlytique,
- unbain-marieor&naire
(ex.MAMMEHT),
- le rrcimir de lecture CC),
. . . / . . .
(x) :Cmke Engineering Corrpq, Medioal Research Division, 735 North Saint Asaph
Street, Alexandria, Virginia 22314. Représenté en France par Poly-Labo,
Paul Block et Cie, 305 Route de Colmar, 67023 Stmsbaurg Cédex.
des portoirs divers peuvent être ajcxxtés (B),
un frigidaire ou une chan-bre froide à t 4OC.
remarquzà s'imposent :
ltutilisation du matériel (micro-diluteurs) et scn entretien
(lav- des plaques) cbéissent à des &gles strictes, anmnc&s
par le fabricant, qui doivmt être irnpérativemnt respect&,
le prix de revient peut apparaître élevé, mais la rmltiplicité
des titrages r&LisabLes, pour de na-rbreuses affections, lui
donne en fait le caractèred'un 6quipexentdebase de tout
laboratoiremxderne,
Produits biologiques et réactif :
- sérums à tester : les prises de sang doivent être effectuées le
plus stérilemnt possible pour dkinuer au mxirmmle mrbre des
sérum antiromplémntaires (VEIDWUBES, VACUI'AINEPS, matériel
PPELVEX-COOPER). Les sérum; sont sépar& au Laboratoire par cen-
trifugaticn,
- tarrpon véronal-calcium-magnésium (B.DJ?ERIEUX, OXOID) ,
- antigène : préparé selm la technique de CAMPELL et TURNER (1)
par le Service de Microbiologie de 1'I.E.M.V.T. (x1,
- cmplémmt: lycphilisé Urstitut Pasteur, B.D. MERIEUX) ou
frais mais de ben titre.,
- sémmhémlytique de lapin ami-hématies de mcuton (Institut
Pasteur~
- hématies de mton :le protocolesuivantestprGmisé (4) :
utiliser toujours la mêm brebis ; avec une seringue de 50 ml.,
ccxstenant 25 ml. de solution d'AIsever, récolter stérilemmt
25 ml. desang; mettre les 50 ml. dam un balle stérile.
Attendre au reins 3 jcxrs avant d'utiliser les hématies, les la-
ver alors 3 fois parcentrifugatims successives entarrpon.
Q-~utilise dans laréactim une suspemionà environ 3pourlOO. Pour
plus ck prkisicn, il est reommandé de standardiser la suspen-
sicm en prwédant aux opérations qui suivent :
-à partir de 5 ml.de culotd'hémties, après lavage, préparer
50 niL. de suspension d'hématies,
- utiliser le spectmpho~mètre (au laboratoire de Dakar : BECWAN,
.., / . . .
(xl : L'antigène p&par6 àpartirdusurmgeantduproduitprépar6parleSemice
de Bactériologie de lvI.E.M.V.T. (lot ancien) est tout particulii
recQmnandé.
mode1 25, USA) à 540 QJ de longueur d'ande, étalcmerle 0 avec
une solution de carknate de sodium (N32CO~) au 1 p.1000,
- msur?er1'absorbance de :
suspemicn d'h&mties
0,l ml.
so3.rti.m Na$ZOs
4,8 IL
L'absorkmce finale cbit êix de 135 2 5.
Le volume V de las~pemîcn d'hématies à préparerpour obtenir
135 est ainsi calculé :
absorbanœ lue
v =
xvAn-r~ delasuspensicnà titrer.
Lorsque i&3&spensim définitive d%maties est obtenue, vérifier
que :
suspersicn définitive d'hérmties
0,l ml.
solution NazCOg
4,8 ml.
ont une absorbanœ de 135 2 5. Faire &XIX lectures.
Conserverà latenpérature dufrigidaireœttesuspensicn
d'hémties.
B - MEXHODE
Dans un but de clarté, pour exposer une &I%ode bien plus facile à
ex6cuter qu'à décrire, la fycm de disposer les plaques de micmtitmtion face à
l'opérateur a été qualifiée :
- d'!%mizmtàle" ¶ lorsque la longueur est placée de gauche à droite.
Ainsiuneplaque cwtie 8 rangées '?horizmtales" del2 cupules allant de Aà H
ou 12 rangées "verticalesf', de8 etpiLes allarrt delà i2.
- de lrverticalc “, lorsque la largeur de la plaque se trouve de gau&e
à droite. Alors une plaque comporte 12 rang&s "horizontales" de 8 cupules sL1an-t
delà 12,ou8 ran&s "verticales" de H à A (fig. 1).
1 - Titrage du systèm hémalytique : Le titrage d'un sémmhémlytique s'est r&é-
lé très diffîdle à r&liser en micmtiter. Apris différents essais, le sérum
hémlytique de 1'Insfitut Pasteur de Paris est employé a la dilutîm de Ip.1000
. . /. .*.
5
pour une suspension d'hématie s de nxxton présentant une absorbante de 135 t'5.
La sensibilisation des h&naties est effectuée en r&langeant à volumes égaux sé-
rum hemolytique au 1 2.1000 et suspension d'h&aties 3 135 + 5 d'absorbance,
Bien agiter. Dans toutes les fiactions le couple hémlytique est ajouté sous un
volume de 25 ~1.
2 - Titrage du,compl,&nt (photo 3 et fig,Z)
Le protocole proposé permet d'économiser au maximum le compl&tent (4):
- préparer 3 tubes à hemolyse contenant 0,8 ml de tampon,
- ajouter 0,2 ml de complément frais ou reconstitué dans le ler tube,
on obtient 1 ml de solution au 1/5,
- p&lever 0,2 ml de la solution au 1/5, ajouter dans le second tube, on
obtient 1 mil de solution au 1/2S,
- p&lever 0,4 mil de la solution au 1/5, ajouter dans le troisikne tube,
on obtient 1,2 ml de solution au U-15,
- ajouter 1,2 ml de tampon au 0,4 ml restant de la solution au 1/5, on
obtient 1,6 mil de solution au 1/20.
Dilution du complément :
La plaque est tenede façon verticale.
- partager la plaque en 3 zones en traçant au crayon feutre 2 lignes entre
les rangées 4 et 5 et 8 et 9 (fig.1 et photo 31,
- distribuer 50 ~1 de tampon dans toutes les cupules sauf celles de la ran-
gée "verticale" H,
- distribuer 50 ~1 de complément dans les deux premières rangées "verti-
cales" H et G :
- au 1/15 dans ies cupules G9, GlO, Gll, G12 et H9, HlO, I-Ill, X12,
- au 1120 dans les cupules 65, G6, G7, 68 et H5, H6, H7, H8,
- au 11s dans les cupules Gl, 62, 63, 64 et Hl, H2, H3, HY,
- diluer avec les micrûdiluteurs de 50 ~1, montés sur le manche, de la
rangée G à la rangée A, en passant par les rangées "verticales" intermé-
diaires" F, E, D......A.
Ainsi de gauche à droite, dans la zone 1, le complément se -ixwve
r&arti à des dilutions multiples du 1/15 (1/30, 1/60..,.1/1280) sous un volume
de 50 ~1, à raison de 4 cupules pour chaque dilution; dans la zone 2, à des
dilutions multiples du 1/20 (1140, 1/80.....1/2560); dans la zone 3, à des dilu-
tions rrslltiples du 1/25 (1/50, l/lOO..... 1/3200).
6
Titrage :
- ajouter dans chaque cupule : 25 ~1. de tampon,
25 ~1. d'antigke titi (1/20, voir plus
loin),
- recouvrir la plaque d'adhésif auto-collant,
- placer quelques secondes sur le vibreur,
- incuber 1 h. à 37*C. au bain-marie,
- ajouter 25 1~1. de système hérrolytique par cupule,
- recouvrir la plaque d'adhésif auto-collant,
- placer quelques secondes sur le vibreur,
- incuber lh à 37*C au bain-marie,
-lire 2 à 3 hapr& aumiroir de lecture.
Le titre du complément correspond à la dilution maximm dans les
4 cupules où l'hémlyse est totale (ex. : titre au 1/80 : cupules F5, F6, F7,
F8; au l/lOO : F9, FlO, Fil, F12; au 1/60 : cupules Fl, F2, F3, F4, etc...).
On utilise, pour la réaction, le complémmt à 2 unités. Par exemple,
si le titre est le 1/80, utiliser le 1/40.
3 - Titrage de l'antigène (fig.31
La plaque est tenue de façon horizontale.
Disposer d'un sérum étalon décorrrplémenté de titre connu (ex.1/640).
P&parer la dilution 1/5 de ce sérum décomplémnté.
- distribuer 25 ~1. de t-n dans toutes les cupules, sauf celles de la
rangée "verti.cUe" 1,
- distribuer 25 ~1. de sérum étalon au 1/5 dans les deux premières rangées
'verticales" 1 et 2,
- diluer avec 8 microdiluteurs de 25 ~1, mntés sur le manche, de la rangée
"verticale" 2 à la rangée 12, en passant par les rangées "verticales"
intermédiaires 3, 4, 5......12.
La nangée verticale 1 contient donc 25 ~1. de sérum étalon à la dilu-
tion du 1/5; la rangée 2,25 fi. à la dilution du l/lO, etc...; la rangée
verticale 12, 25 ~1. à la dilution du 1/10240.
tiparer 8 dilutions d'antigène situées de part et d'autre d'une
dilution supposée optimum, ex. : 1/5, l/lO, 1/20.....1/640.
. ./ . .
7
- répartir 25 ~1. par cupule de l'antigsne au 1/640 dpans la rang& "hori-
zontale" H; 25 ~1. par cupule de lkntigène au 1/320 d‘ans la rangée
"horizontale" G, etc... 25 ~1. par cupule de l'antigène au 1/5 dans la
rangée horizontale A,
- ajouter le complément a un titre moyen (2U) sous un volume de 50 ~1. par
- recouvrir la plaque d'adhésif auto-collant,
- placer quelques secondes sur le vibreur,
- incuber 1 h. à 37OC au bain-marie,
- ajouter 25 ~1. de système hémolytique par cupule,
- recouvrir la plaque d'adhésif auto-collant,
- placer quelques secondes sur le vibreur,
- incuber 1 h, à 37OC au bain-marie,
- lire 2 à 3 h. après au miroir de lecture.
k titre de l'antigène correspond à la plus forte dilution donnant
le titre exact du sérum étalon, sans hémlyse dans les premières cupules de la
rangée horizontale.
La figure 3 représente un timge d'antigène réalisé COIIHTKZ ci-dessus,
les rangées A et R révèlent un excès d'antigène, les rangées D, E, F, G un naan-
que d'antigène croissant, avec hémlyse dans les premières cupules. Le titre
exact correspond à la ligne D, soit à la dilution du 1/20 de l'antigène. L'anti-
gène utilisé à une dilution supérieure dans la réalisation de la réaction en-
tr&nwait la formation d'un "faux phénomène de zone" pour les basses dilutions
du sérk.lm. La oX??be classique a été surimposée SUT la figure, L'utilisa-
tion de dilutions plus serrées de I'antigène, trop proches du 1/20, n'aurait
pas permis la mise en évidence des différentes zones (excès d'antigène, opti.nuIm,
mue d'antigène).
4 - Exécution de la Action
Deux solutions sont proposées :
- exécution de la réaction avec un seul témoin sérum Cà la dilution du
l/lO). Dans ce cas, la recherche des anticorps se poursuit jusqu'à la
dilution 1/5120.
- exécution de la réaction avec un témin sérum pour chaque dilution.
Dans cc cas, la recherche des anticorps ne dépasse pas la dilution 1/160
(à mins que l'on accepte de placer des plaques bout à bout).
.* /. .
8
En effet, en peripneumnie bovine et dans les conditions de r&olte
des prélèvemnts en brousse, il arrive souvent qu'un sérm, anticomplémmtaire
aw basses dilutions (l/lO, 1/20), soit positif et non anticomplémsntaire aux
dilutions supérieures.
a> Exécution de la Aaction avec un seul témin sém (2 la &lution du
l/lO) (fig.41 :
- diluer les s&ums au 115 dans du tcurlpon et décomplémnter cette dilu-
tion (30 mn à 58-60°C),
- la plaque est tenue de façon 'horizontale" (les sérum étant supposés
fortement positifs, 7 drums + 1 sérum positif de &férence sont étu-
diés par plaque , jusqu'à la dilution du 1/5120, dans le cas contraire,
la plaque peut être tenue de façon "verticale" et permet de traiter
11 sérums + 1 sérum positif de référence, jusqu'à la dilution du 1/320),
- distribuer (à l'aide des compte-gouttes en plastique "disposable") pour
chaque sérum 25 ~1. de la dilution au 1/5 dans la première cupule
(ex. : Al), dans la seconde cupule (.A21 et dam le dernière (A31 (té-
min sérum anticomplémcnttiire) d'une même rangée "horizontale",
- le second sérum se place en Bl, B2, B12, etc...
- ne pas oublier le ou les sérum de référence,
- ajouter 25 ~1. de tampon dans chaque cupule, sauf celles de la rangée
"ve.rticaley 1,
- diluer avec 8 micmdilutem de 25 pl., montés SUT manche, de la rangée
"verticale" 2 à la rangée 11, en passant par les rangées "verticales"
inter-&diaires 3, 4, 5.... 11. (il est évident que si la plaque avait été
tenue de façon "verticale", 12 microdiluteurs auraient été employés de
la rangée “verticale" G à la rangée B, la rangée A contenant les témoins
sérum> )
- ajouter 25 ~1. d?antigène titré (1/20) dans toutes les cupules, sauf
celles appartenant à la dernière mngée "verticale's 12,
- distribuer 50 ~1. de complémnt au titre choisi (2U) dans toutes les
cupules. Cette opération doit être faite en fin de journée ouvrable, le
com$érrent non fixé risquant d'être détruit le lendemain rmtin, mal&
la mise à +4OC, s'il a é-t-6 distribué trop tôt.
- recouvrir la plaque d'adhésif auto-collant,
- placer la plaque quelques secondes sur le vibreur,
- Laisse~~ incuber une nuit à ++OC,
- le lendemin mtin, ajouter? 25 ~1. de système hémlytique par cupule,
- placer quelques secondes la plaque sur le vibreur,
/
. . . .
9
- incuber 30 mn. au bain-marie 2 37*C ,
' "
- lire 2 à 3 heures a?rGs au mimi r de lecture. Bien observer le compor-
terrent des témoins sérums au 1110 (rangée "verticale" 12).
b) Exécution de la r&ction avec un témoin sérum pour chaque dilution
(photo 4 et kg.51 :
Bans ce cas, la plaque est tenue obligatoirement de façon "hori-
zontale".
- distribuer (compte-gouttes en plastique "dispsable"),pour chaque sérum,
25 ~1 de la dilution au 1/5 dans les 4 pretières cupules (ex. : Al, A2,
A3, A4) d'une mke rangée "horizontale",
- le second sérum se place en Bl, B2, B3, B4, etc...
- ne pas oublier le ou les sérums de réfk-ence,
- ajouter 25 ~1 de tampon dans chaque cupule, sauf celles de la rangée
"verticale" 1 et 2,
- diluer avec 8 microdiluteurs de 25 111, montés sur rraache, de la rangée
"verticale" 3 à la rangée "verticale" 11, en passant ,par les rangées
"verticales" intermédiaires 5, 7, 9. Rincer et sécher à la flamme les
microdiluteurs, puis effectuer une nouvelle s&ie de dilutions de la
rangée "verticale" 4 à la rangée "verticale" 12, en passant par les
rangées "verticales" intermédiaires 6, 8, 10,
- ajouter 25 ~1 d'antigène au titre choisi (1/20) dans toutes les cupules
des rangées "verticales" impaires,
- ajouter 25 ~1 de -t-n dans toutes les cupules des rangées 'verticales"
mes y
- distribuer 50 ~1 de complément au titre choisi (2U) dans toutes les
cupules.
. . . ..a. la suite des wtnipulations corrune ci--dessus (a),
IXI'ER'BETATION DES RESULTATS
L'interprétation des résultats est identique à celle déjà connue de
la fixation du compléa:ent en tubes, selon la méthode de l6lmer, à savoir :
est considéré cormne positif tout sérum +++t au 1/80 et douteux, tout sérum
tt++ au 1/40.
.* ! . .
10
CONCLUSIONS
AVANTAGES ET INCOIWENIENTS
DE LA METHODE
Les avantages apparaissent évidents : rapidite d'exécution de réac-
tions grâce à la rklisation automatique des dilutions, d'où possibilité de
tmiter en un temps minimum un nombre de s6m élevé, d'autant plus élevé, que
l'on s'attache à quelques dilutions bien déterminées, les plaques pouvant être
fracticnnées selon la volonté de l'opérateur, Les manipulations sont faciles
à réaliser et un technicien ordinaire acquiert très rapidement le "coup de main"
que réclame l'emploi du rmt&iel "microtit~17 (pipettes, microdiluteurs, etc..,)
La standardisation diminue les risques d'erreur. La &thode est sensible et
fidèle.
Au chapitre des inconvénients, le coût du mtériel ne doit pas être
retenu, l'amortissement étant assuré par la multiplicité des usages auxquels
il se prête (ex. : en péripneumnie bovine, exécution de la -réaction d'hémagglu-
tination indirecte utilisant cm-me antigène les hématies de mouton forrmlées
sensibilisées par le galactane de Mycoplasma -ides). Par contre, au passif,
on doit admttre que ce type de microréaction, qui réClame le confort, le calme
et l'équipement général d'un laboratoire, ne peut &zre pratiqué sur le terrain.
Laboratoire national de L'Elevage
et de Recherches vétérinaires
(1.S.R.A.)
B I B L I O G R A P H I E
(1) CAMPBELL, (A.D.), TURNER (A.W.).- Studies on contagious pleuropneumonia
of cattle. An improved complement-fixation test.-
The Austr.vet.J., 1953, 29 (6) : 154-163.
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(2) coNJ?ATH, (T.B.),- Handbcok of microtiter procedures, Dynatech Corpor.,
Cambridge, Mass., 1972, 475 p.
(3) ELLIS (E.M.1 .- Microtiter serologic techniques for diagnostic bacteriology.
Proceedings 77th Annual Meet. ofthe IJ.S.Anim,Hlth A~S., 1973 (pu-
blié 1974) 77 : 563-581.
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(51 YMST (O.).- Contagious bovine pleuropnemnia : a plate complement fixa-
tion test employed at the Federal Department of Veterinary Research,
Vom.- Bull.Epiz.Dis.Afr., 1970, 18 (1) : 5-11.
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(6) PERREAU (P.1, PROVOST (A.), REGNCULT (R.), @RUE (J.).- Valeur de la &ac-
tion d'h&agglutination indirecte dans la péripneumonie bovine.
Rev.Elev.Méd.&t.Pays trop,, 1964, 17 (1) : S-14.
(7) PROVOST (A,).- Adaptation sur plaques de Ia &action de fixation du complé-
ment : application à la décentralisation du diagwstic.- Rapport à la
IVème Réunion Groupe Experts FAOlOIE/OlJA sur la p6~~prm.tmni.e bovine
contagieuse,
Paris, 15-20, 1971, 14 p.
(8) PROVOST (A.).- Recherches immunologiques sur la péripneurrrsnie. XlV. Des-
cription de deux techniques applicables sur le terrain pour le dia-
gnostic de la maIadie.- Rev.Elev,Méd.vét.Pays trop., 1972, 25 (4) :
475-496.
(9) RENOUX (G.1, PLOMMET CM.), PHILIPFQN.- Microréactions d'agglutination et
de fixation du cor@&nt pour le diagnostic des brucelloses,- Ann.
Rech.vét., 1971, 3 (2) : 263-269.
(10) SCUDMRE (J.M.).- Evaluation of the field Cl?T in the diagnostic and con-
trol of CBPP.- Trop.anim.Hlth & F'rod., 1975, 7 (2) : 73-79.
Lematériel Y+ticrwtiter" estenplcyé àlar&JLisatim
d1unen-àcmr6-
dctiOn de fixation du ccmplhmt. ks acœssoires, les réactifs, les différents
temps delamé-%ode fontl'abjet d'une desczipticn d6taillée.
Cette miczmttique sensible et fidèle, très standardisée, d'exécu-
tien rapideet aisée,nepeutétmenplcyéeque
dan~lecadred~unlaboratoire
norrralerrerrt: équipé etm dans les cmditions difficiles dumilieumral.
&ieof'%IicrotiterV systemin cmplerrentfixakiontestin
ccntagîous
bovine pleurqpnewxnia,
Wicrutîterl' systemis u3ed in a cmplemnt fixation micmte&ni.que.
The acœssories,thereagenti caidthevtious stages ofthete&nicalprmess are
describedin cwtails. The sensitive aid mnstant mhwtedmique canbe easily
perfomdand &llcws serialsemlog;ical diag~cc;is onlyintie îitits oftheacti-
vities of anonnally equipped labomtoxy. Application in the fieldis beymd
possibilities.