. REPUBLIQUE DU SENEGAL m”--------- MINI...
.
REPUBLIQUE DU SENEGAL
m”---------
MINI STERE DE LA RECHERCHE
SCIENTIFIQUE ET TECHNIQUE
m.-L*-------
I NSTI TUT SENEGALAI S OE RECHERCHES
AGRICOLES (1 .S.R.A. 1
-w-w-I--*-..
LAEIORATOIRE NATIONAL DE L’ELEVAGE
ET DE RECHERCHES VETERINAIRES
DAKAR - HANN
ç
S T A G E F A O S U R L A P R O D U C T I O N D E V A C C I N S
D A K A R , D U 1 7 O C T O B R E A U 5 N O V E M B R E 1 9 8 3
V A C C I N C O N T R E L E S P A S T E U R E L L O S E S ANI M A L E S
U T I L I S A T I O N D E t’APPAREIL D E S T E R N E D A N S L A
P R E P A R A T I O N D’UN V A C C I N C O N T R E L A S E P T I C E M I E
HEMORRAGIQUE
P a r M . P . OOUTRE
,
D o c t e u r v é t é r i n a i r e m i c r o b i o l o g i s t e
C h e f d u S e r v i c e d e B a c t é r i o l o g i e a u
L N E R V / ISRA
R E F . No 31/MICROBIO.
M A I 1 9 8 3 .
“,
2 l'utilisation de di,-estat C.d gancr&.s dans le m27.5~..1 (apport d\\acides n~xzl&q.xs).
=n 3 une aération constante,
- à lsapport ré,mïi.ier de miliw neuf au moment oc la cultwe est en phase de w2ï.s~
sance lo,~arithmicuc‘.
de 1%ome
bovine
"" Pasteurellose
des netits rw2irm2ts
- Pastewellose porcine
- Pasteurellosk
du lapin
t- Pwtewellose des ciseaux;
.
d
-.. 5
- un second (b) qui sert à la fois à l'admission d'antimusse et à l%vaouation
de l'air,
.<
- un tmisièm cc) permet également la' sortie de l'air et le remplacement de (a)
en cas de rupture de ce dernier.
.
'i, I.
, :
Le joint inférieur comporte &&ment deux ouvertures :
,:, . .
I>
~'l%+e'se&ant à l'arriv6e d,'air stérile cd),
'1 l%btre (k) à la Gcolte de la culture.
:. ': ,, .<"
,.
a) L'intrcduction de l'inoculum et du milieu syeffectue par l'intem6diaired9un
I.
tube en rhodorsil (0 int6rieur 8 mn, r&istance 5 l'autoclavage) @&r&t dans.'
la colonne grâce à un tube de vexe de '8 m (0 ext&ieur), l'ext&mité distale
du tube souple porte un tube de jonction md6 Quickfit femelle (87/X) qui per-
met tous les branchements E.nc~ulm et milieu),
celle de l'antimusse (pr6alablemnt lmtifoén6isé et st&ilise
à l'autoclave
en tubes à essai de 18 rrm à 1lOT Dendant 15 mn ; volume TEIF tube à essai : 1Occ)
est effectuée par une allonge à plasrra (f) et un tube en rhodorsil iden$que
, .,
.'J :;'.
1 (
au pr&édent, pén&ant dans la colonne de verre par l'inte&ed&.re d'u& rmr-
ceau de canne de verre Ilorgueur environ 12 cc; 0 extérieur : 8 mn>,
identique à (a)iassure la sortie de l'air et le remplacerrtant
de (a) en cas de
rupture, la culture pouvant ainsi être prolong6e<
Diffusem d'air (d) et tube de &colte (e) sont mntés suivant le sohérm A.
Aération : l'air est fourni par un compresseur (petit comresseur Pmlabo ou ïnieux
..:.
compresseur fowmissant l'air comrimé dans lîensemble du labomtoire). Il est
st&ilisé par filtration (membrane EXS 1) w passage à travers un filtre~Sei&
:-i ::.+y.;,;: '
de 100 cm 3 fi) (ce filtre est min-tenu wr une pince à 4 doigts solidaire d'une
noix fixge sur une des 5 tirres qui assure la cohésicn colonne de Ve&, joints
et couronnes) et pé.n&ze dans le milieu sous forme de fines bulles qui se déga-
gent.&~ diffuseur d'au;'&) (sch&& A). Crne pince clamp (j), placée enF,,<<,le dif-
fuseur d!ati &::le filWe&?iO6 -&m 1 permet à volont de suspendre l',a&$ion
(%itant:.le refoi&&nt~de~~~a'cult&e au'mment de la récolte et l%.&dification
'<
._
de la rnaabrane EXS 11, de r&me, une autre pince clamp (k) est placée sur le tube
de vidange pendant le cours de la cultwe, l"ext&mité en verre plonge alors dans
le forml.
..o / . . .
. . . 6
Fixation de l'appareil : la colonne est fixéemr un chassis-support (schk. B) en
-.
cornières Dixonx chassis amovible permet la diswsition wrticale de liapp~il
dan? la c+rbre 6tuve et assure une boxe protection de 13ensemble au cours des o$-
rations de tmnsport et de st&ilisation à l'autoclave,
II - STEBILISATION DE L'AF'RREIL
-*_
:' .
Contenant environ 15 rr3 d'eau distillk, la colonne et ses accessoires sont s-t&&
.
lisés à l'autoclave (45 mn Z 120%) dans l'&t oh ils sont repr&entés sur le sché-
ma A,(f) est obturé Dar un boucl-xon coton-gaze re&xvert de papier et ficelg (apr&
st6rilisation le panier est r+emplac6 r:at? du -papier d'aluminium dont l'épisseur
est quadruplée w plia,~e),
(a) et Cc) chacun p3.r un tube-à essai de 22 rrm et un
coton. La pince (j) est maintenue en pcsition ouverte.
,.
'.
:.
TES tulx~ de jmctim rodés fendl.&(a) et Cc), l'c?llcn.~e .3 @ma (f), le tube de
vidange (e) sont mbattus et imbilis& à l'aide de ficelles sud la colonne, LFen-
semble px6alablermt fix6 sur le chassis-suT?port (sehem l.33 à l'aide de fil de fer
est dispsé horizontalement dans l'autoclave (autoclave horizontal).
CII - COMFOSITION ET STERILISA~oN DG MILIEU
-._. .
Le milieu utilisé offre la covsition suivante :
:
F+our 10 litres d'eau p"rtee à 6O*C (dissolution des in@ients et filtmtion glus
rapide) :
- extrait de viande Liebiq .O.~")~~.~gL~O,~...~...*.*....."~~~~".~~.
90 g
- Facto pptone Difco 6x pe?tone $uivalente) ....a.....a~3~.~Foro~
Km g
- chlomre de sodium .
..**....0.0~*~0.0,~................~~~~.~~..~*
50 F
- digestat ~yclSnioue de panc&as. "..JQ~O........,.i..,,.~~~~~"~~~~~
1.250 ml
- @ucose ,....*.....*.....,..e 0 0 c CI, o.O...*..P..*.* ?.a 3." 0.0 I." 0 L 0..
2og
'.
_
- lactate de soude * 0 a.........0 *r C..O 0 <a ,..*.*..*..".....C 0 0.0 ,. I) 0 . . . . 35d ., '.'
- phosphate mnoscdique
. . . . ...1 UP.0 0 0 c c a.t..,.r...Y...*..f 0 n * 0 en n 0 e
3oi-T
-
Le pH est ajust6 à 7,5 -) 7,8.
la st&ilisa,tion s'effectue w filtmtion sur filtre Seitz de 10 litres pourvu '
i<l
d'une w&mme ElG 1. Afin de ,faciliter. cette optkation, il y‘a intérêt à prm$d&-'
. !'
à une clarification m$klahle Sur un autre filtre Seitz de 10 lit;r?es mu-mu d'une
mmbrane A S .
:, r
-7
a ) Pr&am-tion du digestat pay-&ïnique de pancrjas :
".-._A.....sv
4ti y de pancrgas de boeuf, recueilli à l'akkttoir, d&raissé et haché, sont
&%.&&s à 1.500 ml d'eau distillk portée à 5@%, en ptisence‘de'5 g de pst
paule. F'n une heure, la temp&ature est élevée à 70°C &&wrtarie); La di:restion
,
est alors +t&z en aymentant latmpérature à 660 en quelques @utes. TLe J-X+
I
dkt de la"dieestion est recueilli,apr& filtmtio~,~~ papier. Ce d&estat acide
._:
peut être consem& à -2OOC.
:
.:.
L'obtention de digestat m+nique de panctias est à la fois .facile et rapide.
L*autodipestat cykinel de S-terne nécessitant des op&wtions b+ucc;ur, plus :lon-
:
:-
gu&, ii été abandon&.
:- .,
:
b) nétails de.la st<rilisation par filtration du milieu
.
-.
---- -
.--
Le milieu filtré est recueilli dans des flacons de Wcolf de lû 1i.Ws dont la
tubulure infkieure a cté &tir&e (travail du verre daw un atelier spécialisk) ~
Sur cette tilmlure est adapté un tube souple en rlmdorsil, mi d'une pince: :
:
.,
clamp, et termi& psg,un tube de jonction rode Ouickfit @le (sch&m C)i
Lîerrkmchure, su~&$eure du flacon porte un tube de jonction à mdaEe normlis~
E&lle S&&el (&h&a C) (1403) qui.@&, sous la flamw, se raccorder à
I
l'&%ry~t n&e c14/23) correspondant port$ par le filtre de 10 litres (schema
:
ci :,.
_,
flacons de Gkolf vides et filtres Seitz de 10 litres, pourvus d'une mer&&ne -'
EXS 1, sont stérilisés à l'autoclave (45 mn ) l%O*C).
Au laboratoire de Dak22, la p¶tion dt& lot de vaccin contre la sept&-
mie hkwzm~ique met en jeu deux appareils de Sterne fonctionnant sir+ta&-
;.,-:
,; i.'I
ment et approvisionn& journellerrmt TXU? 100 litres (10 flacons de b1fJ:d.e _,,
milieu fil& et pr&lablement ~prou& pendant 24 heures.
IV - PREPARA'LION DE L'INOCUUIE!
a) choix et entretien, des souches
-:;
:..
Le choix de la souche de Pasteurella mltocida àutiliser est avant,,tout +XX$
. ,.
par l'affection que l'on se pmFse de cc&attre et l'espèce animale en cause
(voir tableau en introduction I classification s&olo-;ique actuelle de-P'i'?l-
tocida). C'est ainsi c-ge le type E ~oit‘ettk ob1ipatoirem.n-t employ& dans la
.e. / . . .
pr$arwtion du vaccin contre la septicémie h&mmagique du Centre et de lFOU&st
africain : les types A et D pour lutter contxe la pasteurellose des petits rumi-
Ikwlts, etc..,
Les souches sent 3 conserver lyophilisÉesz cg Evitant ri,pureuse..nt les passa-
ges imtil:es sur milieux artificiels. Il est p&fZ&tble de lyophiliser :
- soit du sim- virulent, r&oltG st&ilemnt sur un bouvillon mxmznt de la ma-
ladie exp%.mntale :
- soit une cul& iridescente sur p5lose tryptose-s&um r&olt& en eau pep-
ton& et diluée au l/3 dans du s&um de boeuf.
Les souches de p. mltocidaJ~u-&lis~es dans la p&$waticm des. vaccins, d=!ivent
tuer la souris.
.:
h1 L'imculm : au laboratoire de Dakar, l~in-culum est contenu dans un Erlen-&yw
de 2 litres a la base duquel a i?t& LsoudCe une tubulure dfenvim&‘6 cm (travail
du verre dans un atelier sp&ialis~). Cnm pur les flacons de Woolf de 10 li-
tres,'cette tu?xlure se ,pmrsuit par un tube SOU+~ de rhodorsil, temninlé gaz un
:.
tub& de jonctim rrsl< Q..&cMit rrâle (voir schém E). Une pince cl- est +K&
sur le tube scxnle. Dans le passé, des flacons de Kjt,sato ont étg utilis&, mais
la tubulure, nld&e pr& du goulot, offre un d&avantagc (risaue de muillage
du coton).
‘.
;.
:
Chaq,ue Erlen-Payer contient au mins 1 litre de milieu fil-t& et introduit selon
le ppcédé d&rit pr&$dement
(III,b),
L'i-noculm est utilisé E 2 8 heures après son ensemencement avec environ 60 ml
de culture en tubes (6 tub&).
.-
a> station de l'apareil autoclav&
.--
L'apareil, sorti de l'autoclave, est clacé en jsition verticale dans la chambre
étuve'et fixé. Une série d'op&ations est alors cffectu& :
;
- resemage des &xous papillons,
- f&ation de l'arriw?e d'air comri& sur le filtp de 100 cm -:(FT),
.
.
/
.
0..
-s
- (a) est déFa&, (cl et (1) fixés sup+ieuremmt en psition verticale,
- (e) est intrxduit dans un tube de,.forml fixg inférieurement en position
verticale,
,.,.
- Cj> et Ik) sont ferm&.
:
. . . .
1
'^<-
La charnlme Etuve doit être ~pourvue d'un bec bunsen aliment& en gaz.
b) Introduction de lpinoculum et d,&ut de la culture
L'inoculum est versé dans la colonne @ce au branchement des tubes de jonction
rodés Quickfit, rr$le &len Yeyer de lYinoculm) femlle (a) (de l'appareil)~
effectué sous la flamme. Puis, aprè.s d&omection de 1'Erlen Meyer, 2 litres de
milieu sont alors introduits, toujours Grèce au hmnchemnt sous la flame des
tubes de jonction roi]& Quickfit m9le ELaccn de Wcolf)-femelle fa> (de l'a?-
mil), Les 2 litres &+Lés, la pince clamp situge en amont du tube de jonc-
.-.
tioG $odÉ QuicMit file est fe$$e (sch&m 0. Le milieu situé au,GvFau du
branchement des tubes de jonction Quickfit est de préference expulsi dans la co-
lonne par pression sur les tubes souples.
2 litres de milieu et 1 litre d'imculum sont alors pr&ents dans l'a~payeil.
Après 3 heures de culture non a&Ge, 2 ,3 3 ml d'antimusse sont alors. introduits
sous la flamme, Dày; l'allonge à plasma (f) et l'a&ation est mise en mute. 3 :
:
heures plus tard. on laisse les 8 litres de milieu restant dans le flacon de
Mmlf s'écouler dans l'appareil.
Cette mise en mute, tsar Eta7es
de la culture as= une densité optioue mi-
mm, le rapprt %xxulum"
- milieu neuf C-tant toujours gmnd.
'
c) première r&olte et Scoltes ult&ieuxes
-..-
I.
La rmrche de la culture peut être suivie en effectuant des pfilèvements st&ile-
.,
ment par le tube de vidange ce). Après chacune de ces o&mtions, le tube dot-t ', y
être réintroduit dans le foml.
:.
Au but de 6 heures, la culture a atteint son dévelopy>ement ti. La récolte 1~
. ,-, -
est alors effectuée.
.,_..
3
Sur le circuit air, la pince clamp a vis Cj) est fermée. Le tube de vidangc~ est 'Y
.' j
inQmduit dans un ballon de 10 litres st&5le, la -flamw du bac bunsen est tiin- " :
..* / . . .
.- 10
tenue au voisinaFe du ~wlot- In +-~e clamn (k) est alors ouverte et la culture
:
"s'6couIeP'. IJne coloration de Gtmm permet de v&i?iew, me la r&mlte n'est ;aS
f
~con-bmin& -
.'I
Lmsque lpappareil ne contient élus qu"un litre de culture, la pince (k) est ferm6e.
-
Ce volume restant pemttril: 1~ensemncemn-t de l'apIm% nouveau de milieu neuf.
*
La r6colte est foulée imm6diate~nt (4 p.lOOO>.
,<
Du milieu neuf est de nouveau introduit dans lFappareil. 10 CL d"antimusse s-t%&
,*
., .,
sont'a.msn& par l'allonge, ,et la s&ie des opbations préc6demnt d&ites est r&
p5tée dans le m&e orC!re &mnologique,
:
‘
V I - RESULTATS
.
Paz cette méthode, 'une culme offrant une opacit6 sunC%ieure 2 20 est couramnt
obtenue. 10 litres de culture mrmettent donc de falrriquer 20 litres de vaccin. Le
vaccin foml6 est ad-&v6 ~a.r lialun de potassium. A cette fir: une solution d'alun
de potassium st6rile (autoclavage) est ajout6e de telle sotie que le titz final en
alun soit de 10 ~.1000,
Le conditionnement est effectu6 mit en wules de 20 ~1 @akar).3soit en flacons
de 250 ml C%echa~. La dose vaccinale est de 2 ml.
VII Y cowIRoL;Es
-
A effectuer sur la suspension vaccinale finale awant lpadjonction d'alun.
.'
a) StCrilité
-- ensemencer en houillm ordinaire7 en bouillon viande-foie ana&mhie, sur gElose
:t.q@ose. Observation pendant 5 2 4 jours.
,,
. .
. . . .
b)
~-j-&
.
. .
.
m-
Irmuler 2 cc sous la peau d'un laI::in qui sera mis en o?xervation pendant urb
semaine,
LI_-
en-L.-
--- -.-----"..l I-.---1-...-..-^
_---__-"i_l^~-...-._.
-X Remarques
.
: Les Princi&es causes de contamination de l'appareil de"Steme sont les sui-
vantes : &xulu.m souillk,, rriilieu neuf souillé, manaue dVantimussel la culture a refoul6
par les orifices sup&ieuz,
contamination au niveau du l-mnchement tubes de jonc-rC,ion rw
d6 r&le-femelle, Pour cviter ce dernier cap3n il est reconmm& d'une pwt d'essuyer 2
l'aide d‘une gaze l'él&xmt @le avant tout Lxanchewnt nouveau et de'.la fiasses e%uite
irm%iiatemnt à la rlm, d’autre met de remplacer im&diatemnt tout flacm Woolf vide
.paF un autre plein de milieu. mais dont hien .sQr la pince clamp est maintenue en position
ferm6e. Ainsi Ia zone de branchement pr&ente une ab&nce tctale de cû7ieuz une rince clamp
placée en aval peut d'ailleurs accr&-tre la sécuritk.
..* 11
-- Si l'on souhaite effectuer des tests d'Lm32i-G peur pouvoir ccntrôlerle pou-,
voir r!.ellement protecteur du ~a&i.&~, il est- indispensable d9utiliser-,des l-e-
vins, A signaler que le cobaye est un animal à pmscrire absolument de tcute
expérimentation en rrati&e de septic&nie hém?rragiq.ue, même pour procéder d
de simples passaces de souches.
- Les brins utilises doivent être tri& s&clogiquement pour éliminer les anirrraux
i.rrmms naturellement, ce qui evitera de voir Owrviwe un certain n&re de t&
mbns non vaccin&. LES tests les plus Ir&ieux peur ce dépistage sont le titra-
ge du pcwcir protecteur pur la wuris 5 la fixation du ccr@ément et l'agglu-
tinaticn de cultures sur géloss @AIN~ R.V.S. : Brit. v6-t. J, L 1955, III : 521
5181, enfin il convient d‘ajouter l'hC&a$~$utination de gWLules mups hmT&ls
du grcupe 0 (CAPm, C,.R. : 1955 ; PERFEHJ, PT : 19611, Tcus ces tests nécessitent un
personnel q!balifid, un materie suffisant, un labratcire adapte.
-1 La souche d'Épreuve doit Ctre choisie une fois pour tcutes et sera seule utili-
sée, on lui évitera au maximum les passages sur milieux artificiels. Le titrage
du pouvoir patbgène doit être également établi dPune mani& définitive et
pour cela, on peut partir de la bse suivante : 1 ml dîune dilution au l/î.Oc?T)
d%ne herrwulture de 15 2 18 heures de la souche d'épreuve peut être consici&&
COImE la dose stlreniênt mrstelle ~XXX? un tiuvillon sensiN.e de 70 à 100 kc, Il
est pcssible que l'on enregistre des diff&ences tenant aux races h&.ncs cc~.~
sidé&es, Cette dcse sifrement mwtelle (DZ$?> a été csti.m&e assez largement, il
est pwsihle (et il est bn de le vérifier) nue la DSM &elle varie selon les
régions,
Lp, liquide utilise COITEE diluant pr6sen-te une grande impcrtance. Le S&~JJ phy-
siolt-gique est mal supporté T-W?
._
les Pasteurella et mieux vaut utiliser de l'eau
u--
peptcn& st&ile.
- I..e protocole d'exp&ience est t&s s'impie. Il est identique 2 celui appliqu6
pour le charbn symptcmatique.
Les r&ultats des tests d'immunit3 ne deviennent ~X&T nets qu'au mmen-t 06 l'on
disrose dPun lct scirclwiquement hcmgene d'animaux de sensibilit6 uniforme, ce
qui est souvent très difficile 2 obtenir, TLes r6süLtats favcra>les fournis par
- 3.3
-' 13
A N N E X E
LISTE DU MA'TERIEL UTILISE
1
..,
Canne de verre de 8 mn de 0,
"(
- Tubes à essais de 0 16,
- Tubes à essais de 0 22,
- Erlen-Meyer de 2 litres ~pr‘urvu dOun -h.&e soudé à la base, atelier spécialisé
dans travail du verre),
- Flacons de Wmlf de 10 litres (ciont l'ouvertme inf&ieure est éttic, atelier
spécialisé dans travail du verre>,
- Flacons de 10 litres,
- Filtres Seitz de 10 litres, membranes EKS S et AS ccrrsspcndantesp
- Pinces clmp de 6 cm,
- Filtres Seitz de 100 cm", membres EKS 1 correspondantes,
- Piffuseur d'air (SOVIREL)Y
- Tubes de jonction rodés @ïles et femelles QUICKFIT (871161,
-. 'IWxs de jonction rod& r&le3c et femelles SOVIREL (14/23),,
- Tubes souples rhcdorsil kistant aux conditions de stérilisation (0 int&ieur 8m),
- Filtre papier,
.s Antimusse (Silicone, phcdorsil) (PROLARO),
- Pinces à 4 doigts, ncix de fixation,
- CornibesDIXON,
- Fil de fer, ficelle, coton car&, ‘gaze, papier Kraft? etc.. o
- E!actériclop;iste en état de marche-
PASTEURELLA MULTOCIDA
En pratique, trois principaux types de colonie@ peuvent
@tre distinguk sur milieu solide à l'aide du stéréomicro~o~e en
lumière transmise ohlicluewnt à 45* ou par la réaction produite par
les suspensions épaisses de bact&ics dans l'acriflavine à 1 p. 1000
@XI'ER, 1957).
- Les variants fluorescents ou iris&, rf colonies mu-
queuses ou non,
- les variants bleus ou Fris-bleu, qui ont perdu leur an-
ti$ne capsulairr,
- les variants R, 2 colonies irr&uli~res, de couleur gris
jaunâtre.
Carter (1957) pur Cviter toute confusion entre les diverses d&omi-
nations donn6es aux variants, a px-opsé les terws de ?4ilCOIL)~~ SWI’JTH
et .XWXi pour les disigner,
." .__.< L?.m@Ptance des phénomènes de dissociation.app2t au
niveau de ,la structure tanti,y6nique, du pouvoir patho@ne et kmwkant.
- Les souches muqueuses sont de virulence très variable
., ..
pur la souris, toujours capsulées et faciles à typer
(CPXTER et RIGLMD, 19531,
- les souches smooth irisées sont considérées par tous les
auteurs comme la forme la plus hautement virulente ;
elles sont capsüL&es et faciles 21 typer,
7 les souches smoczth non iri&es (SR) ont une virulence
en génkal conse&e, elles ont perdu leur antigène
va
capsulaire et sont donc non typables (CARTER,195"7),
- les souches rouph se montrent non patho$nes et sont
@ssibles à typer ; cependant, on peut quelquefois
identifier leur skotype somatique (antigène de paroi)
(AF~ERso!~T:~~ coll., 1929).
Les souches smooth qui ont perdu leur "iridescence" peuvent parfois
la retrouver par passaw sur la souris ou l'embryon de poulet.
/
. . . l e.
IFPORTANCE DE L'ENTRETIEX' DES SOUCHES.
En culture sur (s,élose ou en. bouillon, les souches ntises
au ~&f&-&at-.ur 2 4OC, disparaissent en -une serraine environ.
La culture en piqke centrale il;ms la &lose demi-m0lle (5 p.10001,
ii la ter@rature du laboratoire et à l'abri de la lumi&, aswre
aux souches une survie de plusiwrs semaines au mins.
Con,Telées 2 -2OOC ou -30°C, elles se conservent F mis et si elles
sont lyophilisées, II! <ans ; ce sont donc les proc$dés de choix, qui
devant être employés si on veut maintenir les sowhes au stade VW-
eo$de ou',wnoth., soit sous forme de sang virulent, soit sous forme de
cultures t&s jeunes, de 15 ?I 16 heures au maxinnun, car les séjours
plus longs 2 .l'&uve entraiinent leur dissociation.
Lorsque les cultures sont simpletint ,i congeler, il est
nkessaire de leur ajouter une substance protectrice (skum animal,
lait &&mé, polyvinylpyrrolidone, etc...).
CONSTITUTIOIJ ANTIGENIQUE DE PASTEURELLA MULTOCIDA
a) Un ou des polyosides simples, constituants de la cap-
sule et diFfusant dans le milieu (I(nox et Bain, 1960) ;
ils se comportent comme des haptanes ; ils sent imuno-
logiquement actkk lorsqu'ils restent associés ? une
fraction prWéique, Ils absorbent une partie m?is non
la totalité du pouwir immunisant des skums contre les
3actGries entières ; ils sont spkifio*ues des types
capsulaires.
h) De l'acide hyaluronique associ& 5 la capsule d-s va-
;
riants 14 (Carter et Annau, 1953 ; Carter et Byrne,l953 ;
Carter, 1955 et 1957). Ce mucopolyoside, s&&lo@?.w
3
ment et imologiquement inactif,masquc les anti+nes
de type dans les réactions s&olop:iqucs ; il est en
qu‘antitg ‘abondante chez les sérotynes A et C en phase M
et absent chez les sérotypes B et C.
c> Des lipopolÿosides poss&&nt tous les caractères des
endotoxincs classiques des germes wam-negatifs.
. . . / . . .
Ils sont facilement lib&& du corps bactérien et immuno-
lopiquerrent actifs dès qu'ils restent associés 2 des
fractions protéiques (Knox et Bain, 196-1 ; Rebers et
coll. , 1967). Ils inhibent en partie le pouvoir pro-
-
tecteur du skum. Ils sont absorbes par les h&mties de
mammifères.
Les propriét.~3
6~ ne sont pas supprirkes par le chauffage,
-
_. .
.' . ..--.. - _
..<
ni par l'action de la trypsine.
d) Certaines protéines ordinairement associées aux frac-
tions précédentes, apporteraient le pouvoir protecteur ;
-
les autres peuvent jouer le r+3le d'adjuvant ou provo-
._
. .
quer la fomtion d'anticorps opsonisants qui dliorent
l'imité conf&&. Tout laisse \\2 croire do$c que plu-
sieurs antigènes participent au processus d'inmunisation,
c) Quant à la r&partition des antigènes, on parle couram-
ment d'antigks capsulaires et d'antigènes somatiques
quoiqu'une extraction à l'eau physiologique (isotoni-
que ou hypertonique) ou au phenol, litire un tilange
d'antigkes en proportions variables dont la multipli-
cite peut être d&cclCe par des tests de précipitation
sur g&ose ou biologiquement par la toxicité, le pouvoir
pmgène et l'hkagglutination (Bain et Knox, 1961 ;
Penn et NaLgy, 1972').
De tous ces travaux, il faut donc retenir la difficulté
d'obtenir des entités,anti$niques chimiquement pures même avec des
I7I&l&S élabor5es-..'- '.
En effet, il est presqu'impossible de pr$arer des anti-
g&es de type capsulaire qui n9aient pas de pouvoir toxique net, in-
versement la méthode de kstphal ne permet pas d'isoler à l'état pur
l'endotoxine toujours contaminee par les polyosides capsulaires.
TABLEAU no 2
Corwqondance entre les s%Wypes capsulaires de Cwte~ et ceux de
riobwts (SE~~T; Prodjohapjono, Cwter, Conner, 1974.
‘Types Rcherts
II
III
IV
1
v
(pas dv Ecxiva-
h-it !
TABLEAU no 3
Relation entre les types capsulaires et 1~s tyles somati-
ques actuels (d'apr& &.mioka, 1970).
Il en ressort qu?à lvint6ricur d'un m&~ s&ot~;pe, exis-
tent plusieurs types soriWiques,
Types capsulaiEs
A
B
D
E
Types som&iqu~s
1, 3, s-, 7, c, 9* F, 11
1, 2, 3,4,10,12
P
DISTRIBUTION DES SEROTYPES DANS LES INFECTIONS,
Ce skotype est l'agent principal du cholka aviaire ;
il est aussi .fr~~quemwnt rencontrh dans les complications pasteurel-
liques qui succEdent fréqwment aux infections virales chez les
porcs, les bovins, les petits ruminants, les rorgeurs. Pour autant
qugon sache, les souches isolks chez l'home sont exclusivement
du type A.
BType
Ce type est responsable de la septic&ie hémrragiquc
des bovins et des buffles d'kit-;, du Proche-Orient et d'Afrique
Orientale, des bisons d'Am&ique. Il peut F-tre isolC t&s occasion-
nellment chez d'autres espkes animales (chevaux, ~m-cs, mutors).
Type
Ce sémtype a et6 fr$ucmnent isol6 ,i partir d'infections
sporadiques chez de ombreuses cspk~s. Sa distribution est tout 2
fait comparable .? celle du type A. Il apparaît, comme ce dernier,
responsable des pasteurelloses secondaires qui, sur les diverses es-
pèces de mmmifkes et d'oiseaux, peuvent "sortir" à l'occasion de
causes favorables trk variées.
Type
Distinct du type 13, il a é-te pur l'instant exclusivemnt
isol6 de cas de septickie hémrragique des bovins d'Afrique Occi-
dentale, Centrale et Orientale.
,
*
REPUBLIQUE DU SENEGAL
m”---------
MINI STERE DE LA RECHERCHE
SCIENTIFIQUE ET TECHNIQUE
m.-L*-------
I NSTI TUT SENEGALAI S OE RECHERCHES
AGRICOLES (1 .S.R.A. 1
-w-w-I--*-..
LAEIORATOIRE NATIONAL DE L’ELEVAGE
ET DE RECHERCHES VETERINAIRES
DAKAR - HANN
ç
S T A G E F A O S U R L A P R O D U C T I O N D E V A C C I N S
D A K A R , D U 1 7 O C T O B R E A U 5 N O V E M B R E 1 9 8 3
V A C C I N C O N T R E L E S P A S T E U R E L L O S E S ANI M A L E S
U T I L I S A T I O N D E t’APPAREIL D E S T E R N E D A N S L A
P R E P A R A T I O N D’UN V A C C I N C O N T R E L A S E P T I C E M I E
HEMORRAGIQUE
P a r M . P . OOUTRE
,
D o c t e u r v é t é r i n a i r e m i c r o b i o l o g i s t e
C h e f d u S e r v i c e d e B a c t é r i o l o g i e a u
L N E R V / ISRA
R E F . No 31/MICROBIO.
M A I 1 9 8 3 .
“,
2 l'utilisation de di,-estat C.d gancr&.s dans le m27.5~..1 (apport d\\acides n~xzl&q.xs).
=n 3 une aération constante,
- à lsapport ré,mïi.ier de miliw neuf au moment oc la cultwe est en phase de w2ï.s~
sance lo,~arithmicuc‘.
de 1%ome
bovine
"" Pasteurellose
des netits rw2irm2ts
- Pastewellose porcine
- Pasteurellosk
du lapin
t- Pwtewellose des ciseaux;
.
d
-.. 5
- un second (b) qui sert à la fois à l'admission d'antimusse et à l%vaouation
de l'air,
.<
- un tmisièm cc) permet également la' sortie de l'air et le remplacement de (a)
en cas de rupture de ce dernier.
.
'i, I.
, :
Le joint inférieur comporte &&ment deux ouvertures :
,:, . .
I>
~'l%+e'se&ant à l'arriv6e d,'air stérile cd),
'1 l%btre (k) à la Gcolte de la culture.
:. ': ,, .<"
,.
a) L'intrcduction de l'inoculum et du milieu syeffectue par l'intem6diaired9un
I.
tube en rhodorsil (0 int6rieur 8 mn, r&istance 5 l'autoclavage) @&r&t dans.'
la colonne grâce à un tube de vexe de '8 m (0 ext&ieur), l'ext&mité distale
du tube souple porte un tube de jonction md6 Quickfit femelle (87/X) qui per-
met tous les branchements E.nc~ulm et milieu),
celle de l'antimusse (pr6alablemnt lmtifoén6isé et st&ilise
à l'autoclave
en tubes à essai de 18 rrm à 1lOT Dendant 15 mn ; volume TEIF tube à essai : 1Occ)
est effectuée par une allonge à plasrra (f) et un tube en rhodorsil iden$que
, .,
.'J :;'.
1 (
au pr&édent, pén&ant dans la colonne de verre par l'inte&ed&.re d'u& rmr-
ceau de canne de verre Ilorgueur environ 12 cc; 0 extérieur : 8 mn>,
identique à (a)iassure la sortie de l'air et le remplacerrtant
de (a) en cas de
rupture, la culture pouvant ainsi être prolong6e<
Diffusem d'air (d) et tube de &colte (e) sont mntés suivant le sohérm A.
Aération : l'air est fourni par un compresseur (petit comresseur Pmlabo ou ïnieux
..:.
compresseur fowmissant l'air comrimé dans lîensemble du labomtoire). Il est
st&ilisé par filtration (membrane EXS 1) w passage à travers un filtre~Sei&
:-i ::.+y.;,;: '
de 100 cm 3 fi) (ce filtre est min-tenu wr une pince à 4 doigts solidaire d'une
noix fixge sur une des 5 tirres qui assure la cohésicn colonne de Ve&, joints
et couronnes) et pé.n&ze dans le milieu sous forme de fines bulles qui se déga-
gent.&~ diffuseur d'au;'&) (sch&& A). Crne pince clamp (j), placée enF,,<<,le dif-
fuseur d!ati &::le filWe&?iO6 -&m 1 permet à volont de suspendre l',a&$ion
(%itant:.le refoi&&nt~de~~~a'cult&e au'mment de la récolte et l%.&dification
'<
._
de la rnaabrane EXS 11, de r&me, une autre pince clamp (k) est placée sur le tube
de vidange pendant le cours de la cultwe, l"ext&mité en verre plonge alors dans
le forml.
..o / . . .
. . . 6
Fixation de l'appareil : la colonne est fixéemr un chassis-support (schk. B) en
-.
cornières Dixonx chassis amovible permet la diswsition wrticale de liapp~il
dan? la c+rbre 6tuve et assure une boxe protection de 13ensemble au cours des o$-
rations de tmnsport et de st&ilisation à l'autoclave,
II - STEBILISATION DE L'AF'RREIL
-*_
:' .
Contenant environ 15 rr3 d'eau distillk, la colonne et ses accessoires sont s-t&&
.
lisés à l'autoclave (45 mn Z 120%) dans l'&t oh ils sont repr&entés sur le sché-
ma A,(f) est obturé Dar un boucl-xon coton-gaze re&xvert de papier et ficelg (apr&
st6rilisation le panier est r+emplac6 r:at? du -papier d'aluminium dont l'épisseur
est quadruplée w plia,~e),
(a) et Cc) chacun p3.r un tube-à essai de 22 rrm et un
coton. La pince (j) est maintenue en pcsition ouverte.
,.
'.
:.
TES tulx~ de jmctim rodés fendl.&(a) et Cc), l'c?llcn.~e .3 @ma (f), le tube de
vidange (e) sont mbattus et imbilis& à l'aide de ficelles sud la colonne, LFen-
semble px6alablermt fix6 sur le chassis-suT?port (sehem l.33 à l'aide de fil de fer
est dispsé horizontalement dans l'autoclave (autoclave horizontal).
CII - COMFOSITION ET STERILISA~oN DG MILIEU
-._. .
Le milieu utilisé offre la covsition suivante :
:
F+our 10 litres d'eau p"rtee à 6O*C (dissolution des in@ients et filtmtion glus
rapide) :
- extrait de viande Liebiq .O.~")~~.~gL~O,~...~...*.*....."~~~~".~~.
90 g
- Facto pptone Difco 6x pe?tone $uivalente) ....a.....a~3~.~Foro~
Km g
- chlomre de sodium .
..**....0.0~*~0.0,~................~~~~.~~..~*
50 F
- digestat ~yclSnioue de panc&as. "..JQ~O........,.i..,,.~~~~~"~~~~~
1.250 ml
- @ucose ,....*.....*.....,..e 0 0 c CI, o.O...*..P..*.* ?.a 3." 0.0 I." 0 L 0..
2og
'.
_
- lactate de soude * 0 a.........0 *r C..O 0 <a ,..*.*..*..".....C 0 0.0 ,. I) 0 . . . . 35d ., '.'
- phosphate mnoscdique
. . . . ...1 UP.0 0 0 c c a.t..,.r...Y...*..f 0 n * 0 en n 0 e
3oi-T
-
Le pH est ajust6 à 7,5 -) 7,8.
la st&ilisa,tion s'effectue w filtmtion sur filtre Seitz de 10 litres pourvu '
i<l
d'une w&mme ElG 1. Afin de ,faciliter. cette optkation, il y‘a intérêt à prm$d&-'
. !'
à une clarification m$klahle Sur un autre filtre Seitz de 10 lit;r?es mu-mu d'une
mmbrane A S .
:, r
-7
a ) Pr&am-tion du digestat pay-&ïnique de pancrjas :
".-._A.....sv
4ti y de pancrgas de boeuf, recueilli à l'akkttoir, d&raissé et haché, sont
&%.&&s à 1.500 ml d'eau distillk portée à 5@%, en ptisence‘de'5 g de pst
paule. F'n une heure, la temp&ature est élevée à 70°C &&wrtarie); La di:restion
,
est alors +t&z en aymentant latmpérature à 660 en quelques @utes. TLe J-X+
I
dkt de la"dieestion est recueilli,apr& filtmtio~,~~ papier. Ce d&estat acide
._:
peut être consem& à -2OOC.
:
.:.
L'obtention de digestat m+nique de panctias est à la fois .facile et rapide.
L*autodipestat cykinel de S-terne nécessitant des op&wtions b+ucc;ur, plus :lon-
:
:-
gu&, ii été abandon&.
:- .,
:
b) nétails de.la st<rilisation par filtration du milieu
.
-.
---- -
.--
Le milieu filtré est recueilli dans des flacons de Wcolf de lû 1i.Ws dont la
tubulure infkieure a cté &tir&e (travail du verre daw un atelier spécialisk) ~
Sur cette tilmlure est adapté un tube souple en rlmdorsil, mi d'une pince: :
:
.,
clamp, et termi& psg,un tube de jonction rode Ouickfit @le (sch&m C)i
Lîerrkmchure, su~&$eure du flacon porte un tube de jonction à mdaEe normlis~
E&lle S&&el (&h&a C) (1403) qui.@&, sous la flamw, se raccorder à
I
l'&%ry~t n&e c14/23) correspondant port$ par le filtre de 10 litres (schema
:
ci :,.
_,
flacons de Gkolf vides et filtres Seitz de 10 litres, pourvus d'une mer&&ne -'
EXS 1, sont stérilisés à l'autoclave (45 mn ) l%O*C).
Au laboratoire de Dak22, la p¶tion dt& lot de vaccin contre la sept&-
mie hkwzm~ique met en jeu deux appareils de Sterne fonctionnant sir+ta&-
;.,-:
,; i.'I
ment et approvisionn& journellerrmt TXU? 100 litres (10 flacons de b1fJ:d.e _,,
milieu fil& et pr&lablement ~prou& pendant 24 heures.
IV - PREPARA'LION DE L'INOCUUIE!
a) choix et entretien, des souches
-:;
:..
Le choix de la souche de Pasteurella mltocida àutiliser est avant,,tout +XX$
. ,.
par l'affection que l'on se pmFse de cc&attre et l'espèce animale en cause
(voir tableau en introduction I classification s&olo-;ique actuelle de-P'i'?l-
tocida). C'est ainsi c-ge le type E ~oit‘ettk ob1ipatoirem.n-t employ& dans la
.e. / . . .
pr$arwtion du vaccin contre la septicémie h&mmagique du Centre et de lFOU&st
africain : les types A et D pour lutter contxe la pasteurellose des petits rumi-
Ikwlts, etc..,
Les souches sent 3 conserver lyophilisÉesz cg Evitant ri,pureuse..nt les passa-
ges imtil:es sur milieux artificiels. Il est p&fZ&tble de lyophiliser :
- soit du sim- virulent, r&oltG st&ilemnt sur un bouvillon mxmznt de la ma-
ladie exp%.mntale :
- soit une cul& iridescente sur p5lose tryptose-s&um r&olt& en eau pep-
ton& et diluée au l/3 dans du s&um de boeuf.
Les souches de p. mltocidaJ~u-&lis~es dans la p&$waticm des. vaccins, d=!ivent
tuer la souris.
.:
h1 L'imculm : au laboratoire de Dakar, l~in-culum est contenu dans un Erlen-&yw
de 2 litres a la base duquel a i?t& LsoudCe une tubulure dfenvim&‘6 cm (travail
du verre dans un atelier sp&ialis~). Cnm pur les flacons de Woolf de 10 li-
tres,'cette tu?xlure se ,pmrsuit par un tube SOU+~ de rhodorsil, temninlé gaz un
:.
tub& de jonctim rrsl< Q..&cMit rrâle (voir schém E). Une pince cl- est +K&
sur le tube scxnle. Dans le passé, des flacons de Kjt,sato ont étg utilis&, mais
la tubulure, nld&e pr& du goulot, offre un d&avantagc (risaue de muillage
du coton).
‘.
;.
:
Chaq,ue Erlen-Payer contient au mins 1 litre de milieu fil-t& et introduit selon
le ppcédé d&rit pr&$dement
(III,b),
L'i-noculm est utilisé E 2 8 heures après son ensemencement avec environ 60 ml
de culture en tubes (6 tub&).
.-
a> station de l'apareil autoclav&
.--
L'apareil, sorti de l'autoclave, est clacé en jsition verticale dans la chambre
étuve'et fixé. Une série d'op&ations est alors cffectu& :
;
- resemage des &xous papillons,
- f&ation de l'arriw?e d'air comri& sur le filtp de 100 cm -:(FT),
.
.
/
.
0..
-s
- (a) est déFa&, (cl et (1) fixés sup+ieuremmt en psition verticale,
- (e) est intrxduit dans un tube de,.forml fixg inférieurement en position
verticale,
,.,.
- Cj> et Ik) sont ferm&.
:
. . . .
1
'^<-
La charnlme Etuve doit être ~pourvue d'un bec bunsen aliment& en gaz.
b) Introduction de lpinoculum et d,&ut de la culture
L'inoculum est versé dans la colonne @ce au branchement des tubes de jonction
rodés Quickfit, rr$le &len Yeyer de lYinoculm) femlle (a) (de l'appareil)~
effectué sous la flamme. Puis, aprè.s d&omection de 1'Erlen Meyer, 2 litres de
milieu sont alors introduits, toujours Grèce au hmnchemnt sous la flame des
tubes de jonction roi]& Quickfit m9le ELaccn de Wcolf)-femelle fa> (de l'a?-
mil), Les 2 litres &+Lés, la pince clamp situge en amont du tube de jonc-
.-.
tioG $odÉ QuicMit file est fe$$e (sch&m 0. Le milieu situé au,GvFau du
branchement des tubes de jonction Quickfit est de préference expulsi dans la co-
lonne par pression sur les tubes souples.
2 litres de milieu et 1 litre d'imculum sont alors pr&ents dans l'a~payeil.
Après 3 heures de culture non a&Ge, 2 ,3 3 ml d'antimusse sont alors. introduits
sous la flamme, Dày; l'allonge à plasma (f) et l'a&ation est mise en mute. 3 :
:
heures plus tard. on laisse les 8 litres de milieu restant dans le flacon de
Mmlf s'écouler dans l'appareil.
Cette mise en mute, tsar Eta7es
de la culture as= une densité optioue mi-
mm, le rapprt %xxulum"
- milieu neuf C-tant toujours gmnd.
'
c) première r&olte et Scoltes ult&ieuxes
-..-
I.
La rmrche de la culture peut être suivie en effectuant des pfilèvements st&ile-
.,
ment par le tube de vidange ce). Après chacune de ces o&mtions, le tube dot-t ', y
être réintroduit dans le foml.
:.
Au but de 6 heures, la culture a atteint son dévelopy>ement ti. La récolte 1~
. ,-, -
est alors effectuée.
.,_..
3
Sur le circuit air, la pince clamp a vis Cj) est fermée. Le tube de vidangc~ est 'Y
.' j
inQmduit dans un ballon de 10 litres st&5le, la -flamw du bac bunsen est tiin- " :
..* / . . .
.- 10
tenue au voisinaFe du ~wlot- In +-~e clamn (k) est alors ouverte et la culture
:
"s'6couIeP'. IJne coloration de Gtmm permet de v&i?iew, me la r&mlte n'est ;aS
f
~con-bmin& -
.'I
Lmsque lpappareil ne contient élus qu"un litre de culture, la pince (k) est ferm6e.
-
Ce volume restant pemttril: 1~ensemncemn-t de l'apIm% nouveau de milieu neuf.
*
La r6colte est foulée imm6diate~nt (4 p.lOOO>.
,<
Du milieu neuf est de nouveau introduit dans lFappareil. 10 CL d"antimusse s-t%&
,*
., .,
sont'a.msn& par l'allonge, ,et la s&ie des opbations préc6demnt d&ites est r&
p5tée dans le m&e orC!re &mnologique,
:
‘
V I - RESULTATS
.
Paz cette méthode, 'une culme offrant une opacit6 sunC%ieure 2 20 est couramnt
obtenue. 10 litres de culture mrmettent donc de falrriquer 20 litres de vaccin. Le
vaccin foml6 est ad-&v6 ~a.r lialun de potassium. A cette fir: une solution d'alun
de potassium st6rile (autoclavage) est ajout6e de telle sotie que le titz final en
alun soit de 10 ~.1000,
Le conditionnement est effectu6 mit en wules de 20 ~1 @akar).3soit en flacons
de 250 ml C%echa~. La dose vaccinale est de 2 ml.
VII Y cowIRoL;Es
-
A effectuer sur la suspension vaccinale finale awant lpadjonction d'alun.
.'
a) StCrilité
-- ensemencer en houillm ordinaire7 en bouillon viande-foie ana&mhie, sur gElose
:t.q@ose. Observation pendant 5 2 4 jours.
,,
. .
. . . .
b)
~-j-&
.
. .
.
m-
Irmuler 2 cc sous la peau d'un laI::in qui sera mis en o?xervation pendant urb
semaine,
LI_-
en-L.-
--- -.-----"..l I-.---1-...-..-^
_---__-"i_l^~-...-._.
-X Remarques
.
: Les Princi&es causes de contamination de l'appareil de"Steme sont les sui-
vantes : &xulu.m souillk,, rriilieu neuf souillé, manaue dVantimussel la culture a refoul6
par les orifices sup&ieuz,
contamination au niveau du l-mnchement tubes de jonc-rC,ion rw
d6 r&le-femelle, Pour cviter ce dernier cap3n il est reconmm& d'une pwt d'essuyer 2
l'aide d‘une gaze l'él&xmt @le avant tout Lxanchewnt nouveau et de'.la fiasses e%uite
irm%iiatemnt à la rlm, d’autre met de remplacer im&diatemnt tout flacm Woolf vide
.paF un autre plein de milieu. mais dont hien .sQr la pince clamp est maintenue en position
ferm6e. Ainsi Ia zone de branchement pr&ente une ab&nce tctale de cû7ieuz une rince clamp
placée en aval peut d'ailleurs accr&-tre la sécuritk.
..* 11
-- Si l'on souhaite effectuer des tests d'Lm32i-G peur pouvoir ccntrôlerle pou-,
voir r!.ellement protecteur du ~a&i.&~, il est- indispensable d9utiliser-,des l-e-
vins, A signaler que le cobaye est un animal à pmscrire absolument de tcute
expérimentation en rrati&e de septic&nie hém?rragiq.ue, même pour procéder d
de simples passaces de souches.
- Les brins utilises doivent être tri& s&clogiquement pour éliminer les anirrraux
i.rrmms naturellement, ce qui evitera de voir Owrviwe un certain n&re de t&
mbns non vaccin&. LES tests les plus Ir&ieux peur ce dépistage sont le titra-
ge du pcwcir protecteur pur la wuris 5 la fixation du ccr@ément et l'agglu-
tinaticn de cultures sur géloss @AIN~ R.V.S. : Brit. v6-t. J, L 1955, III : 521
5181, enfin il convient d‘ajouter l'hC&a$~$utination de gWLules mups hmT&ls
du grcupe 0 (CAPm, C,.R. : 1955 ; PERFEHJ, PT : 19611, Tcus ces tests nécessitent un
personnel q!balifid, un materie suffisant, un labratcire adapte.
-1 La souche d'Épreuve doit Ctre choisie une fois pour tcutes et sera seule utili-
sée, on lui évitera au maximum les passages sur milieux artificiels. Le titrage
du pouvoir patbgène doit être également établi dPune mani& définitive et
pour cela, on peut partir de la bse suivante : 1 ml dîune dilution au l/î.Oc?T)
d%ne herrwulture de 15 2 18 heures de la souche d'épreuve peut être consici&&
COImE la dose stlreniênt mrstelle ~XXX? un tiuvillon sensiN.e de 70 à 100 kc, Il
est pcssible que l'on enregistre des diff&ences tenant aux races h&.ncs cc~.~
sidé&es, Cette dcse sifrement mwtelle (DZ$?> a été csti.m&e assez largement, il
est pwsihle (et il est bn de le vérifier) nue la DSM &elle varie selon les
régions,
Lp, liquide utilise COITEE diluant pr6sen-te une grande impcrtance. Le S&~JJ phy-
siolt-gique est mal supporté T-W?
._
les Pasteurella et mieux vaut utiliser de l'eau
u--
peptcn& st&ile.
- I..e protocole d'exp&ience est t&s s'impie. Il est identique 2 celui appliqu6
pour le charbn symptcmatique.
Les r&ultats des tests d'immunit3 ne deviennent ~X&T nets qu'au mmen-t 06 l'on
disrose dPun lct scirclwiquement hcmgene d'animaux de sensibilit6 uniforme, ce
qui est souvent très difficile 2 obtenir, TLes r6süLtats favcra>les fournis par
- 3.3
-' 13
A N N E X E
LISTE DU MA'TERIEL UTILISE
1
..,
Canne de verre de 8 mn de 0,
"(
- Tubes à essais de 0 16,
- Tubes à essais de 0 22,
- Erlen-Meyer de 2 litres ~pr‘urvu dOun -h.&e soudé à la base, atelier spécialisé
dans travail du verre),
- Flacons de Wmlf de 10 litres (ciont l'ouvertme inf&ieure est éttic, atelier
spécialisé dans travail du verre>,
- Flacons de 10 litres,
- Filtres Seitz de 10 litres, membranes EKS S et AS ccrrsspcndantesp
- Pinces clmp de 6 cm,
- Filtres Seitz de 100 cm", membres EKS 1 correspondantes,
- Piffuseur d'air (SOVIREL)Y
- Tubes de jonction rodés @ïles et femelles QUICKFIT (871161,
-. 'IWxs de jonction rod& r&le3c et femelles SOVIREL (14/23),,
- Tubes souples rhcdorsil kistant aux conditions de stérilisation (0 int&ieur 8m),
- Filtre papier,
.s Antimusse (Silicone, phcdorsil) (PROLARO),
- Pinces à 4 doigts, ncix de fixation,
- CornibesDIXON,
- Fil de fer, ficelle, coton car&, ‘gaze, papier Kraft? etc.. o
- E!actériclop;iste en état de marche-
PASTEURELLA MULTOCIDA
En pratique, trois principaux types de colonie@ peuvent
@tre distinguk sur milieu solide à l'aide du stéréomicro~o~e en
lumière transmise ohlicluewnt à 45* ou par la réaction produite par
les suspensions épaisses de bact&ics dans l'acriflavine à 1 p. 1000
@XI'ER, 1957).
- Les variants fluorescents ou iris&, rf colonies mu-
queuses ou non,
- les variants bleus ou Fris-bleu, qui ont perdu leur an-
ti$ne capsulairr,
- les variants R, 2 colonies irr&uli~res, de couleur gris
jaunâtre.
Carter (1957) pur Cviter toute confusion entre les diverses d&omi-
nations donn6es aux variants, a px-opsé les terws de ?4ilCOIL)~~ SWI’JTH
et .XWXi pour les disigner,
." .__.< L?.m@Ptance des phénomènes de dissociation.app2t au
niveau de ,la structure tanti,y6nique, du pouvoir patho@ne et kmwkant.
- Les souches muqueuses sont de virulence très variable
., ..
pur la souris, toujours capsulées et faciles à typer
(CPXTER et RIGLMD, 19531,
- les souches smooth irisées sont considérées par tous les
auteurs comme la forme la plus hautement virulente ;
elles sont capsüL&es et faciles 21 typer,
7 les souches smoczth non iri&es (SR) ont une virulence
en génkal conse&e, elles ont perdu leur antigène
va
capsulaire et sont donc non typables (CARTER,195"7),
- les souches rouph se montrent non patho$nes et sont
@ssibles à typer ; cependant, on peut quelquefois
identifier leur skotype somatique (antigène de paroi)
(AF~ERso!~T:~~ coll., 1929).
Les souches smooth qui ont perdu leur "iridescence" peuvent parfois
la retrouver par passaw sur la souris ou l'embryon de poulet.
/
. . . l e.
IFPORTANCE DE L'ENTRETIEX' DES SOUCHES.
En culture sur (s,élose ou en. bouillon, les souches ntises
au ~&f&-&at-.ur 2 4OC, disparaissent en -une serraine environ.
La culture en piqke centrale il;ms la &lose demi-m0lle (5 p.10001,
ii la ter@rature du laboratoire et à l'abri de la lumi&, aswre
aux souches une survie de plusiwrs semaines au mins.
Con,Telées 2 -2OOC ou -30°C, elles se conservent F mis et si elles
sont lyophilisées, II! <ans ; ce sont donc les proc$dés de choix, qui
devant être employés si on veut maintenir les sowhes au stade VW-
eo$de ou',wnoth., soit sous forme de sang virulent, soit sous forme de
cultures t&s jeunes, de 15 ?I 16 heures au maxinnun, car les séjours
plus longs 2 .l'&uve entraiinent leur dissociation.
Lorsque les cultures sont simpletint ,i congeler, il est
nkessaire de leur ajouter une substance protectrice (skum animal,
lait &&mé, polyvinylpyrrolidone, etc...).
CONSTITUTIOIJ ANTIGENIQUE DE PASTEURELLA MULTOCIDA
a) Un ou des polyosides simples, constituants de la cap-
sule et diFfusant dans le milieu (I(nox et Bain, 1960) ;
ils se comportent comme des haptanes ; ils sent imuno-
logiquement actkk lorsqu'ils restent associés ? une
fraction prWéique, Ils absorbent une partie m?is non
la totalité du pouwir immunisant des skums contre les
3actGries entières ; ils sont spkifio*ues des types
capsulaires.
h) De l'acide hyaluronique associ& 5 la capsule d-s va-
;
riants 14 (Carter et Annau, 1953 ; Carter et Byrne,l953 ;
Carter, 1955 et 1957). Ce mucopolyoside, s&&lo@?.w
3
ment et imologiquement inactif,masquc les anti+nes
de type dans les réactions s&olop:iqucs ; il est en
qu‘antitg ‘abondante chez les sérotynes A et C en phase M
et absent chez les sérotypes B et C.
c> Des lipopolÿosides poss&&nt tous les caractères des
endotoxincs classiques des germes wam-negatifs.
. . . / . . .
Ils sont facilement lib&& du corps bactérien et immuno-
lopiquerrent actifs dès qu'ils restent associés 2 des
fractions protéiques (Knox et Bain, 196-1 ; Rebers et
coll. , 1967). Ils inhibent en partie le pouvoir pro-
-
tecteur du skum. Ils sont absorbes par les h&mties de
mammifères.
Les propriét.~3
6~ ne sont pas supprirkes par le chauffage,
-
_. .
.' . ..--.. - _
..<
ni par l'action de la trypsine.
d) Certaines protéines ordinairement associées aux frac-
tions précédentes, apporteraient le pouvoir protecteur ;
-
les autres peuvent jouer le r+3le d'adjuvant ou provo-
._
. .
quer la fomtion d'anticorps opsonisants qui dliorent
l'imité conf&&. Tout laisse \\2 croire do$c que plu-
sieurs antigènes participent au processus d'inmunisation,
c) Quant à la r&partition des antigènes, on parle couram-
ment d'antigks capsulaires et d'antigènes somatiques
quoiqu'une extraction à l'eau physiologique (isotoni-
que ou hypertonique) ou au phenol, litire un tilange
d'antigkes en proportions variables dont la multipli-
cite peut être d&cclCe par des tests de précipitation
sur g&ose ou biologiquement par la toxicité, le pouvoir
pmgène et l'hkagglutination (Bain et Knox, 1961 ;
Penn et NaLgy, 1972').
De tous ces travaux, il faut donc retenir la difficulté
d'obtenir des entités,anti$niques chimiquement pures même avec des
I7I&l&S élabor5es-..'- '.
En effet, il est presqu'impossible de pr$arer des anti-
g&es de type capsulaire qui n9aient pas de pouvoir toxique net, in-
versement la méthode de kstphal ne permet pas d'isoler à l'état pur
l'endotoxine toujours contaminee par les polyosides capsulaires.
TABLEAU no 2
Corwqondance entre les s%Wypes capsulaires de Cwte~ et ceux de
riobwts (SE~~T; Prodjohapjono, Cwter, Conner, 1974.
‘Types Rcherts
II
III
IV
1
v
(pas dv Ecxiva-
h-it !
TABLEAU no 3
Relation entre les types capsulaires et 1~s tyles somati-
ques actuels (d'apr& &.mioka, 1970).
Il en ressort qu?à lvint6ricur d'un m&~ s&ot~;pe, exis-
tent plusieurs types soriWiques,
Types capsulaiEs
A
B
D
E
Types som&iqu~s
1, 3, s-, 7, c, 9* F, 11
1, 2, 3,4,10,12
P
DISTRIBUTION DES SEROTYPES DANS LES INFECTIONS,
Ce skotype est l'agent principal du cholka aviaire ;
il est aussi .fr~~quemwnt rencontrh dans les complications pasteurel-
liques qui succEdent fréqwment aux infections virales chez les
porcs, les bovins, les petits ruminants, les rorgeurs. Pour autant
qugon sache, les souches isolks chez l'home sont exclusivement
du type A.
BType
Ce type est responsable de la septic&ie hémrragiquc
des bovins et des buffles d'kit-;, du Proche-Orient et d'Afrique
Orientale, des bisons d'Am&ique. Il peut F-tre isolC t&s occasion-
nellment chez d'autres espkes animales (chevaux, ~m-cs, mutors).
Type
Ce sémtype a et6 fr$ucmnent isol6 ,i partir d'infections
sporadiques chez de ombreuses cspk~s. Sa distribution est tout 2
fait comparable .? celle du type A. Il apparaît, comme ce dernier,
responsable des pasteurelloses secondaires qui, sur les diverses es-
pèces de mmmifkes et d'oiseaux, peuvent "sortir" à l'occasion de
causes favorables trk variées.
Type
Distinct du type 13, il a é-te pur l'instant exclusivemnt
isol6 de cas de septickie hémrragique des bovins d'Afrique Occi-
dentale, Centrale et Orientale.
,
*