l STAGE D'ENSEIGNENIENT PRATIQUE SUR LES METHODES ...
l
STAGE D'ENSEIGNENIENT PRATIQUE SUR LES METHODES
SEROLOGIQUES DE DIAGNOSTIC DE LA PERIPNEU-MONIE BOVINE
CONTAGIEUSE (ABIDJAN - 15 au 24 Juin 1964)
--ooo--
Plan du stage
'I
-&)o-
1 .- Récolte et conservation des sérums - pratique des dilutions
2 .- La déviation du complément :
I") Rappel du principe
2O) La méthode Kolmer :
a) exécution :
- préparation des réactifs
- titrage du complément
- exécution de la réaction
- importance des témoins
b) interprétation et taux significatif
3*- La séroagglutination sur lame :
- exécution
- interprétation et limites
4 .- L'hémagglutination passive :
- exécution
- interprétation et limites.
( Xission 1 -
REGNOULT
i QUEjrAL )
- 2 -
1 RECOLTE ET CONSERVATION DES SERUMS -
L'animal maintenu fermement, soit debout dans un couloir
de vaccination, soit couché à kerre, est saigné à la jugulaire au
moyen d'une grosse aiguille intraveineuse (100/20/10 ou 80/20/10)
après désinfection soignée du lieu de ponction
Le sang est recueilli directement dans un tube à essai de
18 ou de 22 préalablement stérilisé et bouché au coton cardé. Sur
l'étiquette en sparadrap collée sur chaque tube le numéro de référen-
ce de l'animal saigné est inscrit lisiblement.
Les tubes pleins sont rangés verticalement dans un panier
métallique ou de boîtes spéciales en bois qui ne permettent pas aux
tubes de s’entrechoquer pendant le transport. Ils sont mis dans un
endroit frais pendant quelques heures et , quand le sang est coagulé,
le caillot est décollé de la paroi au moyen d'une baguette de verre
ou de métal (que l'on devra laver à l'eau physiologique et essuyer
après chaque échantillon). Après quelques heures de repos (au frigi-
daire à + 4” ou dans un endroit frais) le sérum est exsudé.
On recueille le sérum dans un tube propre stérile bouché
au coton cardé ou bien dans un flacon pénicilline stérile à bouchon
caoutchouc stérilisé (cet emballage est conseillé si les skrums doi-
vent voyager, les flacons sont alors hermétiquement bouchés avec du
sparadrap et placés sur glace) chaque tube de sérum ou flacon péni-
cilline doit Porter une étiquette de sparadrap sur laquelle le numé-
ro de référence de l'animal doit être reproduit.
Il est à noter que si les sérums ne sont pas utilisés im-
médiatement il est indispensable de les mettre sous glace dès leur
récolte, et si possible au congélateur. Pour éviter les contamina-
tions microbiennes on peut utiliser unatisePtique'tel que le mer-
thiolate (merseptyl) à raison de 2 gouttes d'une solution à 2/100
pour un flacon pénicilline de 20 mml,
.
:
.
c
!
1
- 3 -
I I - FRATIQUE DES DILUTIONS
Pour effectuer un titrage il est nécessaire d'utiliser les
réactifs à certaines dilutions.
Dans toutes les dilutions , qu'il s'agisse du sérum ou des
réactifs utilisés, le diluant doit toujours être identique. On em-
ploie généralement lteau,phgsiologique
c'est-à.dire de l'eau dis-
tillée à laquelle on aajoute 8,5 g pour 1.000 de chlorure de sodium.
Le diluant doit être filtré et auoun dépot ne doit se former dans le
fond des récipients qui le contiennent.
Avant de préparer une dilution quelconque (sérum ou réac-
tifs) il est indispensable de connaître la quantité nécessaire de
chaque dilution qui sera utilisée au cours de la
ou des réactions
Cette quantité sera connue en multipliant la quantité de réactif.
distribuée dans chaque tube par le nombre de tubes.
Par exemple, dans le cas d'une réaction de déviation du complément
sur 1 sérum, type Kolmer :
:
!
!
!
, Chaque tube , Nombre de tube;
TOTAL
.
L ---------------- 1*-----..-----.me ;---------------;-------------------
!
!
!
!
! Sérum
!
0,05 mm1 !
2 x 10
!
1 mm1
!
! Complément
!
!
!
0,4 mm1 i
2 x 10
!
8 mm1
.
! !Sérum Hémolyti-!
!
!
que !
0,I mm1 i
2 x 10
.
!
2 mm1
! Globules rouges!
0,I mm1 !
2 x 10
!
2 mm1
!
!
!
!
!
!
!
!
!
!
!
!
-Z-Z -=-t-=-=-=-=-=
-=-=-=-=-=-zz-=-=-=-
= -= -=- Z-Z-= -=-=-=-==-zz-=-=-=--
(si l'on pratique la réaction sur 20 sérums les quantités de com-
plément, sérum hémolytique et suspension globulaire seront bien en-
tendu multipliées par 20).
Il faut bien préciser pour commencer d'une dilu-
tion à 1 pour 100 (ou à I/IOO)
est obtenue en mélangeant 1 partie
de réactif pour 99 parties de diluant, c'est à dire qu'une suspen-
sion (ou une solution) à =
est obtenue en mélangeant 1 partie : 9 part.
l!
II
1
"
: yy "
Il
Il
1
"
: 999 "
tl
II
1
"
: 49 '1
II
Il
2
"
: 98 1(
::
1,II
6
8,
18
: 97 ” ”
:
94
-f-=-=...=-=-=
-=-=-=-I-=-=-=-=
-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=--
--=-=w
-4 -
Généralement pour la dilution des sérums on utilise des di-
lutions 1 pour 2 (soit au 1/2) dans une série qui commence au I/IOe.
C'est à dire que l'on dispose sur un portoir des tubes à hémolyse en
nombre correspondant à celui des dilutions qu'on veut obtenir. Dans
le premier tube on mettra (par exemple) 0,5 mm1 de sérum pur et 4,5
mm1 de diluant (eau physiologique) pour obtenir la dilution au I/I0 du
sérum. Dans chacun des tubes suivants (tubes, 2, 3, 4, 5---> on met
(par exemple) 1 mm1 de diluant. En partant du mélange du tube no1 on
verse 1 mm1 dans le tube n"2, on mélange. On prend 1 mm1 du mélange
tube 2 et on le porte dans le tube 3, on mélange et ainsi de suite
jusqu'au dernier tube. On obtient alors des dilutions au I/IO, 1/20,
1140, 1/80, 1/160.
Généralement, pour les diagnostics rapides on se contente
pour l'épreuve de déviation du complement des dilutions de sérum au
I/I0 - I/20 - I/40 - 1/80? Pour la réaction d'hémagglutination indi-
recte il est préférable d'y ajouter la dilution à I/I60 ème.
Pour le sérum hémolytique, si l'on emploie le sérum hémoly-
tique de l'Institut Pasteur dont le titre est I/IO.OOOe, une dilution
à Ip.1000 s'obtient en laissant tomber une
. gout;@ de sérum hémolyti-
que dans 12.5 mm1 de diluant (eau physiologique
Pour le complément (sérum de cobaye), si l'on utilise le com-
plément lyophilisé de l'Institut Pasteur, il faut le souvenir quo cha-
que ampoule doit être reconstituée à 0,5 mm1 et donne 0,5 mm1 de sérum
de cobaye (complément) pur. Donc une dilution à I/40e s'obtient en
mélangeant le contenu d'une ampoule à 19,5 mm1 de diluant (eau physio-
logique).
Une suspension d'hématies à 2 p.100 s'obtient en portant
2 mm1 de culot globulaire dans 98 mm1 de diluant (eau physiologique).
P
!
t
*
-5-
III - LA FIXATION DU COMPLEïVIENT
La réaction de fixation du complément est utilisée soit
détecter un anticorps dans un sérum en présence d'un antigène connu,
soit pour déceler un antigène dans le produit en présence d'un immun-
sérum connu.
On effectue cette réaction en deux temps :
Dans le premier temps, on met en contact, le sérum étudié,
l'antigène et le complément. SI le sérum renferme un anticorps, ce
dernier se combine à l'antigène et l'immun-complexe fixe le complé-
ment; s'il n'y a pas d'anticorps, le complément reste libre,
Dans le deuxième temps, on introduit des hématies sensibi-
lisées par du sérum hémolytique.
- si le complément introduit a été fixé dans le premier temps par un
complexe antigène-anticorps, les hématies ne sont pas lysées : la
réaction.est positive.
- s'il n'y a pas eu union entre un anticorps et un antigène, le com-
plément est demeuré libre et les hématies sont lysées : la réaction
gst négative.
c
On peut effectuer la réaction de fixation du complément
selon des modalités très diverses. Ici nous utiliserons :
- 0,I cm3 de suspension de globules de mouton à 2 p.100.
rc
- 2 unités de complément titré en présence de 2 unités d'hémolysine.
- une durée de 1 heure à 37” pour la fixation du complément.
- l'antigène à une concentration correspondant à sa sensibilité op-
tima.
1 " - Titrage du com!>lément.
Avant d'éffectuer une réaction de fixation du complément,
il est indispensable de titrer l'activité du complément utilisé. Ce
titrage doit être fait en employant la même suspension d'hématies et
le même sérum hémolytique qui seront utilisés, par la suite, dans la
réaction elle-même.
Il est nécessaire, égalemtint, de réaliser (cetitrage en pré-
sence de l'antigène afin de tenir compte de son éventuelle action
anti-complémentaire.
Enfin, il faut soumettre les mélanges complément
et antigène du titrage au même traitement que celui qui subira ce com-
plément lors de réaction de fixation : ici on mettra les tubes conte-
nant le complément et l'antigène pendant 1 heure dans un bain-marie
à 37O, une partie du complélqent peut être détruite; il est donc in-
dispensable de connaître le titre exact du complément à la fin de cet-
te incubation qu'il doit subir lors de la réaction de fixation.
i
Exécution du titrage
Di!luer le complément à I/I00 (complément 0,I cm3 + eau phy-
siologique 9,9 cm3).
Diluer le sérum hémolytique à I/I000 (sérum hénolytique
standard 1/80 om3 + eau physiologique 12,5 cm?). On peut mélanger la
i
-6-
suspension de globules rouges et le sérum hémolytique à I/I000 en
Par?ties égales = globules sensibilisés. On ajoute alors en une seu-
le opération 0,2 cm3 de ce mélange à chaque tube.
Préparer sur même portoir métallique, le titrage du complé-
ment selon les indications données dans le tableau suivant :
1
2
3
4
5
6
7
8
9
=-=*=-=-= -=-=-=-=-=-=-=-=rm=
..=-c .,.=-=-=w =-=-=-=-=-=.w=-=-
=-=z-=-=-=-=--
C' I/I00
f 0~10
0915 020 0,25 0,30 0,35 0,40 0,45 0,50
Eau physiolo;
0,40
0,35
0,30
0,25
0,20
OI15
0,IO
0,05
0
Antigène
i 0,I 0,I 0,I 0,I 0,I 0,I 0,I 0,I 0,I
:
:
1 heure dans un bain marie à 37"
.
S.H I/I000 : 0,I 0,I 0,I 0,I 0,I 0,I 0,I 0,I 0,I
:
G.R 2 p.100 i 0,I 0,I 091 0,I 0,I 0,I 0,I 0,I 0,I
::
1 heure dans un bain-marie à 3’7”
Lecture des résultats
On note le tube contenant la plus petite quantité "a" de
complément dilué présentant une hémolyse totale : ce tube renferme
1 unité de complément pour ce système.
On calcule la dilution I/x à laquelle il faut amener ce
sérum de cobaye afin que la solution ainsi obtenue renferme 2 unités
de complément dans 0,4 cm3.
1
=
{a est exprimé en cm3)
X
x&-
k
a
Il est nécessaire de titrer l'activité du complément uti-
lisé pour chaque nouveau lot de fabrication et chaque fois que les
conditions de conservation du complément (freezer ou congélateur à-
15") n'ont pu être respectées. Dans ces cas là, le titrage du con-
plément doit être le premier travail de la journée.
2"/ TITRAGE DE L'ANTIGENE
Il a été effectué au laboratoire et sera donné lors de
l'approvisionnement en réactifs. La dilution à employer dans la réac-
tion de déviation du complément sera indiquée sur chaque ampoule.
..* / . . .
-7-
30,’ LA REACTION DE FIXATION DU COXE'LEIfJ3NT
Plusieurs méthodes sont applicables au diagnostic de
la péripneumonie bovine.
La méthode de Campbell etTUrner, universellement con-
nue et la méthode de Kolmer, récemment adaptée par le laboratoi-
re de Farcha (tchad).
-- -- -- a- -.. me .a . . L. . . m. .a m. .D .O . . .O OI 0. . . *. . . .a . . ** .O 00 a. . . .a
.”
.
.
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‘.*
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. . . .o .O
00
111
.*
.D
.o
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a
,
-8.
LA mTHODE DE KOLBrlER (adaptée par Farcha)
Elle détermine la dilution la plus élevée de sérum suscepti-
ble de fixer en 18 heures (une nuit au frigidaire à 6” 2 unités de com-
plément en présence de l'antigène péripneumonique à sa dilution optima.
Dans 7 tubes de kahn on prépare à partir du sérum dilué au
I/IOè 7 dilutions en progression géométrique de raison 1/2.
0,5 mm1 sérum dilué + 0,5 mm1 d'eau physiologique).
1
2
5
6
Dans 16 tubes à collerette groupés par deux, on introduit
les réactifs selon les indications données dans le tabireau suivant :
- les tubes I', 2', 31, . . . . . . . . sont les "témoins sérums!'
destinés à mettre en évidence le pouvoir anti-complémentaire éventuel
du sérum en absence de l'antigène.
- le tube 9 est le "témoin antigène".
Employer le complément à la dilution de I/x (sérum de cobaye
cm3 + eau physiologique... cm3).
-=-=e=-
tC=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=.=.~.=.=-=-=.=.=.=.=.=.=.=“=.=.=.=.=.=.=..
!?
i 1
11;* 2
2': ...*..,'8
.
SI; . 9
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(dilution i
.
i 1
f 1
f
i 1
10
20
1280
,
.
t Sérum
(
(quantité i 0,05 0,05;; 0,05 w5j
!
0,05 0,05;
1
.
.
.
.
i Antigène I/I000
; 0,I 0
; 0,I 0 ;
; 0,I 0
.
f 0,I
.
! Eau physiologique
! 0
0,I ! 0
0,I !
! 0
0,I ! 0,05
!
!
!
!
!
!
! C1 2 unités
! 0,4
094 ! 0,4 Q,4 !
! 0,4 0,4 ! 0,4
!
!
!
!
!
!
!
!
!
!
!
!
!
!
!
!
!
!
!
!
!
!
!
!
0
!
!
Une nuit au frigidaire à 6" - 8O
!
1
! S.H. I/I000
; 0,I 0,I !
0,I O,I!
! 0,I 0,I ! 0,I
! G.R. 2 p.IOO
! 0,I 0,I !
0,I 0,I.f
!
0,I 0,I 1 0,I
!
!
!
!
!
!
!
!
, Bain-mari.e!à 37" (1 -iecture!IO mn après la lyse
!
.
!
!
(des témoins
!!
--.- .-... .-. ^ ,,__
_,,,
!
(2 - lecture après 20 minutes.
,. _. . <.
. . . / . . .
---
---..
’
I
-9-
Lecture des résultats :
On peut employer deux modes de lecture :
- lecture 10 minutes après la lyse des témoins ("témoins sérum" et
"témoin antigène) on note la dilution la plus élevée du sérum dans
laquelle, en présence de l'antigène, l'hémolyse est nulle ou partiel-
le.
- lecture apxès 1 heure à 37*, dans ce cas également il est indispen-
Sable de vérifier que les témoins sont lysés et on note la dilution
la plus élevée du sérum ayant inhibé l'hémolyse en présence d'anti-
gène.
Pour aider à la lecture on fera une échelle d'hémolyse qui
servira à comparer les degrés divers de l'hémolyse obtenue dans les
tubes de la réaction.
ECHELLE DE L'HEMOLYSE
1 " - une suspension de globules rouges à 0,25 p.100
A
( 1 cm3 G.R. 2 p.100
( 7 cm3 eau physiologique
.
2" - une solution d'hémoglobine correspondant à la suspension de glo-
bules à O,25 p.100. On lyse les globules par addition d'eau dis-
‘U
tillée et on isotonise la solution dthémoglobine
par addition de
CLNa.
B
( 1 cm3 G.R. 2 p.100
( 6,3 cm3 eau distillée
( 0,7 cm3 CLNa 8,5 p.100
Dans une série de tubes à collerette, on prépare les mélan-
ges suivants :
a.=-=-=-=-=-=-=-=..
Z-=-=-E-=-=-
f-=-=.mz-=.m=r=r=r=.,
=-=-=r=-=-=-=-=-=-=-=-
!
!
! G.R. 0,25 p.100
A
! 1
0,75
0,50
0,25
0
!
!
! Hémoglobine
B
! 0
0,25
0,50
0975
1
!
!
f Hémolyse p.100
i 0
.
.
25
50
75
100
i
.
! Inhibition de I'hémolyse!
! p.100
! 100
75
50
25
0
!
!
! Notation
! +i-+
+++
-k-l-
+
!
!
!
!
-_-----------_-------------
-_-----_---_------I__c__________________~-
. . . / . . .
- 10 -
Les réactions sont lues en se basant sur l'échelle d'hé-
molyse et affectées d'une coefficient (++++> (+++) (+> (0) selon
l'intensité de l'hémolyse observée.
Est considéré dans cette réaction comme positif tout sé-
rum affecté de (++++) (-t++) (++> ou (+)
à la dilution de I/BO,ou
supérieure c'est à dire positif à (++++) (+-t+) (++) aux dilutions
précédentes (I/IO, 1/20,-1/40).
Est considére comme douteux tout sérum affecté de (++++)
(
. I. -
,
+++ ) (+> & la dilution de I/JO c'est à dire positif & (+-t++) c-t++)
b-4 aux dilutions précédentes (I/I0 - 1/20).
Une réaction positive :
- au taux de 1/80 est le signe d'une infection certaine.
- au taux de I/4O est le signe d'une infection possible.
- à un taux inférieur à I/4O n'a pas de signification valable.
Dans le cas d'un sérum positif à I/JO, il convient de fai-
re une nouvelle saignée à l'animal, si le taux minimum de I/4O est
retrouvé à nouveau, considérer le cas comme positif.
Généralement le pouvoir anticomplémentaire n'affecte pas
les sérums au delà de 1/20 et ne gène donc en rien la lecture de la
réadtion.
IV - LA SEROAGGLUTINATION SUR LAME
Cette réaction sérologique est effectuée avec un sérum
fraichement recueilli et peut donc être employée au moment de l'a-
chat des animaux il faut bien préciser qu'il ne slagit que d'un test
très grossier qui n'a de valeur que lorsqu'il est positif.
Un sérum qui agglutine la suspension de Nvcoplasma mycoï-
&s, var.. mswoïdes,
colorée est considéré comme positif et provient
d'un animal suspect ou infecté de péripneumonie bovine.
Le principe de la réaction est de mettre en présence sur
une plaque transparente (plaque plastique ou lame de verre) une gout-
te du sérum de l'animal et une goutte d'une suspension colorée de
Mycoplasma mycoïdes var mgcoïdes. Seules les réactions d'agglutina-
tion vraiment nettes sont considérées comme positives.
V - HEMAGGLUTINATION INDIRECTE
Cette réaction s'effectue sur le sérum. On met en présen-
ce une suspension d'hématies de mouton sensibilisées par Mycoplasma
mycoïdes, var mycoTdes et le sérum aux dilutions choisies.
. . . . / . . . .
- II -
On prépare d'abord les dilutions de sérum à I/I0 - 1/20 -
1140 - I/%O - I/I60 - I/320 - 1/6t$o - 1/X280.
On prépare ensuite la suspension d'hématies sensibilisées
à la dilution choisie comme étant la plus sensible. Les hématies sen-
sibilisées sont fournies par le laboratoire d'Alfort de l'Institut
d*Elevage et Médecine Vétérinaire des Pays Tropicaux sous forme d'hé-
maties sensibilisées formolées et lyophilisées.
11 convient de reconstituer le contenu de chaque ampoule
avec 2 mm1 d'eau distillée. Bien agiter pour ohtenir une suspension
homogène. Diluer cette suspension par addition de 98 mm1 d'eau phy-
siologique et bien agiter pour homogéneiser. Cette suspension est à
conserver au frigidaire à 4” si on ne
l'utilise pas immédiatement.
Pour la réaction d'hémagglutination disposer une série de
tubes de Kahn dans lesquels on distribue en série les dilutions du
sérum à raison de 0,4 mm1 par tube.
Après avcir bien homogéneisé la suspension d'hématies sen-
sibilisées à 1% la distribuer à raison de 0,4 mm1 par tube.
Agiter les tubes sur leur portoir, laisser reposer dans un
endroit frais et effectuer la lecture au moins 2 heures après (les
réactions sont encore plus lisibles le lendemain matin si le labora-
toire est suffisamment frais).
Il est bon de vérifier que les sérums n'ont pas d'anticorps
agglutinant normalement les globules rouges de mouton en faiaant pour
chaque sérum un "témoin hématies normales". Pour ce lttémointt on uti-
lise la dilution du sérum au I/I0 (0,4 mml) et une suspension à 1%
d'hcaaties normales de mouton (0,4 mnl), Il ne doit pas y avoir d'ag-
glutination dans ce tube.
La lecture est faite par appréciation du degre d'aggluti-
nation des globules rouges.
Pour être positive la réaction d'hémagglutination
doit être
très nette, les réactions douteuses ne sont pas considérées comme
positives (en cas de réactions douteuses il y a intérêt à recommen-
cer la réaction avec un nouveau prélèvement de sérum.)-
Un sérum positif à une dilution supérieur à 1/80 est le si-
gne d'une infection certaine ou presque certaine.
Les sérums positifs au I/IO, 1120 et 1140 peuvent être
considérés comme sans signification valable.
c
.*. / . . .
I
-
------.-
-~
.
.’
- 12 -
APPENDICES
Jo/ RECOLTE ET STOCKAGE DES HEiXATIES DE MOUTON
Le sang d'un mouton est récolté aseptiquement dans un vase
clos contenant une solution anticoagulante (solution Alsever modifiée).
Le flacon contient déjà un certain volume de solution conser-
vatrice, on lui ajoute un égal volume de sang (par exemple dans un fla-
con de 500 mml, à 250 mm1 de solution Alsever on ajoutera 250 mm1 de
sang de mouton).
On mélange la suspension en agitant modérément. Le stockage
des hématies se fait au réfrigérateur à 40-6" (jamais au congélateur).
Les hématies conservées de cette façon sont utilisables durant I5 jours
‘amais le liquide surnageant ne doit être coloré, cela signerait une
iitérioration
des hématies )
. .
Pour l'utilisation les hematies doivent être lavées. A cet
.
effet on prélève un certain volume du culot globulaire auquel on ajoute
de l'eau physiologique, on agite modérément pour mettre en suspension
puis on centrifuge à 3000 T/min, Pendant 10 minutes on élimine le liqui-
w
de surnageant qui doit être clair ou très peu coloré. On ajoute à nou-
veau de l'eau physiologique et on remet les globules en suspension avant
de les centrifuger à nouveau 10 minutes; nouvelle élimination du surna-
geant qui doit être limpide, nouveau lavage, nouvelle centrifugation.
Après élimination du surnageant liquide on obtient la "purée
globulaire" qui sera utilisée pour les réactions de déviation du complé-
ment et les témoins d'hémagglutination.
Formule de la solution Alsever modifiée (Cohen 1953)
glucose
20,5 gramme
Citrate Na
8
Il
Acide citrique
0755
"
Chlorure Na
4,2
"
Eau distillée
1000 mm1
Stériliser à l'autoclave 20 minutes. Vérifier ensuite le ppH
de la solution qui doit être de 6,r.
. . . / . . .
--
--
w
- 14 -
Les témoins négatifs devront être entierement hémolgsés, les
témoins positifs devront rester indemnes. La lecture de la réaction (3)
se fait comme pour la réaction de Kolmer selon une cotation (++++)(++I-)
(++> (4.
Un sérum positif sur les 4 tubes (non hémolysé aux I/I0 -
1120 - I/40 - 1/80) est le signe d'une infection certaine.
Un sérum positif sur les 3 premiers tubes (I/I0 - 1/20 - I/4O
est douteux" et doit être refait, l'animal étant l'objet d'une seconde
saignée. Du cas de ncuvclle réaction positive au I/40 tenir cet animal
pour suspect d'infection.
Un sérum positif sur les 2 premiers tubes n'a pas de signi-
fication importante.
Le tube ",témoin sérum" doit être hémolysé en totalité (il ne
contient pas d'antigène et au cas où un trouble subsisterait ge serait
le signe que le sérum possède un pouvoir anticomplementaire).
TJOTA (1) A un complément de titre 1/80 correspond une dilution de I/33e
pour 2,5 unités.
(2) A un sérum hémolytique de I/IO.OOOe correspond une dilution
de I/I400 pour 6 HD 50 $.
(3) Le repos des tubes pendant une nuit au frigidaire de 4” à 8O
rendra la lecture très aisée sans nuire à la réaction.
.
- 13 -
II - CONDITIONS DE CONSERVATION DES REACTIFS
Sont à conserver au frigidaire à faible température (4” à SO) :
Globules rouges de mouton en Alsever.
Sérum hémolytique ;
suspension antigènique pour déviation du complément.
suspension antigènique colorée pour agglutination,
Sont à conserver au congélateur h-15" - IS") :
Complément de cobaye lyophilisé
Antigène lyophilisé pour déviation du complément
Globules rouges de mouton sensibilisés lyophilisés.
Il faut noter qu'on ne doit pas conserver d'un jour à l'autre
les réactifs dilués, à l'exception de la suspension antigènique.
III - REACTION DE DEVIATION DU COiJPLEIvlENT SELON CAMPBELL ET TURNER
(test de dégrossissage sur 4 tubes)
Cette réaction est recommandée pour sa simplicité et a été
universellement reconnue (conférence de Muguga) comme test de référen-
ce en matière de Péripneumonie bovine.
rl
Prendre le sérum à analyser avec dilution I/IO, I/20, I/40r
1/80, les placer sur un portoir à réaction en y ajoutant un "témoin sé-
rum au I/IO" (pour étude du pouvoir anticomplémentaire).
1
Distribuer :
sérum à analyser . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
0,25
mm1
antigène (5 unités ) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
0,25
mal
complément (2,5 unités)
0~25 mm1
0)
.*.**.....*.*.*...
Agiter, mettre au bain-marie à 37” durant 30 minutes. Prépa-
rer les globules rouges sensibilisés pendant que la réaction est au
bain-marie. Ces globules rouges sensibilisés sont préparés en mélan-
.'
gement à parties égales globules rouges de mouton lavés et sérum hémo-
lytique (à la dilution choisie) et en laissant le mélange 30 minutes à
la température du laboratoire.,
Ajouter alors dans chaque tube de réaction =
sérum hémolytique (~HD. 50%) !
globules rouges de mouton à 6%): Oy2'
(2)
Agiter et mettre au bain-marie à 37” durant 30 minutes.
Pour chaque série de réactions ajouter un "témoin négatif"
aux 4 dilutions (I/I0 - 1/20 - I/4O - 1/80) et un ",témoin positif" aux
4 dilutions (I/I0 - 1120 - I/40 - 1/80).
f
STAGE D'ENSEIGNENIENT PRATIQUE SUR LES METHODES
SEROLOGIQUES DE DIAGNOSTIC DE LA PERIPNEU-MONIE BOVINE
CONTAGIEUSE (ABIDJAN - 15 au 24 Juin 1964)
--ooo--
Plan du stage
'I
-&)o-
1 .- Récolte et conservation des sérums - pratique des dilutions
2 .- La déviation du complément :
I") Rappel du principe
2O) La méthode Kolmer :
a) exécution :
- préparation des réactifs
- titrage du complément
- exécution de la réaction
- importance des témoins
b) interprétation et taux significatif
3*- La séroagglutination sur lame :
- exécution
- interprétation et limites
4 .- L'hémagglutination passive :
- exécution
- interprétation et limites.
( Xission 1 -
REGNOULT
i QUEjrAL )
- 2 -
1 RECOLTE ET CONSERVATION DES SERUMS -
L'animal maintenu fermement, soit debout dans un couloir
de vaccination, soit couché à kerre, est saigné à la jugulaire au
moyen d'une grosse aiguille intraveineuse (100/20/10 ou 80/20/10)
après désinfection soignée du lieu de ponction
Le sang est recueilli directement dans un tube à essai de
18 ou de 22 préalablement stérilisé et bouché au coton cardé. Sur
l'étiquette en sparadrap collée sur chaque tube le numéro de référen-
ce de l'animal saigné est inscrit lisiblement.
Les tubes pleins sont rangés verticalement dans un panier
métallique ou de boîtes spéciales en bois qui ne permettent pas aux
tubes de s’entrechoquer pendant le transport. Ils sont mis dans un
endroit frais pendant quelques heures et , quand le sang est coagulé,
le caillot est décollé de la paroi au moyen d'une baguette de verre
ou de métal (que l'on devra laver à l'eau physiologique et essuyer
après chaque échantillon). Après quelques heures de repos (au frigi-
daire à + 4” ou dans un endroit frais) le sérum est exsudé.
On recueille le sérum dans un tube propre stérile bouché
au coton cardé ou bien dans un flacon pénicilline stérile à bouchon
caoutchouc stérilisé (cet emballage est conseillé si les skrums doi-
vent voyager, les flacons sont alors hermétiquement bouchés avec du
sparadrap et placés sur glace) chaque tube de sérum ou flacon péni-
cilline doit Porter une étiquette de sparadrap sur laquelle le numé-
ro de référence de l'animal doit être reproduit.
Il est à noter que si les sérums ne sont pas utilisés im-
médiatement il est indispensable de les mettre sous glace dès leur
récolte, et si possible au congélateur. Pour éviter les contamina-
tions microbiennes on peut utiliser unatisePtique'tel que le mer-
thiolate (merseptyl) à raison de 2 gouttes d'une solution à 2/100
pour un flacon pénicilline de 20 mml,
.
:
.
c
!
1
- 3 -
I I - FRATIQUE DES DILUTIONS
Pour effectuer un titrage il est nécessaire d'utiliser les
réactifs à certaines dilutions.
Dans toutes les dilutions , qu'il s'agisse du sérum ou des
réactifs utilisés, le diluant doit toujours être identique. On em-
ploie généralement lteau,phgsiologique
c'est-à.dire de l'eau dis-
tillée à laquelle on aajoute 8,5 g pour 1.000 de chlorure de sodium.
Le diluant doit être filtré et auoun dépot ne doit se former dans le
fond des récipients qui le contiennent.
Avant de préparer une dilution quelconque (sérum ou réac-
tifs) il est indispensable de connaître la quantité nécessaire de
chaque dilution qui sera utilisée au cours de la
ou des réactions
Cette quantité sera connue en multipliant la quantité de réactif.
distribuée dans chaque tube par le nombre de tubes.
Par exemple, dans le cas d'une réaction de déviation du complément
sur 1 sérum, type Kolmer :
:
!
!
!
, Chaque tube , Nombre de tube;
TOTAL
.
L ---------------- 1*-----..-----.me ;---------------;-------------------
!
!
!
!
! Sérum
!
0,05 mm1 !
2 x 10
!
1 mm1
!
! Complément
!
!
!
0,4 mm1 i
2 x 10
!
8 mm1
.
! !Sérum Hémolyti-!
!
!
que !
0,I mm1 i
2 x 10
.
!
2 mm1
! Globules rouges!
0,I mm1 !
2 x 10
!
2 mm1
!
!
!
!
!
!
!
!
!
!
!
!
-Z-Z -=-t-=-=-=-=-=
-=-=-=-=-=-zz-=-=-=-
= -= -=- Z-Z-= -=-=-=-==-zz-=-=-=--
(si l'on pratique la réaction sur 20 sérums les quantités de com-
plément, sérum hémolytique et suspension globulaire seront bien en-
tendu multipliées par 20).
Il faut bien préciser pour commencer d'une dilu-
tion à 1 pour 100 (ou à I/IOO)
est obtenue en mélangeant 1 partie
de réactif pour 99 parties de diluant, c'est à dire qu'une suspen-
sion (ou une solution) à =
est obtenue en mélangeant 1 partie : 9 part.
l!
II
1
"
: yy "
Il
Il
1
"
: 999 "
tl
II
1
"
: 49 '1
II
Il
2
"
: 98 1(
::
1,II
6
8,
18
: 97 ” ”
:
94
-f-=-=...=-=-=
-=-=-=-I-=-=-=-=
-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=--
--=-=w
-4 -
Généralement pour la dilution des sérums on utilise des di-
lutions 1 pour 2 (soit au 1/2) dans une série qui commence au I/IOe.
C'est à dire que l'on dispose sur un portoir des tubes à hémolyse en
nombre correspondant à celui des dilutions qu'on veut obtenir. Dans
le premier tube on mettra (par exemple) 0,5 mm1 de sérum pur et 4,5
mm1 de diluant (eau physiologique) pour obtenir la dilution au I/I0 du
sérum. Dans chacun des tubes suivants (tubes, 2, 3, 4, 5---> on met
(par exemple) 1 mm1 de diluant. En partant du mélange du tube no1 on
verse 1 mm1 dans le tube n"2, on mélange. On prend 1 mm1 du mélange
tube 2 et on le porte dans le tube 3, on mélange et ainsi de suite
jusqu'au dernier tube. On obtient alors des dilutions au I/IO, 1/20,
1140, 1/80, 1/160.
Généralement, pour les diagnostics rapides on se contente
pour l'épreuve de déviation du complement des dilutions de sérum au
I/I0 - I/20 - I/40 - 1/80? Pour la réaction d'hémagglutination indi-
recte il est préférable d'y ajouter la dilution à I/I60 ème.
Pour le sérum hémolytique, si l'on emploie le sérum hémoly-
tique de l'Institut Pasteur dont le titre est I/IO.OOOe, une dilution
à Ip.1000 s'obtient en laissant tomber une
. gout;@ de sérum hémolyti-
que dans 12.5 mm1 de diluant (eau physiologique
Pour le complément (sérum de cobaye), si l'on utilise le com-
plément lyophilisé de l'Institut Pasteur, il faut le souvenir quo cha-
que ampoule doit être reconstituée à 0,5 mm1 et donne 0,5 mm1 de sérum
de cobaye (complément) pur. Donc une dilution à I/40e s'obtient en
mélangeant le contenu d'une ampoule à 19,5 mm1 de diluant (eau physio-
logique).
Une suspension d'hématies à 2 p.100 s'obtient en portant
2 mm1 de culot globulaire dans 98 mm1 de diluant (eau physiologique).
P
!
t
*
-5-
III - LA FIXATION DU COMPLEïVIENT
La réaction de fixation du complément est utilisée soit
détecter un anticorps dans un sérum en présence d'un antigène connu,
soit pour déceler un antigène dans le produit en présence d'un immun-
sérum connu.
On effectue cette réaction en deux temps :
Dans le premier temps, on met en contact, le sérum étudié,
l'antigène et le complément. SI le sérum renferme un anticorps, ce
dernier se combine à l'antigène et l'immun-complexe fixe le complé-
ment; s'il n'y a pas d'anticorps, le complément reste libre,
Dans le deuxième temps, on introduit des hématies sensibi-
lisées par du sérum hémolytique.
- si le complément introduit a été fixé dans le premier temps par un
complexe antigène-anticorps, les hématies ne sont pas lysées : la
réaction.est positive.
- s'il n'y a pas eu union entre un anticorps et un antigène, le com-
plément est demeuré libre et les hématies sont lysées : la réaction
gst négative.
c
On peut effectuer la réaction de fixation du complément
selon des modalités très diverses. Ici nous utiliserons :
- 0,I cm3 de suspension de globules de mouton à 2 p.100.
rc
- 2 unités de complément titré en présence de 2 unités d'hémolysine.
- une durée de 1 heure à 37” pour la fixation du complément.
- l'antigène à une concentration correspondant à sa sensibilité op-
tima.
1 " - Titrage du com!>lément.
Avant d'éffectuer une réaction de fixation du complément,
il est indispensable de titrer l'activité du complément utilisé. Ce
titrage doit être fait en employant la même suspension d'hématies et
le même sérum hémolytique qui seront utilisés, par la suite, dans la
réaction elle-même.
Il est nécessaire, égalemtint, de réaliser (cetitrage en pré-
sence de l'antigène afin de tenir compte de son éventuelle action
anti-complémentaire.
Enfin, il faut soumettre les mélanges complément
et antigène du titrage au même traitement que celui qui subira ce com-
plément lors de réaction de fixation : ici on mettra les tubes conte-
nant le complément et l'antigène pendant 1 heure dans un bain-marie
à 37O, une partie du complélqent peut être détruite; il est donc in-
dispensable de connaître le titre exact du complément à la fin de cet-
te incubation qu'il doit subir lors de la réaction de fixation.
i
Exécution du titrage
Di!luer le complément à I/I00 (complément 0,I cm3 + eau phy-
siologique 9,9 cm3).
Diluer le sérum hémolytique à I/I000 (sérum hénolytique
standard 1/80 om3 + eau physiologique 12,5 cm?). On peut mélanger la
i
-6-
suspension de globules rouges et le sérum hémolytique à I/I000 en
Par?ties égales = globules sensibilisés. On ajoute alors en une seu-
le opération 0,2 cm3 de ce mélange à chaque tube.
Préparer sur même portoir métallique, le titrage du complé-
ment selon les indications données dans le tableau suivant :
1
2
3
4
5
6
7
8
9
=-=*=-=-= -=-=-=-=-=-=-=-=rm=
..=-c .,.=-=-=w =-=-=-=-=-=.w=-=-
=-=z-=-=-=-=--
C' I/I00
f 0~10
0915 020 0,25 0,30 0,35 0,40 0,45 0,50
Eau physiolo;
0,40
0,35
0,30
0,25
0,20
OI15
0,IO
0,05
0
Antigène
i 0,I 0,I 0,I 0,I 0,I 0,I 0,I 0,I 0,I
:
:
1 heure dans un bain marie à 37"
.
S.H I/I000 : 0,I 0,I 0,I 0,I 0,I 0,I 0,I 0,I 0,I
:
G.R 2 p.100 i 0,I 0,I 091 0,I 0,I 0,I 0,I 0,I 0,I
::
1 heure dans un bain-marie à 3’7”
Lecture des résultats
On note le tube contenant la plus petite quantité "a" de
complément dilué présentant une hémolyse totale : ce tube renferme
1 unité de complément pour ce système.
On calcule la dilution I/x à laquelle il faut amener ce
sérum de cobaye afin que la solution ainsi obtenue renferme 2 unités
de complément dans 0,4 cm3.
1
=
{a est exprimé en cm3)
X
x&-
k
a
Il est nécessaire de titrer l'activité du complément uti-
lisé pour chaque nouveau lot de fabrication et chaque fois que les
conditions de conservation du complément (freezer ou congélateur à-
15") n'ont pu être respectées. Dans ces cas là, le titrage du con-
plément doit être le premier travail de la journée.
2"/ TITRAGE DE L'ANTIGENE
Il a été effectué au laboratoire et sera donné lors de
l'approvisionnement en réactifs. La dilution à employer dans la réac-
tion de déviation du complément sera indiquée sur chaque ampoule.
..* / . . .
-7-
30,’ LA REACTION DE FIXATION DU COXE'LEIfJ3NT
Plusieurs méthodes sont applicables au diagnostic de
la péripneumonie bovine.
La méthode de Campbell etTUrner, universellement con-
nue et la méthode de Kolmer, récemment adaptée par le laboratoi-
re de Farcha (tchad).
-- -- -- a- -.. me .a . . L. . . m. .a m. .D .O . . .O OI 0. . . *. . . .a . . ** .O 00 a. . . .a
.”
.
.
.
.
- -
- -
- -
- -
-_
_-
- -
- -
- _
--
f . .
‘.*
‘,, :. ‘A ‘i.
. . . .o .O
00
111
.*
.D
.o
_y---
a
,
-8.
LA mTHODE DE KOLBrlER (adaptée par Farcha)
Elle détermine la dilution la plus élevée de sérum suscepti-
ble de fixer en 18 heures (une nuit au frigidaire à 6” 2 unités de com-
plément en présence de l'antigène péripneumonique à sa dilution optima.
Dans 7 tubes de kahn on prépare à partir du sérum dilué au
I/IOè 7 dilutions en progression géométrique de raison 1/2.
0,5 mm1 sérum dilué + 0,5 mm1 d'eau physiologique).
1
2
5
6
Dans 16 tubes à collerette groupés par deux, on introduit
les réactifs selon les indications données dans le tabireau suivant :
- les tubes I', 2', 31, . . . . . . . . sont les "témoins sérums!'
destinés à mettre en évidence le pouvoir anti-complémentaire éventuel
du sérum en absence de l'antigène.
- le tube 9 est le "témoin antigène".
Employer le complément à la dilution de I/x (sérum de cobaye
cm3 + eau physiologique... cm3).
-=-=e=-
tC=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=.=.~.=.=-=-=.=.=.=.=.=.=.=“=.=.=.=.=.=.=..
!?
i 1
11;* 2
2': ...*..,'8
.
SI; . 9
-t!
(dilution i
.
i 1
f 1
f
i 1
10
20
1280
,
.
t Sérum
(
(quantité i 0,05 0,05;; 0,05 w5j
!
0,05 0,05;
1
.
.
.
.
i Antigène I/I000
; 0,I 0
; 0,I 0 ;
; 0,I 0
.
f 0,I
.
! Eau physiologique
! 0
0,I ! 0
0,I !
! 0
0,I ! 0,05
!
!
!
!
!
!
! C1 2 unités
! 0,4
094 ! 0,4 Q,4 !
! 0,4 0,4 ! 0,4
!
!
!
!
!
!
!
!
!
!
!
!
!
!
!
!
!
!
!
!
!
!
!
!
0
!
!
Une nuit au frigidaire à 6" - 8O
!
1
! S.H. I/I000
; 0,I 0,I !
0,I O,I!
! 0,I 0,I ! 0,I
! G.R. 2 p.IOO
! 0,I 0,I !
0,I 0,I.f
!
0,I 0,I 1 0,I
!
!
!
!
!
!
!
!
, Bain-mari.e!à 37" (1 -iecture!IO mn après la lyse
!
.
!
!
(des témoins
!!
--.- .-... .-. ^ ,,__
_,,,
!
(2 - lecture après 20 minutes.
,. _. . <.
. . . / . . .
---
---..
’
I
-9-
Lecture des résultats :
On peut employer deux modes de lecture :
- lecture 10 minutes après la lyse des témoins ("témoins sérum" et
"témoin antigène) on note la dilution la plus élevée du sérum dans
laquelle, en présence de l'antigène, l'hémolyse est nulle ou partiel-
le.
- lecture apxès 1 heure à 37*, dans ce cas également il est indispen-
Sable de vérifier que les témoins sont lysés et on note la dilution
la plus élevée du sérum ayant inhibé l'hémolyse en présence d'anti-
gène.
Pour aider à la lecture on fera une échelle d'hémolyse qui
servira à comparer les degrés divers de l'hémolyse obtenue dans les
tubes de la réaction.
ECHELLE DE L'HEMOLYSE
1 " - une suspension de globules rouges à 0,25 p.100
A
( 1 cm3 G.R. 2 p.100
( 7 cm3 eau physiologique
.
2" - une solution d'hémoglobine correspondant à la suspension de glo-
bules à O,25 p.100. On lyse les globules par addition d'eau dis-
‘U
tillée et on isotonise la solution dthémoglobine
par addition de
CLNa.
B
( 1 cm3 G.R. 2 p.100
( 6,3 cm3 eau distillée
( 0,7 cm3 CLNa 8,5 p.100
Dans une série de tubes à collerette, on prépare les mélan-
ges suivants :
a.=-=-=-=-=-=-=-=..
Z-=-=-E-=-=-
f-=-=.mz-=.m=r=r=r=.,
=-=-=r=-=-=-=-=-=-=-=-
!
!
! G.R. 0,25 p.100
A
! 1
0,75
0,50
0,25
0
!
!
! Hémoglobine
B
! 0
0,25
0,50
0975
1
!
!
f Hémolyse p.100
i 0
.
.
25
50
75
100
i
.
! Inhibition de I'hémolyse!
! p.100
! 100
75
50
25
0
!
!
! Notation
! +i-+
+++
-k-l-
+
!
!
!
!
-_-----------_-------------
-_-----_---_------I__c__________________~-
. . . / . . .
- 10 -
Les réactions sont lues en se basant sur l'échelle d'hé-
molyse et affectées d'une coefficient (++++> (+++) (+> (0) selon
l'intensité de l'hémolyse observée.
Est considéré dans cette réaction comme positif tout sé-
rum affecté de (++++) (-t++) (++> ou (+)
à la dilution de I/BO,ou
supérieure c'est à dire positif à (++++) (+-t+) (++) aux dilutions
précédentes (I/IO, 1/20,-1/40).
Est considére comme douteux tout sérum affecté de (++++)
(
. I. -
,
+++ ) (+> & la dilution de I/JO c'est à dire positif & (+-t++) c-t++)
b-4 aux dilutions précédentes (I/I0 - 1/20).
Une réaction positive :
- au taux de 1/80 est le signe d'une infection certaine.
- au taux de I/4O est le signe d'une infection possible.
- à un taux inférieur à I/4O n'a pas de signification valable.
Dans le cas d'un sérum positif à I/JO, il convient de fai-
re une nouvelle saignée à l'animal, si le taux minimum de I/4O est
retrouvé à nouveau, considérer le cas comme positif.
Généralement le pouvoir anticomplémentaire n'affecte pas
les sérums au delà de 1/20 et ne gène donc en rien la lecture de la
réadtion.
IV - LA SEROAGGLUTINATION SUR LAME
Cette réaction sérologique est effectuée avec un sérum
fraichement recueilli et peut donc être employée au moment de l'a-
chat des animaux il faut bien préciser qu'il ne slagit que d'un test
très grossier qui n'a de valeur que lorsqu'il est positif.
Un sérum qui agglutine la suspension de Nvcoplasma mycoï-
&s, var.. mswoïdes,
colorée est considéré comme positif et provient
d'un animal suspect ou infecté de péripneumonie bovine.
Le principe de la réaction est de mettre en présence sur
une plaque transparente (plaque plastique ou lame de verre) une gout-
te du sérum de l'animal et une goutte d'une suspension colorée de
Mycoplasma mycoïdes var mgcoïdes. Seules les réactions d'agglutina-
tion vraiment nettes sont considérées comme positives.
V - HEMAGGLUTINATION INDIRECTE
Cette réaction s'effectue sur le sérum. On met en présen-
ce une suspension d'hématies de mouton sensibilisées par Mycoplasma
mycoïdes, var mycoTdes et le sérum aux dilutions choisies.
. . . . / . . . .
- II -
On prépare d'abord les dilutions de sérum à I/I0 - 1/20 -
1140 - I/%O - I/I60 - I/320 - 1/6t$o - 1/X280.
On prépare ensuite la suspension d'hématies sensibilisées
à la dilution choisie comme étant la plus sensible. Les hématies sen-
sibilisées sont fournies par le laboratoire d'Alfort de l'Institut
d*Elevage et Médecine Vétérinaire des Pays Tropicaux sous forme d'hé-
maties sensibilisées formolées et lyophilisées.
11 convient de reconstituer le contenu de chaque ampoule
avec 2 mm1 d'eau distillée. Bien agiter pour ohtenir une suspension
homogène. Diluer cette suspension par addition de 98 mm1 d'eau phy-
siologique et bien agiter pour homogéneiser. Cette suspension est à
conserver au frigidaire à 4” si on ne
l'utilise pas immédiatement.
Pour la réaction d'hémagglutination disposer une série de
tubes de Kahn dans lesquels on distribue en série les dilutions du
sérum à raison de 0,4 mm1 par tube.
Après avcir bien homogéneisé la suspension d'hématies sen-
sibilisées à 1% la distribuer à raison de 0,4 mm1 par tube.
Agiter les tubes sur leur portoir, laisser reposer dans un
endroit frais et effectuer la lecture au moins 2 heures après (les
réactions sont encore plus lisibles le lendemain matin si le labora-
toire est suffisamment frais).
Il est bon de vérifier que les sérums n'ont pas d'anticorps
agglutinant normalement les globules rouges de mouton en faiaant pour
chaque sérum un "témoin hématies normales". Pour ce lttémointt on uti-
lise la dilution du sérum au I/I0 (0,4 mml) et une suspension à 1%
d'hcaaties normales de mouton (0,4 mnl), Il ne doit pas y avoir d'ag-
glutination dans ce tube.
La lecture est faite par appréciation du degre d'aggluti-
nation des globules rouges.
Pour être positive la réaction d'hémagglutination
doit être
très nette, les réactions douteuses ne sont pas considérées comme
positives (en cas de réactions douteuses il y a intérêt à recommen-
cer la réaction avec un nouveau prélèvement de sérum.)-
Un sérum positif à une dilution supérieur à 1/80 est le si-
gne d'une infection certaine ou presque certaine.
Les sérums positifs au I/IO, 1120 et 1140 peuvent être
considérés comme sans signification valable.
c
.*. / . . .
I
-
------.-
-~
.
.’
- 12 -
APPENDICES
Jo/ RECOLTE ET STOCKAGE DES HEiXATIES DE MOUTON
Le sang d'un mouton est récolté aseptiquement dans un vase
clos contenant une solution anticoagulante (solution Alsever modifiée).
Le flacon contient déjà un certain volume de solution conser-
vatrice, on lui ajoute un égal volume de sang (par exemple dans un fla-
con de 500 mml, à 250 mm1 de solution Alsever on ajoutera 250 mm1 de
sang de mouton).
On mélange la suspension en agitant modérément. Le stockage
des hématies se fait au réfrigérateur à 40-6" (jamais au congélateur).
Les hématies conservées de cette façon sont utilisables durant I5 jours
‘amais le liquide surnageant ne doit être coloré, cela signerait une
iitérioration
des hématies )
. .
Pour l'utilisation les hematies doivent être lavées. A cet
.
effet on prélève un certain volume du culot globulaire auquel on ajoute
de l'eau physiologique, on agite modérément pour mettre en suspension
puis on centrifuge à 3000 T/min, Pendant 10 minutes on élimine le liqui-
w
de surnageant qui doit être clair ou très peu coloré. On ajoute à nou-
veau de l'eau physiologique et on remet les globules en suspension avant
de les centrifuger à nouveau 10 minutes; nouvelle élimination du surna-
geant qui doit être limpide, nouveau lavage, nouvelle centrifugation.
Après élimination du surnageant liquide on obtient la "purée
globulaire" qui sera utilisée pour les réactions de déviation du complé-
ment et les témoins d'hémagglutination.
Formule de la solution Alsever modifiée (Cohen 1953)
glucose
20,5 gramme
Citrate Na
8
Il
Acide citrique
0755
"
Chlorure Na
4,2
"
Eau distillée
1000 mm1
Stériliser à l'autoclave 20 minutes. Vérifier ensuite le ppH
de la solution qui doit être de 6,r.
. . . / . . .
--
--
w
- 14 -
Les témoins négatifs devront être entierement hémolgsés, les
témoins positifs devront rester indemnes. La lecture de la réaction (3)
se fait comme pour la réaction de Kolmer selon une cotation (++++)(++I-)
(++> (4.
Un sérum positif sur les 4 tubes (non hémolysé aux I/I0 -
1120 - I/40 - 1/80) est le signe d'une infection certaine.
Un sérum positif sur les 3 premiers tubes (I/I0 - 1/20 - I/4O
est douteux" et doit être refait, l'animal étant l'objet d'une seconde
saignée. Du cas de ncuvclle réaction positive au I/40 tenir cet animal
pour suspect d'infection.
Un sérum positif sur les 2 premiers tubes n'a pas de signi-
fication importante.
Le tube ",témoin sérum" doit être hémolysé en totalité (il ne
contient pas d'antigène et au cas où un trouble subsisterait ge serait
le signe que le sérum possède un pouvoir anticomplementaire).
TJOTA (1) A un complément de titre 1/80 correspond une dilution de I/33e
pour 2,5 unités.
(2) A un sérum hémolytique de I/IO.OOOe correspond une dilution
de I/I400 pour 6 HD 50 $.
(3) Le repos des tubes pendant une nuit au frigidaire de 4” à 8O
rendra la lecture très aisée sans nuire à la réaction.
.
- 13 -
II - CONDITIONS DE CONSERVATION DES REACTIFS
Sont à conserver au frigidaire à faible température (4” à SO) :
Globules rouges de mouton en Alsever.
Sérum hémolytique ;
suspension antigènique pour déviation du complément.
suspension antigènique colorée pour agglutination,
Sont à conserver au congélateur h-15" - IS") :
Complément de cobaye lyophilisé
Antigène lyophilisé pour déviation du complément
Globules rouges de mouton sensibilisés lyophilisés.
Il faut noter qu'on ne doit pas conserver d'un jour à l'autre
les réactifs dilués, à l'exception de la suspension antigènique.
III - REACTION DE DEVIATION DU COiJPLEIvlENT SELON CAMPBELL ET TURNER
(test de dégrossissage sur 4 tubes)
Cette réaction est recommandée pour sa simplicité et a été
universellement reconnue (conférence de Muguga) comme test de référen-
ce en matière de Péripneumonie bovine.
rl
Prendre le sérum à analyser avec dilution I/IO, I/20, I/40r
1/80, les placer sur un portoir à réaction en y ajoutant un "témoin sé-
rum au I/IO" (pour étude du pouvoir anticomplémentaire).
1
Distribuer :
sérum à analyser . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
0,25
mm1
antigène (5 unités ) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
0,25
mal
complément (2,5 unités)
0~25 mm1
0)
.*.**.....*.*.*...
Agiter, mettre au bain-marie à 37” durant 30 minutes. Prépa-
rer les globules rouges sensibilisés pendant que la réaction est au
bain-marie. Ces globules rouges sensibilisés sont préparés en mélan-
.'
gement à parties égales globules rouges de mouton lavés et sérum hémo-
lytique (à la dilution choisie) et en laissant le mélange 30 minutes à
la température du laboratoire.,
Ajouter alors dans chaque tube de réaction =
sérum hémolytique (~HD. 50%) !
globules rouges de mouton à 6%): Oy2'
(2)
Agiter et mettre au bain-marie à 37” durant 30 minutes.
Pour chaque série de réactions ajouter un "témoin négatif"
aux 4 dilutions (I/I0 - 1/20 - I/4O - 1/80) et un ",témoin positif" aux
4 dilutions (I/I0 - 1120 - I/40 - 1/80).
f