Rev. Elev. Mkd. vbt. Pays trop., 1977, 30 (2) :...
Rev. Elev. Mkd. vbt. Pays trop., 1977, 30 (2) : 143-148.
Sérologie de la péripneumonie
UtilisaGon du matériel « Microtiter »
dans une microréaction de fixation du complément
selon la méthode de Kolmer
par M. P. DOUTRE (*) et B. TOURE (**)
R É S U M É
Le matériel « Microtiter » est employé dans la réalisation d’une micro-
réaction de fixation du complément. Les différents temps de la méthode font
l’objet d’une description détaillée.
Cette microtechnique, sensible et fidèle, très standardisée, d’exécution
rapide et aisée, permet de traiter un nombre important de sérums en utilisant
de petites quantités de réactifs. Son utilisation est néanmoins limitée au cadre
d’un laboratoire normalement équipé.
La sérologie de la péripneumonie bovine,
McPHERSON (6) et PERREAU (8) les em-
tout particulièrement en Australie et en Afrique
ploient dans une microréaction de FC selon
tropicale, a donné lieu à maints développe-
CAMPBELL et TURNER, ainsi que SCUDA-
ments au cours des récentes décennies. Les
MORE (12) qui utilise une microréaction de FC
méthodes présentées par de nombreux auteurs
à chaud nécessitant une centrifugation avant
ont toutes contribué à faciliter le diagnostic de la
lecture.
maladie et à mieux connaître la cinétique des
L’emploi du matériel « Microtiter » a connu
anticorps sériques ou le devenir des substances
ces dernières années une large diffusion en séro-
antigéniques élaborées pendant l’affection. Dans
logie virale et bactérienne, humaine ou animale
cet ensemble, la fixation du complément (FC)
(2, 3, 11). Le texte qui suit présente une tech-
demeure le test le plus communément pratiqué
nique de microréaction de FC à froid, dérivée
lorsqu’il est impératif de préciser l’extension
de la méthode classique de KOLMER, exécutée
d’un foyer, de suivre le déroulement d’une
avec ce matériel.
épreuve d’immunité, etc...
Les plaques en plexiglas type 0. M. S. (80 cu-
pules) ont été utilisées par PERREAU, dans
MATÉRIEL ET MÉTHODE
une réaction d’hémagglutination indirecte (7),
A. MATÉRIEL
par PROVOST en fixation du complément
selon CAMPBELL et TURNER (9, 10) et par
Les accessoires utilisés : microplaques, compte
KARST (5). Actuellement, les microplaques
gouttes (25 et 50 ul), adhésif, etc... sont désormais
(96 cupules) retiennent le choix. PEARSON et
classiques (*).
(*) Chef du Service de Bactériologie. Laboratoire
f*) Cooke Engineering Comuanv. Medical Research
national de YElevage et de Recherches vétérinaires
Division, 735 North Saint Asaph ‘Street, Alexandria,
(1. S. R. A.), B. P. 2057, Dakar Hann, Sénégal.
Virginia 22314. Représenté en France uar Polv-Labo.
(**) Technicien supérieur. Laboratoire National de
Paul Block et Cie, -305 route de Colmar, 67023 Strasi
I’Elevage et de Recherches Vétérinaires (1. S. R. A.).
bourg Cedex.
- 143 -
Deux doivent néanmoins être mentionnés :
Lorsque la suspension définitive d’hématies
- le manche pour micro-dilueurs « Multi »,
est obtenue, vérifier que :
- le micro-agitateur AM69 pour 4 plaques :
suspension définitive d’hématies : 0,I ml,
l’agitation manuelle dans un plan horizontal
solution NaJO,
: 4,8 ml.
étant insuffisante pour la bonne diffusion des
ont un pouvoir d’absorption de 135 & 5. Faire
réactifs et du couple hémolytique.
2 lectures.
Conservation au frigidaire de cette suspen-
Produits biologiques et réactifs
sion d’hématies.
- Sérums à analyser : sang recueilli le plus
stérilement possible pour diminuer le nombre de
B. MÉTHODE
sérums anticomplémentaires. Au laboratoire,
les sérums sont séparés par centrifugation.
La disposition des plaques de microtitration
- Tampon véronal-calcium-magnésium
est qualifiée : d’« horizontale » lorsque la lon-
gueur est placée de gauche à droite de l’opéra-
- Antigène : préparé selon la technique de
teur, de « verticale » lorsque la largeur occupe
CAMPBELL et TURNER (1). Le surnageant
cette situation.
d’un lot ancien est tout particulièrement recom-
mandé.
- Complément : lyophilisé ou frais, mais de
1) Titrage du système hémolytique
bon titre.
Le titrage d’un sérum hémolytique s’est révélé
- Sérum hémolytique de lapin anti-hématies
très difficile à réaliser en microtiter. Après diffé-
de mouton.
rents essais, le sérum hémolytique est employé à
- Hématies de mouton : le protocole suivant
la dilution de 1 p. 1 000 pour une suspension
est préconisé (4). Utiliser toujours la même
d’hématies de mouton présentant un pouvoir
brebis. Avec une séringue de 50 ml, contenant
d’absorption de 135 k 5. La sensibilisation
25 ml de solution d’AIsever, récolter stérile-
des hématies est effectuée en mélangeant à
ment 25 ml de sang ; mettre les 50 ml dans un
volumes égaux sérum hémolytique à 1 p. 1 000
ballon stérile. Attendre au moins 3 jours avant
et suspension d’hématies à 135 A 5 d’absorp-
d’utiliser les hématies, les laver alors 3 fois par
tion. Dans toutes les réactions le couple hémo-
centrifugations successives en tampon.
lytique est ajouté sous un volume de 25 pl.
On utilise dans la réaction une suspension à
environ 3 p. 100. Pour plus de précision, il est
2) Titrage du complément
recommandé de standardiser la suspension en
procédant aux opérations qui suivent :
Préparer sous le plus petit volume nécessaire
et suffisant (économie du réactif) une solution
- à partir de 5 ml de culot d’hématies, après
au 1/15, au 1/20 et au lj25 du complément.
lavage, préparer 50 ml de suspension d’hématies,
- utiliser le spectrophotomètre (au labora-
Dilution du complément
toire de Dakar : Beckman, mode1 25, U. S. A.) à
La plaque est tenue « verticale ».
540 mu de longueur d’onde, étalonner le 0 avec
- Partager la plaque en 3 zones en traçant
une solution de carbonate de sodium (Na,CO,)
au crayon feutre 2 lignes entre les rangées 4 et 5
au 1 p. 1 000,
et 8 et 9 (fig. 1).
- mesurer le pouvoir d’absorption :
- Distribuer 50 pl de tampon dans toutes les
suspension d’hématies : 0,l ml,
cupules, sauf celles de la rangée « verticale » H.
solution de Na,CO,
: 4,8 ml.
- Distribuer 50 pl de complément dans les
L’absorption finale doit être de 135 + 5.
2 premières rangées « verticales » H et G :
Le volume V de la suspension d’hématies à
au I/l5 dans les cupules GI à G4 et Hl à
préparer pour obtenir 135 est ainsi calculé :
H4,au lj20 dans les cupules G5 à G8 et H5 à H8.
absorption lue
v =
x volume de la suspension
au 1/25 dans les cupules G9 à GI2 et H9 à
135
à titrer.
H12,
- 144 -
H
G
F
E
D
C
B
A
12 3
415 6 7
81s:
10 11 12
00000000‘
00000000 12
00000000 ZONE1
3
*88B8888- 45
00000000 6
.
.
ZONE2
7
@ Nqn hemolyse .
8
‘///
8 Hemolyse partielle
Hemolyse totale
9
Fig. 2. - Titrage du complément.
10
00000000 ZONE3
11
Le titre du complément correspond à la
00000000
dilution maximale dans les 4 cupules où i’hé-
1 2
molyse est totale (ex. : titre au 1/80 : cupules
F5 à FS ; au l/lOO : F9 à F12 ; au 1/60 : Fl à
F4, etc...). On utilise, pour la réaction, le
Fig. 1. - Dilution du complément pour son titrage.
complément à 2 unités : Exemple : si le titre est
le 1/80, utiliser le 1/40.
- Diluer avec les microdilueurs de 50 ~1,
3) Titrage de l’antigène (fig. 3)
montés sur le manche, de la rangée G à la
La plaque est tenue de façon « horizontale ».
rangée A, en passant par les rangées « verti-
cales » intermédiaires F, E, D...A.
12345678910
11 12
Ainsi de gauche à droite, dans la zone 1, le
complément se trouve réparti à des dilutions
multiples du 1/15, sous un volume de 50 ~1, à
raison de 4 cupules pour chaque dilution ; dans
la zone 2, à des dilutions multiples du 1/20 ;
dans la zone 3, à des dilutions multiples du 1/25.
Titrage (fig. 2)
- Ajouter dans chaque cupule :
25 p1 de tampon,
25 ~1 d’antigène titré (1120, voir plus loin).
Fig. 3. - Titrage de l’antigène (voir texte).
- Recouvrir la plaque d’adhésif auto-collant.
- Placer quelques secondes sur le vibreur.
- Incuber 1 h à 37 “C au bain-marie.
Disposer d’un sérum étalon décomplémenté
de titre connu (ex. 1/640). Préparer la dilution
- Ajouter 25 l.d de système hémolytique par
au 115 de ce sérum.
cupule.
-
- Distribuer 25 ~1 de tampon dans toutes
Recouvrir la plaque d’adhésif au-collant.
les cupules, sauf celles de la rangée « verticale » 1.
- Placer quelques secondes sur le vibreur.
- Distribuer 25 pl de sérum étalon au 1/5
- Incuber 1 h à 37 “C au bain-marie.
dans les deux premières rangées « verticales »
- Lire 2 à 3 h après au miroir de lecture.
1 et 2.
- 145 -
- Diluer avec 8 microdilueurs de 25 ul, recherche des anticorps ne dépasse pas la dilu-
montés sur le manche, de la rangée « verticale »
tion du 1/160 (à moins que l’on accepte de
2 à la rangée 12, en passant par les rangées « ver-
placer des plaques bout à bout).
ticales » intermédiaires 3 à 12.
En effet, en péripneumonie bovine et dans les
Préparer 8 dilutions d’antigène situées de
conditions de récolte des prélèvements en brousse
part
et d’autre d’une dilution optimale,
il arrive souvent qu’un sérum, anti-complémen-
ex : 1/5, l/lO, 1/20...1/640.
taire aux basses dilutions, soit positif et non
- Répartir 25 ul par cupule de l’antigène au anticomplémentaire aux dilutions supérieures.
1/640 dans la rangée « horizontale » H ; 25 ul
a) Exécution de la réaction avec un seul témoin
par cupule de l’antigène au 1/320 dans la rangée
sérum (à la dilution du l/lO) (fig. 4).
« horizontale » G, etc... 25 ul par cupule de l’an-
tigène au 1/5 dans la rangée « horizontale » A,
-
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
Ajouter le complément à un titre moyen
(2 U) sous un volume de 50 ul par cupule.
- Recouvrir la plaque d’adhésif auto-col-
lant.
- Placer quelques secondes sur le vibreur.
- Incuber 1 h à 37 “C au bain-marie.
- Ajouter 25 ul de système hémolytique par
cupule etc... ; comme ci-dessus : adhésif, vi-
breur, incubation 1 h à 37 “C, lecture 2 à 3 h
plus tard.
Le titre de l’antigène correspond à la plus
Fig. 4. - Titrage de différents sérums avec témoin
forte dilution donnant le titre exact du sérum
sérum à la dilution du I/i0 (ligne A : sérum négatif).
étalon, sans hémolyse dans les premières cupules
de la rangée horizontale.
- Diluer les sérums au lj5 en tampon et
La figure 3 représente un titrage d’antigène
décomplémenter cette dilution (30 mn à 58-
réalisé comme ci-dessus. Les rangées A et B 60 “C).
révèlent un excès d’antigène, les rangées D, E,
- La plaque est tenue de façon « horizon-
F, G un manque croissant, avec hémolyse dans
tale » (les sérums sont supposés offrir un titre
les premières cupules. Le titre à retenir corres-
élevé, 7 sérums + 1 sérum positif de référence
pond à la ligne D, soit la dilution du 1/20. L’an-
sont étudiés par plaque, jusqu’à la dilution du
tigène utilisé à une dilution supérieure dans la
1/5 120 ; dans le cas contraire, la plaque peut
réalisation de la réaction entraînerait la forma-
être tenue « verticale » et permet de traiter
tion d’un faux phénomène de zone pour les basses
11 sérums + 1 sérum positif de référence, jusqu’à
dilutions du sérum. La courbe classique a été
la dilution du 1/320.
surimposée sur la figure. L’utilisation de dilu-
- Distribuer (à l’aide des compte-gouttes
tions plus serrées de l’antigène, trop proches
en plastique à usage unique), pour chaque
du 1/20, n’aurait pas permis la mise en évidence
sérum, 25 ul de la dilution au 1/5 dans la pre-
des différentes zones (excès, quantité optimale
mière cupule (ex. : Al), dans la seconde cupule
manque d’antigène).
(A2) et dans la dernière (A12) (témoin sérum
.
anticomplémentaire) d’une même rangée « hori-
4) Exécution de la réaction
zontale » ; le second sérum se place en Bl, B2,
B12, etc...
Deux solutions sont proposées :
- Ne pas oublier le ou les sérums de réfé-
- exécution de la réaction avec un seul témoin
rence.
sérum (à la dilution du l/lO). Dans ce cas, la
- Ajouter 25 ul de tampon dans chaque
recherche des anticorps se poursuit jusqu’à la
cupule, sauf celles de la rangée « verticale » 1.
dilution 1/5 120 ;
- Diluer avec 8 microdilueurs de 25 ul, mon-
- exécution de la réaction avec un témoin
tés sur manche, de la rangée « verticale » 2 à la
sérum pour chaque dilution. Dans cc cas, la
rangée 11, en passant par les rangées « verti-
- 146 -
cales » intermédiaires 3 à 11 (il est évident que
médiaires 5, 7,9. Rincer et sécher à la flamme les
si la plaque avait été tenue « verticale », 12 mi-
microdilueurs, puis effectuer une nouvelle série
crodilueurs auraient été employés, de la ran-
de dilutions de la rangée 4 à la rangée 12, en
gée « verticale » G à la rangée B, la rangée A passant par les rangées intermédiaires 6, 8, 10.
contenant les témoins sérum).
- Ajouter 25 ul d’antigène au titre choisi
- Ajouter 25 ul d’antigène titré (1/20) dans
dans toutes les cupules des rangées «verticales»
toutes les cupules, sauf celles de la dernière
impaires et 25 ul de tampon dans celles des
rangée « verticale » 12.
rangées paires.
- Distribuer 50 1.11 de complément au titre
Etc... La suite des manipulations comme
choisi (2U) dans toutes les cupules. Cette opé-
ci-dessus (a).
ration doit être faite en fin de journée ouvrable,
le complément libre risquant d’être détruit le
INTERPRÉTATION DES RÉSULTATS
lendemain matin, malgré la mise à + 4 Y!,
s’il a été réparti trop tôt.
L’interprétation des résultats est identique à
Etc... adhésif, vibreur, incubation une nuit à celle déjà connue de la fixation du complément
+ 4 “C, système hémolytique, adhésif, vibreur,
en tubes, selon KOLMER, à savoir : est consi-
incubation 30 mn au bain-marie à 37 “C, la
déré comme positif tout sérum + + + + au
lecture 2 à 3 h plus tard. Bien observer le com-
1/80, et douteux, tout sérum + + + + au 1/40.
portement des témoins sérums au l/lO (rangée
(( verticale » 12).
DISCUSSION
b) Exécution de la réaction avec un témoin sérum
Les avantages de la microréaction de fixation
pour chaque dilution (fig. 5).
du complément, dérivée de la méthode de KOL-
MER, sur la technique classique en tubes sont
12 3
4
5
6
7
8
9
10
Il 12
les suivants :
A
-000000000000‘
- Economie des réactifs utilisés. En péripneu-
B
@0eB0@0@0@000
monie bovine, ces derniers sont généralement
d’un prix de revient faible ; néanmoins dans les
pays tropicaux, le titre du complément lyophi-
D
lisé subit très souvent une forte chute pendant
E
le transport par voie aérienne (élévation de
température) en dépit des précautions prises,
G
aussi peut-on rechercher à économiser un
H
complément de haut titre.
- Rapidité d’exécution des manipulations,
Fig. 5. - Titrage de différents sérums avec témoin
grâce à la réalisation semi-automatique des
sérum pour chaque dilution (ligne A : sérum négatif).
dilutions par l’emploi des microdilueurs montés
sur manche, d’où possibilité de traiter en un
Dans ce cas, la plaque est tenue obligatoire-
temps minimal un nombre de sérums élevé.
ment « horizontale ».
L’exécution de la réaction, telle qu’elle vient
- Distribuer, pour chaque sérum, 25 1.11 de
d’être décrite, concerne des sérums titrés pour
la dilution au 1/5 dans les 4 premières cupules
un ensemble de dilutions croissantes, jusqu’à
d’une même rangée horizontale (ex. : Al, A2,
la limite de positivité et au-delà. Ce type de
A3, A4) ; le second sérum se place en BI , B2,
tirage est valable lorsque l’on tient à connaître
B3, B4, etc...
le taux d’anticorps au cours d’une expérimen-
- Ne pas oublier le ou les sérums de réfé-
tation. Lorsque l’on s’attache uniquement à
rence,
déceler la maladie dans un groupe d’animaux,
- Ajouter 25 ul de tampon dans chaque
les plaques peuvent être fractionnées selon la
cupule, sauf celles de la rangée « verticale » 1 et
volonté de l’opérateur et seules quelques dilu-
2.
tions bien déterminées (1/40, l/SO) peuvent
- Diluer avec 8 microdilueurs de 25 ~1,
être retenues.
montés sur manche, de la rangée « verticale »
Les manipulations sont faciles à réaliser et
3 à la rangée 11, en passant par les rangées inter-
un technicien ordinaire acquiert très rapidement
- 147 -
le « coup de main » que réclame le matériel
toute dessiccation possible. Le miroir grossis-
« microtiter » (micropipettes, microdilueurs, etc.).
sant rend la lecture facile avec un peu d’habitude.
L’utilisation des divers accessoires et leur entre-
tien obéissent à des règles strictes, annoncées
- La standardisation diminue les risques d’er-
par le fabricant, qui doivent être impérativement
reur et la méthode est sensible et fidèle.
respectées (microdilueurs).
Au chapitre des inconvénients, le coût du
Le complément titré doit être réparti en fin
matériel ne doit pas être retenu. L’amortisse-
de journée ouvrable, comme il a été dit ci-dessus.
ment étant assuré par la multiplicité des usages
Si cette condition est observée, un nombre
auxquels il se prête. Par contre, au passif, on
important de plaques peut être utilisé au cours
doit reconnaître que ce type de microréaction
de la même séance. La fixation à froid peut être
réclame, pour son exécution, le confort, le calme
réalisée dans un frigidaire ordinaire, avec
et l’équipement général d’un laboratoire, aussi ne
un encombrement minimal, ‘les plaques s’em-
peut-elle être accomplie sur le terrain. De même
pilant aisément les unes sur les autres grâce à doit-on noter la nécessité de disposer d’un com-
un système de tétons. La cellophane adhésive,
plément d’excellent titre, comme dans la réaction
qui obture de façon étanche les cupules, évite
classique de CAMPBELL et TURNER.
)” I
S U M M A R Y
Serology of contagious bovine pleuropneumonia
.
a Kolmer microtiter complement fixation test
« Microtiter )) system is employed in a complement fixation microtech-
nique. The various phases of the technical process are described in details.
This sensitive and constant microtechnique cari be easily performed and
allows serial serological diagnosis with saving of biological reagents. Its use
is restricted to a normally equipped laboratory.
RESUMEN
Serologia de la perineumonia.
Utilizacih del material « Microtiter » para una microreaccih
de fijacih del complemento seghn el mCtodo de Kolmer
Se utiliza el material « Microtiter » para realizar una microreaccion de
fijacion del complemento. Se describen en detalle las diferentes fases del método.
Dicha microtécnica, sensible y fiel, muy unificada, de ejecucibn rapida
y facil, permite el tratamiento de un gran nfimero de sueros a1 utilizar pequeiïas
cantidades de reactivos. Sin embargo, no puede ser utilizada mas que en un
laboratorio normalmente equipado.
BIBLIOGRAPHIE
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- 148 -
Sérologie de la péripneumonie
UtilisaGon du matériel « Microtiter »
dans une microréaction de fixation du complément
selon la méthode de Kolmer
par M. P. DOUTRE (*) et B. TOURE (**)
R É S U M É
Le matériel « Microtiter » est employé dans la réalisation d’une micro-
réaction de fixation du complément. Les différents temps de la méthode font
l’objet d’une description détaillée.
Cette microtechnique, sensible et fidèle, très standardisée, d’exécution
rapide et aisée, permet de traiter un nombre important de sérums en utilisant
de petites quantités de réactifs. Son utilisation est néanmoins limitée au cadre
d’un laboratoire normalement équipé.
La sérologie de la péripneumonie bovine,
McPHERSON (6) et PERREAU (8) les em-
tout particulièrement en Australie et en Afrique
ploient dans une microréaction de FC selon
tropicale, a donné lieu à maints développe-
CAMPBELL et TURNER, ainsi que SCUDA-
ments au cours des récentes décennies. Les
MORE (12) qui utilise une microréaction de FC
méthodes présentées par de nombreux auteurs
à chaud nécessitant une centrifugation avant
ont toutes contribué à faciliter le diagnostic de la
lecture.
maladie et à mieux connaître la cinétique des
L’emploi du matériel « Microtiter » a connu
anticorps sériques ou le devenir des substances
ces dernières années une large diffusion en séro-
antigéniques élaborées pendant l’affection. Dans
logie virale et bactérienne, humaine ou animale
cet ensemble, la fixation du complément (FC)
(2, 3, 11). Le texte qui suit présente une tech-
demeure le test le plus communément pratiqué
nique de microréaction de FC à froid, dérivée
lorsqu’il est impératif de préciser l’extension
de la méthode classique de KOLMER, exécutée
d’un foyer, de suivre le déroulement d’une
avec ce matériel.
épreuve d’immunité, etc...
Les plaques en plexiglas type 0. M. S. (80 cu-
pules) ont été utilisées par PERREAU, dans
MATÉRIEL ET MÉTHODE
une réaction d’hémagglutination indirecte (7),
A. MATÉRIEL
par PROVOST en fixation du complément
selon CAMPBELL et TURNER (9, 10) et par
Les accessoires utilisés : microplaques, compte
KARST (5). Actuellement, les microplaques
gouttes (25 et 50 ul), adhésif, etc... sont désormais
(96 cupules) retiennent le choix. PEARSON et
classiques (*).
(*) Chef du Service de Bactériologie. Laboratoire
f*) Cooke Engineering Comuanv. Medical Research
national de YElevage et de Recherches vétérinaires
Division, 735 North Saint Asaph ‘Street, Alexandria,
(1. S. R. A.), B. P. 2057, Dakar Hann, Sénégal.
Virginia 22314. Représenté en France uar Polv-Labo.
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- 143 -
Deux doivent néanmoins être mentionnés :
Lorsque la suspension définitive d’hématies
- le manche pour micro-dilueurs « Multi »,
est obtenue, vérifier que :
- le micro-agitateur AM69 pour 4 plaques :
suspension définitive d’hématies : 0,I ml,
l’agitation manuelle dans un plan horizontal
solution NaJO,
: 4,8 ml.
étant insuffisante pour la bonne diffusion des
ont un pouvoir d’absorption de 135 & 5. Faire
réactifs et du couple hémolytique.
2 lectures.
Conservation au frigidaire de cette suspen-
Produits biologiques et réactifs
sion d’hématies.
- Sérums à analyser : sang recueilli le plus
stérilement possible pour diminuer le nombre de
B. MÉTHODE
sérums anticomplémentaires. Au laboratoire,
les sérums sont séparés par centrifugation.
La disposition des plaques de microtitration
- Tampon véronal-calcium-magnésium
est qualifiée : d’« horizontale » lorsque la lon-
gueur est placée de gauche à droite de l’opéra-
- Antigène : préparé selon la technique de
teur, de « verticale » lorsque la largeur occupe
CAMPBELL et TURNER (1). Le surnageant
cette situation.
d’un lot ancien est tout particulièrement recom-
mandé.
- Complément : lyophilisé ou frais, mais de
1) Titrage du système hémolytique
bon titre.
Le titrage d’un sérum hémolytique s’est révélé
- Sérum hémolytique de lapin anti-hématies
très difficile à réaliser en microtiter. Après diffé-
de mouton.
rents essais, le sérum hémolytique est employé à
- Hématies de mouton : le protocole suivant
la dilution de 1 p. 1 000 pour une suspension
est préconisé (4). Utiliser toujours la même
d’hématies de mouton présentant un pouvoir
brebis. Avec une séringue de 50 ml, contenant
d’absorption de 135 k 5. La sensibilisation
25 ml de solution d’AIsever, récolter stérile-
des hématies est effectuée en mélangeant à
ment 25 ml de sang ; mettre les 50 ml dans un
volumes égaux sérum hémolytique à 1 p. 1 000
ballon stérile. Attendre au moins 3 jours avant
et suspension d’hématies à 135 A 5 d’absorp-
d’utiliser les hématies, les laver alors 3 fois par
tion. Dans toutes les réactions le couple hémo-
centrifugations successives en tampon.
lytique est ajouté sous un volume de 25 pl.
On utilise dans la réaction une suspension à
environ 3 p. 100. Pour plus de précision, il est
2) Titrage du complément
recommandé de standardiser la suspension en
procédant aux opérations qui suivent :
Préparer sous le plus petit volume nécessaire
et suffisant (économie du réactif) une solution
- à partir de 5 ml de culot d’hématies, après
au 1/15, au 1/20 et au lj25 du complément.
lavage, préparer 50 ml de suspension d’hématies,
- utiliser le spectrophotomètre (au labora-
Dilution du complément
toire de Dakar : Beckman, mode1 25, U. S. A.) à
La plaque est tenue « verticale ».
540 mu de longueur d’onde, étalonner le 0 avec
- Partager la plaque en 3 zones en traçant
une solution de carbonate de sodium (Na,CO,)
au crayon feutre 2 lignes entre les rangées 4 et 5
au 1 p. 1 000,
et 8 et 9 (fig. 1).
- mesurer le pouvoir d’absorption :
- Distribuer 50 pl de tampon dans toutes les
suspension d’hématies : 0,l ml,
cupules, sauf celles de la rangée « verticale » H.
solution de Na,CO,
: 4,8 ml.
- Distribuer 50 pl de complément dans les
L’absorption finale doit être de 135 + 5.
2 premières rangées « verticales » H et G :
Le volume V de la suspension d’hématies à
au I/l5 dans les cupules GI à G4 et Hl à
préparer pour obtenir 135 est ainsi calculé :
H4,au lj20 dans les cupules G5 à G8 et H5 à H8.
absorption lue
v =
x volume de la suspension
au 1/25 dans les cupules G9 à GI2 et H9 à
135
à titrer.
H12,
- 144 -
H
G
F
E
D
C
B
A
12 3
415 6 7
81s:
10 11 12
00000000‘
00000000 12
00000000 ZONE1
3
*88B8888- 45
00000000 6
.
.
ZONE2
7
@ Nqn hemolyse .
8
‘///
8 Hemolyse partielle
Hemolyse totale
9
Fig. 2. - Titrage du complément.
10
00000000 ZONE3
11
Le titre du complément correspond à la
00000000
dilution maximale dans les 4 cupules où i’hé-
1 2
molyse est totale (ex. : titre au 1/80 : cupules
F5 à FS ; au l/lOO : F9 à F12 ; au 1/60 : Fl à
F4, etc...). On utilise, pour la réaction, le
Fig. 1. - Dilution du complément pour son titrage.
complément à 2 unités : Exemple : si le titre est
le 1/80, utiliser le 1/40.
- Diluer avec les microdilueurs de 50 ~1,
3) Titrage de l’antigène (fig. 3)
montés sur le manche, de la rangée G à la
La plaque est tenue de façon « horizontale ».
rangée A, en passant par les rangées « verti-
cales » intermédiaires F, E, D...A.
12345678910
11 12
Ainsi de gauche à droite, dans la zone 1, le
complément se trouve réparti à des dilutions
multiples du 1/15, sous un volume de 50 ~1, à
raison de 4 cupules pour chaque dilution ; dans
la zone 2, à des dilutions multiples du 1/20 ;
dans la zone 3, à des dilutions multiples du 1/25.
Titrage (fig. 2)
- Ajouter dans chaque cupule :
25 p1 de tampon,
25 ~1 d’antigène titré (1120, voir plus loin).
Fig. 3. - Titrage de l’antigène (voir texte).
- Recouvrir la plaque d’adhésif auto-collant.
- Placer quelques secondes sur le vibreur.
- Incuber 1 h à 37 “C au bain-marie.
Disposer d’un sérum étalon décomplémenté
de titre connu (ex. 1/640). Préparer la dilution
- Ajouter 25 l.d de système hémolytique par
au 115 de ce sérum.
cupule.
-
- Distribuer 25 ~1 de tampon dans toutes
Recouvrir la plaque d’adhésif au-collant.
les cupules, sauf celles de la rangée « verticale » 1.
- Placer quelques secondes sur le vibreur.
- Distribuer 25 pl de sérum étalon au 1/5
- Incuber 1 h à 37 “C au bain-marie.
dans les deux premières rangées « verticales »
- Lire 2 à 3 h après au miroir de lecture.
1 et 2.
- 145 -
- Diluer avec 8 microdilueurs de 25 ul, recherche des anticorps ne dépasse pas la dilu-
montés sur le manche, de la rangée « verticale »
tion du 1/160 (à moins que l’on accepte de
2 à la rangée 12, en passant par les rangées « ver-
placer des plaques bout à bout).
ticales » intermédiaires 3 à 12.
En effet, en péripneumonie bovine et dans les
Préparer 8 dilutions d’antigène situées de
conditions de récolte des prélèvements en brousse
part
et d’autre d’une dilution optimale,
il arrive souvent qu’un sérum, anti-complémen-
ex : 1/5, l/lO, 1/20...1/640.
taire aux basses dilutions, soit positif et non
- Répartir 25 ul par cupule de l’antigène au anticomplémentaire aux dilutions supérieures.
1/640 dans la rangée « horizontale » H ; 25 ul
a) Exécution de la réaction avec un seul témoin
par cupule de l’antigène au 1/320 dans la rangée
sérum (à la dilution du l/lO) (fig. 4).
« horizontale » G, etc... 25 ul par cupule de l’an-
tigène au 1/5 dans la rangée « horizontale » A,
-
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
Ajouter le complément à un titre moyen
(2 U) sous un volume de 50 ul par cupule.
- Recouvrir la plaque d’adhésif auto-col-
lant.
- Placer quelques secondes sur le vibreur.
- Incuber 1 h à 37 “C au bain-marie.
- Ajouter 25 ul de système hémolytique par
cupule etc... ; comme ci-dessus : adhésif, vi-
breur, incubation 1 h à 37 “C, lecture 2 à 3 h
plus tard.
Le titre de l’antigène correspond à la plus
Fig. 4. - Titrage de différents sérums avec témoin
forte dilution donnant le titre exact du sérum
sérum à la dilution du I/i0 (ligne A : sérum négatif).
étalon, sans hémolyse dans les premières cupules
de la rangée horizontale.
- Diluer les sérums au lj5 en tampon et
La figure 3 représente un titrage d’antigène
décomplémenter cette dilution (30 mn à 58-
réalisé comme ci-dessus. Les rangées A et B 60 “C).
révèlent un excès d’antigène, les rangées D, E,
- La plaque est tenue de façon « horizon-
F, G un manque croissant, avec hémolyse dans
tale » (les sérums sont supposés offrir un titre
les premières cupules. Le titre à retenir corres-
élevé, 7 sérums + 1 sérum positif de référence
pond à la ligne D, soit la dilution du 1/20. L’an-
sont étudiés par plaque, jusqu’à la dilution du
tigène utilisé à une dilution supérieure dans la
1/5 120 ; dans le cas contraire, la plaque peut
réalisation de la réaction entraînerait la forma-
être tenue « verticale » et permet de traiter
tion d’un faux phénomène de zone pour les basses
11 sérums + 1 sérum positif de référence, jusqu’à
dilutions du sérum. La courbe classique a été
la dilution du 1/320.
surimposée sur la figure. L’utilisation de dilu-
- Distribuer (à l’aide des compte-gouttes
tions plus serrées de l’antigène, trop proches
en plastique à usage unique), pour chaque
du 1/20, n’aurait pas permis la mise en évidence
sérum, 25 ul de la dilution au 1/5 dans la pre-
des différentes zones (excès, quantité optimale
mière cupule (ex. : Al), dans la seconde cupule
manque d’antigène).
(A2) et dans la dernière (A12) (témoin sérum
.
anticomplémentaire) d’une même rangée « hori-
4) Exécution de la réaction
zontale » ; le second sérum se place en Bl, B2,
B12, etc...
Deux solutions sont proposées :
- Ne pas oublier le ou les sérums de réfé-
- exécution de la réaction avec un seul témoin
rence.
sérum (à la dilution du l/lO). Dans ce cas, la
- Ajouter 25 ul de tampon dans chaque
recherche des anticorps se poursuit jusqu’à la
cupule, sauf celles de la rangée « verticale » 1.
dilution 1/5 120 ;
- Diluer avec 8 microdilueurs de 25 ul, mon-
- exécution de la réaction avec un témoin
tés sur manche, de la rangée « verticale » 2 à la
sérum pour chaque dilution. Dans cc cas, la
rangée 11, en passant par les rangées « verti-
- 146 -
cales » intermédiaires 3 à 11 (il est évident que
médiaires 5, 7,9. Rincer et sécher à la flamme les
si la plaque avait été tenue « verticale », 12 mi-
microdilueurs, puis effectuer une nouvelle série
crodilueurs auraient été employés, de la ran-
de dilutions de la rangée 4 à la rangée 12, en
gée « verticale » G à la rangée B, la rangée A passant par les rangées intermédiaires 6, 8, 10.
contenant les témoins sérum).
- Ajouter 25 ul d’antigène au titre choisi
- Ajouter 25 ul d’antigène titré (1/20) dans
dans toutes les cupules des rangées «verticales»
toutes les cupules, sauf celles de la dernière
impaires et 25 ul de tampon dans celles des
rangée « verticale » 12.
rangées paires.
- Distribuer 50 1.11 de complément au titre
Etc... La suite des manipulations comme
choisi (2U) dans toutes les cupules. Cette opé-
ci-dessus (a).
ration doit être faite en fin de journée ouvrable,
le complément libre risquant d’être détruit le
INTERPRÉTATION DES RÉSULTATS
lendemain matin, malgré la mise à + 4 Y!,
s’il a été réparti trop tôt.
L’interprétation des résultats est identique à
Etc... adhésif, vibreur, incubation une nuit à celle déjà connue de la fixation du complément
+ 4 “C, système hémolytique, adhésif, vibreur,
en tubes, selon KOLMER, à savoir : est consi-
incubation 30 mn au bain-marie à 37 “C, la
déré comme positif tout sérum + + + + au
lecture 2 à 3 h plus tard. Bien observer le com-
1/80, et douteux, tout sérum + + + + au 1/40.
portement des témoins sérums au l/lO (rangée
(( verticale » 12).
DISCUSSION
b) Exécution de la réaction avec un témoin sérum
Les avantages de la microréaction de fixation
pour chaque dilution (fig. 5).
du complément, dérivée de la méthode de KOL-
MER, sur la technique classique en tubes sont
12 3
4
5
6
7
8
9
10
Il 12
les suivants :
A
-000000000000‘
- Economie des réactifs utilisés. En péripneu-
B
@0eB0@0@0@000
monie bovine, ces derniers sont généralement
d’un prix de revient faible ; néanmoins dans les
pays tropicaux, le titre du complément lyophi-
D
lisé subit très souvent une forte chute pendant
E
le transport par voie aérienne (élévation de
température) en dépit des précautions prises,
G
aussi peut-on rechercher à économiser un
H
complément de haut titre.
- Rapidité d’exécution des manipulations,
Fig. 5. - Titrage de différents sérums avec témoin
grâce à la réalisation semi-automatique des
sérum pour chaque dilution (ligne A : sérum négatif).
dilutions par l’emploi des microdilueurs montés
sur manche, d’où possibilité de traiter en un
Dans ce cas, la plaque est tenue obligatoire-
temps minimal un nombre de sérums élevé.
ment « horizontale ».
L’exécution de la réaction, telle qu’elle vient
- Distribuer, pour chaque sérum, 25 1.11 de
d’être décrite, concerne des sérums titrés pour
la dilution au 1/5 dans les 4 premières cupules
un ensemble de dilutions croissantes, jusqu’à
d’une même rangée horizontale (ex. : Al, A2,
la limite de positivité et au-delà. Ce type de
A3, A4) ; le second sérum se place en BI , B2,
tirage est valable lorsque l’on tient à connaître
B3, B4, etc...
le taux d’anticorps au cours d’une expérimen-
- Ne pas oublier le ou les sérums de réfé-
tation. Lorsque l’on s’attache uniquement à
rence,
déceler la maladie dans un groupe d’animaux,
- Ajouter 25 ul de tampon dans chaque
les plaques peuvent être fractionnées selon la
cupule, sauf celles de la rangée « verticale » 1 et
volonté de l’opérateur et seules quelques dilu-
2.
tions bien déterminées (1/40, l/SO) peuvent
- Diluer avec 8 microdilueurs de 25 ~1,
être retenues.
montés sur manche, de la rangée « verticale »
Les manipulations sont faciles à réaliser et
3 à la rangée 11, en passant par les rangées inter-
un technicien ordinaire acquiert très rapidement
- 147 -
le « coup de main » que réclame le matériel
toute dessiccation possible. Le miroir grossis-
« microtiter » (micropipettes, microdilueurs, etc.).
sant rend la lecture facile avec un peu d’habitude.
L’utilisation des divers accessoires et leur entre-
tien obéissent à des règles strictes, annoncées
- La standardisation diminue les risques d’er-
par le fabricant, qui doivent être impérativement
reur et la méthode est sensible et fidèle.
respectées (microdilueurs).
Au chapitre des inconvénients, le coût du
Le complément titré doit être réparti en fin
matériel ne doit pas être retenu. L’amortisse-
de journée ouvrable, comme il a été dit ci-dessus.
ment étant assuré par la multiplicité des usages
Si cette condition est observée, un nombre
auxquels il se prête. Par contre, au passif, on
important de plaques peut être utilisé au cours
doit reconnaître que ce type de microréaction
de la même séance. La fixation à froid peut être
réclame, pour son exécution, le confort, le calme
réalisée dans un frigidaire ordinaire, avec
et l’équipement général d’un laboratoire, aussi ne
un encombrement minimal, ‘les plaques s’em-
peut-elle être accomplie sur le terrain. De même
pilant aisément les unes sur les autres grâce à doit-on noter la nécessité de disposer d’un com-
un système de tétons. La cellophane adhésive,
plément d’excellent titre, comme dans la réaction
qui obture de façon étanche les cupules, évite
classique de CAMPBELL et TURNER.
)” I
S U M M A R Y
Serology of contagious bovine pleuropneumonia
.
a Kolmer microtiter complement fixation test
« Microtiter )) system is employed in a complement fixation microtech-
nique. The various phases of the technical process are described in details.
This sensitive and constant microtechnique cari be easily performed and
allows serial serological diagnosis with saving of biological reagents. Its use
is restricted to a normally equipped laboratory.
RESUMEN
Serologia de la perineumonia.
Utilizacih del material « Microtiter » para una microreaccih
de fijacih del complemento seghn el mCtodo de Kolmer
Se utiliza el material « Microtiter » para realizar una microreaccion de
fijacion del complemento. Se describen en detalle las diferentes fases del método.
Dicha microtécnica, sensible y fiel, muy unificada, de ejecucibn rapida
y facil, permite el tratamiento de un gran nfimero de sueros a1 utilizar pequeiïas
cantidades de reactivos. Sin embargo, no puede ser utilizada mas que en un
laboratorio normalmente equipado.
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- 148 -