REPUBLIQUE D1J SEN'KAL I$JSTJJJ.JT SWWS.DE ...
REPUBLIQUE D1J SEN'KAL
I$JSTJJJ.JT SWWS.DE RECHF+RCHES
AGRIC@LES (I.S,R-Afi)
-CI----.----
LABORATOIRE NATIONAL DE L%FVAG
ETDERECHERCHES -IRES
1 .;.
VACCIN CONTRE LES PASTEURELLOSES ANIMALES
UTILISATION PY L'APPAREIL DE STERNE DANS LA
PREPARATION D'UN VACCIN CONTRE LA SXPTICEMIE
HEMORRAGIQUE
._
“.
-
-
-
^
.-
Par FJ.Pm DOUTRE
L??&eur vétérinaire
mic?mbio~oFiste
Chef du Service de Ekt&iologie au
LNERV/ISRA
RES-'. N* 031/MICRC!!?XU
MAI 1983
corrrmt> tous les vaccins, ceux utilisés dans la prophylaxie médicale des pasteWel=
loses ar&mles doivent présenter un nombre minimm de germes dans le Cas p&Sent
z
tués- par dose vaccinale. Cette condition n'est satisfaite que si les cultures ob--
.F.
tenues sont ]suffisarranent riches, Pratiquement, il est admis qu'avant l'adjonction
-.
de l'aldéhyde formique, la culture doit pr+kentey une densité optique égale'au tube
no 10 de E&own. Dans le passé; ce r&ultat etait obtenu en ajoutant à une culture
ordinaire en bouillon, le produit de racla-eTpm billes de vm>de cultures sur
milieu solide (@ose au sang en boîtes de Roux). D&ormis, l'utilisation des
fementeurs permet d'obteni$, en milieu liquide, des cultures extrêmement denses
quppeuvent @tre mmn&es à la densité optique de 10 avant la r$m.-titi.on en wu-
les OU en flacons. La richesse en gems des cultures en fqnteurs est due :
- à lPutilisation de digest& de pakréas dans le milieu (apport d',acidesnucl~iques),J
- à .une aération constante,
- à 19apport r&iLier de J@&J neuf au mment où la culture est en phase de crois-.
sarice 1ogarithTnio.w.
Lvappareii de Sterne peut ê& &nsidé& corne un fermenteur dépourvu de régulatT.on
thermique (37OC) placé dans une chambre étuve. Fobuste, il est particulikment adap-
té aux conditions de travail. qui p&val.ent dans les p%ys tropicaux. S$conception
&ulte de mises au point r&l&&es par S?T;RNE, en Afrique du Sud,et par ETAIN, en
Fxt&m Orient. A l'IEMvT, c'est essentiellement PEPRMJ qui adapta lvapparei.l au;c
possibilités d'éouipemnt et qui lpintmduisit au Laboratoire de Parch.a (Tchad). Au
kkoYY%toke de Dakar, son utilisation date de 1965, elle a pemnis la pdt-&ion de
millions de doses de vaccins antipasteurelkiques de types divers, destines aussi
bien 2. l!Afrique tropicale qu'à l'Asie. Le tableau qui suit mp*lle h &m-tior,
des différents types de CSIRTER de Pasteurella m.ïltocida en pathologie hmjne et
--
swtout vétérinaire.
-2
CLMSIFICATIOFT SEROLOGIQUE A(JTUEUE DE PA.- mTocm
:
eype~
"capsulaires's)
:
i
Essenti+eme~n:'
E
Septicémie h&rr@que des ti
-
., et des kuffles d'kie, du Proche-Orient-
I 'p.& : d tac,&
et de l'Af%ique orientale, des'bisons
raniquedans
t
d,'Am&ique.
/-
capsyle . .
. . . i..,...
Fxclusivement
.?.
-
-"'
Septi~~~e-heiq,ue des:b&ins
.i,
d'Afrique occidentale et centrale.
. .
Très
ubiquiste
-v-e
Norritxyux typqs Cou sous-gr~upqs)
prdxibles.
:
- Pasteureilose de 1'HOmne
1. En quanti-@ toujo~s - Pastemllose bovine -:.
&ide~hyalurcnique
+tiaate
- Pasteurellose des ,petits ht::
capsulairu! v..
- Pasteurellose porcine
TYPe _R 0 0 0
- Pasteurellose du lapin
- Pasteurellose des oiseaux.
2, En quanti-6 variable NUbiquiste, cors& pour ie &$A
ombreux types (ou salis-FpeS) pro-
"
%eD.,,
iba'bles.
Y_._
:
Tout vaccin préparé à partir de Pasteurella haers9ytica peut épalement faire appel
w-.
à lFappareil de Sterne pou~~l~ob-tention d'une culture dense,
,.
Dans les limes q.ui suivent~ l*emploi de l'appareil de Steme: dans la préparation
d'un vaccin contre la septi&nie h6mrragique- sera décrit.en détail, nais tout
type de Pasteurella rrultczida. autre que. le typeF, pourrait. %tre utilisé dans la
.-'
pr@ation de vaccins destinés par exezle, aw petits ruminants (types A et D>:~U
.
volaill& (jzype A), etc...
:
..,:‘
., :. .
.
; :,
1 - DESCRXPTIO?? DE L'APPAREIL -'
Il est essentiellement constitu6 par une colonne de verre Pyrex (Verrerie g&érale :
39 me des Clo~s, Paris) (longueur : 89 cm ; diam&re int6rieur : 15 cm ; &a.isseur
dt.lveyTe: 8 m), obtkrée aux deux e&r&..i.t&z par 2 cownnes m&alliques par l'in--- 1
t&iaire d'un joint caoutchout6 épais (1 cm). LTensemble est maintenu par 5 ti,,es4
filetées aux extrémités narnies dFécrous papillons(sch&a A),
.
*
Dans l'espace libre de la couronne, le joint sup&ieur est percé de 3 orifices :
'-
s- l'un (a) par oii est introduit lvinoculum et le milieu, primitif puis renouvelé,
0..
/
.,D
,
c
c
f
f
c
-.. 5
- un second (b) qui se* à la. fois à l'admission dvantimusse et à ~'&XXELtiOn
.&z
ltair,
<"
. h' m misi&&(c'> $&& également la &&ie de Ifair et le yz&acemnt de ,.ia)
1
en &s de rup&&'de ce'derniw.
; +-.. .!'
LR joint inférieur comgxzte é@emnt deux ~~~~HIUTCYSS
:
.r.
,.<<.j
/ . . . . . . " >y
,,,"^ .-.. -.- .
s
- ~%XE servant à l'arrivée d'air stérile (d),
; ../
- ltautre Ce) à la ré@te de la culture,
<Y
:, .
a) Ltintrcduction'de 1'inoculum et du &lieu s'effectue par l'inter&di&e d-Sy
<-
"". tubé en rlmdorsil~ i0 int&ieur 8 m, tisistance à lVautoclavage) pén$&ant,dans
.:: la colonne cgrâc& à un tube de vexe de 8 mn (0 extgrieur), 19ext&mité distale
:
du tube souple porte un tube de jofiction rodé Quickfit femelle (87/16) qui per-
met tous.les branchermtnts (inoculum et milieu),
.b) celle de l'antimusse (pr&lablemmt horr@néi&
et stérilisé à l'autoclave
j" en tubes à essai de 18 mn à 1lOOC pendantli mn ; volume par.tube à essai, :, 1Ooc)
; .J
est effectuée par une allonge à Dlasm (f) et un tube en rhcdorsil identique
au precédent, p+%&mant dans la colonne de vem>e ~~~,l'inte&iai.re d'un ~y-
CEW de canne de verre (lonpueur environ 12 cc, 0 ez&$&ur : Smn), .'
c) identique à (a),assure la sortie de l'air et le remplacement de (a) en cas de
rupture, la culture pcwant ainsi être prolongée.
.
.
.
”
Diffuseur d'air (d) et tube de récolte (e) sont mntés suivmt le schém:A.:
,. i i
Aémtion : l'air.est foumii * ti compresseur (petit compresseur Prolaboou inieux
co~resseur EournisSant l'ai@ cotirimk. dans l'&semble du laboratoire): Il-est
<.
st&ilisé par filtration (mmbrane ES 1) wr passage à travers un fil- +itz
de 100 cm3 (a) (ce filtre est tiintenu ?ar une pince à 4 do&ts solidaire d'une
:
noix hxée sur une des S'ti~es qui assure la co&ion colonne de veme: joints
et couronnes) et p&êtm dans le milieu sous forme de fines Isulles'qui 'se d&ga-
gent du diffuseur d'air (h) (S&&E A). TJne pince cl- (j,)3,placée enWe le dif-
~fiisew'd'air et le filtre de 100 ch ?
_ 0.b ,.,
permet 'à volon& de suspendre l'a&tion
I
*
(G%î.tànt le r&&lemnt:de la'culy&& au m&ent de la &colte .et l'hynidification
,,.'Yle la. iimr&mnti EKS '!I)i de T&E', une' au&% pince'~clamp (k) est placée, &m .le..$ybe
de vidange pendant le cours de la cultme, l'etimité en verre plonge alors dans
le fc&ml.
..e / . . .
-6
.
:.
..’
:
Fixation de"l'appareil : la colonne est ftiéezur un chassis-supp* (schG$m B) en
CO?T~&~ Dixon. Ce c,hassis mvible permet: la disrmiti~n verticale .de.lFappareil
.
dans-2 &&mbrk &uv~ & akçure une km-me ~mtecl&n de l'mse@le au ckxrs des ç)$- =
."
"
nations de trans~rt et de stkilisation à 19aut&&we.
II - STERILISATION DE L'APPmEIL“
L
_--
Contenant environ ri5 ml d'eau distillge?.'lti
Cok&e et ses accessoires sotit st&i.-
lisés à l'autoclave (45 mn 2 120°C) dans 1'Êtat où ils sont reb&senkés & le sché-
mi A,(f) est obturé par un bouchm coton-gaze recouvert de papi+ et,ficelé (après
_. >:
&&l&&tion 1: panier est remplacé r/ar du papier d,9alm$niuv dont l'épaisseur
.,..'. t
.<
., -
est qWlrkpk& ,m plia,&?), (a> et ($1 ch&& par un tube à essai de 22.m e$ un
I,
.
Cototi. La.piGe' &k'k&-rtenue en position ouverte.
.
..<,.
.
ks tubes de jonction mdés f&ll@(a) et cc), l'allonge à plasma (f), le tube de
vidange (e) sont r@attus et kbilisés à l'aide de ficelles sur la colo-, &Ten-
s'emble p&&able&nt fixé sur le chassis-support (schém B) à-l'aide de fil de fw
:.
.est disposé hxizontal&n~ dans 19a$mlave (autoclave hxxîzont~~.
;.
I
I
I
- C&RXITIOIkZtERILISATIONW.MILIEu
--..
'.
Le milieu utilisé off& la coqsition suivante :
Pour 10 litres d'eau portée à 6O*C (dissolution des cents et fil-tmtiti plus
mpide) :
I
- extmit de viande Liebic .,.~D~~e.CDC~.D.............*.*.~*.*,~.~~.
90 Fr
- Bacto peptotie,Di'fco'
Cc‘u peptone GquTvalentè)
. . . . . . . . . ..00...C.O..
'100 t?
-chlmde sodium . .
..la....*.e...0.a..................0."..*.....
i
:'.'
50. -5
.
- ckgektat ~~Tni.q~e de &créas *..*a.* .,.............
l ..*5- . . . . .
1.250
a.*:. .‘
m-l'
:.
.
- gluccjse
D...................~~~~~~~~.~...*........~.*.~....~~.~...'
:.
-2o.g
,'
' - lacta?ie de soude
35.ml
,,.. ..: "
. . . . . . . . . ..a e * .- 0.0 *c o.............*...e..~.c 0 0 v..
'= phoSpha*e mmc&dique
. .
..***~c.~."OP~~....~...~..~"..*...*.ee..*...
-. ',
< )
,
;3pq
.. i :.
Le pH est.zjus?$ à 7,s -e 7,8.
:
:
., z.1
,‘. :.
\\
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‘:.
h @&ilis&ion $%fecke par filtrafion sur f,ii& Se$tz de $0 1i.Ws ~x>urvu
-
.
:
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, :
~i~~~Mb~~ &'I. =Afin de faciliter cett~~,opkr~t~o~,, il y a i.nté&t 3 pm$dep : -
il
a un& ckx&fic&ion r>&lable sur un ax.&e '&tre &itz de‘10 litres,& d'une
,
. .
. .
: :
menb7mieAS.
-
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.. .
:,
.,t.t/*...
-
-7
a) Préparation du dipestat ~~pa?nique de panc&as :
ru-l-ù...-
400 g de panc&as~ de'.boeti, recu&Lli à l'abattoir, dCgmissé et haché, sont
niélan& à 1.500':inl'id'eau:di~tillée portée à SOOC, en prkence de 5 g& pah
@ne. Enune heure, la tq&ati est élevée à 70°C ~bain-mie). La dilrestion
est alors ar&tée en aumntant la-k~~@mture à 86O en quelques minutes. LE pro-
. .
..,'.
,..
duit de,la digestion est recueilli apr& filtration sur papier. Ce'd&estat acide
peut être conseAmg à -2OOC.
L'obtention de digestat papabique de pancréas est à la fois facile et rapide.
L'autodilres-tat
originel de Sterneh nécessitant des opémtions beaucoup plus lon-
I.'.
._ '.
gues, a été, abandonné.
b) Détails de la st&ilisation pa$ filtration du milieu.
.-
-1-
-'
:
Le milieu fil& est recueilli dans des flacons de Woolf de 10 litres.dont la
tu~lure inf&iewx a été éti&e (travail du verre dans un atelier spécialis6) D
Sur cette tubn&ure est ada& un tube .souTrle en rhodorsil, mni d'une pince
c;la3lrl?, et termine ir un tube de jonction tii: Ouickfit @le (schém CI..'
'. Lge&ouchuye sup&ieure du flacon po&e un,tube de jonction à rodage r-mm&&
,
feklle Sovirel (schém CI (14/23) qui peut, sous la flm, se raccorde? à
.-
: ;.-;
l',elémnt &le (14/23! corresgmdant porté JFZ le filtre de 10 litres (schéma
Cl *
Flacons de Golf vides et filtres Seitz de 10 litres, pourvus d?ine rmmbrsne
EKS 1, sont stér~isés à l'autoclave (45 mn > 12OOC).
Au laboratoire de Dakar, la p¶tion d'un lot de vaccin contre la septicé-
mie ti-mmagique met en jeu deux appareils de Sterne fonctionnant simJ.tan&
. . :
kmt et approvisionnés journellement par 100 litres (10 flacons de Woolf) de
milieu fil& et préalablement éprouvé pendant 24 heures.
...
.i
.’
‘,:A’
IV - PREIPARATIOM DE L'INOCULtM
I’
._.
.
. .;
a) Choix et entretien des souches
_.
:
I
-"
:
D*
Le clmix de ik'souche de Pastemella mltocida àtiiser est avant tout imposé
: :
"
pa?? l'affection que l'on se -proPose de combattre et l'espèce animale kn cause
(voir tableau en introduction : classification &rologique actueiie'di! P. ml-
tocida). C'est Asi auelie t3pe E doit être obli~a-&&&&nt employé d&s la
8.
/
. . . . . .
..z.
8
Y ’
L ’
.
,.
pr@re.tion du vaccin cont+.la septic&& h&rtm&ique du C&&e et~de"lsOues5
,,, i africain 5 les types A et.D pour lutter ~ontrela pasteurellose des petits rmi- i
: I
I33.n~s.y qtcw e- '
"
:
.:..
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.,
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I ..,.'. ,.
y.
,'
'.",
.
'hz& sckhes sorït'? consemer lyo17hilisÉes3 en'&itant rigomusement lespassa-
,i
3
1'
I
= %
.<
geS 'in&Lés s& miliewc'atiificiels.
Ii 'est p&f&able de lyophilisex,;.
- soit du Sand virulentfj r&olté st&ilemnt sur un bouvillon mu&nt de la rm-
,;,. . TJ&-je,&g-j&&yff-z&
';
'.
'.'
.'
,. .,
. '.
:
'/
-'- soit une culture iridescente sti @ose tryptose-s&um recoltée en eau pep-
tonée et diluée au 1/3 dans du s&um de boeuf.
ks souches de P. mltoci&; utilisées d&ns la préparation des vacc&&, dei-vk.n?
~er.~,g$&....
'.'
b) L9inmiLm ': au lakoratoke de Dakcïr, l'in%ulum est contem dans un Erien-Keyer
de.2 litres à la .base'duquel a C?té soudée une tubulure d*erwi.mn 6 un (travail
du verre dans un atelier spéciali&). Comte pur les f3.accns de Woolf de 10 lis=
'te&, cette tubulure se kpmmuit e,un tube souple de rhxkxsil, terminé par un
t& de jonction rm!lG Quickfit'rr$le (voir schéma E). Une pince clamp est placée
&r le tube souple.'Dans le passé, des flacons de Kitas& ont étg utilisés, mis
la tubulure, 4acee près du goulot, offre un désavantage Crisaue de millage
du.~ton).
,.
.
:
:
Chaque Erlen-Meyer contient au moins 1 litre de milieu fil& et inixduit selon
le procédé &crit.,pr&édemnent (I1I.b).
:
.' Lti&c&m est utilisé 6 a '8' heur& après son ens~ncement avec environ 60 ml
. . .
'de &ul-&& en tubes (6 tub&).
"'
.
'.J'<
:' :
a) Pkpation de l'appareil autoclavé
. - -
.
L'appareil, sorti de l'autoclave, est placii en position verticale dans,la chambre.
.I
'étuve'et fi.%. Vke série"d90p$.Stiotis est alors.effecQGe :
i _
-
.‘._
- reserragides écvs.papillons, :.
'.
/..
._.
2-
.,. '- fixation de li,&ivGe dPair com&&$4 sur le.fil~.de:.dOQ cm3 (RI,: :..‘
.:
. . . / . . .
-9
(a) est déga&, cc) et (1) fixés,sup&ieurement en psition verticale,
(e) est introduit dans un tube de formol fixe inférieurement en position
verticale,
Cj) et (k) sont ferfn&.
..:.
.La chambre étuve doit être ~urvue d'un bec bunsen alimenté en gaz.
m
b) Intrcduction de lvineculum et d6but de la culture
L'inoculum est vers6 dans la colonne gr@ce auhranchement des tubes de jonction
rodes Quickfit, r@le .@rlen Meyer de 1*inocu1um) femelle (a) (de Ivap~il),
effectué sous la flamme. Puis? après déconnection de 1'Erlen Meyer, 2 litres de
milieu sont alors introduits, toujours gr%ce au branchement sous la flamme des
tubes de jonction ~O%S Ouickfit &le (flacon de Woolf)-fem&le (a) (de l'an-
pareil), Les 2 litres écoulés, la pince clamp Situ&e en curant du tube de jonc-
tion rodé Quickfit. file est ferm6e (schena C). Le milieu situé au niveau du
branchement des tubes de jonction Quickfit est de préférence emulsé dans la co-
lonne far nressionsur les tubes souples.
."-
2 litres de milieu et 1 litre d'iwculum sont alors pr&ents dans l'appareil.
Après 3 heures de culture non a&%e, 2 à 3 ml d'antimousse sont alorsintroduits
sous la flwne~ par l'allonge à plasr~~ (f) et l'aératien est mise en route. 3
heures plus tard, on laisse les 8 litres de milieu restant dans le flacon de
Nx&f s'écouler dans l'appareil.
Cette mise en route, par Gtapes
de la cultw-e assure une densité~optiaue n-axi-
mm, le mpprt Ynoculwn" - milieu neuf Stan-t toujours pand.
c) Première r&olte et r&oltes ult&ieures __
La marche de la culture peut être suivie en effectuant des p&lèvents stérile-
ment par le tube de vidange ce). Après chacune de ces onérations, le tube doit
être 3&introduit dans le form9.'
Au bout de 6 heures, la culture a atteint son développement ti. La
récolte
- est alors effectuee..
+I"
Sur le ciwuit air, la pince clamp a vis Cj) est fede. Le tube de vidange est
inWoduit dans un ballon de 10 litres st&ile, la flamme du bclc bunsen estmain-
e.. / . . . y
”
tenue au voisinage du Eroulot, la pince clamp (k> est alors ouverte et la culture
-
"S v:&Oule'v D 1he color&ion'de Gram perywt de v&ifier que la r6colte n'est Tas
F
~contarninéé I
I
.',
c .
lorsque l'app~zeil ne contient qlus qu'un litre de culture, la pince (k) est ferrr&^ *:
Ce velums restant petittra 1'ensemencE-t dti~l'ap$%t ~tiuve&de milieu neuf.
- L
La r&olte est for-wl6.e irr$diaterwnt (4 p.1000) "
"
'-
'
l
7
,<::...
*'
.,
Lu milieu 'neuf Cst de'nouveau introduit dans l'apparzil. 10 rCL dPant~usse~st~ril&
sont amen& pcir l'allon~ey et la serie des op&ations pr&demn?ent d&r,ites est ré-
@tee dans le'n&w ordre chrorxolo~ique.
.-
<
;. : :-
,
VI - RESULTATS
-.
Par cette r&hode, une culture offrant une opacitÊ su@ieure 2 20 est courazxnen-t
obtenue, 10 litres de <ura permettent donc de fabriquer 20 litres de vaccin. Le
vaccin forx~lé est adjuvé par l'alun de potassium. A cette fin: une solution d'alun
de potassium st&ile Cautoclavage) est ajout& de telle sorte que le titre final en
alunsoit de 10 n.lc>OO,
..,
:
Le conditionnement est effectu6 soit en ampoules de 20 ml CDakar?4soit en flacons
de 250 ml (Pawcha). Id dose &ccinnle'est de 2 ml0
,
-:
LT.
.
'c,rII - co?lTRoLEs
-
A effectuer sur la: suspension vaccinale finale avant l!adjonction dPalun.
. . .
_'
a> Stérilité
<I !
-
ee ense?ncer en bouillon ordinaires en lwuillon viande-foie ana&obie, sur @ose
'. :..- .'
trygtose. Ohservation pendant 3 2 4 jours.
.
.,i.-
.,
:
.:b) &-ln(-yuité
.
. .
‘;:
,’
Inoculer 2 cc sous la wau d'un lapin qui sera irils en observation pendant une
saine.
I
t
_I
.n*/r..
!
.d-+d-. .-.-- ..,&.“.A,.-
._,.^ ---.iir ---,_-.,- A--- ---- c ---- ^-..*
---
-% Remarques
. .
: Les principales causes de contamination de lpappareil de St~e.sont~les sui-
vantes : %xxulum souil16C, milieu neuf souillé, manque dgantimousse, la culture a refoulé
par les orifices sup&ieurs,
contamination au niveau du ,branchement .tubes de, jonction X-Q*='
dé 3&le:femelle. Pour M-ter ce derni& Cas, il est recomrran8% d"une '@rt d'ess@?er 2
l?aide d'un& :gaze liél&ment &l.e avant tout~Lxw&ement nouveau et de la nasser ensuite
Mdiamnt %'.la flti, di&tre nart de remplacer tidiaterrent tout flacon Woolf vide :*
par un autre plein de milieu, mais dont bien sûr la pince clamp est .mintenue en position
fer&e. Ainsi la zone de branchement pr&ente une absence totale de milieu: une pince clamp
placée en aval peut d'ailleurs accmître la sécurit6.
- 11
c) lilmunité
- Si l'on souhaite effectuer des tests dPixmunit6 pour pouvoir contrôler le ~TU-
.,.
vair tiellement protecteur du vaccin, il est indispensable d'utiliser des bc-
vins. A signaler tue le cobaye est un animal à proscrire absolument de toute
expérimentation en matiGre de septicémie h&xragique, même pour procéder à
de s.in-@es passaqes de souches.
- Les bwins utilisés doivent être tri& sérnlo&uement pour éliminer les animwx
~XTTW-IS naturellement, ce sui évitera de voir survivre un certain nombre de t&
moins non vaccin&. LES tests les plus Précieux pour ce dépistage sont le titra-
ge du pxwoir protecteur pur la souris , la fixation du complément et l'ag~lu-
tination de cultures sur $lose @AINY R,V.S. : F&it. v6t. J, 0 1955, III : 5'1?.
5181, enfin il convient d'ajouter l'h&a&utination de globules rouges hum=.ins
du groupe 0 (Cm, G.R. : 1955 ; PElWAU, P. : 19611, Tous ces tests &cessitent un
personnel qualifié, un mat&iel suffisantg un laboratoire adapté,
-., La souche d'$reuve doit etre choisie une fois pour toutes et sera seule utili-
sée, on lui Gvitera au maximnxn les passapes sur milieux artificiels. Le titrage
du pouvoir pathogène doit être egalement &tabli d'une manière définitive et
pur cela, on peut partir de la base suivante : 1 ml d'une dilution au l/îO@O
d'une h&roculture de 15 à 18 heures de la souche d'épreuve peut être consid&é
CO~TE la dese Q&rement motielle pour un bouvillon sensible de 70 2 100 kg. Il
est possible que l'on enregistre des diff&nces tenant aux races bovines con--
sidérées. Cette dose sûrement mortelle (DSM) a été estimée assez largement, il
est possible (et il est bon de le vérifier) que la DSM Aelle varie selon les
régions.;
Le liquide utilisé comme diluant pr&ente une grande importance. Le s&um phy-
siologique est mal supwrté par les Pasteurella et mieux vaut utiliser de l'eau
--
peptonge stérile.
- Le protocole d'expgrience est &s simple. Il est identique à celui appliqué
pour le charbon sympton-atique,
.
7
6es résultats des tests d'imrilunitg ne deviennent t&s nets qu'au rrs>ment C-G l'on
1
dispose d'un lot &rolo&uement homogène d'animaux de sensibilité uniforme, ce
qui est souvent -très difficile à obtenir, Les résultats favorables fournis par
- 12
l'utilisation du vaccin dans les tmu~ux &i s&iss3it~dans le passé,la septic35mi.e
h&mmagic&e constituent sans doute'le meilleur cribkre dont m &?pse pur juger
de la qu;ititE du vaccin (exmle de la PASTO~ dans l'Ada&&aj,Cammunj.
'.
I'
"
.
"
- 13
A N N E X E
LISTE DU @TERIE& UTILISE
*
- Canne de verre de 8 mn de 0j
a
- Tlbhes à essais de 0 18:
- Tubes à essais de 0 22,
- Erlen-Meyer de 2 litres (pourvu d'un tub SOU~~ à la base, atelier spécinl_isé
dans travail du verre),
- Flacons de Woolf de 10 litres (dont l'ouverture im%rieure est é-tir&, atelier
spkialisé dans travail du vernie),
- Flacons de 10 litres,
- Filtres Seitz de 10 li-trm, membranes EKS 1 et AS co'rrespcndantes,
- Pinces cl* de 6 CT.,
- Filtres Seitz de 100 crn3, rtembranes EKS 1 ccrrespcndantes,
- Piffùseur d'air (SOVIREL)T
- Tubes de jonction rodés 1~3les et femelles QUICKFXT (87/16),
-1 Tubes de jonction rodés rrt%les et femelles SOVIREL (14/23),
- Tubes souples rbdcrsil r6sistant aux conditions de stérilisation (0 intérieur 81x&?
- Filtm papier,
- Antimussc (Silicme, phcdorsil) @ROLABO>,
- Pinces à 4 doigts, noix de fixation,
- Corni&wDIXON,
- Fil de fer, ficelle, coton cardé, gaze, papier Kmft, etc...
- Bact&?iologi.ste en état de marche*
PASTEURELLP MULTOCIDR
En pratique, trois principaux types de colon&23 peuvent
être distingués sur milieu solide à l'aide du stér6omicrog&@e en
lumière transmise obliquement à 45O ou par la réaction produite par,
P
les suspensions épaisses de bact&ies dans l'acriflavine à 1 p. 1000.
,_,
. .
KARTER, 1957).
- Les variants fluorescents ou iris&3, ci Coloni:es mu-
queuses ou non,
- les variants bleus ou pris-bleu, qui ont perdu leur an-
ti$ne capsulaire,
- les variants R, ;! colonies irrkuli&es, de couleur gris
jaunâtre.
Carter (1957) p6ur &iter toute confusion entre les diverses d&omi-
nations donn6es aux variants, a propos& les termes de MXUZZ3 ,W00TW
et ROUGY pur les dkigner.
L'importance des phénom&es de dissociation apparaît ai
riveau,de la structure antiy&&que, du pouvoir patho$ne et imunisant.
- Les souches muqueuses sont de virulence très variable
pur la souris, toujours capsulées et faciles à typer
(CF.ItTER et BIGLWD, 19531,
- les souches smooth iris6es sont considkées p.-u? tous les
auteurs comme la forme la plus hautement virulente ;
elles sont capsulk et faciles à typer,
y,,leq souches smookh non iris6es (SRI ont une virulence
en &@a1 conser&e, elles~ont perdu leur anti,&e
.-
capsula;ire..et sont.donc'non typables KARTER,1957),
- les SOU&~~ rouph se~&ntretitV%n ipatho&es et sont
impossibles'à typer ; cependanti. on $eut. quelquefois
identifier leur s&otype somatique.(anfigène de paroi)
(ANDERSO16 et coll., 1929).
Les souches smooth clui ont nert;lu leur "iridescentie" peuvent parfois
la retiuver par passaw~sur la souris ou l'embryon de poulet.
.
.
/
.
.e.
IMPORTANCE DE L'ENTRETIEN DES SOUCHES.
En culture sur @ose ou en bouillon, les souches mises
au tifrig&ateur à 4*C, disparaisser;t:
en une sen-aine environ.
& culture en piqûre centrale dans la P&ose demi-mile (5 p.10001,
à la température du laboratoire et à l'abri de la lumière, assure
aux souches une survie de plusieurs semaines au mins.
Congelées à -2OOC ou -3O*C, elles se conservent 6 mis et si elles
sont lyophilisées, 10 ans ; ce sont donc les pmcedés de choix., qui
devront iJtre employés si on veut maintenir les souches au stade IIR~-
Co?de ou smooth, soit sous forme de sanp: virulent, soit sous forme de
cultures très jeunes, de 15 2 18 'heures au mximm, car les séjours
plus longs a l'étuve entraînent leur dissociation.
Lmsque les cultures sont simplemnt 2 congeler, il est
rkessaire de leur ajouter une substance protectrice (sém animai,
lait écr&né, polyvinylpyrmlidone, etc...).
CONSTITUTION ANTIGENIQUE DE PASTEURELLA MULTOCIDA
a> Un ou des polyosides simples, constituants de la cap-
sule et diffusant dam le milieu (Knox et Ekin, 19601 ;
ils se comportent comne des haptanes ; ils sorrt: imnm-
logiquement actifs lorsqu'ils restent associés ,? une
fraction protéique, Ils absorbent une partie mis nor:
la totalité du pouvoir imnunisant des sérum con-lsre les
bactéries entières ; ils sont spécifiques des types
capsulaires.
b) De l‘acide hyalumnique associk à la capsule des va-
riants M (Carte~ et Arma~, 1953. ; Carter~ et Byrne,1953 ;
Carter, 1955 et 1957). Ce mucopolyoside, s&$logique-
ment et immnologiquement irkactif,rmsque les anti$nes
de type dans les réactions s&olo&ues ; il est en
, quantité abondante chez les siirotypes A et D en phase M
*
et absent chez les sérotvpes B et E.
.
c> Des 1i;wpolyosides possidant tous les caractères des
e
m-do-toxines classiques des germes gram-négatifs.
. . . / . . .
Ils sont facilement libérés du corps bactérien et imwno-
logiquement actifs dks qu'ils restent associés 8 des
fractions protéiques (Knox et Bain, 1961 ; Rebers et
col1 * ) 1967). Ils inhibent en partie le pouvoir pro-
-
te,cteur du skum. Ils sont absorbés par les hékties de
rllmte.fères ,
Lt&3 proprlet.,
- O'*'-gC'rie sont oas sur>prties"p& le chauffage,
ni par l'action de la trypsine.
d) Certaines protéines ordinairement associées aux frac-
tions précédentes, apporteraient le pouvoir protecteur ;
_ ..-.
. ..____-
. -.
"les '&trés peu"ent 'jouer & 'y.$jlg "d'a6yuvmt ou pjy$j,
quer la formation d!anticorps opsonisc?nts qui dliorent
l'immunité conférk. Tout laisse à croire donc que plu-
sieurs antigènes participent au processus d~imnunisation,
e) Quant à la r@artition'de$'antigènes, on parle couram-
ment d'antigène s capsulaires et d'<anti.gènes somatiques
quoiqu'une extraction. ii l'eau physiolop;ique (isotoni-
que ou hypertonique) ouau phénol, libk un &Lange
:
d'antigènes en proportions variables dont la mltipli-
cité. peut être d&elée par des tests de p&cipitation
'.
sur @ose ou biologiquement par la toxicité, le pouvoir
. .
. . -. pp$ne et.--l-'.h~Mgglutination-,CBai.n-e~---,~~,
.%961 ";'
Penn et Naa, 1972).
De tous ces travaux, il faut donc retenir la difficulté
d'obtenir des entités antipkiques chimiquement pures même avec des
.
L.-_ ," ___. . . . .<
. . .
.
..,...
méthodes élaborées.
En effet, il est Iresqu'impossible de p&parerl.des -an-$-
gènes de type capsulaire qui n*aient pas de pouvoir toxique net, in-
versement la méthode de kstphal ne permet pas d'isoler à l'&tat pur
l'endotoxine toujours contaminée par les polyosides capsulaires.
TABLEAU no 2
Correspondance entre les s&otypes capsulaires de Cartey et ceux de
Roberts (selor, Frodjoharjono, Car-ter', Canner, 1974.
_
Types Carter A
B
CI
r
._ I
’ i
Types Roberts II III IV 1
V
@as d 1 hiva-
lent>
TABLEAU no 3
Relation entre les types capsulaires et les types somati-
ques actuels (d'après Namioka, 1970).
Il en ressort qu'a l'intkieur d'un JY&W s&type4 exis-
tent plusieurs types som&iques.
Types capsulaires
A
B
D
E
Types somzrtiques
1, 3, 5*, 7, 8*, 9" 6*, 11
1, 2, 3,4,10,12
6m
x responsable du chol&a aviaîre
xx,sémtype respnsable de la septicémie h&?ra~ique
.a
c
DISTRIBUTION DES SEROTYPES DANS LES IXFECTIOXS.
Ce sérotype est l'agent p%ncipal du chol&a aviaire ;
il est aussi frkpement rencontre dans les complications pasteur&-
liques qui succÈ?dent fréquemnt aux infections virales chez les
prcs3 les bovins, les petits ruminants, les rorwurs. Pour autant
qu'on sache, les souches isolées chez l'home sont exclusivment
du t-ype A.
Type B
Ce type est responsable de la septicénie hémrrae;ique
des bovins et des buffles d'Asie, du Proche-Orient et d'Afrique
Orientale, des bisons d'fJm&iquc. Il peut être isolé tr+s occasion-
nellement chez d'autres esp&e s animales (chevaux, porcs, mutons).
Ce sémtype a et6 fr&ymment isolé ci partir d'infections
sporadiques chez de mAreuses cspOcc~;s. Sa distribution est tout 2
fait comparable ,i celle du type A. Il apparaît, comm-z ce dernier,
responsable des pasteurelloses secondaires qui, sur les diverses es-
pèces de rram-tifkes et d'oiseaux, peuvent "sortir" à l'occasion de
causes favorables tres variées.
T@eE
Distinct du type E, il a 6% pour l'instant exclusivement
isoli? de cas de septicémie hémrragicue des bovins d'Afrique Occi-
dentale, Centrale et Orientale.
I$JSTJJJ.JT SWWS.DE RECHF+RCHES
AGRIC@LES (I.S,R-Afi)
-CI----.----
LABORATOIRE NATIONAL DE L%FVAG
ETDERECHERCHES -IRES
1 .;.
VACCIN CONTRE LES PASTEURELLOSES ANIMALES
UTILISATION PY L'APPAREIL DE STERNE DANS LA
PREPARATION D'UN VACCIN CONTRE LA SXPTICEMIE
HEMORRAGIQUE
._
“.
-
-
-
^
.-
Par FJ.Pm DOUTRE
L??&eur vétérinaire
mic?mbio~oFiste
Chef du Service de Ekt&iologie au
LNERV/ISRA
RES-'. N* 031/MICRC!!?XU
MAI 1983
corrrmt> tous les vaccins, ceux utilisés dans la prophylaxie médicale des pasteWel=
loses ar&mles doivent présenter un nombre minimm de germes dans le Cas p&Sent
z
tués- par dose vaccinale. Cette condition n'est satisfaite que si les cultures ob--
.F.
tenues sont ]suffisarranent riches, Pratiquement, il est admis qu'avant l'adjonction
-.
de l'aldéhyde formique, la culture doit pr+kentey une densité optique égale'au tube
no 10 de E&own. Dans le passé; ce r&ultat etait obtenu en ajoutant à une culture
ordinaire en bouillon, le produit de racla-eTpm billes de vm>de cultures sur
milieu solide (@ose au sang en boîtes de Roux). D&ormis, l'utilisation des
fementeurs permet d'obteni$, en milieu liquide, des cultures extrêmement denses
quppeuvent @tre mmn&es à la densité optique de 10 avant la r$m.-titi.on en wu-
les OU en flacons. La richesse en gems des cultures en fqnteurs est due :
- à lPutilisation de digest& de pakréas dans le milieu (apport d',acidesnucl~iques),J
- à .une aération constante,
- à 19apport r&iLier de J@&J neuf au mment où la culture est en phase de crois-.
sarice 1ogarithTnio.w.
Lvappareii de Sterne peut ê& &nsidé& corne un fermenteur dépourvu de régulatT.on
thermique (37OC) placé dans une chambre étuve. Fobuste, il est particulikment adap-
té aux conditions de travail. qui p&val.ent dans les p%ys tropicaux. S$conception
&ulte de mises au point r&l&&es par S?T;RNE, en Afrique du Sud,et par ETAIN, en
Fxt&m Orient. A l'IEMvT, c'est essentiellement PEPRMJ qui adapta lvapparei.l au;c
possibilités d'éouipemnt et qui lpintmduisit au Laboratoire de Parch.a (Tchad). Au
kkoYY%toke de Dakar, son utilisation date de 1965, elle a pemnis la pdt-&ion de
millions de doses de vaccins antipasteurelkiques de types divers, destines aussi
bien 2. l!Afrique tropicale qu'à l'Asie. Le tableau qui suit mp*lle h &m-tior,
des différents types de CSIRTER de Pasteurella m.ïltocida en pathologie hmjne et
--
swtout vétérinaire.
-2
CLMSIFICATIOFT SEROLOGIQUE A(JTUEUE DE PA.- mTocm
:
eype~
"capsulaires's)
:
i
Essenti+eme~n:'
E
Septicémie h&rr@que des ti
-
., et des kuffles d'kie, du Proche-Orient-
I 'p.& : d tac,&
et de l'Af%ique orientale, des'bisons
raniquedans
t
d,'Am&ique.
/-
capsyle . .
. . . i..,...
Fxclusivement
.?.
-
-"'
Septi~~~e-heiq,ue des:b&ins
.i,
d'Afrique occidentale et centrale.
. .
Très
ubiquiste
-v-e
Norritxyux typqs Cou sous-gr~upqs)
prdxibles.
:
- Pasteureilose de 1'HOmne
1. En quanti-@ toujo~s - Pastemllose bovine -:.
&ide~hyalurcnique
+tiaate
- Pasteurellose des ,petits ht::
capsulairu! v..
- Pasteurellose porcine
TYPe _R 0 0 0
- Pasteurellose du lapin
- Pasteurellose des oiseaux.
2, En quanti-6 variable NUbiquiste, cors& pour ie &$A
ombreux types (ou salis-FpeS) pro-
"
%eD.,,
iba'bles.
Y_._
:
Tout vaccin préparé à partir de Pasteurella haers9ytica peut épalement faire appel
w-.
à lFappareil de Sterne pou~~l~ob-tention d'une culture dense,
,.
Dans les limes q.ui suivent~ l*emploi de l'appareil de Steme: dans la préparation
d'un vaccin contre la septi&nie h6mrragique- sera décrit.en détail, nais tout
type de Pasteurella rrultczida. autre que. le typeF, pourrait. %tre utilisé dans la
.-'
pr@ation de vaccins destinés par exezle, aw petits ruminants (types A et D>:~U
.
volaill& (jzype A), etc...
:
..,:‘
., :. .
.
; :,
1 - DESCRXPTIO?? DE L'APPAREIL -'
Il est essentiellement constitu6 par une colonne de verre Pyrex (Verrerie g&érale :
39 me des Clo~s, Paris) (longueur : 89 cm ; diam&re int6rieur : 15 cm ; &a.isseur
dt.lveyTe: 8 m), obtkrée aux deux e&r&..i.t&z par 2 cownnes m&alliques par l'in--- 1
t&iaire d'un joint caoutchout6 épais (1 cm). LTensemble est maintenu par 5 ti,,es4
filetées aux extrémités narnies dFécrous papillons(sch&a A),
.
*
Dans l'espace libre de la couronne, le joint sup&ieur est percé de 3 orifices :
'-
s- l'un (a) par oii est introduit lvinoculum et le milieu, primitif puis renouvelé,
0..
/
.,D
,
c
c
f
f
c
-.. 5
- un second (b) qui se* à la. fois à l'admission dvantimusse et à ~'&XXELtiOn
.&z
ltair,
<"
. h' m misi&&(c'> $&& également la &&ie de Ifair et le yz&acemnt de ,.ia)
1
en &s de rup&&'de ce'derniw.
; +-.. .!'
LR joint inférieur comgxzte é@emnt deux ~~~~HIUTCYSS
:
.r.
,.<<.j
/ . . . . . . " >y
,,,"^ .-.. -.- .
s
- ~%XE servant à l'arrivée d'air stérile (d),
; ../
- ltautre Ce) à la ré@te de la culture,
<Y
:, .
a) Ltintrcduction'de 1'inoculum et du &lieu s'effectue par l'inter&di&e d-Sy
<-
"". tubé en rlmdorsil~ i0 int&ieur 8 m, tisistance à lVautoclavage) pén$&ant,dans
.:: la colonne cgrâc& à un tube de vexe de 8 mn (0 extgrieur), 19ext&mité distale
:
du tube souple porte un tube de jofiction rodé Quickfit femelle (87/16) qui per-
met tous.les branchermtnts (inoculum et milieu),
.b) celle de l'antimusse (pr&lablemmt horr@néi&
et stérilisé à l'autoclave
j" en tubes à essai de 18 mn à 1lOOC pendantli mn ; volume par.tube à essai, :, 1Ooc)
; .J
est effectuée par une allonge à Dlasm (f) et un tube en rhcdorsil identique
au precédent, p+%&mant dans la colonne de vem>e ~~~,l'inte&iai.re d'un ~y-
CEW de canne de verre (lonpueur environ 12 cc, 0 ez&$&ur : Smn), .'
c) identique à (a),assure la sortie de l'air et le remplacement de (a) en cas de
rupture, la culture pcwant ainsi être prolongée.
.
.
.
”
Diffuseur d'air (d) et tube de récolte (e) sont mntés suivmt le schém:A.:
,. i i
Aémtion : l'air.est foumii * ti compresseur (petit compresseur Prolaboou inieux
co~resseur EournisSant l'ai@ cotirimk. dans l'&semble du laboratoire): Il-est
<.
st&ilisé par filtration (mmbrane ES 1) wr passage à travers un fil- +itz
de 100 cm3 (a) (ce filtre est tiintenu ?ar une pince à 4 do&ts solidaire d'une
:
noix hxée sur une des S'ti~es qui assure la co&ion colonne de veme: joints
et couronnes) et p&êtm dans le milieu sous forme de fines Isulles'qui 'se d&ga-
gent du diffuseur d'air (h) (S&&E A). TJne pince cl- (j,)3,placée enWe le dif-
~fiisew'd'air et le filtre de 100 ch ?
_ 0.b ,.,
permet 'à volon& de suspendre l'a&tion
I
*
(G%î.tànt le r&&lemnt:de la'culy&& au m&ent de la &colte .et l'hynidification
,,.'Yle la. iimr&mnti EKS '!I)i de T&E', une' au&% pince'~clamp (k) est placée, &m .le..$ybe
de vidange pendant le cours de la cultme, l'etimité en verre plonge alors dans
le fc&ml.
..e / . . .
-6
.
:.
..’
:
Fixation de"l'appareil : la colonne est ftiéezur un chassis-supp* (schG$m B) en
CO?T~&~ Dixon. Ce c,hassis mvible permet: la disrmiti~n verticale .de.lFappareil
.
dans-2 &&mbrk &uv~ & akçure une km-me ~mtecl&n de l'mse@le au ckxrs des ç)$- =
."
"
nations de trans~rt et de stkilisation à 19aut&&we.
II - STERILISATION DE L'APPmEIL“
L
_--
Contenant environ ri5 ml d'eau distillge?.'lti
Cok&e et ses accessoires sotit st&i.-
lisés à l'autoclave (45 mn 2 120°C) dans 1'Êtat où ils sont reb&senkés & le sché-
mi A,(f) est obturé par un bouchm coton-gaze recouvert de papi+ et,ficelé (après
_. >:
&&l&&tion 1: panier est remplacé r/ar du papier d,9alm$niuv dont l'épaisseur
.,..'. t
.<
., -
est qWlrkpk& ,m plia,&?), (a> et ($1 ch&& par un tube à essai de 22.m e$ un
I,
.
Cototi. La.piGe' &k'k&-rtenue en position ouverte.
.
..<,.
.
ks tubes de jonction mdés f&ll@(a) et cc), l'allonge à plasma (f), le tube de
vidange (e) sont r@attus et kbilisés à l'aide de ficelles sur la colo-, &Ten-
s'emble p&&able&nt fixé sur le chassis-support (schém B) à-l'aide de fil de fw
:.
.est disposé hxizontal&n~ dans 19a$mlave (autoclave hxxîzont~~.
;.
I
I
I
- C&RXITIOIkZtERILISATIONW.MILIEu
--..
'.
Le milieu utilisé off& la coqsition suivante :
Pour 10 litres d'eau portée à 6O*C (dissolution des cents et fil-tmtiti plus
mpide) :
I
- extmit de viande Liebic .,.~D~~e.CDC~.D.............*.*.~*.*,~.~~.
90 Fr
- Bacto peptotie,Di'fco'
Cc‘u peptone GquTvalentè)
. . . . . . . . . ..00...C.O..
'100 t?
-chlmde sodium . .
..la....*.e...0.a..................0."..*.....
i
:'.'
50. -5
.
- ckgektat ~~Tni.q~e de &créas *..*a.* .,.............
l ..*5- . . . . .
1.250
a.*:. .‘
m-l'
:.
.
- gluccjse
D...................~~~~~~~~.~...*........~.*.~....~~.~...'
:.
-2o.g
,'
' - lacta?ie de soude
35.ml
,,.. ..: "
. . . . . . . . . ..a e * .- 0.0 *c o.............*...e..~.c 0 0 v..
'= phoSpha*e mmc&dique
. .
..***~c.~."OP~~....~...~..~"..*...*.ee..*...
-. ',
< )
,
;3pq
.. i :.
Le pH est.zjus?$ à 7,s -e 7,8.
:
:
., z.1
,‘. :.
\\
_:‘..
:.:
‘:.
h @&ilis&ion $%fecke par filtrafion sur f,ii& Se$tz de $0 1i.Ws ~x>urvu
-
.
:
;'
, :
~i~~~Mb~~ &'I. =Afin de faciliter cett~~,opkr~t~o~,, il y a i.nté&t 3 pm$dep : -
il
a un& ckx&fic&ion r>&lable sur un ax.&e '&tre &itz de‘10 litres,& d'une
,
. .
. .
: :
menb7mieAS.
-
.-;:
.. .
:,
.,t.t/*...
-
-7
a) Préparation du dipestat ~~pa?nique de panc&as :
ru-l-ù...-
400 g de panc&as~ de'.boeti, recu&Lli à l'abattoir, dCgmissé et haché, sont
niélan& à 1.500':inl'id'eau:di~tillée portée à SOOC, en prkence de 5 g& pah
@ne. Enune heure, la tq&ati est élevée à 70°C ~bain-mie). La dilrestion
est alors ar&tée en aumntant la-k~~@mture à 86O en quelques minutes. LE pro-
. .
..,'.
,..
duit de,la digestion est recueilli apr& filtration sur papier. Ce'd&estat acide
peut être conseAmg à -2OOC.
L'obtention de digestat papabique de pancréas est à la fois facile et rapide.
L'autodilres-tat
originel de Sterneh nécessitant des opémtions beaucoup plus lon-
I.'.
._ '.
gues, a été, abandonné.
b) Détails de la st&ilisation pa$ filtration du milieu.
.-
-1-
-'
:
Le milieu fil& est recueilli dans des flacons de Woolf de 10 litres.dont la
tu~lure inf&iewx a été éti&e (travail du verre dans un atelier spécialis6) D
Sur cette tubn&ure est ada& un tube .souTrle en rhodorsil, mni d'une pince
c;la3lrl?, et termine ir un tube de jonction tii: Ouickfit @le (schém CI..'
'. Lge&ouchuye sup&ieure du flacon po&e un,tube de jonction à rodage r-mm&&
,
feklle Sovirel (schém CI (14/23) qui peut, sous la flm, se raccorde? à
.-
: ;.-;
l',elémnt &le (14/23! corresgmdant porté JFZ le filtre de 10 litres (schéma
Cl *
Flacons de Golf vides et filtres Seitz de 10 litres, pourvus d?ine rmmbrsne
EKS 1, sont stér~isés à l'autoclave (45 mn > 12OOC).
Au laboratoire de Dakar, la p¶tion d'un lot de vaccin contre la septicé-
mie ti-mmagique met en jeu deux appareils de Sterne fonctionnant simJ.tan&
. . :
kmt et approvisionnés journellement par 100 litres (10 flacons de Woolf) de
milieu fil& et préalablement éprouvé pendant 24 heures.
...
.i
.’
‘,:A’
IV - PREIPARATIOM DE L'INOCULtM
I’
._.
.
. .;
a) Choix et entretien des souches
_.
:
I
-"
:
D*
Le clmix de ik'souche de Pastemella mltocida àtiiser est avant tout imposé
: :
"
pa?? l'affection que l'on se -proPose de combattre et l'espèce animale kn cause
(voir tableau en introduction : classification &rologique actueiie'di! P. ml-
tocida). C'est Asi auelie t3pe E doit être obli~a-&&&&nt employé d&s la
8.
/
. . . . . .
..z.
8
Y ’
L ’
.
,.
pr@re.tion du vaccin cont+.la septic&& h&rtm&ique du C&&e et~de"lsOues5
,,, i africain 5 les types A et.D pour lutter ~ontrela pasteurellose des petits rmi- i
: I
I33.n~s.y qtcw e- '
"
:
.:..
<
.,
. _
I ..,.'. ,.
y.
,'
'.",
.
'hz& sckhes sorït'? consemer lyo17hilisÉes3 en'&itant rigomusement lespassa-
,i
3
1'
I
= %
.<
geS 'in&Lés s& miliewc'atiificiels.
Ii 'est p&f&able de lyophilisex,;.
- soit du Sand virulentfj r&olté st&ilemnt sur un bouvillon mu&nt de la rm-
,;,. . TJ&-je,&g-j&&yff-z&
';
'.
'.'
.'
,. .,
. '.
:
'/
-'- soit une culture iridescente sti @ose tryptose-s&um recoltée en eau pep-
tonée et diluée au 1/3 dans du s&um de boeuf.
ks souches de P. mltoci&; utilisées d&ns la préparation des vacc&&, dei-vk.n?
~er.~,g$&....
'.'
b) L9inmiLm ': au lakoratoke de Dakcïr, l'in%ulum est contem dans un Erien-Keyer
de.2 litres à la .base'duquel a C?té soudée une tubulure d*erwi.mn 6 un (travail
du verre dans un atelier spéciali&). Comte pur les f3.accns de Woolf de 10 lis=
'te&, cette tubulure se kpmmuit e,un tube souple de rhxkxsil, terminé par un
t& de jonction rm!lG Quickfit'rr$le (voir schéma E). Une pince clamp est placée
&r le tube souple.'Dans le passé, des flacons de Kitas& ont étg utilisés, mis
la tubulure, 4acee près du goulot, offre un désavantage Crisaue de millage
du.~ton).
,.
.
:
:
Chaque Erlen-Meyer contient au moins 1 litre de milieu fil& et inixduit selon
le procédé &crit.,pr&édemnent (I1I.b).
:
.' Lti&c&m est utilisé 6 a '8' heur& après son ens~ncement avec environ 60 ml
. . .
'de &ul-&& en tubes (6 tub&).
"'
.
'.J'<
:' :
a) Pkpation de l'appareil autoclavé
. - -
.
L'appareil, sorti de l'autoclave, est placii en position verticale dans,la chambre.
.I
'étuve'et fi.%. Vke série"d90p$.Stiotis est alors.effecQGe :
i _
-
.‘._
- reserragides écvs.papillons, :.
'.
/..
._.
2-
.,. '- fixation de li,&ivGe dPair com&&$4 sur le.fil~.de:.dOQ cm3 (RI,: :..‘
.:
. . . / . . .
-9
(a) est déga&, cc) et (1) fixés,sup&ieurement en psition verticale,
(e) est introduit dans un tube de formol fixe inférieurement en position
verticale,
Cj) et (k) sont ferfn&.
..:.
.La chambre étuve doit être ~urvue d'un bec bunsen alimenté en gaz.
m
b) Intrcduction de lvineculum et d6but de la culture
L'inoculum est vers6 dans la colonne gr@ce auhranchement des tubes de jonction
rodes Quickfit, r@le .@rlen Meyer de 1*inocu1um) femelle (a) (de Ivap~il),
effectué sous la flamme. Puis? après déconnection de 1'Erlen Meyer, 2 litres de
milieu sont alors introduits, toujours gr%ce au branchement sous la flamme des
tubes de jonction ~O%S Ouickfit &le (flacon de Woolf)-fem&le (a) (de l'an-
pareil), Les 2 litres écoulés, la pince clamp Situ&e en curant du tube de jonc-
tion rodé Quickfit. file est ferm6e (schena C). Le milieu situé au niveau du
branchement des tubes de jonction Quickfit est de préférence emulsé dans la co-
lonne far nressionsur les tubes souples.
."-
2 litres de milieu et 1 litre d'iwculum sont alors pr&ents dans l'appareil.
Après 3 heures de culture non a&%e, 2 à 3 ml d'antimousse sont alorsintroduits
sous la flwne~ par l'allonge à plasr~~ (f) et l'aératien est mise en route. 3
heures plus tard, on laisse les 8 litres de milieu restant dans le flacon de
Nx&f s'écouler dans l'appareil.
Cette mise en route, par Gtapes
de la cultw-e assure une densité~optiaue n-axi-
mm, le mpprt Ynoculwn" - milieu neuf Stan-t toujours pand.
c) Première r&olte et r&oltes ult&ieures __
La marche de la culture peut être suivie en effectuant des p&lèvents stérile-
ment par le tube de vidange ce). Après chacune de ces onérations, le tube doit
être 3&introduit dans le form9.'
Au bout de 6 heures, la culture a atteint son développement ti. La
récolte
- est alors effectuee..
+I"
Sur le ciwuit air, la pince clamp a vis Cj) est fede. Le tube de vidange est
inWoduit dans un ballon de 10 litres st&ile, la flamme du bclc bunsen estmain-
e.. / . . . y
”
tenue au voisinage du Eroulot, la pince clamp (k> est alors ouverte et la culture
-
"S v:&Oule'v D 1he color&ion'de Gram perywt de v&ifier que la r6colte n'est Tas
F
~contarninéé I
I
.',
c .
lorsque l'app~zeil ne contient qlus qu'un litre de culture, la pince (k) est ferrr&^ *:
Ce velums restant petittra 1'ensemencE-t dti~l'ap$%t ~tiuve&de milieu neuf.
- L
La r&olte est for-wl6.e irr$diaterwnt (4 p.1000) "
"
'-
'
l
7
,<::...
*'
.,
Lu milieu 'neuf Cst de'nouveau introduit dans l'apparzil. 10 rCL dPant~usse~st~ril&
sont amen& pcir l'allon~ey et la serie des op&ations pr&demn?ent d&r,ites est ré-
@tee dans le'n&w ordre chrorxolo~ique.
.-
<
;. : :-
,
VI - RESULTATS
-.
Par cette r&hode, une culture offrant une opacitÊ su@ieure 2 20 est courazxnen-t
obtenue, 10 litres de <ura permettent donc de fabriquer 20 litres de vaccin. Le
vaccin forx~lé est adjuvé par l'alun de potassium. A cette fin: une solution d'alun
de potassium st&ile Cautoclavage) est ajout& de telle sorte que le titre final en
alunsoit de 10 n.lc>OO,
..,
:
Le conditionnement est effectu6 soit en ampoules de 20 ml CDakar?4soit en flacons
de 250 ml (Pawcha). Id dose &ccinnle'est de 2 ml0
,
-:
LT.
.
'c,rII - co?lTRoLEs
-
A effectuer sur la: suspension vaccinale finale avant l!adjonction dPalun.
. . .
_'
a> Stérilité
<I !
-
ee ense?ncer en bouillon ordinaires en lwuillon viande-foie ana&obie, sur @ose
'. :..- .'
trygtose. Ohservation pendant 3 2 4 jours.
.
.,i.-
.,
:
.:b) &-ln(-yuité
.
. .
‘;:
,’
Inoculer 2 cc sous la wau d'un lapin qui sera irils en observation pendant une
saine.
I
t
_I
.n*/r..
!
.d-+d-. .-.-- ..,&.“.A,.-
._,.^ ---.iir ---,_-.,- A--- ---- c ---- ^-..*
---
-% Remarques
. .
: Les principales causes de contamination de lpappareil de St~e.sont~les sui-
vantes : %xxulum souil16C, milieu neuf souillé, manque dgantimousse, la culture a refoulé
par les orifices sup&ieurs,
contamination au niveau du ,branchement .tubes de, jonction X-Q*='
dé 3&le:femelle. Pour M-ter ce derni& Cas, il est recomrran8% d"une '@rt d'ess@?er 2
l?aide d'un& :gaze liél&ment &l.e avant tout~Lxw&ement nouveau et de la nasser ensuite
Mdiamnt %'.la flti, di&tre nart de remplacer tidiaterrent tout flacon Woolf vide :*
par un autre plein de milieu, mais dont bien sûr la pince clamp est .mintenue en position
fer&e. Ainsi la zone de branchement pr&ente une absence totale de milieu: une pince clamp
placée en aval peut d'ailleurs accmître la sécurit6.
- 11
c) lilmunité
- Si l'on souhaite effectuer des tests dPixmunit6 pour pouvoir contrôler le ~TU-
.,.
vair tiellement protecteur du vaccin, il est indispensable d'utiliser des bc-
vins. A signaler tue le cobaye est un animal à proscrire absolument de toute
expérimentation en matiGre de septicémie h&xragique, même pour procéder à
de s.in-@es passaqes de souches.
- Les bwins utilisés doivent être tri& sérnlo&uement pour éliminer les animwx
~XTTW-IS naturellement, ce sui évitera de voir survivre un certain nombre de t&
moins non vaccin&. LES tests les plus Précieux pour ce dépistage sont le titra-
ge du pxwoir protecteur pur la souris , la fixation du complément et l'ag~lu-
tination de cultures sur $lose @AINY R,V.S. : F&it. v6t. J, 0 1955, III : 5'1?.
5181, enfin il convient d'ajouter l'h&a&utination de globules rouges hum=.ins
du groupe 0 (Cm, G.R. : 1955 ; PElWAU, P. : 19611, Tous ces tests &cessitent un
personnel qualifié, un mat&iel suffisantg un laboratoire adapté,
-., La souche d'$reuve doit etre choisie une fois pour toutes et sera seule utili-
sée, on lui Gvitera au maximnxn les passapes sur milieux artificiels. Le titrage
du pouvoir pathogène doit être egalement &tabli d'une manière définitive et
pur cela, on peut partir de la base suivante : 1 ml d'une dilution au l/îO@O
d'une h&roculture de 15 à 18 heures de la souche d'épreuve peut être consid&é
CO~TE la dese Q&rement motielle pour un bouvillon sensible de 70 2 100 kg. Il
est possible que l'on enregistre des diff&nces tenant aux races bovines con--
sidérées. Cette dose sûrement mortelle (DSM) a été estimée assez largement, il
est possible (et il est bon de le vérifier) que la DSM Aelle varie selon les
régions.;
Le liquide utilisé comme diluant pr&ente une grande importance. Le s&um phy-
siologique est mal supwrté par les Pasteurella et mieux vaut utiliser de l'eau
--
peptonge stérile.
- Le protocole d'expgrience est &s simple. Il est identique à celui appliqué
pour le charbon sympton-atique,
.
7
6es résultats des tests d'imrilunitg ne deviennent t&s nets qu'au rrs>ment C-G l'on
1
dispose d'un lot &rolo&uement homogène d'animaux de sensibilité uniforme, ce
qui est souvent -très difficile à obtenir, Les résultats favorables fournis par
- 12
l'utilisation du vaccin dans les tmu~ux &i s&iss3it~dans le passé,la septic35mi.e
h&mmagic&e constituent sans doute'le meilleur cribkre dont m &?pse pur juger
de la qu;ititE du vaccin (exmle de la PASTO~ dans l'Ada&&aj,Cammunj.
'.
I'
"
.
"
- 13
A N N E X E
LISTE DU @TERIE& UTILISE
*
- Canne de verre de 8 mn de 0j
a
- Tlbhes à essais de 0 18:
- Tubes à essais de 0 22,
- Erlen-Meyer de 2 litres (pourvu d'un tub SOU~~ à la base, atelier spécinl_isé
dans travail du verre),
- Flacons de Woolf de 10 litres (dont l'ouverture im%rieure est é-tir&, atelier
spkialisé dans travail du vernie),
- Flacons de 10 litres,
- Filtres Seitz de 10 li-trm, membranes EKS 1 et AS co'rrespcndantes,
- Pinces cl* de 6 CT.,
- Filtres Seitz de 100 crn3, rtembranes EKS 1 ccrrespcndantes,
- Piffùseur d'air (SOVIREL)T
- Tubes de jonction rodés 1~3les et femelles QUICKFXT (87/16),
-1 Tubes de jonction rodés rrt%les et femelles SOVIREL (14/23),
- Tubes souples rbdcrsil r6sistant aux conditions de stérilisation (0 intérieur 81x&?
- Filtm papier,
- Antimussc (Silicme, phcdorsil) @ROLABO>,
- Pinces à 4 doigts, noix de fixation,
- Corni&wDIXON,
- Fil de fer, ficelle, coton cardé, gaze, papier Kmft, etc...
- Bact&?iologi.ste en état de marche*
PASTEURELLP MULTOCIDR
En pratique, trois principaux types de colon&23 peuvent
être distingués sur milieu solide à l'aide du stér6omicrog&@e en
lumière transmise obliquement à 45O ou par la réaction produite par,
P
les suspensions épaisses de bact&ies dans l'acriflavine à 1 p. 1000.
,_,
. .
KARTER, 1957).
- Les variants fluorescents ou iris&3, ci Coloni:es mu-
queuses ou non,
- les variants bleus ou pris-bleu, qui ont perdu leur an-
ti$ne capsulaire,
- les variants R, ;! colonies irrkuli&es, de couleur gris
jaunâtre.
Carter (1957) p6ur &iter toute confusion entre les diverses d&omi-
nations donn6es aux variants, a propos& les termes de MXUZZ3 ,W00TW
et ROUGY pur les dkigner.
L'importance des phénom&es de dissociation apparaît ai
riveau,de la structure antiy&&que, du pouvoir patho$ne et imunisant.
- Les souches muqueuses sont de virulence très variable
pur la souris, toujours capsulées et faciles à typer
(CF.ItTER et BIGLWD, 19531,
- les souches smooth iris6es sont considkées p.-u? tous les
auteurs comme la forme la plus hautement virulente ;
elles sont capsulk et faciles à typer,
y,,leq souches smookh non iris6es (SRI ont une virulence
en &@a1 conser&e, elles~ont perdu leur anti,&e
.-
capsula;ire..et sont.donc'non typables KARTER,1957),
- les SOU&~~ rouph se~&ntretitV%n ipatho&es et sont
impossibles'à typer ; cependanti. on $eut. quelquefois
identifier leur s&otype somatique.(anfigène de paroi)
(ANDERSO16 et coll., 1929).
Les souches smooth clui ont nert;lu leur "iridescentie" peuvent parfois
la retiuver par passaw~sur la souris ou l'embryon de poulet.
.
.
/
.
.e.
IMPORTANCE DE L'ENTRETIEN DES SOUCHES.
En culture sur @ose ou en bouillon, les souches mises
au tifrig&ateur à 4*C, disparaisser;t:
en une sen-aine environ.
& culture en piqûre centrale dans la P&ose demi-mile (5 p.10001,
à la température du laboratoire et à l'abri de la lumière, assure
aux souches une survie de plusieurs semaines au mins.
Congelées à -2OOC ou -3O*C, elles se conservent 6 mis et si elles
sont lyophilisées, 10 ans ; ce sont donc les pmcedés de choix., qui
devront iJtre employés si on veut maintenir les souches au stade IIR~-
Co?de ou smooth, soit sous forme de sanp: virulent, soit sous forme de
cultures très jeunes, de 15 2 18 'heures au mximm, car les séjours
plus longs a l'étuve entraînent leur dissociation.
Lmsque les cultures sont simplemnt 2 congeler, il est
rkessaire de leur ajouter une substance protectrice (sém animai,
lait écr&né, polyvinylpyrmlidone, etc...).
CONSTITUTION ANTIGENIQUE DE PASTEURELLA MULTOCIDA
a> Un ou des polyosides simples, constituants de la cap-
sule et diffusant dam le milieu (Knox et Ekin, 19601 ;
ils se comportent comne des haptanes ; ils sorrt: imnm-
logiquement actifs lorsqu'ils restent associés ,? une
fraction protéique, Ils absorbent une partie mis nor:
la totalité du pouvoir imnunisant des sérum con-lsre les
bactéries entières ; ils sont spécifiques des types
capsulaires.
b) De l‘acide hyalumnique associk à la capsule des va-
riants M (Carte~ et Arma~, 1953. ; Carter~ et Byrne,1953 ;
Carter, 1955 et 1957). Ce mucopolyoside, s&$logique-
ment et immnologiquement irkactif,rmsque les anti$nes
de type dans les réactions s&olo&ues ; il est en
, quantité abondante chez les siirotypes A et D en phase M
*
et absent chez les sérotvpes B et E.
.
c> Des 1i;wpolyosides possidant tous les caractères des
e
m-do-toxines classiques des germes gram-négatifs.
. . . / . . .
Ils sont facilement libérés du corps bactérien et imwno-
logiquement actifs dks qu'ils restent associés 8 des
fractions protéiques (Knox et Bain, 1961 ; Rebers et
col1 * ) 1967). Ils inhibent en partie le pouvoir pro-
-
te,cteur du skum. Ils sont absorbés par les hékties de
rllmte.fères ,
Lt&3 proprlet.,
- O'*'-gC'rie sont oas sur>prties"p& le chauffage,
ni par l'action de la trypsine.
d) Certaines protéines ordinairement associées aux frac-
tions précédentes, apporteraient le pouvoir protecteur ;
_ ..-.
. ..____-
. -.
"les '&trés peu"ent 'jouer & 'y.$jlg "d'a6yuvmt ou pjy$j,
quer la formation d!anticorps opsonisc?nts qui dliorent
l'immunité conférk. Tout laisse à croire donc que plu-
sieurs antigènes participent au processus d~imnunisation,
e) Quant à la r@artition'de$'antigènes, on parle couram-
ment d'antigène s capsulaires et d'<anti.gènes somatiques
quoiqu'une extraction. ii l'eau physiolop;ique (isotoni-
que ou hypertonique) ouau phénol, libk un &Lange
:
d'antigènes en proportions variables dont la mltipli-
cité. peut être d&elée par des tests de p&cipitation
'.
sur @ose ou biologiquement par la toxicité, le pouvoir
. .
. . -. pp$ne et.--l-'.h~Mgglutination-,CBai.n-e~---,~~,
.%961 ";'
Penn et Naa, 1972).
De tous ces travaux, il faut donc retenir la difficulté
d'obtenir des entités antipkiques chimiquement pures même avec des
.
L.-_ ," ___. . . . .<
. . .
.
..,...
méthodes élaborées.
En effet, il est Iresqu'impossible de p&parerl.des -an-$-
gènes de type capsulaire qui n*aient pas de pouvoir toxique net, in-
versement la méthode de kstphal ne permet pas d'isoler à l'&tat pur
l'endotoxine toujours contaminée par les polyosides capsulaires.
TABLEAU no 2
Correspondance entre les s&otypes capsulaires de Cartey et ceux de
Roberts (selor, Frodjoharjono, Car-ter', Canner, 1974.
_
Types Carter A
B
CI
r
._ I
’ i
Types Roberts II III IV 1
V
@as d 1 hiva-
lent>
TABLEAU no 3
Relation entre les types capsulaires et les types somati-
ques actuels (d'après Namioka, 1970).
Il en ressort qu'a l'intkieur d'un JY&W s&type4 exis-
tent plusieurs types som&iques.
Types capsulaires
A
B
D
E
Types somzrtiques
1, 3, 5*, 7, 8*, 9" 6*, 11
1, 2, 3,4,10,12
6m
x responsable du chol&a aviaîre
xx,sémtype respnsable de la septicémie h&?ra~ique
.a
c
DISTRIBUTION DES SEROTYPES DANS LES IXFECTIOXS.
Ce sérotype est l'agent p%ncipal du chol&a aviaire ;
il est aussi frkpement rencontre dans les complications pasteur&-
liques qui succÈ?dent fréquemnt aux infections virales chez les
prcs3 les bovins, les petits ruminants, les rorwurs. Pour autant
qu'on sache, les souches isolées chez l'home sont exclusivment
du t-ype A.
Type B
Ce type est responsable de la septicénie hémrrae;ique
des bovins et des buffles d'Asie, du Proche-Orient et d'Afrique
Orientale, des bisons d'fJm&iquc. Il peut être isolé tr+s occasion-
nellement chez d'autres esp&e s animales (chevaux, porcs, mutons).
Ce sémtype a et6 fr&ymment isolé ci partir d'infections
sporadiques chez de mAreuses cspOcc~;s. Sa distribution est tout 2
fait comparable ,i celle du type A. Il apparaît, comm-z ce dernier,
responsable des pasteurelloses secondaires qui, sur les diverses es-
pèces de rram-tifkes et d'oiseaux, peuvent "sortir" à l'occasion de
causes favorables tres variées.
T@eE
Distinct du type E, il a 6% pour l'instant exclusivement
isoli? de cas de septicémie hémrragicue des bovins d'Afrique Occi-
dentale, Centrale et Orientale.