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r, INSUTÛT SENEGALAIS Df R~Cf-lFRCIII'C~
AGRICOLES (I.C.R.A.)
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LARORATOIRI NATIONAL !Y L'I:ll VAGI
ET M I?l UII R(:lll I; Vt lt RIYAI I'I '+
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IMKAF - WNN
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- I~wunof‘l uorcsccncf! : Appl î C:<I t ,ion liu diaqnostic
-. i-‘rt*l~drd t iw de (.mjucp~ f’l IJO~ ti.:>(.ifllI.
- Culture des leucocytes (moelle osseuse)
- Obtention du sérum antipeste procine africaine
- Culture de leucocytes d partir du sang dëfribinc'
- Prt:p;\\rdtion de cultures h I~~ucocylc5 par s&iwntation
spontarwe
- Ce 1 - I\\iffusiori dppliquec
I ICI rc~chrchc des anticorps sur
ch><, ilrllllaux swpt’c t s (“i%t t.1. IlC’<> I~or~t.tturs chrrmiques rlu vi rus
do id pcls te porc. I II(' d I ri ccl 1 tltg
- 'T)rc (.ipil;ation tw gt~losc : Ilt>t ih~rcho 41 1 ' dntiqcw
- Intr \\I)i 1 iorl de 1 'tl~nld~lsorp(.ion
- I!prc*uvo dfl 1 ‘t,(,ttl~(l~,cJry,tiori
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1 - A partir des organes reçus
---a coupes ,311 cr,yostat:
3 - rixation
- Coupes
ace tonc pur pendant 10 1mn .
- lubes
- Frottis d partir du culot de cultures w'llulaires centrifunces
(air chaud pendant 15 mn,).
4 - Seckqe
- Coupe5 et
- Tubes à larwl les fixes à l'actltone soril, scxl~ies (1 I 'air ctkiwl 011
à température ambiante.
5 - Coloration 30 mn d. 37°C en chambw humidct.
6 - Rincer 2 a 3 fois avec une sol lJt,iOtl sal-irw pt~0~;thah.x pl! 7,;' (IV~:)
.
8 - Montage à la glyctirine tamponnw a ~II ,: ,J I
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CONTROLE DE SPECIFICITC
a) - Inhibition prc:a Iah le de la r(w.I.iw pur dt.1.i ori d'un d,lliscrum 3n(.1 l'l)i\\
non marquée
b) coloration der nEmes cellules non inl'ectws
c) Coloration Je cellules positives.
La valeur de l'interprëtation c5t fonction c;iz :
- la prtisence d'inclusions cytoplasmiques fortement. fluorescentes
- la non fluoresccncc du noyau.,
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6 - Conjugaison (1115 iwiur:og lohul itws ( I.g) (~V(I(. '1 ' ist~lhiocyanatê de ~luorw2ekw
(ITCT) selon 'ir.: rapport clrl poids I/!I~,
La conju!Inic,on f;(! (‘ait A pH 9,') pewlant
i(‘ lilli soit. d t 4"C, Soit A la
temperature du LaIjo.
I? - Rdsorbcr 1~ c;otiju~lui. sur poutlw (It: foie II~: ~OUI..
pendant '1 heure A t- 4"1.
en agitation continue: suivie de ccntrii-1452 1:iot; (1 10 WO trs/mn pendant 30 mn.
9 - Prendre le surwccant (globuline marqu&) c-l rilpartir en petits vo'lu~ces,
puis aj(JuI.,?r clu Illc?t~t:tlioI,tl.f~ CI(! H<I ;l l./II) OII(i.
10 - Conserver .h - :rm.
11 - Avant son u I:i ri :,<I t i ott, (Il!lor-miter la tli lut iota 0111 II;,<I~~. i.lt? :,II~I (:111ploi .
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3 - Fechercher IC v i r u s sur lct ct~rwau, 1~ (.o~~:tt’, I( p(lumon, l e ganqlion, l a
m o e l l e oss~?usY, 1~ Foie t-!I, l a r8tt..
1 - Donneurs : porcs dc 400 - 100 kgs
1 1s sont saiqn&s tous les 211 jours.
2 - Ponction de
Le sang est
5 - Kecueillir (1 l'ai&! d'urw pipc.!t.l,e, Id couctk~ Tirpckr I i(*ic 1 Ic du s<!lliiwnl: qui
contient If!>; 1 t~uc;or;y I.c9 W I drlg['<i. tl utw (.:ou( tw (1' htwt ies . I vi ter (Ic prendre
trop d'hematies (rapport 4 - 5 ml pour Z!!;O ml de sang) .
6 - Les leucocytes recueillis sont additionnc,s de wrum prélevé après la centrifu-
gation puis ajustes a 6.10' f/ml,
7 - Distribuer <I raison de 1,s ml cn tubes (le c.ulî.ures de tissus.
8 - La suspension est utiliwe à 50 Z serum pur et 50 ‘% de tarle.
9 - Incuber à 37°C et observer aprGs 4~ heures.
10 - Les cultures peuvent étre utilisees apws 4: heures - 8 jours.
Il est important d'utiliser le sf:rum du méme animal donneur des leucocytes
pour la cultures.
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1 - Le sang est
2 - Laisser sd
4 - Ce surnageant est mc:langc d un volume de i:atks ou de Larle puis distribut:
en tubes d r<lison dtb 2 ml/tubr!.
5 - Variante : utiliser un erlen-meyer à 37OC pendant 1 heure ou deux.
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MATtH1t.L
-
-
1 - Antigène
6. Traiter le culot obtenu une nouvelle fois comme il est dit en
2, 3, 4 et 5.
7. Homo~l~:neiser dans 10 ml d'une solution ;1 parties @sales d'actltone et
d'ëther.
8. Traiter cette suspension comme il est dit en 3, 4 et 5.
9. Homog~noiscr ri nouveau dans 10 ml d'cith~r.
10. Traiter deux lois cette suspension comme i I est, dit. en 1.!, 4 (~1. !I ,
11. Evaporer 1 'c-ttwr rcsiduel .
12. Suspendre lc riasidu dans 70 ml de solution saline physiologique et
agiter pendant la nuit, en chambre froide 3 + 4°C.
13. Centrifuger ;1 1 000 trs/mn pendant ;!O mn.
14. Centrifuger d %(: 000 trs/mn pendant l!.) mn.
15. Dyaliser en face d'eau ou de solution saline physiologique pr:ntiant
la nuit..
16. Concentrer forfrnlent ou lynphiliser.
b) Préparation de 1 'antigtw utilisant le "I'rigen 11"
1. Utiliwr 10 rjr* tle I;ist,u (foi(:)
2. Homogc:!tx~iser dans 50 ml de milieu-constituti par :
- urclr! I i.!
- Iris ii,1 f~/lli.l (pli >:,5)
- EDTA Na;! 4,10-"M
- Mcrthiolate ti 1. pour I.0 000 en bain de glace et dans un homo-
gtin(!isatc!ur de teflon
3. Agiter par agitation magnétique pendant .: heures.
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Il provient d’animaux suspects de la ?II~~~ crlronique o u porteurs d u vir6s
d e c e t t e nir71adif~. I cl >;In!1 (5 t prcs Iclvr 4 I <1 VI’ i II(’ w3rrj-i na I c! (If> I ’ orcx i I \\(a ~III y\\<\\y
section de I a yuc~urt .
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A - Plaques tl ' rluclG,er loi\\y
- Agar Noble Difco a 1,5 2 cri tampon ptiospl~dt~~ !;,Ol ri d pli /,.J
- Ajouter mert.hiol,-IIrl (I 1/ 10 013)
- Repartir en hoStes de Petri de 10 cm de diamc~trt! ;1 raison de 12 m
- l,lrw foi5 sol I(ii l ii,, (,lgI1r), 1~s p I <lr~uo4 '.OIIf pl<1clTs il 1 4"( , II*,
util i sees pendent une semai ne.
- Dans chaque pl,yw, on pratique 4
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- poumon5 4' JtI im.wx suspec 1s.
Faire un contr6le positif et ntgatif.
Le titre de l'antigene de contrdle (suspension de rate a ;'D Y!) doit être
de 10-'/0,2 ml au moins.
C- Le sf-?rum
Le serum ctmplr:y< provient de porcs YI‘I ou il011t 1 'origine est. connue. Ces
porcs sont vaccines avec un virus attt.nuti et wqoivent par la suite trois
inoculations de culture de virus virulent de 5 1111, 250 ml et 250 ml (1. 30 jours
d'intervalle. Les‘porcs sont saicrnf-s 30 jours eprias la dernitire inoculation.
Comme témoin ncgatif, on emploie un s~~rw I1ti porc non irrocultt . Les scrums
sont inactives a 56°C pendant 30 mn.
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1 - Laver plu5ieur5 lois ju3qu'J (*I imination tics tkmat.ic!s avec du IY5 pli l,;I
à 37°C une culture de leucocytes aqée de Y il 4 jours, particulierement riche.
II - Inoculer les cultures avec urw souche hi!madsorbdnte et de telle manitire que
1 'on obtienrw 1 ‘Ilc~rnstl~,orpl;i(.>r-t sur tr0 Y', (111 moina; (1~:s cellul os en ïil hcuws.
3 - Une fois 1 'h~madsorption obtenw dan$ lt! f utw (le contrfile qui contenait des
hcmaties, le mi Iic!u ks tubes clst, (.tlang:. (:t, t*(:i,ip ldct' par la ou 1 es tli lutions
de serum suspect.
6 - L'inhibition est consideree comme t?tant positive lorsque le phénomane
d'hémadsorption qui se manifesk dans 107 i..u!,cs de contr61e ne se produit
pas dans les tutus qui contiennent lc st'runj $1 cxper liser.
L e s contrôlc~-; a\\ ri3lirer son! :
- contrô'le de l'h~madsorption
- contrôle de l'absence d'inhibition non sprcifique dans le wrum par
l'usa& d'une souche virale de type h(!madsorbant différent,
-.
A- CULTURES DL LIIUCOCYII::.-.
Les cultures sont obtenues par l'une dos tectoniques indiywes dans 1c.5
fiches correspondantes.
B - INOCULUM
Utiliser :
- soit le sang d'un porc tiyper-ininiunisct contre la peste porcitw classique inoculee
dans un but do diaqnostiç.
Ce Yang c;st recwilli ilu moment, de 1 '(~lt~vdtion
thermique ;
A partir de ce nrstcriel , faire une suspension-à 20 % en solution phosphatée
à pH 7,2 (Hanks, Larlct, etc...) additionnw de '1 000 II de penicilline et de
2,s - 3 mg de streptomycine/ml.
Broyer et centrifuger a 6 OI~O trs/mn pendant 30 mn. Le surnageant est
laissé 1 à. 2 heures a temperature ambiante (laisser agir les antibiotiques) et
d'inoculum.
c- INOCULATION Ut3 CUL IUFCS
- Un minimum de 3 ,tubes est utilise par diagnostic.
- L'inoculum est diluf au l/l.OP dans le milieu de culture.
D - HEMADSORPTVIN
l
Les hematies nccessaircs d la lecture tlo la rtaaction soni ajoutws tlirecte-
ment sur la culture 2 heures apros l'inoculation.
- Les hematies scdimentces sur la cul turc sont (~t~lt:vc~t:s par une Itc.~~~rt! rutdi,iun
du tube sur son axe longitudinal, avant son olwrvation au microscope,
On continue l'observation pendant 7 jours ou 10 jours, Une lecture est
effectuéetoutgles %4 h jusqu'à la constatation & l'hetradsorption ou d'un
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effet cyéopathogc!ne sur 50 I$ des tel lules.
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- Faire des tubes contrbl(~s * ncgat’ ”
l - positi Is
On peut donc ol~:.,c:rwr :
- la présence d’hr:maclsorption suivie d’cf~~!ts cytopat,hogi:rws, CV .lui entraînera
le diagnostic de peste porcine africaine ;
- 1 ‘absence II’ trcwadsot-pEion et; d’eFfe1, c;yl.o~~~l,lt~:~~~~~ttc, qui I.rtI.raCn~~ra url clid-
gnostic d’dbscnce du virus africain ;
- 1’ absence d’ht\\madsorption et la présencx d ’ II~I ef f’fi t cyt.opathr5pk: . Dans ce
cas, procdkr it un nouvel ensemencement <I part.ir de la culture et J d’autres
épreuve5 compl6mentai res, tel les que :
* inoculation au porc
* immunofluorescence
* précipi tùti on cn gc:lose. . .
en vue de cl(:terminer si 1 ‘on est cri pw:,onc c d’une r;ouchc non ~l,~tlt,ztlsoi-l,,ante
du vi rul; 41 ri c3.i n.
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1 - Retirer une anipoulc du conI,aincr lI SaLot~2 I iqul& (iiqir avu, pv~cttul,iort L
risque d'explosion de l'ampoule - choc thermique).
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2
- Décongeler au bain-marie a 37°C.
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3 - Nettoyer l'extcriwr de l'ampoule à l'aide d'Cthano1 a 70 % et laisser secher
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à temperaturr amk~iantc,
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5 - Ajouter du mi I -ieu JC culture tir1 quanti l:t. 5uIlisante pour diluer l/ l(Jt: le
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6 - Mettre en culture A 27°C (meilleure à 5 'Y> f,:P,,) .
7 - Remplacer le milieu aprks 24 heures d'inculpation.
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1 - Trypsiner,
2 - Ajuster la conwntration cellulaire Y,!, - /j .lO" y viableslml de mi lieu je
culture.
ci - Mctttbe 1 ‘at~qt(tulf~ (ht: I uttri II~? !AI (Ii* pal y5 l.ir.c~ttt~ ': h l(t ~III d'(~paiswur) . I entier
la boCte et mcttw au congc:Iateur - 70°C pendant L heures (refroidir l'C/mn).
7 - Conserver 1 'dmpou1~~ au contairrcr A azote liqrr,itif$,
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d'ëther.
8. Traiter cette suspension comme il est dit en 3, 4 et 5.
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13. Centrifuger ;1 1 000 trs/mn pendant ;!O mn.
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15. Dyaliser en face d'eau ou de solution saline physiologique pr:ntiant
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- Repartir en hoStes de Petri de 10 cm de diamc~trt! ;1 raison de 12 m
- l,lrw foi5 sol I(ii l ii,, (,lgI1r), 1~s p I <lr~uo4 '.OIIf pl<1clTs il 1 4"( , II*,
util i sees pendent une semai ne.
- Dans chaque pl,yw, on pratique 4
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- poumon5 4' JtI im.wx suspec 1s.
Faire un contr6le positif et ntgatif.
Le titre de l'antigene de contrdle (suspension de rate a ;'D Y!) doit être
de 10-'/0,2 ml au moins.
C- Le sf-?rum
Le serum ctmplr:y< provient de porcs YI‘I ou il011t 1 'origine est. connue. Ces
porcs sont vaccines avec un virus attt.nuti et wqoivent par la suite trois
inoculations de culture de virus virulent de 5 1111, 250 ml et 250 ml (1. 30 jours
d'intervalle. Les‘porcs sont saicrnf-s 30 jours eprias la dernitire inoculation.
Comme témoin ncgatif, on emploie un s~~rw I1ti porc non irrocultt . Les scrums
sont inactives a 56°C pendant 30 mn.
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1 - Laver plu5ieur5 lois ju3qu'J (*I imination tics tkmat.ic!s avec du IY5 pli l,;I
à 37°C une culture de leucocytes aqée de Y il 4 jours, particulierement riche.
II - Inoculer les cultures avec urw souche hi!madsorbdnte et de telle manitire que
1 'on obtienrw 1 ‘Ilc~rnstl~,orpl;i(.>r-t sur tr0 Y', (111 moina; (1~:s cellul os en ïil hcuws.
3 - Une fois 1 'h~madsorption obtenw dan$ lt! f utw (le contrfile qui contenait des
hcmaties, le mi Iic!u ks tubes clst, (.tlang:. (:t, t*(:i,ip ldct' par la ou 1 es tli lutions
de serum suspect.
6 - L'inhibition est consideree comme t?tant positive lorsque le phénomane
d'hémadsorption qui se manifesk dans 107 i..u!,cs de contr61e ne se produit
pas dans les tutus qui contiennent lc st'runj $1 cxper liser.
L e s contrôlc~-; a\\ ri3lirer son! :
- contrô'le de l'h~madsorption
- contrôle de l'absence d'inhibition non sprcifique dans le wrum par
l'usa& d'une souche virale de type h(!madsorbant différent,
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A- CULTURES DL LIIUCOCYII::.-.
Les cultures sont obtenues par l'une dos tectoniques indiywes dans 1c.5
fiches correspondantes.
B - INOCULUM
Utiliser :
- soit le sang d'un porc tiyper-ininiunisct contre la peste porcitw classique inoculee
dans un but do diaqnostiç.
Ce Yang c;st recwilli ilu moment, de 1 '(~lt~vdtion
thermique ;
A partir de ce nrstcriel , faire une suspension-à 20 % en solution phosphatée
à pH 7,2 (Hanks, Larlct, etc...) additionnw de '1 000 II de penicilline et de
2,s - 3 mg de streptomycine/ml.
Broyer et centrifuger a 6 OI~O trs/mn pendant 30 mn. Le surnageant est
laissé 1 à. 2 heures a temperature ambiante (laisser agir les antibiotiques) et
d'inoculum.
c- INOCULATION Ut3 CUL IUFCS
- Un minimum de 3 ,tubes est utilise par diagnostic.
- L'inoculum est diluf au l/l.OP dans le milieu de culture.
D - HEMADSORPTVIN
l
Les hematies nccessaircs d la lecture tlo la rtaaction soni ajoutws tlirecte-
ment sur la culture 2 heures apros l'inoculation.
- Les hematies scdimentces sur la cul turc sont (~t~lt:vc~t:s par une Itc.~~~rt! rutdi,iun
du tube sur son axe longitudinal, avant son olwrvation au microscope,
On continue l'observation pendant 7 jours ou 10 jours, Une lecture est
effectuéetoutgles %4 h jusqu'à la constatation & l'hetradsorption ou d'un
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effet cyéopathogc!ne sur 50 I$ des tel lules.
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- Faire des tubes contrbl(~s * ncgat’ ”
l - positi Is
On peut donc ol~:.,c:rwr :
- la présence d’hr:maclsorption suivie d’cf~~!ts cytopat,hogi:rws, CV .lui entraînera
le diagnostic de peste porcine africaine ;
- 1 ‘absence II’ trcwadsot-pEion et; d’eFfe1, c;yl.o~~~l,lt~:~~~~~ttc, qui I.rtI.raCn~~ra url clid-
gnostic d’dbscnce du virus africain ;
- 1’ absence d’ht\\madsorption et la présencx d ’ II~I ef f’fi t cyt.opathr5pk: . Dans ce
cas, procdkr it un nouvel ensemencement <I part.ir de la culture et J d’autres
épreuve5 compl6mentai res, tel les que :
* inoculation au porc
* immunofluorescence
* précipi tùti on cn gc:lose. . .
en vue de cl(:terminer si 1 ‘on est cri pw:,onc c d’une r;ouchc non ~l,~tlt,ztlsoi-l,,ante
du vi rul; 41 ri c3.i n.
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1 - Retirer une anipoulc du conI,aincr lI SaLot~2 I iqul& (iiqir avu, pv~cttul,iort L
risque d'explosion de l'ampoule - choc thermique).
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- Décongeler au bain-marie a 37°C.
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3 - Nettoyer l'extcriwr de l'ampoule à l'aide d'Cthano1 a 70 % et laisser secher
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à temperaturr amk~iantc,
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5 - Ajouter du mi I -ieu JC culture tir1 quanti l:t. 5uIlisante pour diluer l/ l(Jt: le
IIMW ;OU (;w(.ri I'w~cli, 110ur* &'l imitltbr II! I$I',I~ (,'I)II (1 !, mn) "
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6 - Mettre en culture A 27°C (meilleure à 5 'Y> f,:P,,) .
7 - Remplacer le milieu aprks 24 heures d'inculpation.
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1 - Trypsiner,
2 - Ajuster la conwntration cellulaire Y,!, - /j .lO" y viableslml de mi lieu je
culture.
ci - Mctttbe 1 ‘at~qt(tulf~ (ht: I uttri II~? !AI (Ii* pal y5 l.ir.c~ttt~ ': h l(t ~III d'(~paiswur) . I entier
la boCte et mcttw au congc:Iateur - 70°C pendant L heures (refroidir l'C/mn).
7 - Conserver 1 'dmpou1~~ au contairrcr A azote liqrr,itif$,
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