REPUBIQUE DU SENEGAL __--m.--------------- -m--e ...
REPUBIQUE DU SENEGAL
__--m.---------------
-m--e
INSTITUT SENFZALAIS
DE'RECHEWHES AGRICOLES
_-------------------___^_
LABORATOIRE NATIONAL DE
INSTITUTE FOR ANIMAL
L'ELEVAGE ET DE ‘RECHERCHES
HEALTH
B.P.2057 Dakar-Hann
PIRBRIGHT LABORATORY
Tel: 221 832 36 78
Ash Road, Pirbright
Fax: 221 832 21 18
Surrey GU24 ONF
United Kingdom
Tel: 44 01483 232441
Fax: 44 01483 232440
TECHNIQUE3 DE DIAGNOSTIC DE LA FIEVRE APHTEUSE:
TECHNIQUES DE CULTURE DE CELLULES,
DE DETECTION DE L'ANTIGENE VIRAL, DES ANTICORPS ANTI
VIRUS, DE POLYMERASE CHAIN REACTION ET DE SEQUENCAGE,
Rapport de otage effectue du 21 avril au 21 Mai 1998 par Yaya
Thiongane au
Laboratoire de
Reference
Mondial de la
Fievre
aphteuse de Pirbright, Woking, Surrey, Grande Bretagne
Mai 1998
i
PROGRAMME
1.
Semaine du 21 au 25 Avril 1998.
1.1. Presentation des regles de securite en usage au
Laboratoire de Pirbright.
- Presentation du laboratoire.
- Visionnage de Films sur la securite.
- Etablisaenmt de Badges.
1.2.Techniques de cultures de cellules:
- Cellules de lignee de rein de porc.
- Cellules primaires de thyroide de veau.
II.
Semaine du 28 au 1 Mai 1998.
(avec Nigel Ferris)
2.1. Tests de detection de l'antigene du virus.
2.2. Techniques de preparation des reactifs,
III. Semaine du 4 au 8 Mai 1998.
(avec Teli Rendle)
3.1. Tests de detection des anticorps anti-virus.
- Technique de titrage de l'antigene du virus de
la F.A.
- Technique de titrage de l'anticorps anti-
virus de la P.A.
3.2. Technique de caracterisation du virus de la F.A.
IV.
Semaine du 11 au 15 Mai 1998.
(avec Bob Armstrong, Sott & David)
4.1. Technique de seroneutralisation,
4.2. Technique de P.C.R.
4.3. Technique de sequencage.
V.
Semaine du 18 au 21 Mai 1998.
(avec P,Kitching)
5.1.
Synthese.
5.2. Visite de l'inscctarium.
5.3. Visite du Laboratoire MARIAL,
5.4. Le 21/05/98 retour au Senegal.
PIAIV
GENERALI!!ES SUR LA FIEVRE APHTEUSE.
1 TECHNIQUES D'ISOLEXEIT DU VIRUS DE LA FIEVRE
APHiiEUSE.
1.1
Techniques de culture des cellules
primaires de thyroide de veau.
1.2
Techniques d'isolement du virus.
II. TECHl?IQUES SEROLOGIQUES.
2.1
Technique de detection des antigenea.
2.2
Techniques de detection des anticorps:
2.2.1 Titrage de l'antigene.
2.2.2 Titrage du Serum par Elisa,
2.2.3 Titrage du serum par SN.
2.3
Technique de caracterisation du virus.
2.4
Technique de skoneutralisation.
III. TECHIVIQUES GENETIQUES.
3.1.
Technique de Polyrerase Chain Reaction.
3.2.
Technique de Sequencage,
IV. BIBLIOGRAPHIE.
v. ANNEXES.
Resultats des tests realises du 21/04 au 21/5/1998 au
laboratoire de Reference Mondial de la fievre aphteuse.
VI. REMERCIEMEHTS.
1. G&?&RBLITÉS SUR LA FIkVRE APHTEUSE.
La fievre aphteuse est une maladie
infectieuse et
fortement
contagieuse due a un virus du genre Aphtovirus
de la famille dea
Picornaviridae
et
atteint
plusieurs
espèces
animales,
essentiellen4ant les bovin%, les porcins,
plus raremsnt les petits
ruminant% et les dromadaires. Slle se manifeste par une forte
morbidito,
une faible mortalit6 et des Usions
vksiculeuse et
érosives des muqueuses de la bouche, de la peau des espaces
interdigités
et des mamelles. Elle est a l'origine de pertes
economiques
importantes
surtout dans les elevages intensifs par
l'arret de la production laitiere et de la restriction
des
exportation% des produits d'origine animale% des pays atteints,
La fièvre aphteuse, maladie de la liste A
, de l'OR5, est tres
largement rhpandue mais reste endémique dans les pays tropicaux.
Elle
est
absente
d e s
regions comne
l'Ar&rique du
nord,
1 ‘Australie,
la Nouvelle Zélande et le Japon. La maladie a dté
éliminée
de Europe par
la vaccination et
des
mesures de
prophylaxie sanitaires strictes consne l'abattage, le contrôle des
importations et les mesures de quarantaine.
Dans les zones endkniques,
la persistance de la maladie est
favorisCe par l'existence de porteurs sains, l’absence ou les
probl&me% de la vaccination et les mdes d'elevage utilises.
Le virus
presente 7a6rotypes: O,A,C, SATl,
SAT2,SAT3 et Asial.
Les serotypes O,A,C sont largement r4pandus
mais les serotypes
!3AT1,2,3 restent confinés au continent
africain
alors que le
serotype ARIA 1 est rencontre uniquement en Asie.
Au laboratoire, le
cobaye et le
souriceau
nouveau-né (voie
intraperitoneale)
sont utilises pour
le diagnostic (isolement et
titrage du virus).
Les
cellules
primaires (de bovins et de
porcin&) et les cellules de lignée consne la BHK21 peuvent être
utilisbeo,
Les test8 %&rologique% conme la fixation du complément
et 1'ELISA sont utilise% pour les enquetes epid&niologique%,
La lutte contre la maladie passe par l’application de mesures
sanitaires
strictes
dans les
zones
indemnes.
Dans les
2ones
endémiques, la
vaccination en
masse
des
espkes
animales
sensibles permet soit d'éradiquer la maladie ou de réduire son
impact à un niveau acceptable.
4
1 IECHNIQUEB D'ISOLENEXC DU VIRUG DE LA FIÈVRE APHTEUSE.
1.1
Techniques de culture des cellules primaires de thyro!ide de
Veau.
111 Matériels:
- Boite d'instruments avec: pince, ciseaux, bistouris et lames;
- Flacons de PBS 88118 Ca-Mg avec antibiotiques;
- Flacons de milieu MEMG avec 10% de SV;
- Bechers;
- Pipettes de 5 et 10 ml;
- Thyroïde de foetus ou de veau;
- Flacon d'enzyme (Dispase au Trypsine);
- Flacon de Trypan Bleu;
- Barreau aimant&;
- Hematimetre;
- Entonnoir avec de la gaze;
112:
Découper la Thyroïde:
- DBbarrasser la thyroïde des tissus et de la graisse
qui
l'entourent;
- Rincer la
glande
avec de
Tampon
PBS
sans
ca-Mg
avec
antibiotiques;
- Découper la glande dans un bêcher vide en menus morceaux;
- Rincer (10 fois) les morceaux .dans le mi5m tampon;
- Reprendre les morceaux dans du milieu de culture a 10% de SV;
- Laisser la glande dans son milieu de culture a +4c pendant une
nuit.
113: Digérer la glande avec de la Dispace:
- Débarrasser la glande de son milieu de culture;
- Rincer la glande
avec le n&ne tampon PBS sans Ca-Mg avec
Antibiotiques;
- Ajouter 100 ml de dispase et mettre sous agitation a 37°C
pendant une heure;
- Reprendre la Diepase surnageant les morceaux de thyroïde;
- Centrifuger 2000 t/mn pendant 10 mn;
- Ajouter 100 ml de dispase frais aux morceaux de thyroïde pour
une seconde digestion de 1 heure a 37°C;
- centrifuger 2000 T/mn pendant 10 mn;
114: Ensemencer les cellules de thyroïde:
- Reprendre
l e s
culots
de centrifugation dans
du milieu de
culture a 10% de SV;
- Numerer les cellules;
- Filtrer les cellules;
- Diluer les cellules dans du milieu de culture a 10% de Sv de
manière a avoir 106 cellules par ml;
- Repartir les cellules dans les tubes ou des flacons;
- Incuber les tubes et les flacons a 37OC.
Le tapis cellulaire se developpe en 48 heures et
presente des
cellules epitheliales et des cellules fibroblastiques,
1.2
Technique d ’ isolement du virus.
Elle permet d'isoler le virus de la FA a
partir d'échantillon
(Cpithélium lingual, sang, raclage du pharynx)provenant d'animal
suspect ou de surnageant de cellules infectées sur des
cultures
de cellules de thyroïde de veau ou des cellules de lignbe de rein
de porc.
1.2.1:
Preparation de l'echantillon:
- Bortir le
prBl&vement de son milieu de transport(Tampon PBS
glycérol) et decouper un morceau de ce pr$Sbwnent et le peser et
d&ernùner la quantité de tampon a employer
pour
obtenir
u n e
suspension a lO%, came par exemple: le poids de l'échantillon de
0.627 g a multiplier par 9 pour obtenir 5.643 ml de tampon PBS a
utiliser pour une suspension de 10%.
NB: Le virus de la FA est tres sensible au pH acide alors Il faut
verifier le pH du milieu de transport de l'échantillon avec une
solution de rouge de phénol: ajouter a 6 gouttes du milieu de
traneport le m&m nombre de gouttes (6) de solution de rouge de
phenol et apprecier
le pH du milieu de transport par la couleur
du mélange obtenu.
- Broyer le pr61ibwmnt avec du sable stbrile dans un mortier
avec un pilon mais auparavant il faut avoir decouper le morceau
de tissu en petits fragments avec les ciseaux,
- Centrifuger le broyât a S-6000 t/mn pendant 10 mn,
- Rkupher le surnageant
(contenant le virus ) dans un tube de
10 ml et reprendre 1.4 ml de ce surnageant dans un tube de 2 ml
pour la recherche de l'antigene viral par la technique ELISA,
1.2.2: Inoculation des cellules en tubes (cellules de thyroïde de
veau et cellules de rein de porc) par 0.2 ml. du surnageant:
- Vider le surnageant des cultures de cellules de 5 tubes par
type de cellules,
et prévoir des tubes de cellules tkmin de
thyroïde de veau et de rein de porc,
- Ajouter 0.2 ml de surnageant viral a 'chaque tube soit 2 ml de
surnageant pour les 2x5 tubes de cellules de thyro'ide de veau et
de rein de porc,
- Incuber les 10 tubes de cellules inoculees et les 10 tubes de
cellules t&moin a 37 C pendant 30 mn (face du tube avec les
cellules vers le bas pour que l'inoculum puisse recouvrir les
cellules),
- Ajouter 1 ml de milieu de culture aans s6rum aux 20 tubes (10
tubes inocule8 et 10 tubes t&irkGn),
- Incuber les tubes a 37C sur des supporta roulants
1.2.3 Mise en Evidence de la prbence du virus de la FA par
l'apparition
de l'effet cytopathogene au bout de 24 heures (le
virus est alors isole): les cellules primaires de porc aont les
plus sensibles que les cellules de lignbe de rein de porc,
- Rhupher le
surnageant
d e s
tubes
presentant un
effet
cytopatogene (ECP) (contenant le virus de la FA) dans un tube de
10 ml par type de cellules.
NB: Le surnageant
des cellules avec ECP est traite came le
broyât de 1'Bchantillon (Etape 1,2,1) pour la dbtection de
l‘antigène viral par la technique ELISA.
NB: Le Virus de la FA est trés sensible aux variations de PH,
surtout très sensibles aux PR acides (inactivation aux pW6.8).
II. TECHHIQUES SEROLOGIQUEB:
Z.l.Technique de detection des antigenes.
Elle permet de determiner le ou les types d'antigenes 0, A, C,
SATl, SAT2, SATS, ASIAl du
virus de la fievre aphteuse
presenta
dans les echantillons
lepitheluim
lingual,
sang,
raclage du
pharynx) provenant d'animal suspect ou dans les surnageant8 de
cellules infectees de thyroide de veau (cellules primaires) ou de
rein de porc (cellules de lignee) par la technique Elisa.
2.1.1 Materiel et reactifs necessaires:
2.1.1.1 Materiel:
- Spectrophometre
- Agitateur de plaque
- Laveur de plaques
- Pipette:
multicanaux (5-50~1,
50-300ul),simples (l-lOu1, 5-4Ou1,
40-200~1,
200-1000u1)
- Rigolee pour reactifs:
a 8 compartiments pour 8 reactifs differents
a 1 compartiment pour 1 reactif
- Appareil de distillation d'eau (eau de type 1, resistivite de
18 megohms,sans
agent6 pyrogenes)
- Microplaques
a 96 cupules
-Refrigerateur (temperatures de + 2 a +6 C)
- Congelateur (temperatures de -15 a -20 C)
- Incubateur(temperatures de t 35 a t39 C)
- Bain Marie (temperatures de + 35 a t39 C)
- Phuwtre
- Verrerie:
Bechers de
20-4OOOml,
eprouvettes de
10-2000 ml‘
pippettes
graduees de 1 a 20 ml, flacons de 1 a 100 ml, tubes de 2 a 4 ml
et leurs boites de rangement, , bidons de 5 a 10 litres
- Cryotubes de l-5 ml
Melangeur Voortex,
- Balance de precision (+/- 0.1 mg)
- Mortier et pilon
- Sable sterile
- Minuteur avec alarme,
- Serviette et papier buvard,
- Etiquettes collantes et marqueurs indelebiles
2.1.1.2 Tampons et reactifs:
- Tampom PB3,
- Tampon de sensibilisation,
- Tampon de dilution des antigenes,
- Tampon de dilution du serum de detection et du conjugue,
- Solution chromcgene ou OPD,
- Eau oxygenee,
- Solution d'acide sulfurique,
- Solution desinfectante,
- Solution de rouge de phenol,
- Solution d'aaide,
- 8olution de lavage des plaques,
- Serum de lapin anti 8 serotypes du virus de la FA (0, A, c,
SATl,
SAT2,
SAT3,
ASIAl,
SVDV) et du
virus de
la maladie
vesiculeuse du porc,
- Serum de cobaye anti 8 serotypes du virus de la FA et du virus
de la maladie vesiculeuse du porc,
- Serum de lapin anti imnunoglobuline de cobaye conjugue a la
peroxydase,
7
- Antigenes de reference (8 serotypes du virus de la FA et de la
maladie vesiculeuse du porc),
2.1.2 Sensiblisation des plaques avec les serums de lapin anti-
serotypes 0, A, c, SA!rl, 6A!r2, w3, AmAl et SVDV:
- Preparcr du tampon de fixation a pH 9.6+/-0.05:
Dissoudre une capsule de carbonate-bicarbonate dans 100 ml d'eau
distillee (tampon a 0.05M) et a garder a +4c pendant une semaine,
Diluer les 8 serums de lapin anti types 0, A, C, SATl,
SAT2 r
SAT3, ASUI et SVDV au 1/1000 dans le tampon de fixation a pH
9.6, soit 1 ul de serum anti-types dans 1000 ul (1 ml)
NB: la dilution se fait dans un rigole a 8 canaux.
Repartir le8 8 serums de lapin anti-seratypes dilues au l/lOOO
dans les 8 rangees de la paque, a raison de 50 ul par cupule:
Rangee M-12:
SEROTYPE 0
Rangee Dl-12:
SKROTYPR A
Rangee Cl-12:
SERomPg C
Rangee Dl-12:
SERGTYPE SATl
Rangee El-12:
SERGTYPR SAT2
Rangee Fl-12:
SZROTYPE SAT3
Rangee Gl-12:
SEROTYPE ASIAl
Rangee Hl-12:
SEROTYPE SVDV
Placer les plaques a 37 C pendant 1 heure sous agitation ou + 4 c
pendant une nuit.
2.1.3 Repartition des antigenes de reference et des echantillons
suspects:
- Laver les plaques 3 fois 'avec du PBS,
- Diluer les antigenes de reference 0, A, C,
SATl, SAT2, SAT3,
ASIAl, SVDV au 115,
11'25 et 1/125 dans les 3 premieres colonnes
1, 2, 3 de la plaque
Colonne 1:
antigenes de reference OI A, C, SATl, SAT2, SAT3, ASIAl,
SVDV au
1/5, (80 ul de tampon avec 20 ul d'antigene):
1A: antigene de reference 0 diliue au 115
1B: antigene de reference A diliue au 1/5
1C: antigene de reference C diliue au 115
1D: antigene de reference SATl diliue au 1/5
1E: antigene de reference SAT2 diliue au 1/5
1F: antigene de reference SAT3 diliue au 1/5
1G: antigene de reference ASIN diliue au 1/5
1H: antigene de reference SVDV diliue au 1/5
Colonne 2:
antigenea de reference 0, A, C, SATl, SAT2, SAT3, ASIAl, SVDV au
1/25,(80 ul de tampon avec 20 ul d'antigene de la colonne 1)
2A: antigene de reference 0 diliue au 1/25
2B: antigene de reference A diliue au 1/25
2C: antigene de reference C diliue au 1125
2D: antigene de reference SATl diliue au 1/25
2E: antigcne de reference SAT2 diliue au 1/25
2F: antigene de reference SAT3 diliue au 1/25
2G: antigene de reference ASIAl diliue au 1/25
2H: antigene de reference SVDV diliue au 1/25
Colonne 3:
antigenes de reference 0, A, C, SATl, SAT2, SAT3, ASIAl, SVDV au
1/125,(80 ul de tampon avec 20 ul d'antigene de la colonne 2)
3A: antigene de reference 0 diliue au 1/125
3B: antigene de reference A diliue au 11125
8
3~: antîgene de reference C diliue au 1/125
3D: antigene de reference SATl diliue au lf125
3E: antîgene de reference SAT2 dîliue au 1/125
38: antigene de reference SAT3 diliue au 1/125
36: antigene de reference ASIAl diliue au 1/125
3H: antigene de rcference SVDV diliue au 1/125
NB: les 8 aatigenes de reference sont directement dilues dans la
plaques dans les rangees correepondantb; a leurs serotypes dans du
tampom PBS avec rouge de phenol.
- Repartir les echantîllons non dilues dans les autres colonnes
et rangees de la plaque: le reste de la plaque est utilise pour
deux
echantillons:
Colonnes 5A-H,6A-H,7A-H : Echantillon NI non dilue, a raison de
50 ul par cupule,
Colonnes 9A-H,lOA-H,llA-H: Echantillon N2 non dilue, a raison de
50 ul par cupule,
- Retenir les colonnes 4A-H,
8A-H I
12A-H pour des
oolonnes
temoins negatifs, a raison de 50 ul de tampon PBS par cupule (pas
d'antigene,
pas d'echantillon),
- Incuber la plaque a 31 C pendant une heure sous agitation,
2.1.4 Repartition des serums de detection de cobaye antiserotype
0, A, C, SATl, SAT2, SAT3, ASIAl, SVDV:
- Laver la plaque 3 fois dans du tampon PBS,
- Preparer le tampon de detection : du tampon PBS a 5 % de lait
ecreme
- Diluer les serums de cobaye antiserotypes 0, A, C, SA!f!l, SA!l!2,
sAT3,
ASIAL, SVDV au 11100, a raison de 10 ul dans 1000 ul de
tampon de detection,
(A?B:Les dilutions sont faites dans USJ rigole a 8 rangees.]
- Repartir les serums de cobaye anti-serotype dilues a raison de
50 ul par cupule, un serotype par rangee:
Rangee Al-12:
ANTI-SEROTYPE 0
Rangee El-X?:
AETI-EEROTYPE A
Rangee Cl-12:
ANTI-SEROTYPE C
Rangee Dl-12:
ANTI-SEROTYPE SATl
Rangee El-12:
ANTI-SERGTYPE SAT2
Rangee Fl-12:
ANTI-SEROTYPE 3AT3
Rangee Gl-12:
ANTI-SEROTYPE ASU
Rangee Hl-12:
ANTI-SEROTYPE SVDV
- Incuber a 37 C pendant une heure sous agitation,
2.1.5 Repartition du serum de lapin conjugue avec la peroxydaoe
- Laver la plaque 3 fois avec du tampom PBS pour enlever le serum
de cobaye,
- Diluer le serum de lapin anti-cobaye conjugue au 1/200,
raison 35 ul dans 7000 ul de tampon de detectîon
(oad a 5 B dz
lait ecreme)
9
- Repartir 50 ul du serum de lapin conjugue dilue dans tous les
cupules, a raison de 50 ul par cupule,
- Incuber a 37 C pendant 40 mu et sous agitation,
2.1.6 Repartion du substrat de l'enzyme peroxydase
- Laver 3 fois avec du tampon PBS pour eli.mi.mr
le serum conjugue
(DB: toute trace de conjugue peut fausser la lecture ulterieure)
- Preparer le subtrat de l'enzyme: de l'eau oxygenenee dilue a
1/2000 dans de l'OPD, a raison de 5 ul de H202 dans 10 0000 ul de
OPD,
- Repartir 50 ul du substrat dans tous les cupules, a raison de
50 ul par cupule,
- Laisser la plaque a la temperature ambiante (a
l'obscurite)
pendant 15 mn,
(T@&er le substrat en melangeant SO ul de conjugue dilue a 50 ul
. de subtrat par I'apparition de la coloration, temin de l'action
enxynatique)
2.1.7 Arret de la reaction enzymatique avec de l'acide
- Repartir 50 ul de solution acide par cupule pour arreter la
reaction
enaymatiaue,
2.1.8 Lecture des densites optiques a 492 nm
- Lire les plaques au spectrophotometre a la longueur d'onde de
492.
- Les cupules contenant les antigenes de reference sont toutes
colores
avec
une
intensite decroissante
avec la dilution de
l'antigene.
- Les echantillons positifs sont colores au niveau de la rangee
contenant le type d'antigene viral en cause: par exemple, urne
coloration de l'echantillon au nieau de la rangee D montre un
antigene du type BAT1
Rangee Al-12:
SEROT!E'R 0
Rangee Bl-12:
SEROTYPE A
Rangee Cl-12:
!3RROTYPE C
Rangee Dl-12:
SEROlWE SATl (Colore aux D5D6D7)
Rangee El-12:
SEROTYPE SAT2
Rangee Fl-12:
SEROT!fPE SAT3
Rangee Cl-12:
SEROTYPE ASIAl
Rangee Hl-12:
SERCTYPE SVDV
2.1.8
Interpretation;
Le prelevement posscdc un antigent du virun de la FA du type
SATl .
2.2.Technique de titrage de l'antigeae du virus de la
fievre aphteuse.
Elle permet de quantifier l'antigene
(virus titer) present dans
l'echantillon viral (surnageant de culture de cellules infectees)
et de determiner la dose d'antigene neceaaaire pour les tests
serologiques (dilution for reaction with serum),
221 Materiel:
22llMatériel
- Spectrophometre
- Agitateur de plaque
- Laveur de plaque&
- Pipette:
multicanaux (5-5Ou1,
50-300ul),&imple& (l-lOu1, 5-4ou1,
40-200111,
zoo-1000u1)
- Rigoles pour reactifs:a 1 compartiment pour 1 reactif
- AnPareil de distillation d'eau (eau de type 1, resistivite de
18 &gohm,sans agents pyrogenes)
Microplaques B 96 cupules pour test ELISA
Microplaques à 96 cupule& pour test Fixation du compltint
Refriaerateur (temperatures de t 2 a t6 C)
Congeiateur (temperatures de -15 a -20 C)
Incubateur(temperature& de t 35 a t39 C)
Bain Marie (temperatures de t 35 a +39 C)
Phmetre
Verrerie:
Bechers de
20-4OOOml.,
eprouvettes de
10-2000 ml,
pippettes
graduees de 1 a 2 0 ml, flacons de 1 a 1 0 0 m l , tubes de 2 a 4 ml
et leurs boi.te& d e rangement, , bidons de 5 a 10 litres
- Cryotubes de l-5 ml
Melangeur Voortex,
- Hinuteur avec alarme,
- Serviette et papier buvard,
- Etiquette& collantes et marqueurs indelebiles
2.2.1.2 Tampon& et reactifs:
- Tampom PBS,
- Tampon de sensibilisation,
- Tampon de dilution des antigenea,
- Tampon de dilution du serum de detection et du conjugue,
- Solution chromogene ou OPD,
- Eau oxygenee,
- Solution d'acide sulfurique,
- Solution desinfectante,
- Solution de rouge de phenol,
- Solution d'azide,
- Solution de lavage des plaques,
- Serum de lapin anti 8 serotypes du virus de la FA (0, A, C,
SATl,
SAT2,
SAT3,
ASIAl,
SVDV) et
du virus de
la maladie
vesiculeuse du porc,
- Serum de cobaye anti 8 serotypea du virus de la FA et du virus
de la maladie vesiculeuse du porc,
- Serum de lapin anti imnunoglobuline de cobaye conjugue a la
peroxydase,
- Antigenes de reference (8 serotypes du virus de la FA et de la
maladie vesiculeuse du porc),
222 Methodes:
2221 Sensiliser les plaques de fixation (Coat fat bottomed Elisa
plates ):
- Preparer une dilution au 1/5000 du serum de lapin antiserotype
dans le tampon de fixation a pH 9.6,
- Repartir 100 ul par cupule du serum de lapin dilue dans tous
1~ cupule& de la plaque,
- Placer
l e s
plaques a la
temperature
ambiante
dans
u n e
atmosphere humide (ou chambre humide) pendant toute une nuit,
2222 Diluer l'antigene viral dans une plaque pour fixation du
complemsnt ou
plaque de
dilution
(Round-bottonmed CF-Carrier
plates):
11
- Diluer la suspension antigenique de 1/'2 en 1/2 avec du tampon
ma Tween:
- Repartir 50 ul de tampon PBS 'Rieen dans tous les cupules
- Ajouter 50 ul de solution antigenique dans 50 ul de tampon PBS
Tween pour obtenir la dilution 1/2 dans la colonne 1, ensuite 50
ul de la dilution au 1/2 dans les cupules de la colonne 2 pour
une dilution au 1/4.
ainsi de suite jusqu'a la dilution 1/4096 au
niveau de la colonne 12),
- Ajouter 50 ul de tampon PI39 Tween dans
chaque
cupule pour
obtenir 100 ul dans chaque cupule de la plaque et doubler
l e s
precedentes dilutions, ainsi la dilution sere de 1/4 dans la
colonne 1 et 118192 dans la colonne 12,
- Placer les plaques a +4C pendant une nuit et sous agitation,
2223 Transferer les dilutions antigeniques dans la plaque Elisa:
- Laver les plaques ELisa 3 fois avec du tampon PBS,
- Transferer les dilutions antigeniquea, a raison de 50 ul par
cupule, dans la plaque Elisa, en respectant l'ordre croissant des
dilutions de 1/4 au 1/8192.
- Placer les plaques a +37C pendant une heure et sous agitation,
2224 Ajouter le serum de cobaye anti-serotype (Blocked Guinea pig
anti-sera):
- Laver les plaques 3 fois avec du tampon PBS,
- Diluer le serum au l/lOOO (pour plaque: 5 ul de fterm dans 5 ml
de PM),
- Repartir 50 ul du serum dilue dans chaque plaque du seroype
correspondant 0, A, C,..
- Placer les plaques a t37C pendant une heure et sous agitation,
2225 Ajouter le conjugue (Blocked conjugate) dilue au 111000:
- Laver les plaques 3 fois avec du tampon PBS,
- Diluer le cojugue au l/lOOO (pour plaque: 5 ul de serum dans 5
ml. de PBS),
- Repartir 50 ul du conjugue dilue dans toutes les plaques.
- Placer lee plaques a t37C pendant une heure et sous agitation,
2226 Ajouter la solution de revelation OPD activee avec de l'eau
oxygenee:
- Preparer une solution d'OPD avec une tablette d'OPD dans 55 ml
de tampon Phosphate-Citrate,
- Preparer
une
solution au
1/2000 d'eau
oxygenee
avec de
l'OPD(pour une plaque : 2,5 ml dans 5 ml d'OPD),
- Distribuer 50 ul de cette solution dans chaque plaque en allant
de la colonne 1 a 12,
- Placer
les
plaque8 a
temperature
ambiante
pendant
15 mn
(Declencher la minuterie au debut de Xa distribution de l'OPD),
NB: Preparer un test du conjugue: 50 ul de conjugue avec 50 ul de
solution OPD qui entraine une coloration.
2227 Arreter la reaction avec de l‘acide citrique a 1.5M:
- Ajouter 50 ul de la solution d'acide dans tous les cupules.
NB: Preparer une plaque Temoin (Blank. control plate) : 50 ul de
OPD avec 50 ul d'acide sulfurique a 1.5M.
2228 Lire a 492 nm:
- Etablir la DO de la plaque t-in,
- Lire les plaque% Xliga et Calculer les DO moyennes de chaque
dilution,
2229 Etablir la courbe des DO:
- en abcisse (X):
Dilution dea antigenes
12
- en ordonnees (Y): Dcnsites optiques moyennes
22210 Choisir la dilution de reaction avec le test serologique:
- La dilution optimale antigenique se s.itue entre les DO de 1.0 a
1.5,
- La dilution a utiliser pour le test serologique est la moitie
de la dilution optimale antigenique,
(VOIR EN ANNEXE: IA M?iNIPULA!J!ION DU 5-6/05/1998)
2.3 Technique de detection des ankicorps antivirus de la
F,A par le test Elisa:
Elle permet de detecter
les anticorps presents dans le serum des
animaux vaccines ou ayant survecu a une infection
naturelle par
le virus de la fievre aphteuse. Les anticorps sont specifiques du
type de virus.
2 3 1
Materiels et reactifs utilises:
2311 Materiel.
Le materiel est identique a celui utilise pour la detection de
l'antigene (liste en page).
2312 Reactifs.
- Rouge de phenol a 0.28,
- Solution de soude a lM,
- Tampon de fixation (0.05 M Carbonate-bicarbonate ou
Coating
buffer) a pHm9.6,
- Tampon PBS a pH 7.2,
- Tampon de dilution Elisa (Tween et rouge de phenol),
- Tampon de revelation (Tampon PBS, Tweeen et Lait en poudre),
- Substrat (OPD dans tampon phosphate-citrate a pH 5.0),
- Solution d'acide d'arret (acide sulphurique a 1.25M),
- Solution desinfectante,
232 Methodes utilisees:
On utilise trois tests:
- Spot test: 40 serums sont testes par plaque,
- Minititration: 10 serums sont testes par plaque,
- Full titration: 5 serums par plaque,
2321 Spot test
23211 Preparation des temoins et des echantillons de serums:
232111 Dilution des temoins:
On prepare les temoins suivants:
Temoin antigenes 0, A, C, SATl, SAT2, SAT3, ASIAl;
Temoin serum negatif 0, A, C, SATl, SAT2,SAT3, ASIAl;
Temoin serum faiblement Positif 0, A, C, SATl, SAT2,SAT3, ASUl;
Temoin serum fortement Positif 0, A, C,, SATl, SAT2, SAT3, ASIAl;
Ces temoins sont utilises au 1/16 (10 ul dans 150 ul) et sont
repartis dans une plaque de dilution a fond rond, a raison de 50
ul par cupule.
Pour chaque temoin, on utilise 4 cupul.es dans les colonnes 11 et
12.
La repartition est la suivante:
Tenwin antigene: 11-12H et 11-12G
Temoin serum negatif:ll-12F et 11-12E
Temoin serum faible positif:ll-12D et 11-12C
Temoin serum fort positif:ll-12B et 11-12A
Pour le temoin antigene, on met 50 ul de tampon PBS-Tween a cote
des dilutions de 116 des temoins serums.
232112 Dilution des serums
Les 40 serums sont dilues au 1/16 dans une plaque de dilution a
fond rond (plaque de fixation de complement): 10 ul de serum dans
150 ul de tampon PBS.
13
Les 40 serums dilues sont repartis
dans une deuxieme plaque de
dilution,
deux cupules par serum, a raison de 50 ul par cupule.
Les serums sont reparti8 dans les colonnes 1 a 10 et les rangees
A a H.
Le schema de reppartition des 4 temoins et 40 semas
sont
presentes a la page xxx.
232113 Dilution de l'antigene.
chaque antigene 0, A, C, SATl, SAT2, SAT3, MIA1 est dilue selon
le titre defini dans le test precedent titrage du virus.
Par exemple, pour les antigenes suivants:
- antigene 0 BFS: au 1/120
(diluer pour 1 plaque 60 ul dans 7,2 ml de tampon)
- antigene A22: au 1/45
(diluer pour 1 plaque 200 ul dans 9 ml de tampon)
- antigene C: au l/lOO
(diluer pour 1 plaque 50 ul dans 5 ml de tampon)
232114 Melange Serum-Antigene.
Ajouter 50 a1 de l'antigene dilue (0, A,
. ..) dans tous les
cupules de la plaque de dilution contenant les 4 temoins et les
40 serums dilues.
Les plaques contenant le melange serum-antigene sont places a la
temperature ambiante dans une chambre humide pendant une nuit.
UB:
Chaque antigene doit etre melange a tous les serums dilues,
donc
preparer 7 plaques de serums-tunoins
dilues
pour les 7
serotypes du virus de la fievre aphteuse.
2322 Preparation des plaques sensibilisees:
Les plaques Elisa sont sensibilisees avec du serum de lapin anti-
serotype du virus de la FA. Le serum de lapin,
dilue au 1/5000
dans le tampon de fixation (a pH 9,6), est reparti dans tous les
cupules de la plaque a raison de 100 ul par cupule. Les plaques
sont placeen ensuite a la temperature de +4 c sous agitation.
NB: on sensibilise une plaque par serotype, soit 7 plaque pour
les 7 serotypes du virus de la FA.
2323
Transfert du
stuzlange
Serum-antigene
dans
l e s
plaques
sensibilisees:
23231 Laver les plaques sensibilisees 3 fois dans du tampon PBS,
23232 Transferer les 40 melange seruwantigene de la plaque FC a
la plaque Elisa, en raison de 50 ul par cupile respectant l'ordre
de repartion des cupules.
De nmrw,
transferer
l e s
4 temoins
Ag,Negatif,
faible positif, fort positif.
23233 Incuber a 37C pendant 1 heure sous agitation.
2324 Addition du serum de cobaye antiserotype:
23241 Laver les plaques sensibilisees 3 fois dans du tampon PBS,
23242 Ajouter du serum de cobaye anti-serotype dilue au l/lOOO,a
raison de 50 ul par cupule,
23243 Incuber a 37C pendant 1 heure sous agitation,
2325 Addition du conjugue(serum de lapin anti-cobaye conjugue a
la peroxydase):
23251 Laver les plaques sensibilisees 3 fois dans du tampon PBS,
23252 Ajouter du conjugue dilue au l/lOOO,a raison de 50 ul par
cupule,
23253 Incuber a 37C pendant 1 heure sous agitation,
2326 Addition du chromgene OPD:
23261 Dissoudre 1 tablette d'OPD dans 55 ml de tampon Phosphate-
citrate,
23262 Activer la solution avec 1/2000 d'eau oxygenee, cad 2.5 ul
de H202 dans 5 ml de OPD,
23263 Ajouter la solution OPD-H202 dans tous les cupules , a
raison de 50 ul par cupule,
14
23264 Laisser les plaques pendant 15 mn (mettre le chronomtre en
marche) a la
temperature
ambiante(lers
plaques
sont
sur la
paillaese et a l'obscurite).
NB: - Tester le conjuge en melangeant dans deux cupules d'une
plaque, 50 ul de conjugue et 50 ul de solution OPD-H202 pour voir
apparaitre
l a
coloration
caracteriaque de
l a
reaction
enzymatique.
- Preparer la plaque etalon (Balnk plate) en mettant 50 ul de
OPD-HZ02 dans les 8 cupules de la colonne l(donc de 1A a 1H)
2327 Arret de la reaction enzymatique par une solution d'acide a
1.25H:
23271 Ajouter 50 ul d'acide sulfurique a 1.25M a tous les cupules
au bout des 15 mn,
23272 Ajouter 50 ul d'acide a toua les cupules de la colonne 1 de
la plaque etalon,
2328 Lire au spectrophotometre a la longueur d'onde de 492 mn:
23281 Lire la plaque etalon,
23282 Lire la ou les plaques de titrage de
serums.
2329 Interpreter les resultats:
La valeur des Do indique l'intensite de la coloration et montre
la prescnce ou l'absence de reaation Anticorps-Antigene:
- Serum positif = DO faible
- Serum negatif = DO fort
L'interpretation
des
resultats
est
faite
sur
la valeur
d e s
pourcentages
d'inhibition:
la valeur du Temoin Ag permet de verifier la qualite des temoins
serum positif et negatif:
Le temoin fort positif doit etre superieur a 90 % d'inhibition
par rapport au temoin Ag.
Le t-in faible positif doit etre entre 50 a 90 % d'inhibition.
Le tmoin negatif doit etre inferieur a 50 % d'inhibition.
(VOIR FICHE DE LEXTDRE DE LA MANIPDLATION DU 07 MAI 1998)
a . 3
Technique de titrage des anticorps antivirus de la F.A par
le test Elisa ou full titration:non r8alis8
2.4
Technique de caractkisation d'une souche du virus de la F.A
par le test Elisa:
241 Repliquer la souche virale isolée de l'animal (field strain)
sur culture de lignée de celllules de rein de porc (Renal 8wine
Ce11 ou RS cell) ou de cellules BHK;
242 Récolter et Titrer le virus en utilisant une gamw de sérums
anti diffbrentes souches vaccinales du m$me sérotype. Ces souches
vaccinales sont choisies en fonction de la xone gGographique et
du contexte épidémiologique (voir le protocole titrage de virus);
2 4 3
Choisir la
combinaison
antigène/sérum
(trapper/detector)
optimale et la dilution d'utilisation de la
aouahe
vaccrinale.
Cette dilution ne doit pas @tre inférieure à 1/6.
244 Titrer les
sérums de 21 jours après vaccination
(par un
vaccin
connu)
contre
la souche virale
isolée et
le vaccin
homologue (Voir le protocole de titrage des sérums).
245 Déterminer le titre du r&rum:
Calculer la DO moyenne de 24 cupuples de t&uG.n antig$ne; Cette
DO représente le maximum de DO obtenue avec ce test, cad 100 % de
DO. Il faut diviser par 2 cette DO maximale pour determiner 50%
d'inhibition.
Noter
les
cupule6
positifs
lorsque la DO
est
infbrieure
& 50% du 'Smoin antigiine et
l e s
cupules
négatifs
lorsque la DO est supérieure à 50% de la DO du t6mA.n antigene.
Pour le calcul du titre du t&um, il faut se refker à la m&hode
Karber,
246 Calculer la Valeur relative ou R value:
valeur r = titre du sbmm avec la souche isolée divis& par le
titre du sLrum de souche virale de rlfkence.
16
2.4 Technique de detection des anticorps antivirus de la
F.A par le test de seroneutralisation:
Elle permet de
detecter
l e s
anticorps
neutralisants
l'effet
cytopatog&ne
du virus de la FA sur
une
culture de cellules
sensibles,
notammnt les celllules de lign6e de rein de porc
(cellules RS). Ces anticorps sont presents dans le serum des
animaux vaccines ou ayant survecu a une infection
naturelle par
le virus de la fievre aphteuse. Les anticorps sont specifiques du
type de virus.
241: Matiriels h Mkthodes
2411 Materiels:
L'equipement est le suivant:
Microscope
invers&,
Flacons de culture de cellules,
Microplaque de culture de cellules,
Micropipettes,
Pipettes
stériles,
Flacons,
Cones,
Bain marie,
Etuve
Les Reactifs chimiques sont:
Desinfectant (le FAM, eau de javel),
Les reactifs biologiques sont:
SQrum de rbfkence:
sérum d'animal convalescent
Milieu de culture MEMG a pH 7,4-7,6 à +4*C pendant 3 mois.
3ouche virale du virus de la stomatite vésiculeuse bovine.
2412 MQthodes:
- Choisir les palques suivantes:
2 Paques de Titrage du virus(virus control)
2 Paques de Titrage du serum de reference
(serum reference control)
1 plaque de test des echantillon de skum
- Delimiter des aones avec des marques sur les plaques:
Plaque de titrage du virus:
tirer un trait apres la collonne 9,
Plaque de controle du skum de rhfkrence:
tirer trois traits pour delimiter les zones :l-4;5-8
et 9-12 (de A à H,
Plaque de controle des dchantillons de serum:
tirer trois traits pour diG.mi.ter les zones:7-8;9-10
et 11-12 pour le serum à tester
tirer trois traits pour délimiter les zones:
A-B(3-4);
C-D(3-4) et D-E(3-4) pour le serurn negatif
tirer un trait pour délimiter la zone A-B(l-2)pour le
ttsmoin de toxicite
Distribuer le diluant dans les plaques,:
Plaque de titrage du virus:
mettre 50 ul dans tous les cupules de 1 à 9(A-H)
mettre 150 ul dans le tcrmin diluant
mettre 100 ul dans le témoin cellules
Plaque de titrage de serum:
mettre 50 ul dans tous les cupules(sauf ceux de la
rangle H)
Plaque de controle des échantillons de sérums:
mettre 50 ul de diluant dans les 2 cupules 2A-2B pour
le controle de toxicite
mettre 25 ul de diluant dama les cupules 4A-4B (ne
rien mettre dans 3A-3B) pour les t-in8 sérums
négatifs
ajouter l'échantillon de s8rum pr&dilu& au 1/4: 50 ul
dans les témoins de toxicite 2&2B, 50 ul dans les
cupules 3A-F {dilution 1/8)et 25 ul dans les cupules
4A-F(dilution 1116)
diluer le s6rum des vaccinés ou des convalescents:
mettre 50 ul de diluant dans les cupules de B à H, à
raison de 2 colonnes par &rum,
ajouter 50 ul de sérum d6compldment6 et dilu8 au 1/4
dans les cupules A et B
diluer de B à H, ce qui donne les dilutions suivantes:
A:1/4, B:1/8, C:1116, D:1/32, E:1/64, F:1/128,
G:1/256,
H:1/512
Diluer et distribuer la solution virale:
Diluer de loglO2,7 à loglO6,9 et distribuer 50 ul de
la dilution la plus forte (6,9 DICTSO) dans les 8
cupules de la colonne 9 et la dilution la plus faible
(2,7 DICTSO) dans les 8 cupules de la colonne 1, le
schéma de distribution est le suivant:
Colonne1 :2,7
Colonne2 :3,0
(o,:Q?d 10)
Colonne3 :3,3
(o,:~log 10)
Colonne4 :3,9
(0~6loglO)
Colonne5
:4,5
(0,6loglo)
Colonne6 :5,1
(0,6log10)
Colonne7
:5,7
(0,6loglo)
Colonne8 :6,3
(0,6log 10)
Colonne9
:6,3
(0,6log 10)
NB:
(0,61og 10) est Egal à la dilution au 1/4
(0,31og 10) est 6gal à la dilution au 1/2
Distribuer les 3 dilutions virales de 2,7, 3,0 et 3,3
dans les 2 plaques de titrage de s6rums de rifirence
et les 2 plaques de titrage de s&mus de vaccin& ou
convalescents.
Incuber les plaques à 37°C pendant 45-75 mn.
Distribuer les cellules:
150 ul dans les cupules témoins cellules,
50 ul dans les autres cupules des 5 plaques (virus, sérum de
reference,
serum de convalescent)
Incuber les plaques pendant 75 heures,
Lire les plaques:
titre du virus sur la plaque de virus par la m&hode de Karber,
titre du
sk.un de
r6ference
6W
les
plaques de
serum
r&f&rence(voir le8 annexes)
titre du srkum des convalescents sur les plaques de skums de
convalescents(voir les annexes).
Interpreter:
l e s
s&xns
sont
considéres
négatifs
lorsque
leur
titre est inferieur ou égal à ljll.
18
III. TEC!HNIQUES GElfETIQUEG.
3.1. Technique de Polyrerase Chain Reactiou.
3.1.1 Extraction de 1'ARN viral.
- Mettre 460 ul de l'echantillon dans uu tube de 1,5 ml;
- Ajouter un volume égal de tampon de lyse(vace 1% de B mercapto
ethanol) à l'dchantillon et melanger au vortex;
- Ajouter 460 ul d'Bthano1 a 70% et m&langer au vortex;
Utliser les colonnes de RNA (700 ul de volume max);
Centrifuger a 10 000 rpun pendant 15 secondes;
- Laver avec 700 ul de tampon de lavage RWI avec centrifugation;
- Laver avec 500 ul de tampon de lavage RPE avec centrifugation;
- Laver avec 500 ul de tampon de lavage RPE avec centrifugation
pendant 2 mn pour secher la membrane;
- Eluer le RBA avec 50 ul de DEPC-H2C) dans un nouveau tube et
centrifuger 10 000 rpm pendant 60 secondes;
- Stocker a -2O'C.
3.1.2 Reverse Transcription de 1'ARN viral.
- Mettre dans un tube de 0,75 ml le melange suivant: dNTPs,5XRT
buffer, MMLV, RNasin, DEPC-H20, Primer;
- Ajouter 11 ul de ce melange a 14 ul de RNA viral pour obtenir
un volume de 25 ul.
- Centrifuger;
- Chauffer a 42'C pendant 60 mn et puis 94*C pendant 10 mn;
- Stocker a -20°C.
3.1.3 PCR Amplification du produit de l.a Reverse Transcription,
- Mettre
dans un
tube de
0,75 ml le
melange
suivant:
25mMMgC12,10mMdNTPs,lOXbuffer,Primerl(lO-2!~prnol/ul),
primer2(10 -
2%mwul),
Taq DNA polymerase(W/ul), RT product, DEPC-H20 pour
un volume total de 50 ul;
- Ajouter 20 ul d'huile minerale sur le melange;
- Placer dans le theruwycleur avec le schéma suivant:
94OC, 4mn, 1 cycle
94T, ~OS, 30 cycles
55"C, ~OS, "
72*C, 908, '
73'C, 5mn, 1 cycle
- Prendre 5 ul du produit PCR dans un gel d'agaroge.
3.2.
Technique de Sequencage.
- Preparer tubes par souche de virus et marquer les tubes T,C,G
et A;
- Ajouter 1 ul de dd/dNTPs dans chaque tube selon l'ordre T,C,G
et A;
- Centrifuger rapidement;
- Stocker à +4OC jusqu'à son utilisaton;
Pour chaque rbaction,
il faut ajouter dans des tubes le reactif
suivant:
template DNA=
3 ul
Sxsequencing
buffer=
4 Ill
32py ATP labelled primer=
1,5 ul
sequencing grade Taq polymerase(5U/ul)=
1 Ill
DEPC-h2o=
10,5 ul
- Mélanger et centrifuger;
- Ajouter 4 ul du Zélande de chaque dd/dNTP;
- Centrifuger;
19
- Ajouter une goutte d'huilt mintralt;
- Mettre dans un thermxycleur B 9PC;
- rbalioer le progrmne suivant:
94*c
2mn
1 cycle
92OC
1lNl
55OC
1mXI
30 CyCltB
72°C
lmn3Os
2o"c
hold
1 cycle
- Ajouter 4 ul de solution d'arrtt dans chaque tube,
- Centrifuger
- Chauffer k 80-9OoC avant de d+oser dans le gel,
- Mettre 2,5-2,5 ul dans chaque puits;
- Mettre un courant de 70 watts pendant 2 heures ou 4 heures;
- Retirer le gel et le faire Bbcher (1,5 heurts à 80-85 OC!];
- Exposer le gel k un film (48 heures & -7O'C)
- Développer le film et lire Belon l'ordre T,C,Q et A.
IV. BIBLIaxAFwIE:
1
Reynolds
Christine.-
Tissue Culture (Techniques des cutures
d e
cellules) .Document
technique du
Laboratoire de
Reference
Mondial pour la fievre aphteuse, Pirbrigt, May 1998, 21 pages.
2
Ferris
Nigel.- Foot and Mouth Disease and Swine vesicular
Diseaae
Virus
Diaagn0sis.A
Manual of
Operations.
Document
technique du Laboratoire de Reference Mondial pour la
fievre
aphteuse, Pirbrigt, January 1998, 43 pages.
3
David.J,Rowlands.
-
Foot and Mouth
Diseasse
viruses. in
Encyclopedy of Virology, 1994, pp 488-496.
4
Ferris Nigel.- Drocedure for producing inactivated,
purified
FMD 1466 antigens.A Manual of Operations.
Document
technique du
Laboratoire de
Reference
Mondial
pour la
fievre
aphteuse,
Pirbrigt,
January 1998, 2 pages.
5
Ferris
Nigel.-
HRL procedure for producing E'MD
anti-1466
sera. A Manual of Operations. Document technique du Laboratoire de
Reference
Mondial
pour la
fievre
aphteuse,
Pirbrigt,
January
1998, 2 pages.
6
!Celli
Rendle.-
Poot and Mouth Disease Antibody
Detection:
Elisa
Manual. A
Manual of
Operations.
Document
technique du
Laboratoire de
Reference
Mondial
pour la
fievre
aphteuse,
Pirbrigt,
January 1998,lO pages.
7
D.J.K Mackay,R.P.Kitching and R.M
hrmstrong.-
Detection of
antibodies
against
vesicular
and
related
viruses by the virus
neutralisation
test
(VNT).Standard Operating Prodedure
(QOP) I
Institute for Animal Health, Pirbright Laboratory, May
1998, 17
pages.
v. ANNEXES:
5 . 1
Resultats des tests de
detection
des antignes
(densites
optiques):
5.1.1 Fiche d'analyse du 28 Avril 1998:
Plaque 1: NF
- hntigenes de Reference=
Faibles eu D.0 en Type 0:
1.791 au lj5,
0.569 au 1/25,
0.112 au 1/125
(DENSITES OPTIQUES FAIBLES)
- Echantillon N 1:Iran 27/95
(suspension originale)= POSITIF en 0 avec D.0 myenne de 0,695
0.715+0.872+0.683/3 = 0.756
0.756 - 0.060 (controle negatif ) = 0.696
- Echantillon N2: Saudia 7/92
(suspension
originale):(NFWWF)
avec des D 0 < 0.1
Plaque II: Y
- hntigenes de Reference= Corrects en D.0
Type 0 :
1.304 (au 1/5),
0.631 (1/25),
0,225 (1/125)
Type A :
2.175 (au 1/5),
1.211 (au 1/25),
0.398 (au 1/125)
- Echantillon N 1:Iran 27/95
(BTYl):POSITIF en type 0:
avec denaite optique moyenne 1.469
- Echantillon N2: Saudia 7/92
(BTYl):POSITIF en type A: avec densite optique moyenne 0,922
5.1.2 Fiche d'analyse du 29 Avril 1998:
Plaque N:l Y
- Antigenes de reference:
Faibles en D.0 en type 0
0.360 (au 1/5),
0.167 (au 1/25),
- 0.013 (I/l251
Echantillon Nl:
- Kuwait 48194 (Original suspension,)
POSITIF en type 0,
avec
optique moyenne de 0.500
22
5.1.3 Fiche d'analyse d u 3 0 Avril 1998:
Plaque NI:Y
Antigene de reference: avec D 0 faibles en type 0 de:
0.393 (au 1/5),
0.019 (au 1/25],
0.049 (au 1/125).
Echantillon Nl:.
Kuwait 40194 BTYl: POSITIF en type 0 avec dcnsite optique moyenne
de 0.489
Plaque NII:Y
Antigene de reference: avec D 0 correctefi :
en type 0:
1.66 (au 1/5),
0.77 (1/25)
et 0.29(1/125)
en type C:
1.64 (au 1/5),
0.75 (1/25)
et 0.26 (au 1/125)
Echantillon Nl:
Kuwait 48194 BTYl: POSITIF en type 0 avec densite optique moyenne
de 1.51
Echantillon 12:
C3 Chaco Parc 74 BHK3: POSITIF en type C avec denaite optique
moyenne de 1.47
5.1.4 Fiche d'analyse du 1 Mai. 1998:
Plaque NI:Y
Antigenes de reference:
avec des densites optiques correctes de:
1.24 (au 1/5),
0.89 (1/X)
et 0.19 (1/125)en type 0
Echantillon Nl
Kuwait 48/94 RS: POSITIF en type 0 avec une densite myenne de
0.96
Echantillon NI1
Cam 8/94 BTYl: POSITIFF en 0 avec une densîte myenne de 1,216
5.2. Resultats du titrage du virus de la F.A
5.2.1 Fiche d'analyse du 5-6/05/1998:
Echantillon Nl:
Antigene 0
BFS
Densites
optique8
moyenne8
obtenues aux dilutions suivante&:
Colonne 1:1/4
2.22
Colonne 2:1/8
2.22
Colonne 3:1/16
2.21
Colonne 4:1/32
2.19
Colonne 5:1/64
2.24
Colonne 6:1/128
2.18
Colonne 7:1/256
2.13
Colonne 8:1/512
1.50
Colonne 9:1/1024
1.09
Colonne 10:1/2048
0.57
Colonne 11:1/4096
0.35
Colonne 12:1/8192
5.22
La dilution antigenique optimale est de 1/512 correspondant a la
densite optique de 1.5. La d&ki.On a utiliser est de 1/256,
cad
la roitie de 1/512.
5.3 Resultats du titrage (Spot test) des serums du 07/05/1998 en
presence de l'antigene 0 BFS.
- Echantillons: 45 serums,
23
- Temin antigene: antigene OBFS,
- Temin serum fort positif anti-0,
- Temoin serum faible positif anti-0,
- Temoin negatif,
La Valeur obtenue en 100% en DO :1.28 (valeur donnee par le
apectrohotometre).
La Valeur obtenue en DO des Temoins:
Temoin antiaene aSPS(dilu8 au 1/16):
1,74; 1,68; 1,87; 1,80
permet de calculer la valeur DO 100 % d'inhibition qui est egale
a 1,74+1,8 = 3,54/2= 1,77 (ecarter les 2 valeurs extremes 1,87 et
1,68).
Elle permet d'interpreter les resultats: Un serum est dit
positif lorsque le pourcentage d'inhibition est superieur a 50%
et il est dit negatif lorsque le pourcentage est inferieur a 50%.
Temin serum fort positif anti-O(diluB au 1/16):
0,06(97%); 0,08(96%); 0.05(97%); 0,06(97%).
Le
termin
positif
est
correct
car
tous
l e s
pourcentages
d'inhibition sont superiears
a 90%.
Temoin serum faible uositif anti-O(dilu& au 1/16):
0,21(88%); 0,27(85%); 0,22(87%); 0,26(86%)
La DO du serum faible positif est correcte elle est situee entre
50% et 90%.
Temoin serum neqatif(dilu4 au 1/16):
1,25(29%);
1,29(27%);
1,19(33%);1,27(28%)
La DO est corrrecte car elle est inferieure a 50% d'inhibition.
La valeur obtenue en DO des 40 echantillons de serums(dilues
au 1/16):
31: 1,3(26%) ET 1,15(35%)
31 est negatif car les DO sont ( a 50% d'inhibition.
52:
0,84(53%) ET 0,71(60%)
S2 est positif car les DO sont > a 50% d'inhibition.
Les autres serums positifs en anticorps anti Type 0 sont au
nombre de 12:
S3(65%);
35(51%);
S15(92%);
916(67%);
S17(91%);
s21(65%);
522(84%);
S23(56%);
524(66%);
S25( 69%);
531(90%) et
836176%).
5.4 Resultats du titrage (Spot test) des serums du 07/05/1998 en
presence de l'antigene A22.
- Echantillons: 40 serums,
- Temin antigene: antigene A22,
- Temoin serum fort positif anti-A22,
- Temoin serum faible positif anti-A22,
- Temoin negatif,
La valeur des DO des temoins est de:
Temin antiaene A22(dilu6 au 1/16):
2,04+2,08=2,12:2=2,06
Cette valeur 2,06 correspond a 100 % de densite optique.
Un serum est positif lorsque le 8 d'inhibition est superieur a
50%. Au contraire, il eat nbgatif lorsque le % d'inibition est
inferieur a 50%.
Temoin serum neaatif(dilu8 au 1/16):
1,86(10%); 1,77(14%); 1,79(13%);
1,85(10%)
Les % d'inhibition sont corrects car sont inferieurs a 50%.
Temoin serum faiblement uositif(dilu& au 1/16):
0,69(66%);0,53(74%);0,63(69%);0,55(73%)
Les % d'inhibition sont corrects car sont situes entre a 50% et
90%.
Temoin serum fortement oositif(dilue au 1/16):
0,43(79%);0,47(77%);0,49(76%);0,43(79%)
Les % d'inhibition sont trop faibles pour un temoin fort positif
et sont inferieurs a 90%.
24
40 Serum8 a tester(dilués au 1/X:):
Les serum8 positifs en anticorps anti Type ~22 sont ceux dont le
% d'inhibition est superieurs a 50% sont au nombre de quatre:
915(53%); 816(90%); s23(86%); s35(71%).
5.5 Resultats du titrage (Spot test) des serums du 07/05/1998 en
presence de l'antigene c.
- Echantillons: 40 serums,
- Tem3in antigene: antigene C,
- Temin serum fort positif anti-C,
- Tenwin serum faible positif anti-C,
- Temoin negatif,
La valeur des DO des temoins est de:
T&uoi.n antiuene(dilué au U16):
2,Ol;
2,02 permet la DO 100 % d'inhibition = 2,01+2,02=4,03/2 #
2,02
NB: on peut egalement calculer le seuil de ponitivite qui est
egal a
2,02/2=1,01.
les sertuns positifs
sont
ceux dont
les
valeurs de DO sont inferieures a 1,Ol. Ce sont les six 6erums
suivants:
S3(0,22 et 0,22); S5(0,57 et 0,59); 814(0,97 et 0,83);
529(0,42 et 0‘35); S30(0,19 et 0,18); S33(0,87 et 0,74).
Temoin serum neqatif en C(dilue au lj16):
ont des % d'inhibition de 6%; 35%; 42% et 4% correcta car ils
sont inferieurs a 50%.
Temin serum faiblement positif en C(dilué au 1/16):
ont dee % d'inhibition de 52%;44%;53% et sont situes entre 50 et
908,
Temoin serum fortement positif en C(dilu& au 1/16):
ont des % d'inhibition de 93%; 93%; 95% et 93% sont superieurs a
90%.
40 serums a tester en anticorps anti-c(dilués au 1/16):
Les
serums
positifs
sont
ceux
dont le 8
d'inhibition
est
superieur a 50%. Ces serums sont les 6 serums S3(90%); s5(71%);
S14(55%); 529(81%); S30(90%); 533(60%).
5.6 Resultats du titrage (FULL test) des serums du 08/05/1998 en
presence de l'antigene 0 BFS.
- Echantillons: 5 serums positifs en O(dilué au 1/16, 1/32, 1/64,
1/128, 1/512, 1/1024 et 1/2048)
- Temin antigene: antigene OBFS(dilué au 1/16),
- Temoin serum fort positif anti-O(dilué au 1/16),
- Temoin serm faible positif anti-O(dilue au 1/16),
- Temoin negatif(dilué au 1/16),
La valeur des DO des temoins est de:
T&kn antigene:
2,13;
2,04 permet la DO 100 % d'inhibition = 2,13+2,04=4,17/2 #
2,08 correspond a la valeur 100% de D.o pour le calcul de %
d'inhibition.
NB: on
peut
calculer
l e s
seuil de
positivite
des
8erunw
(Thresold):
2,08/2=1,04.
Les
serums
positifs
ont
des DO
infereiurs au seuil de positivité 1,04.
Temoin serum neqatif en 0:
2%; 11%; 7%: 41% sont corects car ils sont inferieurs a 50%
Temoin serwn faiblement positif en 0:
66%; 80%; 63%; 63% sont des DO corectes car aituees netre 50 et
90 % d‘inhibition.
Temoin fortement positif en 0:
91%; 91%; 92%; 92% sont corrects car superieurs a 90%.
Titre des 5 serons:
les serums ont ete dilues au 1/16;
1/32; 1164; 1/128;
1/256;
11512;
11'1024 et 1/2048,
2s
Les titres obtenus sont :Sl= 1/22; 32x16; 53=1/22; s4=1/448; SS=
1/64.(Conférer 1'Àppendix 2 titres selon la mkthode Karber de
&rums dilués en 2 cupules).
Interpretation des resultats:
Un serum est dit positif de facon apecifique lorsque le titre est
> 45.
Le serum est dit protecteur lorsque le titre est > 100. Alors lea
animaux presentant ces taux d'anticorps sont dits proteges.
5.7 Resultats du titrage (F'ULL test) des serums du lWO511998 en
presence de l'antigene 0 BFS.
- Echantillons:5 serums positifs en C(spot test)
- Temin antigene: antigene CBKS,
- !kmoi.n serum fort positif anti-0,
- %min serum faible positif anti-0,
- Tem0i.n negatif,
La valeur des DO des temoins est de:
p?moin antiaene 0:
2,07;
2,09
permet d e
calculer
l a
valeur
100% DO:
2,07+2,09=4,16/2=2,08.
NB: le seuil de positivite en DO est 2,08/2=1,04. Les serums dont
la DO moyenne est inferieure a
1,04 sont dits
positifs, au
contraire
lorsque la Do est superieur a 1,04,
le serum est
negatif.binsi les titres des serums sont les suivants: 81: DO
1,Ol a la dilution 1/1024 donc titre est egal a 1448;
S2=724 i
93=45; s4=181 et s5<16.
Temin serum nesatif:
6%;7%;1% et 3% ont des pourcentages corrects car Inferieurs a 50%
d'inhibition,
Temin serum faiblement wsitif:
64%; 71%; 68%; 69% sont corrects car situes netre 50 et 90%
d'inhibition.
Temoin 8erum fortement uositif:
94%;
94%;
94% et 95%
sont
corrects
car
superieurs a
9 0 %
d'inhibition.
Titre des 5 serums testes:
Le serum est positif aux dilutions dont le 8 d'inhibition est
superier a 50%.Ainsi,
le serum 1 est positif jusq'a la dilution
1024 d'ou le titre 1448. Les autres
serums
ont
l e s
titres
suivants:
92=724; S3=45; S4=181; S5<16.
5.8 Resultats de la caracterisation d'une souche du virus de la
fievre aphteuse du 14/05/1998.
5.8.1 Titrage de la souche virale de type 0 avec les antiserums
de reference 0 BFS; 0 Mani&a et 0 Hong Kong,
Lc virus est dilue de 2 en 2 de 1/2; 114; 1/$; 1/16; 1/32; 1164;
11128 et 1/256. Le titre du virus est a la valeur de ~0 entre 1
et 1,5.
Titre avec 0 BFS: 32 (les DO sont de 1,12; 1,29; 1,41; 1‘42 a la
dilution 1/32) donc le virus peut etre utilise en titrage de
serum a la dilution 1/16 cad 32/2.
Titre avec 0 Manisa: 32 (les DO sont de 1833; 1,33; 1‘34 et 1,28
a la dilution de 1/32)
donc le virus peut etre utilise en titrage
de 8erum a la dilution 1/16 cad 32/2.
Titre avec 0 Hong Kong: 64 (les DO sont de 1,42; 1,40; 1,25 et
1,23 a la dilution de 1/64) donc le virus peut etre utilise en
titrage de serum a la dilution 1/32 cad 64/2.
5.8.2 Caracterisation de la souche virale avec le serum de
reference.
- Souche vaccinale,
- Souche virale a caracteriser
- Serum de reference
26
La moyenne des Deneites optiques avec 24 cupuA;s contenant i.
souche
vaccinale:1,17+1,27=2,44/2=1,22
w---t
calculer
seuil de positivite 1,22/2=0,61 pour le titrage du serum de
reference.
Le
titre du serum est obtenu par la dilution qui donne une
moyenne de DO = ou le plus proche de la DO de 0,61, dans ce cas,
de la
dilution
1/4096
dont
les DO
sont
~155+o"'~?:: 06/2=0 53.
LL moienne' des densites
optiques
avec 24 cupules contenant la
souche
virale a caracteriaer:
0,98+0,95=0,96 pour un seuil de
positivite de 0,96/2=0,48.
Le titre est donne par la dilution de 1/8192 dont la DO moyenne
est de 0,47+0,53=0,5.
La R value est de 4096/8192=0,5.
5.8.3
Interpretation:
La R value <0,2 signifie que le vaccin ne protege pas contre la
souche
isolee.
La r value =l signifie que le vaccin protege bien.
5.9:
APPEHDIX
SELOI LA Klkl!HODS DE KARBBR: CALCUL Dl5 TITRE DE
&RUMS CWJJWUS PAR LA FUI& TEST :
Rangbe
Rang8s Rang&3
Ranghe Rang&3
Rang&e
Rangtie
Rang&e
A
B
c
D
E
F
(3
E
P*lut~
TITRE-
1/16
1/32
1/64
1/128
1/256
1/512
1/2048
t
1/16
t
t
il22
+
t
+
1/32
t
t
+
t
1/45
t
t
t
+
+
1164
t
t
t
t
t
t
1/90
t
t
t
t
t
t
t
1/128
t
t
t
t
+
+
+
+
1/181
t
t
t
t
t
+
t
t
t
1/256
+
t
+
t
t
t
t
t
t
t
1/36â
+
t
t
t
t
t
t
t
t
t
1/512
+
t
t
t
t
t
t
+
+
+
1/724
+
t
+
t
t
t
t
t
t
t
+
111024
t
+
t
t
t
t
t
t
t
t
1/1448
t
+
t
t
t
t
t
t
t
1/2048
27
5.10: Test de s6roneutralisation du virus de la fibre aphteuse
( Gamme de dilutions du virus).
Dilutions de
Volume
virus
(en ml)
Virus
Diluant
Total
10-l
0,5
4,5
5,o
10'2
0,5
4,s
5,o
10-J
1‘5
13‘5
15‘0
m-3,3
6
6
12,0
la-316
5
5
10,o
10-4~2
1
3
4,o
10-4L,8
1
3
4,o
lO--5,4
1
3
4,o
10-6
1
3
4,o
10-6,6
1
3
4,o
10-9,~
1
3
4‘0
Exemple de lecture:
10-L
100% (16 sur 16)
10-2=
100% (16 sur 16)
10'3=
100% (16 sur 16)
10'3,3= 100% (16 sur 16)
lO-3,6= 50%
(08 sur 16)
lO-4,2= 0%
(00 sur 16)
Le titre e8t de 10-3r3+O16, 10-3,9,
NB:
le nombre 0,6 correspond à 8 cupules avec ECP sur 16 cupules
inoculls,
28
5.11: Test de séroneutralisation du virus de la fi8vre aphteuse
(Gamne de lecture de Titrage du virus: 2 plaques de 8 cupules par
dilution soit soit 16 cupule8pour le8 2 plaques).
Nombre de cupule8 po8itif8
Fraction c
ajouter *
l a
sur le8 16 inocules
dernière dilution avec lOIA ECP
Of16
0‘30
l/lO
0,34
2/16
0,38
3116
0,41
4/16
Q,48
5/16
0,49
6/16
0,53
7/16
0,56
8/16
0,60
9110
0,64
10/16
0,68
11/16
0,71
12/16
0,75
13/16
0,79
14/16
0,83
15/16
0,86
16/16
0‘90
29
Dr A.I.Donaldson,
Directeur du Laboratoire de Pirbright.
Dr R.P. Kitching,
Directeur du Laboratoire de Reference Mondial
pour la fievre aphteuse,
Dr D. Mackay, Directeur du Laboratoire de Reference de la
Comwnaute pour la fîevre aphteuse.
Dr Nigel Ferris, Chercheur au Laboratoire de Reference Mondial
pour la fievre aphteuse.
Mr Jef, Technicien au Laboratoire de Reference pour la fievre
aphteuse,
Mrs Christine Reynolds, Responsable des cultures de cellules au
Laboratoire de Reference Hondial pour la fievre aphteuse.
R,M Armstrong, Responsable de la seroneutralisation au
Laboratoire de Reference Mondial pour la fievre aphteuae.
Teli.
Rendle, Reaponsable des tests serologigues au Laboratoire
de Referencc Mondial pour la fievrc aphteuse.
Linda Turner, Technicienne au Laboratoire de Reference Mondial
pour la fievre aphteuse.
Anne Qardner,
technicienne au Laboratoire de Reference Mondial
pour la fievre aphteuse.
__--m.---------------
-m--e
INSTITUT SENFZALAIS
DE'RECHEWHES AGRICOLES
_-------------------___^_
LABORATOIRE NATIONAL DE
INSTITUTE FOR ANIMAL
L'ELEVAGE ET DE ‘RECHERCHES
HEALTH
B.P.2057 Dakar-Hann
PIRBRIGHT LABORATORY
Tel: 221 832 36 78
Ash Road, Pirbright
Fax: 221 832 21 18
Surrey GU24 ONF
United Kingdom
Tel: 44 01483 232441
Fax: 44 01483 232440
TECHNIQUE3 DE DIAGNOSTIC DE LA FIEVRE APHTEUSE:
TECHNIQUES DE CULTURE DE CELLULES,
DE DETECTION DE L'ANTIGENE VIRAL, DES ANTICORPS ANTI
VIRUS, DE POLYMERASE CHAIN REACTION ET DE SEQUENCAGE,
Rapport de otage effectue du 21 avril au 21 Mai 1998 par Yaya
Thiongane au
Laboratoire de
Reference
Mondial de la
Fievre
aphteuse de Pirbright, Woking, Surrey, Grande Bretagne
Mai 1998
i
PROGRAMME
1.
Semaine du 21 au 25 Avril 1998.
1.1. Presentation des regles de securite en usage au
Laboratoire de Pirbright.
- Presentation du laboratoire.
- Visionnage de Films sur la securite.
- Etablisaenmt de Badges.
1.2.Techniques de cultures de cellules:
- Cellules de lignee de rein de porc.
- Cellules primaires de thyroide de veau.
II.
Semaine du 28 au 1 Mai 1998.
(avec Nigel Ferris)
2.1. Tests de detection de l'antigene du virus.
2.2. Techniques de preparation des reactifs,
III. Semaine du 4 au 8 Mai 1998.
(avec Teli Rendle)
3.1. Tests de detection des anticorps anti-virus.
- Technique de titrage de l'antigene du virus de
la F.A.
- Technique de titrage de l'anticorps anti-
virus de la P.A.
3.2. Technique de caracterisation du virus de la F.A.
IV.
Semaine du 11 au 15 Mai 1998.
(avec Bob Armstrong, Sott & David)
4.1. Technique de seroneutralisation,
4.2. Technique de P.C.R.
4.3. Technique de sequencage.
V.
Semaine du 18 au 21 Mai 1998.
(avec P,Kitching)
5.1.
Synthese.
5.2. Visite de l'inscctarium.
5.3. Visite du Laboratoire MARIAL,
5.4. Le 21/05/98 retour au Senegal.
PIAIV
GENERALI!!ES SUR LA FIEVRE APHTEUSE.
1 TECHNIQUES D'ISOLEXEIT DU VIRUS DE LA FIEVRE
APHiiEUSE.
1.1
Techniques de culture des cellules
primaires de thyroide de veau.
1.2
Techniques d'isolement du virus.
II. TECHl?IQUES SEROLOGIQUES.
2.1
Technique de detection des antigenea.
2.2
Techniques de detection des anticorps:
2.2.1 Titrage de l'antigene.
2.2.2 Titrage du Serum par Elisa,
2.2.3 Titrage du serum par SN.
2.3
Technique de caracterisation du virus.
2.4
Technique de skoneutralisation.
III. TECHIVIQUES GENETIQUES.
3.1.
Technique de Polyrerase Chain Reaction.
3.2.
Technique de Sequencage,
IV. BIBLIOGRAPHIE.
v. ANNEXES.
Resultats des tests realises du 21/04 au 21/5/1998 au
laboratoire de Reference Mondial de la fievre aphteuse.
VI. REMERCIEMEHTS.
1. G&?&RBLITÉS SUR LA FIkVRE APHTEUSE.
La fievre aphteuse est une maladie
infectieuse et
fortement
contagieuse due a un virus du genre Aphtovirus
de la famille dea
Picornaviridae
et
atteint
plusieurs
espèces
animales,
essentiellen4ant les bovin%, les porcins,
plus raremsnt les petits
ruminant% et les dromadaires. Slle se manifeste par une forte
morbidito,
une faible mortalit6 et des Usions
vksiculeuse et
érosives des muqueuses de la bouche, de la peau des espaces
interdigités
et des mamelles. Elle est a l'origine de pertes
economiques
importantes
surtout dans les elevages intensifs par
l'arret de la production laitiere et de la restriction
des
exportation% des produits d'origine animale% des pays atteints,
La fièvre aphteuse, maladie de la liste A
, de l'OR5, est tres
largement rhpandue mais reste endémique dans les pays tropicaux.
Elle
est
absente
d e s
regions comne
l'Ar&rique du
nord,
1 ‘Australie,
la Nouvelle Zélande et le Japon. La maladie a dté
éliminée
de Europe par
la vaccination et
des
mesures de
prophylaxie sanitaires strictes consne l'abattage, le contrôle des
importations et les mesures de quarantaine.
Dans les zones endkniques,
la persistance de la maladie est
favorisCe par l'existence de porteurs sains, l’absence ou les
probl&me% de la vaccination et les mdes d'elevage utilises.
Le virus
presente 7a6rotypes: O,A,C, SATl,
SAT2,SAT3 et Asial.
Les serotypes O,A,C sont largement r4pandus
mais les serotypes
!3AT1,2,3 restent confinés au continent
africain
alors que le
serotype ARIA 1 est rencontre uniquement en Asie.
Au laboratoire, le
cobaye et le
souriceau
nouveau-né (voie
intraperitoneale)
sont utilises pour
le diagnostic (isolement et
titrage du virus).
Les
cellules
primaires (de bovins et de
porcin&) et les cellules de lignée consne la BHK21 peuvent être
utilisbeo,
Les test8 %&rologique% conme la fixation du complément
et 1'ELISA sont utilise% pour les enquetes epid&niologique%,
La lutte contre la maladie passe par l’application de mesures
sanitaires
strictes
dans les
zones
indemnes.
Dans les
2ones
endémiques, la
vaccination en
masse
des
espkes
animales
sensibles permet soit d'éradiquer la maladie ou de réduire son
impact à un niveau acceptable.
4
1 IECHNIQUEB D'ISOLENEXC DU VIRUG DE LA FIÈVRE APHTEUSE.
1.1
Techniques de culture des cellules primaires de thyro!ide de
Veau.
111 Matériels:
- Boite d'instruments avec: pince, ciseaux, bistouris et lames;
- Flacons de PBS 88118 Ca-Mg avec antibiotiques;
- Flacons de milieu MEMG avec 10% de SV;
- Bechers;
- Pipettes de 5 et 10 ml;
- Thyroïde de foetus ou de veau;
- Flacon d'enzyme (Dispase au Trypsine);
- Flacon de Trypan Bleu;
- Barreau aimant&;
- Hematimetre;
- Entonnoir avec de la gaze;
112:
Découper la Thyroïde:
- DBbarrasser la thyroïde des tissus et de la graisse
qui
l'entourent;
- Rincer la
glande
avec de
Tampon
PBS
sans
ca-Mg
avec
antibiotiques;
- Découper la glande dans un bêcher vide en menus morceaux;
- Rincer (10 fois) les morceaux .dans le mi5m tampon;
- Reprendre les morceaux dans du milieu de culture a 10% de SV;
- Laisser la glande dans son milieu de culture a +4c pendant une
nuit.
113: Digérer la glande avec de la Dispace:
- Débarrasser la glande de son milieu de culture;
- Rincer la glande
avec le n&ne tampon PBS sans Ca-Mg avec
Antibiotiques;
- Ajouter 100 ml de dispase et mettre sous agitation a 37°C
pendant une heure;
- Reprendre la Diepase surnageant les morceaux de thyroïde;
- Centrifuger 2000 t/mn pendant 10 mn;
- Ajouter 100 ml de dispase frais aux morceaux de thyroïde pour
une seconde digestion de 1 heure a 37°C;
- centrifuger 2000 T/mn pendant 10 mn;
114: Ensemencer les cellules de thyroïde:
- Reprendre
l e s
culots
de centrifugation dans
du milieu de
culture a 10% de SV;
- Numerer les cellules;
- Filtrer les cellules;
- Diluer les cellules dans du milieu de culture a 10% de Sv de
manière a avoir 106 cellules par ml;
- Repartir les cellules dans les tubes ou des flacons;
- Incuber les tubes et les flacons a 37OC.
Le tapis cellulaire se developpe en 48 heures et
presente des
cellules epitheliales et des cellules fibroblastiques,
1.2
Technique d ’ isolement du virus.
Elle permet d'isoler le virus de la FA a
partir d'échantillon
(Cpithélium lingual, sang, raclage du pharynx)provenant d'animal
suspect ou de surnageant de cellules infectées sur des
cultures
de cellules de thyroïde de veau ou des cellules de lignbe de rein
de porc.
1.2.1:
Preparation de l'echantillon:
- Bortir le
prBl&vement de son milieu de transport(Tampon PBS
glycérol) et decouper un morceau de ce pr$Sbwnent et le peser et
d&ernùner la quantité de tampon a employer
pour
obtenir
u n e
suspension a lO%, came par exemple: le poids de l'échantillon de
0.627 g a multiplier par 9 pour obtenir 5.643 ml de tampon PBS a
utiliser pour une suspension de 10%.
NB: Le virus de la FA est tres sensible au pH acide alors Il faut
verifier le pH du milieu de transport de l'échantillon avec une
solution de rouge de phénol: ajouter a 6 gouttes du milieu de
traneport le m&m nombre de gouttes (6) de solution de rouge de
phenol et apprecier
le pH du milieu de transport par la couleur
du mélange obtenu.
- Broyer le pr61ibwmnt avec du sable stbrile dans un mortier
avec un pilon mais auparavant il faut avoir decouper le morceau
de tissu en petits fragments avec les ciseaux,
- Centrifuger le broyât a S-6000 t/mn pendant 10 mn,
- Rkupher le surnageant
(contenant le virus ) dans un tube de
10 ml et reprendre 1.4 ml de ce surnageant dans un tube de 2 ml
pour la recherche de l'antigene viral par la technique ELISA,
1.2.2: Inoculation des cellules en tubes (cellules de thyroïde de
veau et cellules de rein de porc) par 0.2 ml. du surnageant:
- Vider le surnageant des cultures de cellules de 5 tubes par
type de cellules,
et prévoir des tubes de cellules tkmin de
thyroïde de veau et de rein de porc,
- Ajouter 0.2 ml de surnageant viral a 'chaque tube soit 2 ml de
surnageant pour les 2x5 tubes de cellules de thyro'ide de veau et
de rein de porc,
- Incuber les 10 tubes de cellules inoculees et les 10 tubes de
cellules t&moin a 37 C pendant 30 mn (face du tube avec les
cellules vers le bas pour que l'inoculum puisse recouvrir les
cellules),
- Ajouter 1 ml de milieu de culture aans s6rum aux 20 tubes (10
tubes inocule8 et 10 tubes t&irkGn),
- Incuber les tubes a 37C sur des supporta roulants
1.2.3 Mise en Evidence de la prbence du virus de la FA par
l'apparition
de l'effet cytopathogene au bout de 24 heures (le
virus est alors isole): les cellules primaires de porc aont les
plus sensibles que les cellules de lignbe de rein de porc,
- Rhupher le
surnageant
d e s
tubes
presentant un
effet
cytopatogene (ECP) (contenant le virus de la FA) dans un tube de
10 ml par type de cellules.
NB: Le surnageant
des cellules avec ECP est traite came le
broyât de 1'Bchantillon (Etape 1,2,1) pour la dbtection de
l‘antigène viral par la technique ELISA.
NB: Le Virus de la FA est trés sensible aux variations de PH,
surtout très sensibles aux PR acides (inactivation aux pW6.8).
II. TECHHIQUES SEROLOGIQUEB:
Z.l.Technique de detection des antigenes.
Elle permet de determiner le ou les types d'antigenes 0, A, C,
SATl, SAT2, SATS, ASIAl du
virus de la fievre aphteuse
presenta
dans les echantillons
lepitheluim
lingual,
sang,
raclage du
pharynx) provenant d'animal suspect ou dans les surnageant8 de
cellules infectees de thyroide de veau (cellules primaires) ou de
rein de porc (cellules de lignee) par la technique Elisa.
2.1.1 Materiel et reactifs necessaires:
2.1.1.1 Materiel:
- Spectrophometre
- Agitateur de plaque
- Laveur de plaques
- Pipette:
multicanaux (5-50~1,
50-300ul),simples (l-lOu1, 5-4Ou1,
40-200~1,
200-1000u1)
- Rigolee pour reactifs:
a 8 compartiments pour 8 reactifs differents
a 1 compartiment pour 1 reactif
- Appareil de distillation d'eau (eau de type 1, resistivite de
18 megohms,sans
agent6 pyrogenes)
- Microplaques
a 96 cupules
-Refrigerateur (temperatures de + 2 a +6 C)
- Congelateur (temperatures de -15 a -20 C)
- Incubateur(temperatures de t 35 a t39 C)
- Bain Marie (temperatures de + 35 a t39 C)
- Phuwtre
- Verrerie:
Bechers de
20-4OOOml,
eprouvettes de
10-2000 ml‘
pippettes
graduees de 1 a 20 ml, flacons de 1 a 100 ml, tubes de 2 a 4 ml
et leurs boites de rangement, , bidons de 5 a 10 litres
- Cryotubes de l-5 ml
Melangeur Voortex,
- Balance de precision (+/- 0.1 mg)
- Mortier et pilon
- Sable sterile
- Minuteur avec alarme,
- Serviette et papier buvard,
- Etiquettes collantes et marqueurs indelebiles
2.1.1.2 Tampons et reactifs:
- Tampom PB3,
- Tampon de sensibilisation,
- Tampon de dilution des antigenes,
- Tampon de dilution du serum de detection et du conjugue,
- Solution chromcgene ou OPD,
- Eau oxygenee,
- Solution d'acide sulfurique,
- Solution desinfectante,
- Solution de rouge de phenol,
- Solution d'aaide,
- 8olution de lavage des plaques,
- Serum de lapin anti 8 serotypes du virus de la FA (0, A, c,
SATl,
SAT2,
SAT3,
ASIAl,
SVDV) et du
virus de
la maladie
vesiculeuse du porc,
- Serum de cobaye anti 8 serotypes du virus de la FA et du virus
de la maladie vesiculeuse du porc,
- Serum de lapin anti imnunoglobuline de cobaye conjugue a la
peroxydase,
7
- Antigenes de reference (8 serotypes du virus de la FA et de la
maladie vesiculeuse du porc),
2.1.2 Sensiblisation des plaques avec les serums de lapin anti-
serotypes 0, A, c, SA!rl, 6A!r2, w3, AmAl et SVDV:
- Preparcr du tampon de fixation a pH 9.6+/-0.05:
Dissoudre une capsule de carbonate-bicarbonate dans 100 ml d'eau
distillee (tampon a 0.05M) et a garder a +4c pendant une semaine,
Diluer les 8 serums de lapin anti types 0, A, C, SATl,
SAT2 r
SAT3, ASUI et SVDV au 1/1000 dans le tampon de fixation a pH
9.6, soit 1 ul de serum anti-types dans 1000 ul (1 ml)
NB: la dilution se fait dans un rigole a 8 canaux.
Repartir le8 8 serums de lapin anti-seratypes dilues au l/lOOO
dans les 8 rangees de la paque, a raison de 50 ul par cupule:
Rangee M-12:
SEROTYPE 0
Rangee Dl-12:
SKROTYPR A
Rangee Cl-12:
SERomPg C
Rangee Dl-12:
SERGTYPE SATl
Rangee El-12:
SERGTYPR SAT2
Rangee Fl-12:
SZROTYPE SAT3
Rangee Gl-12:
SEROTYPE ASIAl
Rangee Hl-12:
SEROTYPE SVDV
Placer les plaques a 37 C pendant 1 heure sous agitation ou + 4 c
pendant une nuit.
2.1.3 Repartition des antigenes de reference et des echantillons
suspects:
- Laver les plaques 3 fois 'avec du PBS,
- Diluer les antigenes de reference 0, A, C,
SATl, SAT2, SAT3,
ASIAl, SVDV au 115,
11'25 et 1/125 dans les 3 premieres colonnes
1, 2, 3 de la plaque
Colonne 1:
antigenes de reference OI A, C, SATl, SAT2, SAT3, ASIAl,
SVDV au
1/5, (80 ul de tampon avec 20 ul d'antigene):
1A: antigene de reference 0 diliue au 115
1B: antigene de reference A diliue au 1/5
1C: antigene de reference C diliue au 115
1D: antigene de reference SATl diliue au 1/5
1E: antigene de reference SAT2 diliue au 1/5
1F: antigene de reference SAT3 diliue au 1/5
1G: antigene de reference ASIN diliue au 1/5
1H: antigene de reference SVDV diliue au 1/5
Colonne 2:
antigenea de reference 0, A, C, SATl, SAT2, SAT3, ASIAl, SVDV au
1/25,(80 ul de tampon avec 20 ul d'antigene de la colonne 1)
2A: antigene de reference 0 diliue au 1/25
2B: antigene de reference A diliue au 1/25
2C: antigene de reference C diliue au 1125
2D: antigene de reference SATl diliue au 1/25
2E: antigcne de reference SAT2 diliue au 1/25
2F: antigene de reference SAT3 diliue au 1/25
2G: antigene de reference ASIAl diliue au 1/25
2H: antigene de reference SVDV diliue au 1/25
Colonne 3:
antigenes de reference 0, A, C, SATl, SAT2, SAT3, ASIAl, SVDV au
1/125,(80 ul de tampon avec 20 ul d'antigene de la colonne 2)
3A: antigene de reference 0 diliue au 1/125
3B: antigene de reference A diliue au 11125
8
3~: antîgene de reference C diliue au 1/125
3D: antigene de reference SATl diliue au lf125
3E: antîgene de reference SAT2 dîliue au 1/125
38: antigene de reference SAT3 diliue au 1/125
36: antigene de reference ASIAl diliue au 1/125
3H: antigene de rcference SVDV diliue au 1/125
NB: les 8 aatigenes de reference sont directement dilues dans la
plaques dans les rangees correepondantb; a leurs serotypes dans du
tampom PBS avec rouge de phenol.
- Repartir les echantîllons non dilues dans les autres colonnes
et rangees de la plaque: le reste de la plaque est utilise pour
deux
echantillons:
Colonnes 5A-H,6A-H,7A-H : Echantillon NI non dilue, a raison de
50 ul par cupule,
Colonnes 9A-H,lOA-H,llA-H: Echantillon N2 non dilue, a raison de
50 ul par cupule,
- Retenir les colonnes 4A-H,
8A-H I
12A-H pour des
oolonnes
temoins negatifs, a raison de 50 ul de tampon PBS par cupule (pas
d'antigene,
pas d'echantillon),
- Incuber la plaque a 31 C pendant une heure sous agitation,
2.1.4 Repartition des serums de detection de cobaye antiserotype
0, A, C, SATl, SAT2, SAT3, ASIAl, SVDV:
- Laver la plaque 3 fois dans du tampon PBS,
- Preparer le tampon de detection : du tampon PBS a 5 % de lait
ecreme
- Diluer les serums de cobaye antiserotypes 0, A, C, SA!f!l, SA!l!2,
sAT3,
ASIAL, SVDV au 11100, a raison de 10 ul dans 1000 ul de
tampon de detection,
(A?B:Les dilutions sont faites dans USJ rigole a 8 rangees.]
- Repartir les serums de cobaye anti-serotype dilues a raison de
50 ul par cupule, un serotype par rangee:
Rangee Al-12:
ANTI-SEROTYPE 0
Rangee El-X?:
AETI-EEROTYPE A
Rangee Cl-12:
ANTI-SEROTYPE C
Rangee Dl-12:
ANTI-SEROTYPE SATl
Rangee El-12:
ANTI-SERGTYPE SAT2
Rangee Fl-12:
ANTI-SEROTYPE 3AT3
Rangee Gl-12:
ANTI-SEROTYPE ASU
Rangee Hl-12:
ANTI-SEROTYPE SVDV
- Incuber a 37 C pendant une heure sous agitation,
2.1.5 Repartition du serum de lapin conjugue avec la peroxydaoe
- Laver la plaque 3 fois avec du tampom PBS pour enlever le serum
de cobaye,
- Diluer le serum de lapin anti-cobaye conjugue au 1/200,
raison 35 ul dans 7000 ul de tampon de detectîon
(oad a 5 B dz
lait ecreme)
9
- Repartir 50 ul du serum de lapin conjugue dilue dans tous les
cupules, a raison de 50 ul par cupule,
- Incuber a 37 C pendant 40 mu et sous agitation,
2.1.6 Repartion du substrat de l'enzyme peroxydase
- Laver 3 fois avec du tampon PBS pour eli.mi.mr
le serum conjugue
(DB: toute trace de conjugue peut fausser la lecture ulterieure)
- Preparer le subtrat de l'enzyme: de l'eau oxygenenee dilue a
1/2000 dans de l'OPD, a raison de 5 ul de H202 dans 10 0000 ul de
OPD,
- Repartir 50 ul du substrat dans tous les cupules, a raison de
50 ul par cupule,
- Laisser la plaque a la temperature ambiante (a
l'obscurite)
pendant 15 mn,
(T@&er le substrat en melangeant SO ul de conjugue dilue a 50 ul
. de subtrat par I'apparition de la coloration, temin de l'action
enxynatique)
2.1.7 Arret de la reaction enzymatique avec de l'acide
- Repartir 50 ul de solution acide par cupule pour arreter la
reaction
enaymatiaue,
2.1.8 Lecture des densites optiques a 492 nm
- Lire les plaques au spectrophotometre a la longueur d'onde de
492.
- Les cupules contenant les antigenes de reference sont toutes
colores
avec
une
intensite decroissante
avec la dilution de
l'antigene.
- Les echantillons positifs sont colores au niveau de la rangee
contenant le type d'antigene viral en cause: par exemple, urne
coloration de l'echantillon au nieau de la rangee D montre un
antigene du type BAT1
Rangee Al-12:
SEROT!E'R 0
Rangee Bl-12:
SEROTYPE A
Rangee Cl-12:
!3RROTYPE C
Rangee Dl-12:
SEROlWE SATl (Colore aux D5D6D7)
Rangee El-12:
SEROTYPE SAT2
Rangee Fl-12:
SEROT!fPE SAT3
Rangee Cl-12:
SEROTYPE ASIAl
Rangee Hl-12:
SERCTYPE SVDV
2.1.8
Interpretation;
Le prelevement posscdc un antigent du virun de la FA du type
SATl .
2.2.Technique de titrage de l'antigeae du virus de la
fievre aphteuse.
Elle permet de quantifier l'antigene
(virus titer) present dans
l'echantillon viral (surnageant de culture de cellules infectees)
et de determiner la dose d'antigene neceaaaire pour les tests
serologiques (dilution for reaction with serum),
221 Materiel:
22llMatériel
- Spectrophometre
- Agitateur de plaque
- Laveur de plaque&
- Pipette:
multicanaux (5-5Ou1,
50-300ul),&imple& (l-lOu1, 5-4ou1,
40-200111,
zoo-1000u1)
- Rigoles pour reactifs:a 1 compartiment pour 1 reactif
- AnPareil de distillation d'eau (eau de type 1, resistivite de
18 &gohm,sans agents pyrogenes)
Microplaques B 96 cupules pour test ELISA
Microplaques à 96 cupule& pour test Fixation du compltint
Refriaerateur (temperatures de t 2 a t6 C)
Congeiateur (temperatures de -15 a -20 C)
Incubateur(temperature& de t 35 a t39 C)
Bain Marie (temperatures de t 35 a +39 C)
Phmetre
Verrerie:
Bechers de
20-4OOOml.,
eprouvettes de
10-2000 ml,
pippettes
graduees de 1 a 2 0 ml, flacons de 1 a 1 0 0 m l , tubes de 2 a 4 ml
et leurs boi.te& d e rangement, , bidons de 5 a 10 litres
- Cryotubes de l-5 ml
Melangeur Voortex,
- Hinuteur avec alarme,
- Serviette et papier buvard,
- Etiquette& collantes et marqueurs indelebiles
2.2.1.2 Tampon& et reactifs:
- Tampom PBS,
- Tampon de sensibilisation,
- Tampon de dilution des antigenea,
- Tampon de dilution du serum de detection et du conjugue,
- Solution chromogene ou OPD,
- Eau oxygenee,
- Solution d'acide sulfurique,
- Solution desinfectante,
- Solution de rouge de phenol,
- Solution d'azide,
- Solution de lavage des plaques,
- Serum de lapin anti 8 serotypes du virus de la FA (0, A, C,
SATl,
SAT2,
SAT3,
ASIAl,
SVDV) et
du virus de
la maladie
vesiculeuse du porc,
- Serum de cobaye anti 8 serotypea du virus de la FA et du virus
de la maladie vesiculeuse du porc,
- Serum de lapin anti imnunoglobuline de cobaye conjugue a la
peroxydase,
- Antigenes de reference (8 serotypes du virus de la FA et de la
maladie vesiculeuse du porc),
222 Methodes:
2221 Sensiliser les plaques de fixation (Coat fat bottomed Elisa
plates ):
- Preparer une dilution au 1/5000 du serum de lapin antiserotype
dans le tampon de fixation a pH 9.6,
- Repartir 100 ul par cupule du serum de lapin dilue dans tous
1~ cupule& de la plaque,
- Placer
l e s
plaques a la
temperature
ambiante
dans
u n e
atmosphere humide (ou chambre humide) pendant toute une nuit,
2222 Diluer l'antigene viral dans une plaque pour fixation du
complemsnt ou
plaque de
dilution
(Round-bottonmed CF-Carrier
plates):
11
- Diluer la suspension antigenique de 1/'2 en 1/2 avec du tampon
ma Tween:
- Repartir 50 ul de tampon PBS 'Rieen dans tous les cupules
- Ajouter 50 ul de solution antigenique dans 50 ul de tampon PBS
Tween pour obtenir la dilution 1/2 dans la colonne 1, ensuite 50
ul de la dilution au 1/2 dans les cupules de la colonne 2 pour
une dilution au 1/4.
ainsi de suite jusqu'a la dilution 1/4096 au
niveau de la colonne 12),
- Ajouter 50 ul de tampon PI39 Tween dans
chaque
cupule pour
obtenir 100 ul dans chaque cupule de la plaque et doubler
l e s
precedentes dilutions, ainsi la dilution sere de 1/4 dans la
colonne 1 et 118192 dans la colonne 12,
- Placer les plaques a +4C pendant une nuit et sous agitation,
2223 Transferer les dilutions antigeniques dans la plaque Elisa:
- Laver les plaques ELisa 3 fois avec du tampon PBS,
- Transferer les dilutions antigeniquea, a raison de 50 ul par
cupule, dans la plaque Elisa, en respectant l'ordre croissant des
dilutions de 1/4 au 1/8192.
- Placer les plaques a +37C pendant une heure et sous agitation,
2224 Ajouter le serum de cobaye anti-serotype (Blocked Guinea pig
anti-sera):
- Laver les plaques 3 fois avec du tampon PBS,
- Diluer le serum au l/lOOO (pour plaque: 5 ul de fterm dans 5 ml
de PM),
- Repartir 50 ul du serum dilue dans chaque plaque du seroype
correspondant 0, A, C,..
- Placer les plaques a t37C pendant une heure et sous agitation,
2225 Ajouter le conjugue (Blocked conjugate) dilue au 111000:
- Laver les plaques 3 fois avec du tampon PBS,
- Diluer le cojugue au l/lOOO (pour plaque: 5 ul de serum dans 5
ml. de PBS),
- Repartir 50 ul du conjugue dilue dans toutes les plaques.
- Placer lee plaques a t37C pendant une heure et sous agitation,
2226 Ajouter la solution de revelation OPD activee avec de l'eau
oxygenee:
- Preparer une solution d'OPD avec une tablette d'OPD dans 55 ml
de tampon Phosphate-Citrate,
- Preparer
une
solution au
1/2000 d'eau
oxygenee
avec de
l'OPD(pour une plaque : 2,5 ml dans 5 ml d'OPD),
- Distribuer 50 ul de cette solution dans chaque plaque en allant
de la colonne 1 a 12,
- Placer
les
plaque8 a
temperature
ambiante
pendant
15 mn
(Declencher la minuterie au debut de Xa distribution de l'OPD),
NB: Preparer un test du conjugue: 50 ul de conjugue avec 50 ul de
solution OPD qui entraine une coloration.
2227 Arreter la reaction avec de l‘acide citrique a 1.5M:
- Ajouter 50 ul de la solution d'acide dans tous les cupules.
NB: Preparer une plaque Temoin (Blank. control plate) : 50 ul de
OPD avec 50 ul d'acide sulfurique a 1.5M.
2228 Lire a 492 nm:
- Etablir la DO de la plaque t-in,
- Lire les plaque% Xliga et Calculer les DO moyennes de chaque
dilution,
2229 Etablir la courbe des DO:
- en abcisse (X):
Dilution dea antigenes
12
- en ordonnees (Y): Dcnsites optiques moyennes
22210 Choisir la dilution de reaction avec le test serologique:
- La dilution optimale antigenique se s.itue entre les DO de 1.0 a
1.5,
- La dilution a utiliser pour le test serologique est la moitie
de la dilution optimale antigenique,
(VOIR EN ANNEXE: IA M?iNIPULA!J!ION DU 5-6/05/1998)
2.3 Technique de detection des ankicorps antivirus de la
F,A par le test Elisa:
Elle permet de detecter
les anticorps presents dans le serum des
animaux vaccines ou ayant survecu a une infection
naturelle par
le virus de la fievre aphteuse. Les anticorps sont specifiques du
type de virus.
2 3 1
Materiels et reactifs utilises:
2311 Materiel.
Le materiel est identique a celui utilise pour la detection de
l'antigene (liste en page).
2312 Reactifs.
- Rouge de phenol a 0.28,
- Solution de soude a lM,
- Tampon de fixation (0.05 M Carbonate-bicarbonate ou
Coating
buffer) a pHm9.6,
- Tampon PBS a pH 7.2,
- Tampon de dilution Elisa (Tween et rouge de phenol),
- Tampon de revelation (Tampon PBS, Tweeen et Lait en poudre),
- Substrat (OPD dans tampon phosphate-citrate a pH 5.0),
- Solution d'acide d'arret (acide sulphurique a 1.25M),
- Solution desinfectante,
232 Methodes utilisees:
On utilise trois tests:
- Spot test: 40 serums sont testes par plaque,
- Minititration: 10 serums sont testes par plaque,
- Full titration: 5 serums par plaque,
2321 Spot test
23211 Preparation des temoins et des echantillons de serums:
232111 Dilution des temoins:
On prepare les temoins suivants:
Temoin antigenes 0, A, C, SATl, SAT2, SAT3, ASIAl;
Temoin serum negatif 0, A, C, SATl, SAT2,SAT3, ASIAl;
Temoin serum faiblement Positif 0, A, C, SATl, SAT2,SAT3, ASUl;
Temoin serum fortement Positif 0, A, C,, SATl, SAT2, SAT3, ASIAl;
Ces temoins sont utilises au 1/16 (10 ul dans 150 ul) et sont
repartis dans une plaque de dilution a fond rond, a raison de 50
ul par cupule.
Pour chaque temoin, on utilise 4 cupul.es dans les colonnes 11 et
12.
La repartition est la suivante:
Tenwin antigene: 11-12H et 11-12G
Temoin serum negatif:ll-12F et 11-12E
Temoin serum faible positif:ll-12D et 11-12C
Temoin serum fort positif:ll-12B et 11-12A
Pour le temoin antigene, on met 50 ul de tampon PBS-Tween a cote
des dilutions de 116 des temoins serums.
232112 Dilution des serums
Les 40 serums sont dilues au 1/16 dans une plaque de dilution a
fond rond (plaque de fixation de complement): 10 ul de serum dans
150 ul de tampon PBS.
13
Les 40 serums dilues sont repartis
dans une deuxieme plaque de
dilution,
deux cupules par serum, a raison de 50 ul par cupule.
Les serums sont reparti8 dans les colonnes 1 a 10 et les rangees
A a H.
Le schema de reppartition des 4 temoins et 40 semas
sont
presentes a la page xxx.
232113 Dilution de l'antigene.
chaque antigene 0, A, C, SATl, SAT2, SAT3, MIA1 est dilue selon
le titre defini dans le test precedent titrage du virus.
Par exemple, pour les antigenes suivants:
- antigene 0 BFS: au 1/120
(diluer pour 1 plaque 60 ul dans 7,2 ml de tampon)
- antigene A22: au 1/45
(diluer pour 1 plaque 200 ul dans 9 ml de tampon)
- antigene C: au l/lOO
(diluer pour 1 plaque 50 ul dans 5 ml de tampon)
232114 Melange Serum-Antigene.
Ajouter 50 a1 de l'antigene dilue (0, A,
. ..) dans tous les
cupules de la plaque de dilution contenant les 4 temoins et les
40 serums dilues.
Les plaques contenant le melange serum-antigene sont places a la
temperature ambiante dans une chambre humide pendant une nuit.
UB:
Chaque antigene doit etre melange a tous les serums dilues,
donc
preparer 7 plaques de serums-tunoins
dilues
pour les 7
serotypes du virus de la fievre aphteuse.
2322 Preparation des plaques sensibilisees:
Les plaques Elisa sont sensibilisees avec du serum de lapin anti-
serotype du virus de la FA. Le serum de lapin,
dilue au 1/5000
dans le tampon de fixation (a pH 9,6), est reparti dans tous les
cupules de la plaque a raison de 100 ul par cupule. Les plaques
sont placeen ensuite a la temperature de +4 c sous agitation.
NB: on sensibilise une plaque par serotype, soit 7 plaque pour
les 7 serotypes du virus de la FA.
2323
Transfert du
stuzlange
Serum-antigene
dans
l e s
plaques
sensibilisees:
23231 Laver les plaques sensibilisees 3 fois dans du tampon PBS,
23232 Transferer les 40 melange seruwantigene de la plaque FC a
la plaque Elisa, en raison de 50 ul par cupile respectant l'ordre
de repartion des cupules.
De nmrw,
transferer
l e s
4 temoins
Ag,Negatif,
faible positif, fort positif.
23233 Incuber a 37C pendant 1 heure sous agitation.
2324 Addition du serum de cobaye antiserotype:
23241 Laver les plaques sensibilisees 3 fois dans du tampon PBS,
23242 Ajouter du serum de cobaye anti-serotype dilue au l/lOOO,a
raison de 50 ul par cupule,
23243 Incuber a 37C pendant 1 heure sous agitation,
2325 Addition du conjugue(serum de lapin anti-cobaye conjugue a
la peroxydase):
23251 Laver les plaques sensibilisees 3 fois dans du tampon PBS,
23252 Ajouter du conjugue dilue au l/lOOO,a raison de 50 ul par
cupule,
23253 Incuber a 37C pendant 1 heure sous agitation,
2326 Addition du chromgene OPD:
23261 Dissoudre 1 tablette d'OPD dans 55 ml de tampon Phosphate-
citrate,
23262 Activer la solution avec 1/2000 d'eau oxygenee, cad 2.5 ul
de H202 dans 5 ml de OPD,
23263 Ajouter la solution OPD-H202 dans tous les cupules , a
raison de 50 ul par cupule,
14
23264 Laisser les plaques pendant 15 mn (mettre le chronomtre en
marche) a la
temperature
ambiante(lers
plaques
sont
sur la
paillaese et a l'obscurite).
NB: - Tester le conjuge en melangeant dans deux cupules d'une
plaque, 50 ul de conjugue et 50 ul de solution OPD-H202 pour voir
apparaitre
l a
coloration
caracteriaque de
l a
reaction
enzymatique.
- Preparer la plaque etalon (Balnk plate) en mettant 50 ul de
OPD-HZ02 dans les 8 cupules de la colonne l(donc de 1A a 1H)
2327 Arret de la reaction enzymatique par une solution d'acide a
1.25H:
23271 Ajouter 50 ul d'acide sulfurique a 1.25M a tous les cupules
au bout des 15 mn,
23272 Ajouter 50 ul d'acide a toua les cupules de la colonne 1 de
la plaque etalon,
2328 Lire au spectrophotometre a la longueur d'onde de 492 mn:
23281 Lire la plaque etalon,
23282 Lire la ou les plaques de titrage de
serums.
2329 Interpreter les resultats:
La valeur des Do indique l'intensite de la coloration et montre
la prescnce ou l'absence de reaation Anticorps-Antigene:
- Serum positif = DO faible
- Serum negatif = DO fort
L'interpretation
des
resultats
est
faite
sur
la valeur
d e s
pourcentages
d'inhibition:
la valeur du Temoin Ag permet de verifier la qualite des temoins
serum positif et negatif:
Le temoin fort positif doit etre superieur a 90 % d'inhibition
par rapport au temoin Ag.
Le t-in faible positif doit etre entre 50 a 90 % d'inhibition.
Le tmoin negatif doit etre inferieur a 50 % d'inhibition.
(VOIR FICHE DE LEXTDRE DE LA MANIPDLATION DU 07 MAI 1998)
a . 3
Technique de titrage des anticorps antivirus de la F.A par
le test Elisa ou full titration:non r8alis8
2.4
Technique de caractkisation d'une souche du virus de la F.A
par le test Elisa:
241 Repliquer la souche virale isolée de l'animal (field strain)
sur culture de lignée de celllules de rein de porc (Renal 8wine
Ce11 ou RS cell) ou de cellules BHK;
242 Récolter et Titrer le virus en utilisant une gamw de sérums
anti diffbrentes souches vaccinales du m$me sérotype. Ces souches
vaccinales sont choisies en fonction de la xone gGographique et
du contexte épidémiologique (voir le protocole titrage de virus);
2 4 3
Choisir la
combinaison
antigène/sérum
(trapper/detector)
optimale et la dilution d'utilisation de la
aouahe
vaccrinale.
Cette dilution ne doit pas @tre inférieure à 1/6.
244 Titrer les
sérums de 21 jours après vaccination
(par un
vaccin
connu)
contre
la souche virale
isolée et
le vaccin
homologue (Voir le protocole de titrage des sérums).
245 Déterminer le titre du r&rum:
Calculer la DO moyenne de 24 cupuples de t&uG.n antig$ne; Cette
DO représente le maximum de DO obtenue avec ce test, cad 100 % de
DO. Il faut diviser par 2 cette DO maximale pour determiner 50%
d'inhibition.
Noter
les
cupule6
positifs
lorsque la DO
est
infbrieure
& 50% du 'Smoin antigiine et
l e s
cupules
négatifs
lorsque la DO est supérieure à 50% de la DO du t6mA.n antigene.
Pour le calcul du titre du t&um, il faut se refker à la m&hode
Karber,
246 Calculer la Valeur relative ou R value:
valeur r = titre du sbmm avec la souche isolée divis& par le
titre du sLrum de souche virale de rlfkence.
16
2.4 Technique de detection des anticorps antivirus de la
F.A par le test de seroneutralisation:
Elle permet de
detecter
l e s
anticorps
neutralisants
l'effet
cytopatog&ne
du virus de la FA sur
une
culture de cellules
sensibles,
notammnt les celllules de lign6e de rein de porc
(cellules RS). Ces anticorps sont presents dans le serum des
animaux vaccines ou ayant survecu a une infection
naturelle par
le virus de la fievre aphteuse. Les anticorps sont specifiques du
type de virus.
241: Matiriels h Mkthodes
2411 Materiels:
L'equipement est le suivant:
Microscope
invers&,
Flacons de culture de cellules,
Microplaque de culture de cellules,
Micropipettes,
Pipettes
stériles,
Flacons,
Cones,
Bain marie,
Etuve
Les Reactifs chimiques sont:
Desinfectant (le FAM, eau de javel),
Les reactifs biologiques sont:
SQrum de rbfkence:
sérum d'animal convalescent
Milieu de culture MEMG a pH 7,4-7,6 à +4*C pendant 3 mois.
3ouche virale du virus de la stomatite vésiculeuse bovine.
2412 MQthodes:
- Choisir les palques suivantes:
2 Paques de Titrage du virus(virus control)
2 Paques de Titrage du serum de reference
(serum reference control)
1 plaque de test des echantillon de skum
- Delimiter des aones avec des marques sur les plaques:
Plaque de titrage du virus:
tirer un trait apres la collonne 9,
Plaque de controle du skum de rhfkrence:
tirer trois traits pour delimiter les zones :l-4;5-8
et 9-12 (de A à H,
Plaque de controle des dchantillons de serum:
tirer trois traits pour diG.mi.ter les zones:7-8;9-10
et 11-12 pour le serum à tester
tirer trois traits pour délimiter les zones:
A-B(3-4);
C-D(3-4) et D-E(3-4) pour le serurn negatif
tirer un trait pour délimiter la zone A-B(l-2)pour le
ttsmoin de toxicite
Distribuer le diluant dans les plaques,:
Plaque de titrage du virus:
mettre 50 ul dans tous les cupules de 1 à 9(A-H)
mettre 150 ul dans le tcrmin diluant
mettre 100 ul dans le témoin cellules
Plaque de titrage de serum:
mettre 50 ul dans tous les cupules(sauf ceux de la
rangle H)
Plaque de controle des échantillons de sérums:
mettre 50 ul de diluant dans les 2 cupules 2A-2B pour
le controle de toxicite
mettre 25 ul de diluant dama les cupules 4A-4B (ne
rien mettre dans 3A-3B) pour les t-in8 sérums
négatifs
ajouter l'échantillon de s8rum pr&dilu& au 1/4: 50 ul
dans les témoins de toxicite 2&2B, 50 ul dans les
cupules 3A-F {dilution 1/8)et 25 ul dans les cupules
4A-F(dilution 1116)
diluer le s6rum des vaccinés ou des convalescents:
mettre 50 ul de diluant dans les cupules de B à H, à
raison de 2 colonnes par &rum,
ajouter 50 ul de sérum d6compldment6 et dilu8 au 1/4
dans les cupules A et B
diluer de B à H, ce qui donne les dilutions suivantes:
A:1/4, B:1/8, C:1116, D:1/32, E:1/64, F:1/128,
G:1/256,
H:1/512
Diluer et distribuer la solution virale:
Diluer de loglO2,7 à loglO6,9 et distribuer 50 ul de
la dilution la plus forte (6,9 DICTSO) dans les 8
cupules de la colonne 9 et la dilution la plus faible
(2,7 DICTSO) dans les 8 cupules de la colonne 1, le
schéma de distribution est le suivant:
Colonne1 :2,7
Colonne2 :3,0
(o,:Q?d 10)
Colonne3 :3,3
(o,:~log 10)
Colonne4 :3,9
(0~6loglO)
Colonne5
:4,5
(0,6loglo)
Colonne6 :5,1
(0,6log10)
Colonne7
:5,7
(0,6loglo)
Colonne8 :6,3
(0,6log 10)
Colonne9
:6,3
(0,6log 10)
NB:
(0,61og 10) est Egal à la dilution au 1/4
(0,31og 10) est 6gal à la dilution au 1/2
Distribuer les 3 dilutions virales de 2,7, 3,0 et 3,3
dans les 2 plaques de titrage de s6rums de rifirence
et les 2 plaques de titrage de s&mus de vaccin& ou
convalescents.
Incuber les plaques à 37°C pendant 45-75 mn.
Distribuer les cellules:
150 ul dans les cupules témoins cellules,
50 ul dans les autres cupules des 5 plaques (virus, sérum de
reference,
serum de convalescent)
Incuber les plaques pendant 75 heures,
Lire les plaques:
titre du virus sur la plaque de virus par la m&hode de Karber,
titre du
sk.un de
r6ference
6W
les
plaques de
serum
r&f&rence(voir le8 annexes)
titre du srkum des convalescents sur les plaques de skums de
convalescents(voir les annexes).
Interpreter:
l e s
s&xns
sont
considéres
négatifs
lorsque
leur
titre est inferieur ou égal à ljll.
18
III. TEC!HNIQUES GElfETIQUEG.
3.1. Technique de Polyrerase Chain Reactiou.
3.1.1 Extraction de 1'ARN viral.
- Mettre 460 ul de l'echantillon dans uu tube de 1,5 ml;
- Ajouter un volume égal de tampon de lyse(vace 1% de B mercapto
ethanol) à l'dchantillon et melanger au vortex;
- Ajouter 460 ul d'Bthano1 a 70% et m&langer au vortex;
Utliser les colonnes de RNA (700 ul de volume max);
Centrifuger a 10 000 rpun pendant 15 secondes;
- Laver avec 700 ul de tampon de lavage RWI avec centrifugation;
- Laver avec 500 ul de tampon de lavage RPE avec centrifugation;
- Laver avec 500 ul de tampon de lavage RPE avec centrifugation
pendant 2 mn pour secher la membrane;
- Eluer le RBA avec 50 ul de DEPC-H2C) dans un nouveau tube et
centrifuger 10 000 rpm pendant 60 secondes;
- Stocker a -2O'C.
3.1.2 Reverse Transcription de 1'ARN viral.
- Mettre dans un tube de 0,75 ml le melange suivant: dNTPs,5XRT
buffer, MMLV, RNasin, DEPC-H20, Primer;
- Ajouter 11 ul de ce melange a 14 ul de RNA viral pour obtenir
un volume de 25 ul.
- Centrifuger;
- Chauffer a 42'C pendant 60 mn et puis 94*C pendant 10 mn;
- Stocker a -20°C.
3.1.3 PCR Amplification du produit de l.a Reverse Transcription,
- Mettre
dans un
tube de
0,75 ml le
melange
suivant:
25mMMgC12,10mMdNTPs,lOXbuffer,Primerl(lO-2!~prnol/ul),
primer2(10 -
2%mwul),
Taq DNA polymerase(W/ul), RT product, DEPC-H20 pour
un volume total de 50 ul;
- Ajouter 20 ul d'huile minerale sur le melange;
- Placer dans le theruwycleur avec le schéma suivant:
94OC, 4mn, 1 cycle
94T, ~OS, 30 cycles
55"C, ~OS, "
72*C, 908, '
73'C, 5mn, 1 cycle
- Prendre 5 ul du produit PCR dans un gel d'agaroge.
3.2.
Technique de Sequencage.
- Preparer tubes par souche de virus et marquer les tubes T,C,G
et A;
- Ajouter 1 ul de dd/dNTPs dans chaque tube selon l'ordre T,C,G
et A;
- Centrifuger rapidement;
- Stocker à +4OC jusqu'à son utilisaton;
Pour chaque rbaction,
il faut ajouter dans des tubes le reactif
suivant:
template DNA=
3 ul
Sxsequencing
buffer=
4 Ill
32py ATP labelled primer=
1,5 ul
sequencing grade Taq polymerase(5U/ul)=
1 Ill
DEPC-h2o=
10,5 ul
- Mélanger et centrifuger;
- Ajouter 4 ul du Zélande de chaque dd/dNTP;
- Centrifuger;
19
- Ajouter une goutte d'huilt mintralt;
- Mettre dans un thermxycleur B 9PC;
- rbalioer le progrmne suivant:
94*c
2mn
1 cycle
92OC
1lNl
55OC
1mXI
30 CyCltB
72°C
lmn3Os
2o"c
hold
1 cycle
- Ajouter 4 ul de solution d'arrtt dans chaque tube,
- Centrifuger
- Chauffer k 80-9OoC avant de d+oser dans le gel,
- Mettre 2,5-2,5 ul dans chaque puits;
- Mettre un courant de 70 watts pendant 2 heures ou 4 heures;
- Retirer le gel et le faire Bbcher (1,5 heurts à 80-85 OC!];
- Exposer le gel k un film (48 heures & -7O'C)
- Développer le film et lire Belon l'ordre T,C,Q et A.
IV. BIBLIaxAFwIE:
1
Reynolds
Christine.-
Tissue Culture (Techniques des cutures
d e
cellules) .Document
technique du
Laboratoire de
Reference
Mondial pour la fievre aphteuse, Pirbrigt, May 1998, 21 pages.
2
Ferris
Nigel.- Foot and Mouth Disease and Swine vesicular
Diseaae
Virus
Diaagn0sis.A
Manual of
Operations.
Document
technique du Laboratoire de Reference Mondial pour la
fievre
aphteuse, Pirbrigt, January 1998, 43 pages.
3
David.J,Rowlands.
-
Foot and Mouth
Diseasse
viruses. in
Encyclopedy of Virology, 1994, pp 488-496.
4
Ferris Nigel.- Drocedure for producing inactivated,
purified
FMD 1466 antigens.A Manual of Operations.
Document
technique du
Laboratoire de
Reference
Mondial
pour la
fievre
aphteuse,
Pirbrigt,
January 1998, 2 pages.
5
Ferris
Nigel.-
HRL procedure for producing E'MD
anti-1466
sera. A Manual of Operations. Document technique du Laboratoire de
Reference
Mondial
pour la
fievre
aphteuse,
Pirbrigt,
January
1998, 2 pages.
6
!Celli
Rendle.-
Poot and Mouth Disease Antibody
Detection:
Elisa
Manual. A
Manual of
Operations.
Document
technique du
Laboratoire de
Reference
Mondial
pour la
fievre
aphteuse,
Pirbrigt,
January 1998,lO pages.
7
D.J.K Mackay,R.P.Kitching and R.M
hrmstrong.-
Detection of
antibodies
against
vesicular
and
related
viruses by the virus
neutralisation
test
(VNT).Standard Operating Prodedure
(QOP) I
Institute for Animal Health, Pirbright Laboratory, May
1998, 17
pages.
v. ANNEXES:
5 . 1
Resultats des tests de
detection
des antignes
(densites
optiques):
5.1.1 Fiche d'analyse du 28 Avril 1998:
Plaque 1: NF
- hntigenes de Reference=
Faibles eu D.0 en Type 0:
1.791 au lj5,
0.569 au 1/25,
0.112 au 1/125
(DENSITES OPTIQUES FAIBLES)
- Echantillon N 1:Iran 27/95
(suspension originale)= POSITIF en 0 avec D.0 myenne de 0,695
0.715+0.872+0.683/3 = 0.756
0.756 - 0.060 (controle negatif ) = 0.696
- Echantillon N2: Saudia 7/92
(suspension
originale):(NFWWF)
avec des D 0 < 0.1
Plaque II: Y
- hntigenes de Reference= Corrects en D.0
Type 0 :
1.304 (au 1/5),
0.631 (1/25),
0,225 (1/125)
Type A :
2.175 (au 1/5),
1.211 (au 1/25),
0.398 (au 1/125)
- Echantillon N 1:Iran 27/95
(BTYl):POSITIF en type 0:
avec denaite optique moyenne 1.469
- Echantillon N2: Saudia 7/92
(BTYl):POSITIF en type A: avec densite optique moyenne 0,922
5.1.2 Fiche d'analyse du 29 Avril 1998:
Plaque N:l Y
- Antigenes de reference:
Faibles en D.0 en type 0
0.360 (au 1/5),
0.167 (au 1/25),
- 0.013 (I/l251
Echantillon Nl:
- Kuwait 48194 (Original suspension,)
POSITIF en type 0,
avec
optique moyenne de 0.500
22
5.1.3 Fiche d'analyse d u 3 0 Avril 1998:
Plaque NI:Y
Antigene de reference: avec D 0 faibles en type 0 de:
0.393 (au 1/5),
0.019 (au 1/25],
0.049 (au 1/125).
Echantillon Nl:.
Kuwait 40194 BTYl: POSITIF en type 0 avec dcnsite optique moyenne
de 0.489
Plaque NII:Y
Antigene de reference: avec D 0 correctefi :
en type 0:
1.66 (au 1/5),
0.77 (1/25)
et 0.29(1/125)
en type C:
1.64 (au 1/5),
0.75 (1/25)
et 0.26 (au 1/125)
Echantillon Nl:
Kuwait 48194 BTYl: POSITIF en type 0 avec densite optique moyenne
de 1.51
Echantillon 12:
C3 Chaco Parc 74 BHK3: POSITIF en type C avec denaite optique
moyenne de 1.47
5.1.4 Fiche d'analyse du 1 Mai. 1998:
Plaque NI:Y
Antigenes de reference:
avec des densites optiques correctes de:
1.24 (au 1/5),
0.89 (1/X)
et 0.19 (1/125)en type 0
Echantillon Nl
Kuwait 48/94 RS: POSITIF en type 0 avec une densite myenne de
0.96
Echantillon NI1
Cam 8/94 BTYl: POSITIFF en 0 avec une densîte myenne de 1,216
5.2. Resultats du titrage du virus de la F.A
5.2.1 Fiche d'analyse du 5-6/05/1998:
Echantillon Nl:
Antigene 0
BFS
Densites
optique8
moyenne8
obtenues aux dilutions suivante&:
Colonne 1:1/4
2.22
Colonne 2:1/8
2.22
Colonne 3:1/16
2.21
Colonne 4:1/32
2.19
Colonne 5:1/64
2.24
Colonne 6:1/128
2.18
Colonne 7:1/256
2.13
Colonne 8:1/512
1.50
Colonne 9:1/1024
1.09
Colonne 10:1/2048
0.57
Colonne 11:1/4096
0.35
Colonne 12:1/8192
5.22
La dilution antigenique optimale est de 1/512 correspondant a la
densite optique de 1.5. La d&ki.On a utiliser est de 1/256,
cad
la roitie de 1/512.
5.3 Resultats du titrage (Spot test) des serums du 07/05/1998 en
presence de l'antigene 0 BFS.
- Echantillons: 45 serums,
23
- Temin antigene: antigene OBFS,
- Temin serum fort positif anti-0,
- Temoin serum faible positif anti-0,
- Temoin negatif,
La Valeur obtenue en 100% en DO :1.28 (valeur donnee par le
apectrohotometre).
La Valeur obtenue en DO des Temoins:
Temoin antiaene aSPS(dilu8 au 1/16):
1,74; 1,68; 1,87; 1,80
permet de calculer la valeur DO 100 % d'inhibition qui est egale
a 1,74+1,8 = 3,54/2= 1,77 (ecarter les 2 valeurs extremes 1,87 et
1,68).
Elle permet d'interpreter les resultats: Un serum est dit
positif lorsque le pourcentage d'inhibition est superieur a 50%
et il est dit negatif lorsque le pourcentage est inferieur a 50%.
Temin serum fort positif anti-O(diluB au 1/16):
0,06(97%); 0,08(96%); 0.05(97%); 0,06(97%).
Le
termin
positif
est
correct
car
tous
l e s
pourcentages
d'inhibition sont superiears
a 90%.
Temoin serum faible uositif anti-O(dilu& au 1/16):
0,21(88%); 0,27(85%); 0,22(87%); 0,26(86%)
La DO du serum faible positif est correcte elle est situee entre
50% et 90%.
Temoin serum neqatif(dilu4 au 1/16):
1,25(29%);
1,29(27%);
1,19(33%);1,27(28%)
La DO est corrrecte car elle est inferieure a 50% d'inhibition.
La valeur obtenue en DO des 40 echantillons de serums(dilues
au 1/16):
31: 1,3(26%) ET 1,15(35%)
31 est negatif car les DO sont ( a 50% d'inhibition.
52:
0,84(53%) ET 0,71(60%)
S2 est positif car les DO sont > a 50% d'inhibition.
Les autres serums positifs en anticorps anti Type 0 sont au
nombre de 12:
S3(65%);
35(51%);
S15(92%);
916(67%);
S17(91%);
s21(65%);
522(84%);
S23(56%);
524(66%);
S25( 69%);
531(90%) et
836176%).
5.4 Resultats du titrage (Spot test) des serums du 07/05/1998 en
presence de l'antigene A22.
- Echantillons: 40 serums,
- Temin antigene: antigene A22,
- Temoin serum fort positif anti-A22,
- Temoin serum faible positif anti-A22,
- Temoin negatif,
La valeur des DO des temoins est de:
Temin antiaene A22(dilu6 au 1/16):
2,04+2,08=2,12:2=2,06
Cette valeur 2,06 correspond a 100 % de densite optique.
Un serum est positif lorsque le 8 d'inhibition est superieur a
50%. Au contraire, il eat nbgatif lorsque le % d'inibition est
inferieur a 50%.
Temoin serum neaatif(dilu8 au 1/16):
1,86(10%); 1,77(14%); 1,79(13%);
1,85(10%)
Les % d'inhibition sont corrects car sont inferieurs a 50%.
Temoin serum faiblement uositif(dilu& au 1/16):
0,69(66%);0,53(74%);0,63(69%);0,55(73%)
Les % d'inhibition sont corrects car sont situes entre a 50% et
90%.
Temoin serum fortement oositif(dilue au 1/16):
0,43(79%);0,47(77%);0,49(76%);0,43(79%)
Les % d'inhibition sont trop faibles pour un temoin fort positif
et sont inferieurs a 90%.
24
40 Serum8 a tester(dilués au 1/X:):
Les serum8 positifs en anticorps anti Type ~22 sont ceux dont le
% d'inhibition est superieurs a 50% sont au nombre de quatre:
915(53%); 816(90%); s23(86%); s35(71%).
5.5 Resultats du titrage (Spot test) des serums du 07/05/1998 en
presence de l'antigene c.
- Echantillons: 40 serums,
- Tem3in antigene: antigene C,
- Temin serum fort positif anti-C,
- Tenwin serum faible positif anti-C,
- Temoin negatif,
La valeur des DO des temoins est de:
T&uoi.n antiuene(dilué au U16):
2,Ol;
2,02 permet la DO 100 % d'inhibition = 2,01+2,02=4,03/2 #
2,02
NB: on peut egalement calculer le seuil de ponitivite qui est
egal a
2,02/2=1,01.
les sertuns positifs
sont
ceux dont
les
valeurs de DO sont inferieures a 1,Ol. Ce sont les six 6erums
suivants:
S3(0,22 et 0,22); S5(0,57 et 0,59); 814(0,97 et 0,83);
529(0,42 et 0‘35); S30(0,19 et 0,18); S33(0,87 et 0,74).
Temoin serum neqatif en C(dilue au lj16):
ont des % d'inhibition de 6%; 35%; 42% et 4% correcta car ils
sont inferieurs a 50%.
Temin serum faiblement positif en C(dilué au 1/16):
ont dee % d'inhibition de 52%;44%;53% et sont situes entre 50 et
908,
Temoin serum fortement positif en C(dilu& au 1/16):
ont des % d'inhibition de 93%; 93%; 95% et 93% sont superieurs a
90%.
40 serums a tester en anticorps anti-c(dilués au 1/16):
Les
serums
positifs
sont
ceux
dont le 8
d'inhibition
est
superieur a 50%. Ces serums sont les 6 serums S3(90%); s5(71%);
S14(55%); 529(81%); S30(90%); 533(60%).
5.6 Resultats du titrage (FULL test) des serums du 08/05/1998 en
presence de l'antigene 0 BFS.
- Echantillons: 5 serums positifs en O(dilué au 1/16, 1/32, 1/64,
1/128, 1/512, 1/1024 et 1/2048)
- Temin antigene: antigene OBFS(dilué au 1/16),
- Temoin serum fort positif anti-O(dilué au 1/16),
- Temoin serm faible positif anti-O(dilue au 1/16),
- Temoin negatif(dilué au 1/16),
La valeur des DO des temoins est de:
T&kn antigene:
2,13;
2,04 permet la DO 100 % d'inhibition = 2,13+2,04=4,17/2 #
2,08 correspond a la valeur 100% de D.o pour le calcul de %
d'inhibition.
NB: on
peut
calculer
l e s
seuil de
positivite
des
8erunw
(Thresold):
2,08/2=1,04.
Les
serums
positifs
ont
des DO
infereiurs au seuil de positivité 1,04.
Temoin serum neqatif en 0:
2%; 11%; 7%: 41% sont corects car ils sont inferieurs a 50%
Temoin serwn faiblement positif en 0:
66%; 80%; 63%; 63% sont des DO corectes car aituees netre 50 et
90 % d‘inhibition.
Temoin fortement positif en 0:
91%; 91%; 92%; 92% sont corrects car superieurs a 90%.
Titre des 5 serons:
les serums ont ete dilues au 1/16;
1/32; 1164; 1/128;
1/256;
11512;
11'1024 et 1/2048,
2s
Les titres obtenus sont :Sl= 1/22; 32x16; 53=1/22; s4=1/448; SS=
1/64.(Conférer 1'Àppendix 2 titres selon la mkthode Karber de
&rums dilués en 2 cupules).
Interpretation des resultats:
Un serum est dit positif de facon apecifique lorsque le titre est
> 45.
Le serum est dit protecteur lorsque le titre est > 100. Alors lea
animaux presentant ces taux d'anticorps sont dits proteges.
5.7 Resultats du titrage (F'ULL test) des serums du lWO511998 en
presence de l'antigene 0 BFS.
- Echantillons:5 serums positifs en C(spot test)
- Temin antigene: antigene CBKS,
- !kmoi.n serum fort positif anti-0,
- %min serum faible positif anti-0,
- Tem0i.n negatif,
La valeur des DO des temoins est de:
p?moin antiaene 0:
2,07;
2,09
permet d e
calculer
l a
valeur
100% DO:
2,07+2,09=4,16/2=2,08.
NB: le seuil de positivite en DO est 2,08/2=1,04. Les serums dont
la DO moyenne est inferieure a
1,04 sont dits
positifs, au
contraire
lorsque la Do est superieur a 1,04,
le serum est
negatif.binsi les titres des serums sont les suivants: 81: DO
1,Ol a la dilution 1/1024 donc titre est egal a 1448;
S2=724 i
93=45; s4=181 et s5<16.
Temin serum nesatif:
6%;7%;1% et 3% ont des pourcentages corrects car Inferieurs a 50%
d'inhibition,
Temin serum faiblement wsitif:
64%; 71%; 68%; 69% sont corrects car situes netre 50 et 90%
d'inhibition.
Temoin 8erum fortement uositif:
94%;
94%;
94% et 95%
sont
corrects
car
superieurs a
9 0 %
d'inhibition.
Titre des 5 serums testes:
Le serum est positif aux dilutions dont le 8 d'inhibition est
superier a 50%.Ainsi,
le serum 1 est positif jusq'a la dilution
1024 d'ou le titre 1448. Les autres
serums
ont
l e s
titres
suivants:
92=724; S3=45; S4=181; S5<16.
5.8 Resultats de la caracterisation d'une souche du virus de la
fievre aphteuse du 14/05/1998.
5.8.1 Titrage de la souche virale de type 0 avec les antiserums
de reference 0 BFS; 0 Mani&a et 0 Hong Kong,
Lc virus est dilue de 2 en 2 de 1/2; 114; 1/$; 1/16; 1/32; 1164;
11128 et 1/256. Le titre du virus est a la valeur de ~0 entre 1
et 1,5.
Titre avec 0 BFS: 32 (les DO sont de 1,12; 1,29; 1,41; 1‘42 a la
dilution 1/32) donc le virus peut etre utilise en titrage de
serum a la dilution 1/16 cad 32/2.
Titre avec 0 Manisa: 32 (les DO sont de 1833; 1,33; 1‘34 et 1,28
a la dilution de 1/32)
donc le virus peut etre utilise en titrage
de 8erum a la dilution 1/16 cad 32/2.
Titre avec 0 Hong Kong: 64 (les DO sont de 1,42; 1,40; 1,25 et
1,23 a la dilution de 1/64) donc le virus peut etre utilise en
titrage de serum a la dilution 1/32 cad 64/2.
5.8.2 Caracterisation de la souche virale avec le serum de
reference.
- Souche vaccinale,
- Souche virale a caracteriser
- Serum de reference
26
La moyenne des Deneites optiques avec 24 cupuA;s contenant i.
souche
vaccinale:1,17+1,27=2,44/2=1,22
w---t
calculer
seuil de positivite 1,22/2=0,61 pour le titrage du serum de
reference.
Le
titre du serum est obtenu par la dilution qui donne une
moyenne de DO = ou le plus proche de la DO de 0,61, dans ce cas,
de la
dilution
1/4096
dont
les DO
sont
~155+o"'~?:: 06/2=0 53.
LL moienne' des densites
optiques
avec 24 cupules contenant la
souche
virale a caracteriaer:
0,98+0,95=0,96 pour un seuil de
positivite de 0,96/2=0,48.
Le titre est donne par la dilution de 1/8192 dont la DO moyenne
est de 0,47+0,53=0,5.
La R value est de 4096/8192=0,5.
5.8.3
Interpretation:
La R value <0,2 signifie que le vaccin ne protege pas contre la
souche
isolee.
La r value =l signifie que le vaccin protege bien.
5.9:
APPEHDIX
SELOI LA Klkl!HODS DE KARBBR: CALCUL Dl5 TITRE DE
&RUMS CWJJWUS PAR LA FUI& TEST :
Rangbe
Rang8s Rang&3
Ranghe Rang&3
Rang&e
Rangtie
Rang&e
A
B
c
D
E
F
(3
E
P*lut~
TITRE-
1/16
1/32
1/64
1/128
1/256
1/512
1/2048
t
1/16
t
t
il22
+
t
+
1/32
t
t
+
t
1/45
t
t
t
+
+
1164
t
t
t
t
t
t
1/90
t
t
t
t
t
t
t
1/128
t
t
t
t
+
+
+
+
1/181
t
t
t
t
t
+
t
t
t
1/256
+
t
+
t
t
t
t
t
t
t
1/36â
+
t
t
t
t
t
t
t
t
t
1/512
+
t
t
t
t
t
t
+
+
+
1/724
+
t
+
t
t
t
t
t
t
t
+
111024
t
+
t
t
t
t
t
t
t
t
1/1448
t
+
t
t
t
t
t
t
t
1/2048
27
5.10: Test de s6roneutralisation du virus de la fibre aphteuse
( Gamme de dilutions du virus).
Dilutions de
Volume
virus
(en ml)
Virus
Diluant
Total
10-l
0,5
4,5
5,o
10'2
0,5
4,s
5,o
10-J
1‘5
13‘5
15‘0
m-3,3
6
6
12,0
la-316
5
5
10,o
10-4~2
1
3
4,o
10-4L,8
1
3
4,o
lO--5,4
1
3
4,o
10-6
1
3
4,o
10-6,6
1
3
4,o
10-9,~
1
3
4‘0
Exemple de lecture:
10-L
100% (16 sur 16)
10-2=
100% (16 sur 16)
10'3=
100% (16 sur 16)
10'3,3= 100% (16 sur 16)
lO-3,6= 50%
(08 sur 16)
lO-4,2= 0%
(00 sur 16)
Le titre e8t de 10-3r3+O16, 10-3,9,
NB:
le nombre 0,6 correspond à 8 cupules avec ECP sur 16 cupules
inoculls,
28
5.11: Test de séroneutralisation du virus de la fi8vre aphteuse
(Gamne de lecture de Titrage du virus: 2 plaques de 8 cupules par
dilution soit soit 16 cupule8pour le8 2 plaques).
Nombre de cupule8 po8itif8
Fraction c
ajouter *
l a
sur le8 16 inocules
dernière dilution avec lOIA ECP
Of16
0‘30
l/lO
0,34
2/16
0,38
3116
0,41
4/16
Q,48
5/16
0,49
6/16
0,53
7/16
0,56
8/16
0,60
9110
0,64
10/16
0,68
11/16
0,71
12/16
0,75
13/16
0,79
14/16
0,83
15/16
0,86
16/16
0‘90
29
Dr A.I.Donaldson,
Directeur du Laboratoire de Pirbright.
Dr R.P. Kitching,
Directeur du Laboratoire de Reference Mondial
pour la fievre aphteuse,
Dr D. Mackay, Directeur du Laboratoire de Reference de la
Comwnaute pour la fîevre aphteuse.
Dr Nigel Ferris, Chercheur au Laboratoire de Reference Mondial
pour la fievre aphteuse.
Mr Jef, Technicien au Laboratoire de Reference pour la fievre
aphteuse,
Mrs Christine Reynolds, Responsable des cultures de cellules au
Laboratoire de Reference Hondial pour la fievre aphteuse.
R,M Armstrong, Responsable de la seroneutralisation au
Laboratoire de Reference Mondial pour la fievre aphteuae.
Teli.
Rendle, Reaponsable des tests serologigues au Laboratoire
de Referencc Mondial pour la fievrc aphteuse.
Linda Turner, Technicienne au Laboratoire de Reference Mondial
pour la fievre aphteuse.
Anne Qardner,
technicienne au Laboratoire de Reference Mondial
pour la fievre aphteuse.