-J -~ - / REPUBLIQUE DU SENEGAL p /nd ...
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REPUBLIQUE DU SENEGAL
p /nd
---------
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MINISTERE DU DEVELOPPEMENT
(&&.++&+L : $tYieA
RURAL ET DE L'BYDRAULIQUE
---------
/@TT!b '
INSTITUT SENEGALAIS DE RECHERCHES
AGRICOLES (I.S.R.A.)
---------
DEPARTEME+T DE RECHERCHES SUR LES
PRODUCTIONS ET LA SANTE ANIMALES
---------
LABORATOIRE NATIONAL DE L'ELEVAGE
ET DE RECHERCHES VETERINAIRES
B.P. 2057
DARAR-HAHN
COURS PRATIQUE DE FORMATION AU DIAGNOSTIC
DES HEMOPARASITOSES DU BETAIL
DU 2 AU 28 SEPTEMBRE 1991
A BOBO-DIOULASSO (BURKINA-FASO)
RAPPORT DE PARTICIPATION
Par
MBAYE MBENGUE
REF. N0051/PARASIT0.
OCTOBRE 1991.
P L A N
1. INTRODUCTION
II. IMM~NOFLUORES~ENCE INDIRECTE APPLIQU~E A LA COM)RIOSE (HEARTwATER)
III. ELISA INDIRECT AVEC ANTICORPS MONOCLONAL POUR IMMOBILISER L'ANTIGENE
SUR UN SUPPORT SOLIDE (DETECTION D%NTICORPS) : MoAb BABESIA BIG~NA
IV. ELISAINDIRECT AVEC ANTIGENE FIXE DIRJXTEMENT SUR LA MICROPLAQUE
(TEST DE CAPTURE D'ANTICORPS)
Ag Babesia bovis
Ag Tbeileria mutans
V. ELISA DIRECT
(Test de capture d'antigène avec deux anticorps)
MoAb Anaplasm marginale
MoAb Babesia bigemina
VI. 'DESCRIPTION DU TEST DOT ELISA
VII. PREPARATION DES CORPS D'INCLUSION D'ANAPLASMA MARGINALE
VIII. CONCLUSIONS
IX. REmRc1ms
1. INTRODUCTION
L’ une
des contraintes majeures au développement de l’élevage est
caractérisée par les problèmes de pathologie au sein desquels les maladies
hémoparasitaires occupent une place assez importante.
Les résultats de la recherche appliquée doivent nécessairement nous
proposer des moyens pour juguler cette pathologie.
Ainsi, sur l’initiative du C.R.T.A. appuyé par 1’ILRAD et le Ministère
Français de la Coopération, un cours pratique sur les méthodes de diagnostic
des hémoparasitoses du bétail a été organisé à Bobo-Dioulasso.
L’immunofluorescence indirecte a été appliquée avec succès dans le
diagnostic de la Cowdriose.
Des tests ELISA (Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay) ont été utilisés
pour la détection des anticorps et des antigènes circulants dans l’anaplasmose
les piroplasmoses, les trypanosomoses et les theilerioses.
Ces techniques de diagnostic fiables qui nous ont été enseignées
seront appliquées dans nos laboratoires afin de palier aux nombreux obstacles
à l’amélioration de la santé animale.
. . . / . . .
.
- 2
II. IMMUNOFLUORESCENCE INDIRECTE APPLIQUEE A LA COWDRIOSE (Heartwater)
1. Préparation des lames d'antigènes
L’antigène est constitué de corps élémentaires de Cowdria ruminantium
provenant de cultures de cellules endothéliales.
Ces corps élémentaires sont conservés congelés à -2O’C.
Après décongélétation de Cowdria, un aliquot est dilué dans du tampon
PBS pH 7,4 de l/l à 1/20 pour déterminer la dilution optimum, en utilisant un
sérum témoin positif. La meilleure dilution est celle pour laquelle il n’y a
pas trop de corpuscules fluorescents dans chaque cupule de la lame d’antigène,
mais au moins plusieurs o.ién?cnb~; visibles dans chaque champs du microscope
avec un objectif de 50 x.
Avec un peu d’habitude, il suffit de fixer et de colorer au Giemsa la
série de dilutions et de rechercher les corpuscules violets avec un microscope
normale.
Les corps élémentaires sont dilués dans du PBS à la dilution optimum
puis appliqués avec une&ringue à insuline dans les cupules de lames à IF. Il
suffit de 0,5 ml d’antigène dilué pour réaliser 50 lames d’antigène, chacune
contenant 21 cupules de 4 mm de diamètre. Avec deux témoins (+ et -) par lame,
près de 1 000 sérums peuvent être testés.
Les lames couvertes d’antigène sèchent à température ambiante en 15
mn, puis sont enveloppées de papier filtre, scellées sous plastique et stockées
à -20°C.
2. Réalisation du test sérologique
A. Décongélation - Fixation
Les lames sorties du congélateur sont plongées directement dans du
méthanol froid pendant 5 mn. Les lames sont ensuite égouttées pendant 5 mn.
. . . / . . .
- 3
B. Incubation des sérums
Les sérums sont dilués au 1/80 dans du PBS et déposés dans chaque
cupule, sans oublier les témoins. Préalablement, pour éviter un mélange des
sérums, une séparation avec un feutre gras large est dessinées entre chaque
cupule. Les sérums sont incubés à 37’C en chambre humide pendant 30 minutes.
Une goutte de 25 ul de sérum par cupule.
C. Incubation de l'antiglobuline
Le conjugué utilisé est le R.A.B./F.I.T.C. dilué au l/lOO dans du PBS.
Du bleu d’Evans à 1 % est ajouté au conjugué (1/10 000) pour diminuer les
fluorescences parasites.
Le conjugué ainsi préparé est centrifugé à 1 000 tours/mn pendant 10 mn
pour éliminer les impuretés et recouvert de papier alluminium. Les lames sont
lavées pendant 10 mn dans du PBS, puis recouvertes d’une goutte de 25 ~1 de
conjugué/cupule et incubées à 37’C en chambre humide pendant 30 mn.
La dilution optimum de l’antigolobuline est déterminée pour chaque
nouveau lot par dilution en série de 1/30 à 1/180.
La meilleure dilution est celle pour laquelle la fluorescence des
corpuscules est brillante sans fluorescence parasite.
D. Montage des lames
Les lames sont lavées dans du PBS pendant 10 mn, essuyées et laissées
sécher sur du papier filtre pendant 5 mn. Les lames sont montées avec des
lamelles sur un liquide de montage (1 volume de Glycérol + 1 volume de tampon
PBS) et examinées au microscope à immunofluorescence sur fond noir. La lecture
s’effectue dans l’obscurité et sous 24h en utilisant l’objectif 20 x et en
règlant le transformateur sur 9 V pour lire les sérums : sont considérés com-
me positifs, les sérums qui produisent une fluorescence nette des corps élé-
mentaires de Cowdria ruminantium.
. . . / . . .
- 4
III. ELISA INDIRECT AVEC ANTICORPS MONOCLONAL POUR IMMOBILISER
L'ANTIGENE SUR UN SUPPORT SOLIDE
MoAb Babesia bigemina (Détection d'anticorps)
Réalisation du test : Avec la microplaque ELISA-Nunc Maxsorp
1. Ajuster la concentration en protéine de l'anticorps monoclonal (AcMO) à la
RV
concentration recommandée en appliquant la formule o= volume d'anticorps
monoclonal à mettre dans le volume nécessaire (V)
0 : concentration originale
R: concentration de travail
V : volume nécessaire pour l'exécution du test
par exemple : 0 = 10 mg/ml
R = 0,5 Cig/ml
V = 100 ml on a 0,5 x lOO= 5 vl
10 000
Prélever 5 ~1 de l'anticorps monoclonal et le mettre dans 100 ml de tampon
PBS pH 7,4
Mettre dans chaque cupule 100 JJ~ de la solution ainsi préparée et laisser
le coating se faire à+4"C pendant une nuit.
Les plaques déjà coatées avec 1'Acmo peuvent être stockées à -20°C jusqu'à
utilisation.
2. Eliminer l'excès d'Ac Mo en tapotant les plaques au dessus d'un évier.
3. Bloquer les sites restant sur les parois de la plaque ainsi que les sites
non spécifiques sur les Ac Mo, en mettant 300 ~~-11 de lysat de lymphocytes
de caprin à 2,5 mg/ml dans du PBS pH 7,4 (exemple 100 ml de lysat + 400 ml
tampon PBS dilution au 1/4 du lysat -> 2,5 mg/ml>
Diluer les sérums dans une microplaque en même temps que le blocage.
5 JJ~ de sérum + 245 ~1 de lysat de lymphocyte de caprin + 1 % tween 20 ->
Dilution du 1/50 des sérums.
Les plaques sont incubées à + 4'C pendant une nuit.
. . ./ . . .
- 5
4. Eliminer l'excès de la solution de blocage en tapotant les plaques au-dessus
de l'évier et laver 3 fois avec du tampon de lavage : le lavage n'est pas
nécessaire.
5. Ajouter 100 nl/cupule de la solution antigénique de Babesia bigemina à une
concentration de 2 à 5 ng/ml.
Exemple : 0 = 300 ng/ml
R = 7,5 pg/ml
V = 1 2 5 ml
Rv=
0
3 ' 125 ml
Prélever 3,125 ml Ag Babesia bigemina et le mettre dans 125 ml de tampon
PBS pH 7,4 + Tween 20.
Recouvrir les plaques avec du papier adhésif et incuber à 37'C pendant
30 Mn en agitant toutes les 5 mn.
6. Eliminer l'excès de solution antigénique et laver 10 fois les plaques avec
le tampon de lavage (Tpon PBS l- Tween 20)
Laver 5 fois les plaques avec du tampon PBS pH 7,4 sans Tween 20.
7. Bloquer les sites non spécifiques sur l'antigène capturé en remplissant les
puits avec 300 JJ~ de lysat de lymphocyte de caprin à une concentration de
2,s mg/ml et incuber 1 heure à 37'C.
8. Eliminer la solution de blocage et ajouter 100 JJ~ de sérum dilué au 1/50,
en double aux puits. Recouvrir les plaques et incuber à 37'C pendant 30 mn
en agitant toutes les 5 mn.
9. Enlever les anticorps non fixés en tapotant les plaques au dessus de l'évier.
Laver 5 fois les plaques, puis remplir les puits de tampon de lavage(l?BS +
Tween 20) et laisser 15 mn à la température ambiante. Refaire le même lavage
et laver enfin les plaques 5 fois.
10. Mettre dans chaque cupule 100 ~1 de conjugué dilué dans le lysat de lympho-
cyte. Exemple :
Pour une dilution au 1/3000 du conjugué, prendre
50 ~1 de conjugué anti Ig Gl
50 ~1 de conjugué anti Ig G2
50 JJ~ de conjugué anti IgM
et mélanger à 150 ml de tampon PBS + dilution au 1/1500, ajouter 150 ml
de lysat de lymphocyte caprin à 2,5 mg/ml -> Dilution du conjugué au 1/3OOO.
.,. / ..*
- 5 bis
Recouvrir les plaques idem 8 et incuber à 37’C pendant 30 mn en agitant
toutes les 5 mn.
11. Enlever le conjugué non fixé en tapotant les plaques au dessus de l’évier
et laver idem 9.
12. Ajouter 100 JJI. de solution substrat/chromogène à tous les puits et laisser
à la température ambiante à l’obscurité pendant 1 heure en agitant toutes
les 10 mn.
13. Déterminer la densité optique à 414 nM.
c
.
- 6
IV. ELISA INDIRECT AVEC ANTIGENE FIXE DIRECTEMENT SUR LA MICROPLAQUE
(Test de capture d'anticorps)
La capture d’anticorps peut être utilisée pour détecter et quantifier
les anticorps dans les fluides corporels, le sérum par exemple,
Le protocole est simple : un antigène est immobilisé sur un support
solide tel qu’une microplaque, et l’anticorps peut se fixer à l’antigène.
Cet anticorps peut alors être détecté par un anticorps secondaire,
marqué avec une enzyme et qui reconnaît spécifiquement le premier anticorps.
La quantité d’anticorps liés détermine la force du signal.
Technique : Avec la microplaque ELISA Nunc Poly sorp.
1. Ajuster la concentration en protéines de l’antigène avec la formule
RV le volume obtenu est celui que vous prenez à partir du matériel original
0 et que vous transformez en volume nécessaire
Exemple : Si 0 = 200 ug/ml
I
R =
5 Crg/ml
V =120ml
Rv= 5 x 120
0
200
= 3 ml à mettre dans 120 ml de tampon PBS
Mettre dans chaque cupule 100 ul de la solution ainsi préparée et laisser
le coating se faire à +4”C pendant une nuit,
2. Eliminer l’excès d’antigène en tapotant la plaque sur l’évier.
3. Bloquer les sites restant sur les parois de la plaque ainsi que les sites
non spécifiques sur l’antigène lié en remplissant les puits avec 300 ~1 d’un
lysat de lymphocytes de chèvre à 2,5 mg/ml dans du PBS pH 7,4 et incuber à
+4”C pendant une nuit.Faire en même temps la dilution des sérums au 1/50
(5 ul de sérum + 245 JJ~ de lysat de lymphocyte + Tween 20).
/
. . . l . .
- 7
Eliminer l'excès de protéine bloquant en tapotant la plaque au dessus d'un
évier et laver 3 fois les plaques avec un tampon de lavage (PBS pH 7,4 avec
0,l % de Tween 20).
4. Mettre 100 )~l de sérum dilué au 1/50, en double à chaque puits. Recouvrir
les plaques en incuber à 37°C pendant 1 heure en agitant toutes les 10 mn.
5. Enlever les anticorps non fixés en tapotant les plaques au desuus d'un évier.
Laver 5 fois avec le tampon de lavage (PBS pH 7,4 1- 0,5 % Tween 20) puis
remplir les puits avec le tampon de lavage et laisser 15 mn à la température
ambiante. Relaver les plaques et laisser tremper encore 15 mn dans le tampon.
Laver encore 5 fois les plaques.
6, Ajouter 100 ~1 de conjugué convenablement dilué dans le lysat de lymphocyte
caprin à tous les puits.
Exemple : Conjugué au 1/3000 : 150 ~1 de conjugué mère + 150 ml de Tpon
PBS + 0,5 % Tween 20 + 150 ml de lysat de lymphocyte.
Couvrir les plaques et incuber encore à 37'C pendant 1 heure en agitant les
plaques toutes les 10 mn.
7. Enlever le conjugué non fixé en tapotant les plaques au dessus de l'évier
et en lavant idem 5.
8. Ajouter 100 ul de solution substrat/chromogène (500 1-11 H202 + 500 JJ~ ABTS
dans 5Oml de tampon citrate) et laisser incuber à la température ambiante
dans le noir pendant 1 heure en agitant toutes les 10 mn.
9. Déterminer la densité optique au lecteur ELISA à 414 nM.
. . ./ . . .
-8
V. ELISA DIRECT (Capture d'antigène avec deux anticorps)
L’ELISA Sandwich avec 2 anticorps est un des tests immunologiques les
plus utilisés surtout pour détecter la présence d’antigènes circulants dans le
sérum. Le test est beaucoup plus sensible si les anticorps monoclonaux capteurs
reconnaissent différents épitopes sur la molécule d’antigène.
Il est même meilleur si les épitopes reconnus par les AcMo sont différents de
ceux reconnus par les anticorps de l’hôte induits au cours de l’infection.
Pour utiliser le sandwich, un anticorps monoclonal est lié au support solide
et l’antigène à tester est laissé se fixer. Les protéines non fixées sont enle-
vées par lavage et le second anticorps monoclonal se fixe à l’antigène. Après
lavage, le test est quantifié en ajoutant une solution de substrat/chromogène.
Les avantages moyens de cette technique sont que l’antigène ne doit pas
être purifié avant le test.
Le désavantage majeur est qu’il faut du temps pour produire les anti-
corps monoclonaux.
1. Composition des tampons
- Tampon de coatin. : P.B.S. pH 7,4
- Blocage : solution de lait écrémé en poudre à 10 p.100 dans P.B.S. pH 7,4
- Dilution des sérums et du conjugué : solution de lait écrémé en poudre à
10 p.100 dans P.B.S. pH 7,4 + 0,l % Tween 20
- Lavage : solution tampon P.B.S. pH 7,4 + 0,l % Tween 20
- Substrat/Chromogène
-> Tampon substrat : Acide citrique - 9,6 g
Eau A . . . . . . . .
1 , 0 l i t r e
Ajuster le pH à 4,0 avec Hydroxyde de Na 3M
Conserver à la température ambiante et vérifier
le pH juste avant utilisation
.
.
/
.
..a
- 9
-> Chromogène : Poudre ABTS . . . . 0,27 g
eau A . . . . . . ...12.5 ml
Mélanger vigoureusement et conserver à +4"C dans
un récipient foncé
-> Substrat : H,O, (30 X) . . . . 500 ~1
eau A
. . . . . . . . 7,5 ml
Conserver comme pour le chromogène
-> Faire le mélange substrat/chromogène de la façon suivante :
Tampon substrat . . . . 25 ml
Substrat
100 JJl
Chromogène
125 1.11
-> Kit-Elisa pour le diagnostic de Anaplasma marginale ILRAD 91
- Anticorps monoclonal : 0 = 11,5 mg/ml
R = 10 I.rg/ml dans
un volume x
- Conjugué anti MoAb : faire la dilution au 1/2000
Exemple : 7,5 ~1 de solution mère conjugué dans 15 ml de Tampon
-> Kit -Elisa pour le diagnostic de Babesia bigemina ILRAD 91
- Anticorps monoclonal : 0 = 10 mg/ml
R = 5 ug/ml dans un
volume x
Evaluer le volume x nécessaire et appliquer la formule y pour savoir
le volume de MoAb à mettre dans le volume x pour avoir la concentra-
tion de travail (5 pg/mi).
- Conjugué anti-MoAb : A diluer au 1/2000
Exemple 7,5 ul de solution mère de conjugué dans 15 ml de tampon.
/
. . . l . .
- 10
2. Réalisation du test : Avec les plaques micro ELISA Nunc ou Dynatec,
a) Ajuster la concentration en protéines de 1’AcMo non marqué en utilisant
la formule F si 0 = 11,5 mg/ml
R = 10 pg/ml
V = volume nécessaire pour tester x sérums
Pour tester 45 sérums (1 plaque), il faut 1 volume V de
150 v-11 x 100 = 15 rnls 20 ml ; pour 10 plaques, il faut V = 200 ml : la
quantité x à prélever sur la solution mère d’Ac Mo est de :
10 x 200.000
11.500
= 170 ~1 dans 200 ml de PBS p H 7,4.
b) Fixer l’anticorps monoclonal dans chaque cupule en ajoutant 150 ul de solu-
tion Ac Mo. laisser le coating se faire à +4’C pendant une nuit. Si on veut
d i f f é r e r l e t e s t , stocker les plaques déjà coatées à -2OOC jusqu’à leur
u t i l i s a t i o n .
c) Vider la plaque pour éliminer l’excès d’AcMo non fixés.
d) ler blocage : mettre 300 ul du tampon de blocage/cupule et laisser à
+ 4°C pendant une nuit.
Faire en même temps la dilution des sérums (125 ul de sérum + 125 ~1 de
tampon ; incuber la plaque de dilution des sérums à +4’C de dilution)
dilution au 112 pendant une nuit.
e) Vider la plaque test contenant le tampon de blocage.
f) Ajouter 100 1-11 de sérum à tester : 2 cupules/sérum.
g) Laisser les plaques à la température ambiante 30 mn.
h) Vider la plaque.
i) 2è blocage : 300 ~1 de tampon de blocage/cupule et laisser 1 heure à la
température ambiante.
j) Préparer le conjugué en le diluant au 1/2000 : exemple 7,5 ~1 de conjugué
dans 15 ml de tampon de dilution.
- 11
k) Vider la plaque, ajouter 100 ~1 de conjugué/cupule et laisser à la
température ambiante en agitant toutes les 5 mn pendant 30 mn.
1) Vider la plaque.
m) Lavage : - Rincer 5 fois, recouvrir de tampon lavage et laisser 15 mn
- Rincer 3 fois,
WI’-
- “ _
-“_
-“_
-“_
n) Vider la plaque.
o) Préparer le substrat/chromogène
500 nl HzOz + 500 ~1 ABTS dans 50 ml de solution tampon citrate pH 4,0
Mettre 100 ~1 du mélange substrat/chromogène dans chaque cupule.
Déposer la plaque sur le rocker 2 mn pour bien homogénéiser et laisser
1 heure à la température ambiante et à l’obscurité.
p) Faire la lecture des densités optiques au lecteur ELISA.
Ce test a été utilisé dans le diagnostic de l’anaplasmose à Anaplasma
marginale,
mais aussi dans le diagnostic de la babesiose à Babesia
bigemina chez les bovins.
- 12
VI. DESCRIPTION DU TEST DOT-ELISA
Test de détection d'anticorps.
Déterminer la meilleure concentration en antigène pour le test par un
titrage (en général, la meilleure concentration en protéines est de 1 à
2 mg/ml).
a) Déposer les cercles de nitrocellulose (BlO-BAD O,45 prn) dans les cupules
de la plaque à l'aide d'une pince.
b) Avec des gants, mettre 1 ~1 d'antigène sur la nitrocellulose et laisser
sécher 5 mn à la température ambiante.
c) Blocage : Mettre du tampon de blocage (PBS pH 7,4 + O,5 % tween 20) environ
200 à 300 pl/cupule et laisser 15 mn à la température ambiante.
Diluer en même temps les sérums au 1/200 dans PBS Tween 20 0,l %.
d) Enlever le tampon de blocage et ajouter 100 1-11 de sérum dilué/cupule,
incuber 1 heure à la température ambiante.
e) Laver 4 fois 5 mn avec le tampon PBS + 0,l % Tween 20.
f) Ajouter 100 1-11 du conjugué phosphatase Alcaline-Protéine A dilué au 1/500
dans PBS + 0,l % Tween 20 par cupule et incuber 30 mn à la température
ambiante.
g) Laver idem e, puis lavage final seulement avec du PBS (sans Tween 20).
h) Mettre 100 r-1 de substrat BCIP/NBT dans le tampon Tris.
i) Stopper la réaction avec du PBS contenant 200 mM EDTA.
j) Sécher 1a nitrocellulose.
Faire la lecture des résultats à l'oeil nu : la réaction positive est
caractérisé par l'apparition d'un cercle violacé dans la nitrocellulose.
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DOT-ELISATEST: PLATE LAYOUT
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----___- --.---- ----- -- ---- ---------__
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- - - ------.- - - - - - -
-----_-- -_--
d
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Notes
Signature:
k-pcAJy k-i c?fG-ns C&E. ,
- 14
VII. PROTOCOLE DE PREPARATION DES CORPS D'INCLUSION D'ANAPLASMA MARGINALE
1. Source de sang infecté
a) Inoculer 2 - 4 ml de la souche d'A.marginale à un veau sensible splenecto-
misé en I.V.
b) Pour obtenir un meilleur pourcentage de globules rouges parasités (P.G.P.)
avec un hématocrite de 16 à 18 %, des passages successifs sont recommandés,
Quand le P.G.P. atteint 20 B 30 p.100, du sang hépariné (= 250 ml) est
transfusé à un second veau splenectamisé. Avec un troisième veau, l’incuba-
tion est considérablement raccourcie.
c) Avec un P.G.P.2 70 % et un hématocrite de 16 - 18 %, récolter le sang.
N’importe quel anticoagulant peut être utilisé par exemple 1’E.D.T.A. à
1 g/l de sang.
2. Traitement du sang pour la préparation de l'antigène
a) Traiter rapidement le sang après sa récolte et le centrifuger à 2 500 -
3 000 tours/mn pendant 20 mn à + 4’C.
Rejeter le plasma et le buffy coat.
b) Laver les globules rouges infectées 3 fois avec un tampon choline (chlorure
de choline 155 mM, HEPES pH 7,5 5 mM) ou du sérum salé physiologique.
c) Ajouter 2 ml de sérum salé à 1 ml de G.R. (1/3) et soniquer pour rompre 75
à 85 % des cellules en évitant de surchauffer le lysat.
Pour lyser complètement les cellules, congeler et décongeler rapidement le
sonicat 3 fois.
d) Centrifuger le lysat à 10 000 g/30 mn/4’C et récolter le culot.
e) Laver vigoureusement le culot 4- 5 fois jusqu’à élimination de la majorité
de l’hémoglobine (avec 20 volumes de sérum salé à 10 000 g/30 mn/+ 4’C).
. . . / . . .
*
.
- 15
f) Remettre en suspension le culot lavé dans un petit volume de sérum salé et
homogénéiser avec un broyeur de tissu en verre jusqu'à passer le culot à
travers une aiguille 26 g.
3. Gradient de Percoll pour isoler les corps d'inclusion d'A. marginale
a) Dans une éprouvette graduée, ajouter successivement :
- 25 ml Percoll (SIGMA ou PHARMACIA)
- 10 ml Tampon K-l, 10 x
- 2 ml HEPES 1 M
- eau distillée qsq 100 ml
bien mélanger pour obtenir une suspension de Percoll à 25 p.100.
b) Ajouter 10 à 30 ml de suspension de Percoll dans des tubes en polycarbonate
de 15 ou 50 ml.
c) Ajouter (avec une pipette Pasteur) lentement et soigneusement, sans pertur-
ber le Percoll, 2 ou 6 ml de préparation brute d'Anaplasma sur le dessus du
Percoll.
d) Centrifuger à 24 000 g/60 mn/4'C. Récolter la couche d'inclusion.
e) Laver 2 fois avec du PBS pH 7,4 la fraction collectée, à 30 000 g/20 mn.
Formule des tampons
K-l - 10 x
P.B.S. pH 7,4
Nacl
393 g
Nacl
890 g
Kcl
434 g
Kcl
032 g
NaH2POQ.
0914 g
KH2P04
022 g
K,HPO&
19.57 g
Na2HP04
1915 g
NaHCOs
i
099 g
j. b
Thimerosal 0,l g
QSP 100 ml Ha04
QSP 1 1 H,O
. . . / . . .
- 16
VIII. CONCLUSIONS
Ce cours nous a permis d’approfondir nos connaissances sur le séro-
diagnostic des hémoparasitoses du bétail.
De nouvelles techniques de détection d’anticorps et d’antigènes
telles que la DOT-ELISA et 1’ELISA SANDWICH nous ont donné d’excellents
résultats à partir de sérums de bovins et doivent être adaptées à nos
programmes de recherche en cours.
- 17
IX. REMERCIEMENTS
Une parfaite disponibilité a été manifestée par les autorités du
C.R.T.A. Nous adressons les remerciements les plus sincères :
- Au Dr Saydil Moctar TOURE, Directeur du C.R.T.A. pour l'accueil chaleureux
qu'il nous a réservé de même que la très bonne organisation du cours.
- Au Dr Gérard DUVALLET pour l'assistance continue qu'il a toujours manifesté
à notre égard.
- Au Dr Emmanuel CAMUS, Directeur du cours pour son dévouement, sa modestie
qu'il n'a jamais ménagé afin de nous enrichir les connaissances scientifiques.
Ces remerciements s'adressent aussi au corps professoral en particulier
- le Pr Gerrit UILENBERG, Directeur Scientifique de 1'IEMVT pour la qualité
des sujets traités,
- les Drs V.M. NANTULLIA et Joseph KATENDE de 1'ILRAD qui nous ont détaillée
les techniques ELISA avec beaucoup plus de clarté,
- le Dr MONTENEGRO James de l'Université de Tulane pour la nouvelle technique
DOT ELISA enseignée,
- Au Ministère Français de la Coopération de nous avoir octroyé une bourse
qui nous a permis d'assister à ce cours.
- A tout le personnel scientifique et technique du C.R.T.A. pour la parfaite
collaboration qu'il a toujours témoigné pour le bon déroulement de nos
séances de travaux pratiques,
- Au Directeur Général de 1'ISRA et au Directeur des Recherches sur les
Productions et la Santé animales de nous avoir autorisé à participer à
ce cours de formation.
-~
-
/
REPUBLIQUE DU SENEGAL
p /nd
---------
,J
MINISTERE DU DEVELOPPEMENT
(&&.++&+L : $tYieA
RURAL ET DE L'BYDRAULIQUE
---------
/@TT!b '
INSTITUT SENEGALAIS DE RECHERCHES
AGRICOLES (I.S.R.A.)
---------
DEPARTEME+T DE RECHERCHES SUR LES
PRODUCTIONS ET LA SANTE ANIMALES
---------
LABORATOIRE NATIONAL DE L'ELEVAGE
ET DE RECHERCHES VETERINAIRES
B.P. 2057
DARAR-HAHN
COURS PRATIQUE DE FORMATION AU DIAGNOSTIC
DES HEMOPARASITOSES DU BETAIL
DU 2 AU 28 SEPTEMBRE 1991
A BOBO-DIOULASSO (BURKINA-FASO)
RAPPORT DE PARTICIPATION
Par
MBAYE MBENGUE
REF. N0051/PARASIT0.
OCTOBRE 1991.
P L A N
1. INTRODUCTION
II. IMM~NOFLUORES~ENCE INDIRECTE APPLIQU~E A LA COM)RIOSE (HEARTwATER)
III. ELISA INDIRECT AVEC ANTICORPS MONOCLONAL POUR IMMOBILISER L'ANTIGENE
SUR UN SUPPORT SOLIDE (DETECTION D%NTICORPS) : MoAb BABESIA BIG~NA
IV. ELISAINDIRECT AVEC ANTIGENE FIXE DIRJXTEMENT SUR LA MICROPLAQUE
(TEST DE CAPTURE D'ANTICORPS)
Ag Babesia bovis
Ag Tbeileria mutans
V. ELISA DIRECT
(Test de capture d'antigène avec deux anticorps)
MoAb Anaplasm marginale
MoAb Babesia bigemina
VI. 'DESCRIPTION DU TEST DOT ELISA
VII. PREPARATION DES CORPS D'INCLUSION D'ANAPLASMA MARGINALE
VIII. CONCLUSIONS
IX. REmRc1ms
1. INTRODUCTION
L’ une
des contraintes majeures au développement de l’élevage est
caractérisée par les problèmes de pathologie au sein desquels les maladies
hémoparasitaires occupent une place assez importante.
Les résultats de la recherche appliquée doivent nécessairement nous
proposer des moyens pour juguler cette pathologie.
Ainsi, sur l’initiative du C.R.T.A. appuyé par 1’ILRAD et le Ministère
Français de la Coopération, un cours pratique sur les méthodes de diagnostic
des hémoparasitoses du bétail a été organisé à Bobo-Dioulasso.
L’immunofluorescence indirecte a été appliquée avec succès dans le
diagnostic de la Cowdriose.
Des tests ELISA (Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay) ont été utilisés
pour la détection des anticorps et des antigènes circulants dans l’anaplasmose
les piroplasmoses, les trypanosomoses et les theilerioses.
Ces techniques de diagnostic fiables qui nous ont été enseignées
seront appliquées dans nos laboratoires afin de palier aux nombreux obstacles
à l’amélioration de la santé animale.
. . . / . . .
.
- 2
II. IMMUNOFLUORESCENCE INDIRECTE APPLIQUEE A LA COWDRIOSE (Heartwater)
1. Préparation des lames d'antigènes
L’antigène est constitué de corps élémentaires de Cowdria ruminantium
provenant de cultures de cellules endothéliales.
Ces corps élémentaires sont conservés congelés à -2O’C.
Après décongélétation de Cowdria, un aliquot est dilué dans du tampon
PBS pH 7,4 de l/l à 1/20 pour déterminer la dilution optimum, en utilisant un
sérum témoin positif. La meilleure dilution est celle pour laquelle il n’y a
pas trop de corpuscules fluorescents dans chaque cupule de la lame d’antigène,
mais au moins plusieurs o.ién?cnb~; visibles dans chaque champs du microscope
avec un objectif de 50 x.
Avec un peu d’habitude, il suffit de fixer et de colorer au Giemsa la
série de dilutions et de rechercher les corpuscules violets avec un microscope
normale.
Les corps élémentaires sont dilués dans du PBS à la dilution optimum
puis appliqués avec une&ringue à insuline dans les cupules de lames à IF. Il
suffit de 0,5 ml d’antigène dilué pour réaliser 50 lames d’antigène, chacune
contenant 21 cupules de 4 mm de diamètre. Avec deux témoins (+ et -) par lame,
près de 1 000 sérums peuvent être testés.
Les lames couvertes d’antigène sèchent à température ambiante en 15
mn, puis sont enveloppées de papier filtre, scellées sous plastique et stockées
à -20°C.
2. Réalisation du test sérologique
A. Décongélation - Fixation
Les lames sorties du congélateur sont plongées directement dans du
méthanol froid pendant 5 mn. Les lames sont ensuite égouttées pendant 5 mn.
. . . / . . .
- 3
B. Incubation des sérums
Les sérums sont dilués au 1/80 dans du PBS et déposés dans chaque
cupule, sans oublier les témoins. Préalablement, pour éviter un mélange des
sérums, une séparation avec un feutre gras large est dessinées entre chaque
cupule. Les sérums sont incubés à 37’C en chambre humide pendant 30 minutes.
Une goutte de 25 ul de sérum par cupule.
C. Incubation de l'antiglobuline
Le conjugué utilisé est le R.A.B./F.I.T.C. dilué au l/lOO dans du PBS.
Du bleu d’Evans à 1 % est ajouté au conjugué (1/10 000) pour diminuer les
fluorescences parasites.
Le conjugué ainsi préparé est centrifugé à 1 000 tours/mn pendant 10 mn
pour éliminer les impuretés et recouvert de papier alluminium. Les lames sont
lavées pendant 10 mn dans du PBS, puis recouvertes d’une goutte de 25 ~1 de
conjugué/cupule et incubées à 37’C en chambre humide pendant 30 mn.
La dilution optimum de l’antigolobuline est déterminée pour chaque
nouveau lot par dilution en série de 1/30 à 1/180.
La meilleure dilution est celle pour laquelle la fluorescence des
corpuscules est brillante sans fluorescence parasite.
D. Montage des lames
Les lames sont lavées dans du PBS pendant 10 mn, essuyées et laissées
sécher sur du papier filtre pendant 5 mn. Les lames sont montées avec des
lamelles sur un liquide de montage (1 volume de Glycérol + 1 volume de tampon
PBS) et examinées au microscope à immunofluorescence sur fond noir. La lecture
s’effectue dans l’obscurité et sous 24h en utilisant l’objectif 20 x et en
règlant le transformateur sur 9 V pour lire les sérums : sont considérés com-
me positifs, les sérums qui produisent une fluorescence nette des corps élé-
mentaires de Cowdria ruminantium.
. . . / . . .
- 4
III. ELISA INDIRECT AVEC ANTICORPS MONOCLONAL POUR IMMOBILISER
L'ANTIGENE SUR UN SUPPORT SOLIDE
MoAb Babesia bigemina (Détection d'anticorps)
Réalisation du test : Avec la microplaque ELISA-Nunc Maxsorp
1. Ajuster la concentration en protéine de l'anticorps monoclonal (AcMO) à la
RV
concentration recommandée en appliquant la formule o= volume d'anticorps
monoclonal à mettre dans le volume nécessaire (V)
0 : concentration originale
R: concentration de travail
V : volume nécessaire pour l'exécution du test
par exemple : 0 = 10 mg/ml
R = 0,5 Cig/ml
V = 100 ml on a 0,5 x lOO= 5 vl
10 000
Prélever 5 ~1 de l'anticorps monoclonal et le mettre dans 100 ml de tampon
PBS pH 7,4
Mettre dans chaque cupule 100 JJ~ de la solution ainsi préparée et laisser
le coating se faire à+4"C pendant une nuit.
Les plaques déjà coatées avec 1'Acmo peuvent être stockées à -20°C jusqu'à
utilisation.
2. Eliminer l'excès d'Ac Mo en tapotant les plaques au dessus d'un évier.
3. Bloquer les sites restant sur les parois de la plaque ainsi que les sites
non spécifiques sur les Ac Mo, en mettant 300 ~~-11 de lysat de lymphocytes
de caprin à 2,5 mg/ml dans du PBS pH 7,4 (exemple 100 ml de lysat + 400 ml
tampon PBS dilution au 1/4 du lysat -> 2,5 mg/ml>
Diluer les sérums dans une microplaque en même temps que le blocage.
5 JJ~ de sérum + 245 ~1 de lysat de lymphocyte de caprin + 1 % tween 20 ->
Dilution du 1/50 des sérums.
Les plaques sont incubées à + 4'C pendant une nuit.
. . ./ . . .
- 5
4. Eliminer l'excès de la solution de blocage en tapotant les plaques au-dessus
de l'évier et laver 3 fois avec du tampon de lavage : le lavage n'est pas
nécessaire.
5. Ajouter 100 nl/cupule de la solution antigénique de Babesia bigemina à une
concentration de 2 à 5 ng/ml.
Exemple : 0 = 300 ng/ml
R = 7,5 pg/ml
V = 1 2 5 ml
Rv=
0
3 ' 125 ml
Prélever 3,125 ml Ag Babesia bigemina et le mettre dans 125 ml de tampon
PBS pH 7,4 + Tween 20.
Recouvrir les plaques avec du papier adhésif et incuber à 37'C pendant
30 Mn en agitant toutes les 5 mn.
6. Eliminer l'excès de solution antigénique et laver 10 fois les plaques avec
le tampon de lavage (Tpon PBS l- Tween 20)
Laver 5 fois les plaques avec du tampon PBS pH 7,4 sans Tween 20.
7. Bloquer les sites non spécifiques sur l'antigène capturé en remplissant les
puits avec 300 JJ~ de lysat de lymphocyte de caprin à une concentration de
2,s mg/ml et incuber 1 heure à 37'C.
8. Eliminer la solution de blocage et ajouter 100 JJ~ de sérum dilué au 1/50,
en double aux puits. Recouvrir les plaques et incuber à 37'C pendant 30 mn
en agitant toutes les 5 mn.
9. Enlever les anticorps non fixés en tapotant les plaques au dessus de l'évier.
Laver 5 fois les plaques, puis remplir les puits de tampon de lavage(l?BS +
Tween 20) et laisser 15 mn à la température ambiante. Refaire le même lavage
et laver enfin les plaques 5 fois.
10. Mettre dans chaque cupule 100 ~1 de conjugué dilué dans le lysat de lympho-
cyte. Exemple :
Pour une dilution au 1/3000 du conjugué, prendre
50 ~1 de conjugué anti Ig Gl
50 ~1 de conjugué anti Ig G2
50 JJ~ de conjugué anti IgM
et mélanger à 150 ml de tampon PBS + dilution au 1/1500, ajouter 150 ml
de lysat de lymphocyte caprin à 2,5 mg/ml -> Dilution du conjugué au 1/3OOO.
.,. / ..*
- 5 bis
Recouvrir les plaques idem 8 et incuber à 37’C pendant 30 mn en agitant
toutes les 5 mn.
11. Enlever le conjugué non fixé en tapotant les plaques au dessus de l’évier
et laver idem 9.
12. Ajouter 100 JJI. de solution substrat/chromogène à tous les puits et laisser
à la température ambiante à l’obscurité pendant 1 heure en agitant toutes
les 10 mn.
13. Déterminer la densité optique à 414 nM.
c
.
- 6
IV. ELISA INDIRECT AVEC ANTIGENE FIXE DIRECTEMENT SUR LA MICROPLAQUE
(Test de capture d'anticorps)
La capture d’anticorps peut être utilisée pour détecter et quantifier
les anticorps dans les fluides corporels, le sérum par exemple,
Le protocole est simple : un antigène est immobilisé sur un support
solide tel qu’une microplaque, et l’anticorps peut se fixer à l’antigène.
Cet anticorps peut alors être détecté par un anticorps secondaire,
marqué avec une enzyme et qui reconnaît spécifiquement le premier anticorps.
La quantité d’anticorps liés détermine la force du signal.
Technique : Avec la microplaque ELISA Nunc Poly sorp.
1. Ajuster la concentration en protéines de l’antigène avec la formule
RV le volume obtenu est celui que vous prenez à partir du matériel original
0 et que vous transformez en volume nécessaire
Exemple : Si 0 = 200 ug/ml
I
R =
5 Crg/ml
V =120ml
Rv= 5 x 120
0
200
= 3 ml à mettre dans 120 ml de tampon PBS
Mettre dans chaque cupule 100 ul de la solution ainsi préparée et laisser
le coating se faire à +4”C pendant une nuit,
2. Eliminer l’excès d’antigène en tapotant la plaque sur l’évier.
3. Bloquer les sites restant sur les parois de la plaque ainsi que les sites
non spécifiques sur l’antigène lié en remplissant les puits avec 300 ~1 d’un
lysat de lymphocytes de chèvre à 2,5 mg/ml dans du PBS pH 7,4 et incuber à
+4”C pendant une nuit.Faire en même temps la dilution des sérums au 1/50
(5 ul de sérum + 245 JJ~ de lysat de lymphocyte + Tween 20).
/
. . . l . .
- 7
Eliminer l'excès de protéine bloquant en tapotant la plaque au dessus d'un
évier et laver 3 fois les plaques avec un tampon de lavage (PBS pH 7,4 avec
0,l % de Tween 20).
4. Mettre 100 )~l de sérum dilué au 1/50, en double à chaque puits. Recouvrir
les plaques en incuber à 37°C pendant 1 heure en agitant toutes les 10 mn.
5. Enlever les anticorps non fixés en tapotant les plaques au desuus d'un évier.
Laver 5 fois avec le tampon de lavage (PBS pH 7,4 1- 0,5 % Tween 20) puis
remplir les puits avec le tampon de lavage et laisser 15 mn à la température
ambiante. Relaver les plaques et laisser tremper encore 15 mn dans le tampon.
Laver encore 5 fois les plaques.
6, Ajouter 100 ~1 de conjugué convenablement dilué dans le lysat de lymphocyte
caprin à tous les puits.
Exemple : Conjugué au 1/3000 : 150 ~1 de conjugué mère + 150 ml de Tpon
PBS + 0,5 % Tween 20 + 150 ml de lysat de lymphocyte.
Couvrir les plaques et incuber encore à 37'C pendant 1 heure en agitant les
plaques toutes les 10 mn.
7. Enlever le conjugué non fixé en tapotant les plaques au dessus de l'évier
et en lavant idem 5.
8. Ajouter 100 ul de solution substrat/chromogène (500 1-11 H202 + 500 JJ~ ABTS
dans 5Oml de tampon citrate) et laisser incuber à la température ambiante
dans le noir pendant 1 heure en agitant toutes les 10 mn.
9. Déterminer la densité optique au lecteur ELISA à 414 nM.
. . ./ . . .
-8
V. ELISA DIRECT (Capture d'antigène avec deux anticorps)
L’ELISA Sandwich avec 2 anticorps est un des tests immunologiques les
plus utilisés surtout pour détecter la présence d’antigènes circulants dans le
sérum. Le test est beaucoup plus sensible si les anticorps monoclonaux capteurs
reconnaissent différents épitopes sur la molécule d’antigène.
Il est même meilleur si les épitopes reconnus par les AcMo sont différents de
ceux reconnus par les anticorps de l’hôte induits au cours de l’infection.
Pour utiliser le sandwich, un anticorps monoclonal est lié au support solide
et l’antigène à tester est laissé se fixer. Les protéines non fixées sont enle-
vées par lavage et le second anticorps monoclonal se fixe à l’antigène. Après
lavage, le test est quantifié en ajoutant une solution de substrat/chromogène.
Les avantages moyens de cette technique sont que l’antigène ne doit pas
être purifié avant le test.
Le désavantage majeur est qu’il faut du temps pour produire les anti-
corps monoclonaux.
1. Composition des tampons
- Tampon de coatin. : P.B.S. pH 7,4
- Blocage : solution de lait écrémé en poudre à 10 p.100 dans P.B.S. pH 7,4
- Dilution des sérums et du conjugué : solution de lait écrémé en poudre à
10 p.100 dans P.B.S. pH 7,4 + 0,l % Tween 20
- Lavage : solution tampon P.B.S. pH 7,4 + 0,l % Tween 20
- Substrat/Chromogène
-> Tampon substrat : Acide citrique - 9,6 g
Eau A . . . . . . . .
1 , 0 l i t r e
Ajuster le pH à 4,0 avec Hydroxyde de Na 3M
Conserver à la température ambiante et vérifier
le pH juste avant utilisation
.
.
/
.
..a
- 9
-> Chromogène : Poudre ABTS . . . . 0,27 g
eau A . . . . . . ...12.5 ml
Mélanger vigoureusement et conserver à +4"C dans
un récipient foncé
-> Substrat : H,O, (30 X) . . . . 500 ~1
eau A
. . . . . . . . 7,5 ml
Conserver comme pour le chromogène
-> Faire le mélange substrat/chromogène de la façon suivante :
Tampon substrat . . . . 25 ml
Substrat
100 JJl
Chromogène
125 1.11
-> Kit-Elisa pour le diagnostic de Anaplasma marginale ILRAD 91
- Anticorps monoclonal : 0 = 11,5 mg/ml
R = 10 I.rg/ml dans
un volume x
- Conjugué anti MoAb : faire la dilution au 1/2000
Exemple : 7,5 ~1 de solution mère conjugué dans 15 ml de Tampon
-> Kit -Elisa pour le diagnostic de Babesia bigemina ILRAD 91
- Anticorps monoclonal : 0 = 10 mg/ml
R = 5 ug/ml dans un
volume x
Evaluer le volume x nécessaire et appliquer la formule y pour savoir
le volume de MoAb à mettre dans le volume x pour avoir la concentra-
tion de travail (5 pg/mi).
- Conjugué anti-MoAb : A diluer au 1/2000
Exemple 7,5 ul de solution mère de conjugué dans 15 ml de tampon.
/
. . . l . .
- 10
2. Réalisation du test : Avec les plaques micro ELISA Nunc ou Dynatec,
a) Ajuster la concentration en protéines de 1’AcMo non marqué en utilisant
la formule F si 0 = 11,5 mg/ml
R = 10 pg/ml
V = volume nécessaire pour tester x sérums
Pour tester 45 sérums (1 plaque), il faut 1 volume V de
150 v-11 x 100 = 15 rnls 20 ml ; pour 10 plaques, il faut V = 200 ml : la
quantité x à prélever sur la solution mère d’Ac Mo est de :
10 x 200.000
11.500
= 170 ~1 dans 200 ml de PBS p H 7,4.
b) Fixer l’anticorps monoclonal dans chaque cupule en ajoutant 150 ul de solu-
tion Ac Mo. laisser le coating se faire à +4’C pendant une nuit. Si on veut
d i f f é r e r l e t e s t , stocker les plaques déjà coatées à -2OOC jusqu’à leur
u t i l i s a t i o n .
c) Vider la plaque pour éliminer l’excès d’AcMo non fixés.
d) ler blocage : mettre 300 ul du tampon de blocage/cupule et laisser à
+ 4°C pendant une nuit.
Faire en même temps la dilution des sérums (125 ul de sérum + 125 ~1 de
tampon ; incuber la plaque de dilution des sérums à +4’C de dilution)
dilution au 112 pendant une nuit.
e) Vider la plaque test contenant le tampon de blocage.
f) Ajouter 100 1-11 de sérum à tester : 2 cupules/sérum.
g) Laisser les plaques à la température ambiante 30 mn.
h) Vider la plaque.
i) 2è blocage : 300 ~1 de tampon de blocage/cupule et laisser 1 heure à la
température ambiante.
j) Préparer le conjugué en le diluant au 1/2000 : exemple 7,5 ~1 de conjugué
dans 15 ml de tampon de dilution.
- 11
k) Vider la plaque, ajouter 100 ~1 de conjugué/cupule et laisser à la
température ambiante en agitant toutes les 5 mn pendant 30 mn.
1) Vider la plaque.
m) Lavage : - Rincer 5 fois, recouvrir de tampon lavage et laisser 15 mn
- Rincer 3 fois,
WI’-
- “ _
-“_
-“_
-“_
n) Vider la plaque.
o) Préparer le substrat/chromogène
500 nl HzOz + 500 ~1 ABTS dans 50 ml de solution tampon citrate pH 4,0
Mettre 100 ~1 du mélange substrat/chromogène dans chaque cupule.
Déposer la plaque sur le rocker 2 mn pour bien homogénéiser et laisser
1 heure à la température ambiante et à l’obscurité.
p) Faire la lecture des densités optiques au lecteur ELISA.
Ce test a été utilisé dans le diagnostic de l’anaplasmose à Anaplasma
marginale,
mais aussi dans le diagnostic de la babesiose à Babesia
bigemina chez les bovins.
- 12
VI. DESCRIPTION DU TEST DOT-ELISA
Test de détection d'anticorps.
Déterminer la meilleure concentration en antigène pour le test par un
titrage (en général, la meilleure concentration en protéines est de 1 à
2 mg/ml).
a) Déposer les cercles de nitrocellulose (BlO-BAD O,45 prn) dans les cupules
de la plaque à l'aide d'une pince.
b) Avec des gants, mettre 1 ~1 d'antigène sur la nitrocellulose et laisser
sécher 5 mn à la température ambiante.
c) Blocage : Mettre du tampon de blocage (PBS pH 7,4 + O,5 % tween 20) environ
200 à 300 pl/cupule et laisser 15 mn à la température ambiante.
Diluer en même temps les sérums au 1/200 dans PBS Tween 20 0,l %.
d) Enlever le tampon de blocage et ajouter 100 1-11 de sérum dilué/cupule,
incuber 1 heure à la température ambiante.
e) Laver 4 fois 5 mn avec le tampon PBS + 0,l % Tween 20.
f) Ajouter 100 1-11 du conjugué phosphatase Alcaline-Protéine A dilué au 1/500
dans PBS + 0,l % Tween 20 par cupule et incuber 30 mn à la température
ambiante.
g) Laver idem e, puis lavage final seulement avec du PBS (sans Tween 20).
h) Mettre 100 r-1 de substrat BCIP/NBT dans le tampon Tris.
i) Stopper la réaction avec du PBS contenant 200 mM EDTA.
j) Sécher 1a nitrocellulose.
Faire la lecture des résultats à l'oeil nu : la réaction positive est
caractérisé par l'apparition d'un cercle violacé dans la nitrocellulose.
,.* /. . .
,
-----
-.
-
\\
u
w-.
-
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.
--
-”
WV,
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DOT-ELISATEST: PLATE LAYOUT
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-------__---_---_
----___- --.---- ----- -- ---- ---------__
------m--------m-
- - - ------.- - - - - - -
-----_-- -_--
d
-----_--- _.__
Notes
Signature:
k-pcAJy k-i c?fG-ns C&E. ,
- 14
VII. PROTOCOLE DE PREPARATION DES CORPS D'INCLUSION D'ANAPLASMA MARGINALE
1. Source de sang infecté
a) Inoculer 2 - 4 ml de la souche d'A.marginale à un veau sensible splenecto-
misé en I.V.
b) Pour obtenir un meilleur pourcentage de globules rouges parasités (P.G.P.)
avec un hématocrite de 16 à 18 %, des passages successifs sont recommandés,
Quand le P.G.P. atteint 20 B 30 p.100, du sang hépariné (= 250 ml) est
transfusé à un second veau splenectamisé. Avec un troisième veau, l’incuba-
tion est considérablement raccourcie.
c) Avec un P.G.P.2 70 % et un hématocrite de 16 - 18 %, récolter le sang.
N’importe quel anticoagulant peut être utilisé par exemple 1’E.D.T.A. à
1 g/l de sang.
2. Traitement du sang pour la préparation de l'antigène
a) Traiter rapidement le sang après sa récolte et le centrifuger à 2 500 -
3 000 tours/mn pendant 20 mn à + 4’C.
Rejeter le plasma et le buffy coat.
b) Laver les globules rouges infectées 3 fois avec un tampon choline (chlorure
de choline 155 mM, HEPES pH 7,5 5 mM) ou du sérum salé physiologique.
c) Ajouter 2 ml de sérum salé à 1 ml de G.R. (1/3) et soniquer pour rompre 75
à 85 % des cellules en évitant de surchauffer le lysat.
Pour lyser complètement les cellules, congeler et décongeler rapidement le
sonicat 3 fois.
d) Centrifuger le lysat à 10 000 g/30 mn/4’C et récolter le culot.
e) Laver vigoureusement le culot 4- 5 fois jusqu’à élimination de la majorité
de l’hémoglobine (avec 20 volumes de sérum salé à 10 000 g/30 mn/+ 4’C).
. . . / . . .
*
.
- 15
f) Remettre en suspension le culot lavé dans un petit volume de sérum salé et
homogénéiser avec un broyeur de tissu en verre jusqu'à passer le culot à
travers une aiguille 26 g.
3. Gradient de Percoll pour isoler les corps d'inclusion d'A. marginale
a) Dans une éprouvette graduée, ajouter successivement :
- 25 ml Percoll (SIGMA ou PHARMACIA)
- 10 ml Tampon K-l, 10 x
- 2 ml HEPES 1 M
- eau distillée qsq 100 ml
bien mélanger pour obtenir une suspension de Percoll à 25 p.100.
b) Ajouter 10 à 30 ml de suspension de Percoll dans des tubes en polycarbonate
de 15 ou 50 ml.
c) Ajouter (avec une pipette Pasteur) lentement et soigneusement, sans pertur-
ber le Percoll, 2 ou 6 ml de préparation brute d'Anaplasma sur le dessus du
Percoll.
d) Centrifuger à 24 000 g/60 mn/4'C. Récolter la couche d'inclusion.
e) Laver 2 fois avec du PBS pH 7,4 la fraction collectée, à 30 000 g/20 mn.
Formule des tampons
K-l - 10 x
P.B.S. pH 7,4
Nacl
393 g
Nacl
890 g
Kcl
434 g
Kcl
032 g
NaH2POQ.
0914 g
KH2P04
022 g
K,HPO&
19.57 g
Na2HP04
1915 g
NaHCOs
i
099 g
j. b
Thimerosal 0,l g
QSP 100 ml Ha04
QSP 1 1 H,O
. . . / . . .
- 16
VIII. CONCLUSIONS
Ce cours nous a permis d’approfondir nos connaissances sur le séro-
diagnostic des hémoparasitoses du bétail.
De nouvelles techniques de détection d’anticorps et d’antigènes
telles que la DOT-ELISA et 1’ELISA SANDWICH nous ont donné d’excellents
résultats à partir de sérums de bovins et doivent être adaptées à nos
programmes de recherche en cours.
- 17
IX. REMERCIEMENTS
Une parfaite disponibilité a été manifestée par les autorités du
C.R.T.A. Nous adressons les remerciements les plus sincères :
- Au Dr Saydil Moctar TOURE, Directeur du C.R.T.A. pour l'accueil chaleureux
qu'il nous a réservé de même que la très bonne organisation du cours.
- Au Dr Gérard DUVALLET pour l'assistance continue qu'il a toujours manifesté
à notre égard.
- Au Dr Emmanuel CAMUS, Directeur du cours pour son dévouement, sa modestie
qu'il n'a jamais ménagé afin de nous enrichir les connaissances scientifiques.
Ces remerciements s'adressent aussi au corps professoral en particulier
- le Pr Gerrit UILENBERG, Directeur Scientifique de 1'IEMVT pour la qualité
des sujets traités,
- les Drs V.M. NANTULLIA et Joseph KATENDE de 1'ILRAD qui nous ont détaillée
les techniques ELISA avec beaucoup plus de clarté,
- le Dr MONTENEGRO James de l'Université de Tulane pour la nouvelle technique
DOT ELISA enseignée,
- Au Ministère Français de la Coopération de nous avoir octroyé une bourse
qui nous a permis d'assister à ce cours.
- A tout le personnel scientifique et technique du C.R.T.A. pour la parfaite
collaboration qu'il a toujours témoigné pour le bon déroulement de nos
séances de travaux pratiques,
- Au Directeur Général de 1'ISRA et au Directeur des Recherches sur les
Productions et la Santé animales de nous avoir autorisé à participer à
ce cours de formation.