REPUBLIQUE DU SENEGAL 1 NST I TUT SENEGALA I S DE...
REPUBLIQUE DU SENEGAL
1 NST I TUT SENEGALA I S DE RECHERCHES
---e---I-
AGRICOLES (t .S.R.A. 1
--“-.mw--w
YINISTERE DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE
ET TECHN I QUE
LABORATOIRE NATIONAL DE LPELEVAGE
---m-----
ET DE RECHERCHES VETER 1 NAI RES
P R E P A R A T I O N D U V A C C I N C O N T R E L E
CHARBON SYMPTOMAT 1 QUE
R E F . No 37/MtCROBIO.
M A I 1 9 8 3 .
PREPARATION DU VACCIN CONTRE LE
CHARBON SYMPTOMATIQUE
M.P. DOUTRE
Chef de service au L.N.E.R.V.
(I.S.R.A.)
PLAN GENERAL
l- Définition
2- Souche vaccinale
3- Préparation du milieu de culture
4 - Technique de fabrication du vaccin
41 - Généralités
42 - Préparation des inoculums
43 - Ensemencement d'une série de flacons
44 - Mise en culture à I'&tuve
45 - Contrôle de pureté et farmolage
46 - Précipitation par Isalun de potassium et test d'innocuit6 sur cobayes
47 - Rôpartition du vaccin
5 - Test dPimmunité,
PREPARAT1 ON DU VACCIN CONTRE LE
CHARBON SYMPTOMATIQUE
L? . P . DOUTRE
.
Chef de service de’ SactGriologfe
au L.N.E.R.V. (ISRA)
1 - D E F I N I T I O N
Le vacbi n contre le charbon symtomatique, préparé au Laboratoiré de Dakar,
est une anacufture totale de Clostridium chauvei, obtenue sur milieu viande-
fate glucosé à 10 p.1000, formulée à 5 p.1000 et aiunée à 10 p.lOCO.
(
. .
I I - S0UCH.E VACCI NALE
2 . 1 - Origii6
Cette souche sauvage, pleinement virulente, a été isolée d*‘un bovin mort
de charbon symptomatique, près de Sangalkam en 1932.
.,
.
. . _ ..,, y ,-
2.2 - En&-eti&~%
FabrTcatlon
d’une”banque de &%ziies
Pour conserver le pouvoir immunogène
de l,o souche, à chaque préparation
d’un nouveau lot de semence, II est nécessaire de passer Ia[ souche sur bovin.
Prendre des tubes du précédent lot de semence, et repiquer 0,5 ml de
cette semence sur boul I Ion V-F (viande - foie), glucosé à 10 p.1000, sous
huile, en tube de 22, immédiatement après ta regénération de ce dernier.
Après 15 h. d9étuve. à 37’C,
la culture sera en phase exponentiel le. Trois ml.
de cette primocul ture sont réensemencés en bou.1 I Ion V-F gl ucosé, rég6néré dans
s
un Er1enmeye.r
de 1 I itre. Apr.ès 15 à 20 h. dDétuve à 37OC, cette culture
.
seconde servira à inoculer un bovin.
:
2 . 2 . 2 - Passage surbovin
: .‘4T’u’ -u----u---u
. .
Le bovin.choisi sera noti vacciné et bgé de .20 à 30 mois.
L’inoculation se fera par voie intra-musculaire dàns’les muscles anc&&s
de l’épaule. Lginocufum sera constituf: à parties égales de 2,5 ml de la culture
_ 9
..: .,
- 2
seconde de 15 h en Erlen et 2,s ml dvune solutioti de chlorure de csiciw rir
5 p.100 destinse 2 favoriser I 13 réveil ik?S spores et la multiplicsticn du
< * . ‘
clostridium.
-.
II*. .,..
2'3-
0-L.
Fiécelte du sanq & la nhasc se@ic&zigue
-"------------L------~~-----~~
m----- --
15 à 20 h après l'inoculation, Ivanimal est en phase pro-agoniqw ': fl
: est couch4 sur un c6-t6, les 4 membres en extension, avec un oedème volwineux,
~localis6 2 la zone d'inoculat,&?~ ,La prise
,. II. de ,,température
rectale &vh?r: un
début dvhypothermie.
1
On prél&era alors s-t&-ilement du sang B la veine jugulaire dans un flscon
de 500 ml avec billes de verre et citrate de sodium à 5 p.1000.
._..
L'animal ayant succomb6, procéder à IPautopsie, et apr&s avo ir figaturS
les vaisseaux sanguins afferents et effhrents, prélever le coeur. PranCra ~~us.sl
un os long. Ces ~t%l@vements sont destinés S effectuer des hémo c
cultur3s.
2.2.4 - Ensemencements des bouillons V-F g.lti.cos6
-----------'-.----.~Y-*~----~,--~--~ ,*-,,A. sous, .hu i le. ., ww: i-f- !;3n-
--e------ -2. --u-------c
*'
n6s en tube de 22
m.--..m.-.m-.e-------w
g*ussitôt apres la r&zolte, on ensemensera'avec I-e sang, une quarant?iw
de bou il Ions V-F, glucosé, sous huile, en tube de 22, préalablement r&$&-6s
pendant 20 minutes. Par tube de 22, la, (josa ,lnoculum de.$ang ne sers-pas inf&
rleure 3 2 ml si l.'on veut obtenir une bonne culture à démarrage rapide, Yettre
à l'étuve a 37'C, pendsnt 72 h.
.<
2.2.5 - Récolte et stockage
---a...--..------~---
-
'Chaquc~ jour, les tubes sont Observés. On ne retiendra que les tubes ayant
présenté une Woissance rapide -(rejeter les cultures qui n'w+pas dG:r:arr+
-._
dans les 24 h)- avec troubln intense, ascension du'broyat de Vian&, et f-t-i
dhgagement de gaz (visible par les bullas smprisonnies dans Ivhuile de vaseline).
_c
Si les contrôles Indiqués ci-apr&z sont satisfa!$,a,nfs.,.
Ies...bouchons
dc c!~t~n
sont flambes, enfoncés à Iv int&leur du tube donT,.on..protégera 190uvertt;r~:
Dar
un capuchon de cacutchouc. Num&-oter chaque tube, et les inscrire sur 18 re?is-
.
..'
.<:
tre des 'sou&h&s. Stocker a + 4OC.
'
'
1
..* / LI.
83,
*,.
- 3
2.2.6 - Contrôle de eureté
,..“-w-I..-----
-s.---
2.2.6.1 - Ce contrôla est important pour dépister les contamina-
ti,oFs, (pjr exemple germes des rSservoirs gastriques ayant franchi la barrière
intestinale durant la phase agonlque de Ivanimal).
Ce contr8le se fait 5 deux
niveaux :
.
..’
‘..
a) au niveau du flacon-
r6cql te de sang :dg n$rne que I ‘on ensemence des bou i I -
Ions V-r glucos&,
on ensemencera aussi 3 à 4 ,Qouf I Ions nutritifs ordfnatres
pour bien s?assurer que le sang préleve ne contlent que des bactêries sn&ro-
b i e s s t r i c t e s ; .,. .
b) au niveau des tubes souches : après 24 h de culture à 37OC, dans chaque
‘tube souche (boul 1. Ion ‘V-F gl ucosê, SOI~S huile, en tube de 221, on ptié18ve
?&rI I ement, à la p 1 pette Pasteur, quel ques gouttes de tuf tut-o qui: I von
ensemence ai nsi :
- 3 gouttes dans un boui Ilon n u t r i t i f a&oble,
- 3 gouttes sui la pente d ’ u n e gi;lose tiutrltlve,
eni t n une goutte est d&o$e sur lame pour coniect i o n d’un frcttis e t colo-
:
.
ration de grati.
. .
2,Z‘G.Z - I nterpretation des résu I tats
. . ..-... . ..^ .
Les cultures en bouillon et sur gélose nutritive seront suivies pendant
.
i:,
7 jours. Elles doivent demeurer s-t&-iles. Lvasbect mo&hologique des bactéries
”
vues au Grak’doit correspondre aux car&téri&lques d;‘Cl . chauvei .
1.
I...,.“b.,,
>
111
-
PREPAFATION DU Ml Ll iZù‘ &’ ciJi’r(JRE’
’ ’ ’ ’ ’
’
a
3.1 - Généralités . . . .,LL.
.:
. ..*......* a..>,.
Le milieu uti llsé pour la culture de CI.-:c,ha.uvel, .au Laboratoire de Dakar,
est une digestion papafnique d’un mélange d p, viande et de fole de boeuf, glu-
cosëe à 10 p.lf)OC et fil-i-r& sur filtre Seltz EKS 1.
. . . / . . .
- 4
,.
ï
csrta
,
ins'laboratoires (FARCHA, Tchad) Ütit fsent une digestion ch I i::rhydt-o-
pej&que à 48*C, La digestion papalnique offre l'avantage appréciabIs d'i?fte
. - .
beaucoup p lus raside.
Pour les besoins de la fabrication, ce milieu est conditionn5 de 5 façons :
- en flacons Lie 10 litrss : milieu filtrE sur fil-tre'Seitz EKS 1, i~luccsO 5
.10 p.1000 &&rt la fabrication (vair schema A),
- en
ioles Erlenmeyer de 2 Ii,tres (1,5 1 de miliou environ) : milieu filtre
sur EKS 1, glucose à 13 p.1000 avant la fabrfcution. Les fioles Erlenmeyer
uti isées ont 6t6 pourvues d'un tube de verre SOU~~ 5, la base, long de 7 cm
env i ron I-travail du verre dans un a-te! i er sp6cialise);sur lequel est flx5
un tube en rhodordil portant une pince clamp et terminé par une sffilure de
verre (voir schéma 61,
- en tubes de 22C mm x 22 mm.: le miiieu est cette fois non filtré sur EKS 1,
mals prtkipité,
filtre sur papier, rgparti en tubes puis autoclave. i%vant
I 9 autoc I avage, on recouvre le mllieu dvune couche dPhuile da vaseline, de
plus on y ajoute des fragments de viande et de foie cuits, ces tissus Jouant
le rôle dPagants réducteurs (rH bas). Milieu glucosé à 10 p.lC90.
3.2 - Composition du milieu
Les chiffres don& ci-dessous correspondent 2 ta fabrication dvunc skie
de 12 flacons de 10 litres contenant chacun au moment de l'ensemencement 9 Ii-
tres de m'il ieu Y '
Viande de boeuf, parée, hachée .*...........*.*..*.*.
14 kg
Foie de boeuf, pare, hache . ..*....*.................
,4 kcJ
PapaTne
. .
.I ,+Oc). 9 .,
.._.
. ..~..........*.......*................**.....
4
Eau distillée .'....*......*........,.........,..*...
.10O.litres
'.
. "
pi-1
=
7,;,6
à, 79.
.”
.
. . . / l . .
. . .
. .
x
-.
- 5
3.3 - Technique de préparation
3
c
3.3.1 - Déccupe de la carcasse de bovin et parage de la viande. Hachago
de cette dernière et du foie. Conservation en bacs de piastIque
. "
à * 4OC.
i
3.3.2 - Conduite de la dlgostion
-.fe digesteur contenant les 100 litres dveau distillée, la temperature est
e.
port& à 50°C. On ajoute alors la viande et le foie.et l'on homog&Gise la
suspension à Iqaide d'une pagale de bois. La papalne est alors introduite
(les 100 g de paparne sont mis en suspension dans 200 ml d'.eau distillee,
.
et l'homog&éisation peut'être facilitée en utilisant un super-mixer
Yurmix" pendant .l à 2 .mfnutas) .;,
- porter la tempErature du mélanqe à 70°C en une heure. Au bout de ce temps,
la digestion est pratiquement achevée ;
- Qlever alors la température à R5'C, pour détruire la papafne ;
- vérlf.ier le pH ;
- filtrer sur papier filtre ;
- ajouter du glucose pour obtenir 13 CoIIcen+ratlon
finale de 10 p.1000.
..-.
,.
3.3.3 - Filtration du d igestat glucos&-sur-filtres Seltz de iO'"i‘ i tres
EKS 1 (x1
,<
._.
<
2 filtres Seitz de 10 litres, pourvus chacun d'une membrane EKS 1, sont
suffisants pour assurer la filtration du digestat obtenu (série de 12 f'fikons
de 10 litres contenant chacun 9 litres de milieu filtr%), 3 condition de proc&
'der à une clarification préalable sur un filtre Seitz de.10. li.-trss:&quip6 dlune
. membrane AS. Donc, il est indispensable de disposer au total :de 3 filtres Seltz
de 10 litres.
l . . / . . .
.
,’
(*) Remarque : ivemploi de milieu filtré, au' lieu de ,miIleu précipite, 'filtré
sur papier, puis autoclave, assure une croissance bien meilleure de Cl
- •
chauvei et permet un gain de temps constdérabtë.
- 6
.,.
i
- .
Le branchement ffltt-e Seltz d3 10 litres (membrane EKS 1) - flawn de
,hl(j'I'ltres .c,e faif grâ& à I't.rJ-il isatinn de tubes de jotictfon ?I rodage ncrmalisé,
* I-
mâle- femelle, SOVIREL (14/23) emboîtés sous la flamme d'un bec kcker. Le
filtre porte l'element mâle, le flacon de 10 litres 1'6lément femelle et un
tube de verre coudé par 013 sera IntroduI~t
Ivinoculum (voir schema A,et C).
Filtres Soit-z et flacons de 10 litres vides et equlpes sont s-i-erilisi~.s 21 i'auto-
clave (45 mn a 12OOC).
3.3.4 - Filtra-l-ton du milieu destine a I'inoculum
1,5 à 2 litres du digektat glucos ci-dessus sont filtres selon !î même
processus dans 2 Erlenmeyer
de 2 litres pourvus à la base d'un tube de vdt-re
soude (voir ri-dessus). Cette fols, c"est 19Erlanmeyer qui porte le tube de
jonction 2 rodage normalisé femelle SOVIREL (voir sch6ma 8).
Les flacons contenant chacun 9 litres de mtlieu fi If&. et tes Erltinmuyzr
destinés à la culture de I'fnoculum sont conserv&s an attente 2 la chambra
étuve à 37OC.
. . .
.
V- TECHNIQUe;OE FA6RIC,'\\TlON
DU VACCIN
4. 1' - G6néralit&,
L'obtention d'une culture trés riche en formes végétatives, sports et
toxines reclame certaines precautions.
La courbe de croissance commenci.~ dar,s
un tube de 22, poursuivle en krlenmeyer de 2 1, doit continuer dans itis flacons
.,
de 10 1, sans accuser he palier, cvest-à-dire de‘ralentissement, voire dvarr&.
Four ce faire, ii importe :
w-'
- que chaque passage se fass e alors que 19inoculum est en pl.eine croi ssanca
Z-
(phase de croissance exponentieile).
Une telle culture est ,3piXJlle, avec un
.s
fort degagement gazeux qui entraîne à 1.a surface.les, particules :-te 4riat-&-
.<. _
.
_
."
,f6?e. Tout'ensemerkement
tardif, avec une culture qui tiommencc a sedimenter
ne donnera qu7une croissance'lente, pauvre'en batteries i
<
..- _
. . ./ . . .
- 7
- que les clostridies trouvent des conditions optimales de culture :
c
a) présence de tous les éléments nutritifs nécessaires, aux doses precitées.
D
En ce Sens#
la f 1 ltration du mi I ieu constitue un net avantage sur i Qan-
*m
tienne précipitation suivie d’un autociavage ;
b) pH convenable : de 7,5 a .,7r8. ;
CI une temperoture de 37OC : survei i ier regul ièrement
la temperature de I a
chambre étuve ;
dl enfin un pH suffisamment bas. Pour cela, on prlnclpe, dès que les flacons
.
ont atteint ta température de 37OC, i Is doivent être ensemencés.
4.2 - Préparation des i nocul ums
.’
4.2.1 - Cultures en tubes de 22
--------c-----------_I_
Deux souches (au cas où I Q une des souches redémarrerait mal 1 .sont ense-
mencées, en boui I Ion V-F, gl ucose, sous hui le ; tubes de 22 r6générés. La. dose
lnoculum sera de 0,5 ml,
412.2 - Culture en Er lenmeyer do 2 I i tres
--------------w-L ----,a----,------
A’
Après 10 à 12 heures d’ktuve, les tubes de 22 présentent une culture en
pleine croi ssa nce, i I s permettent 1 Qensemencemen~t~ de 2 Er I enmeyer “‘oontenant
__.- -.-
pres de 2 I ii-t-es de bouillon V-F glucosé à lO~p.1000.
Après
16 2 15 h de CU I ture à 37OC, I e contenu des Erl enmeyer. pr&ente
un trouble homogène dense sur toute la hauteur du mi I leu, avec un fort dégage-
ment de gaz qui se traduit par ,la presenc c d’une @usse b I anch.e de ? à 2 cm
d’épafsseur,
au dessus de
a ,surface du liquide.
4.2.3 - Contrô 1 e ‘de
- - w - m - - - - - - - ureté des i nocul ums
--------i---“o-----
Pour sqassurer de I a pureté de i Q i nocu 1 um, 3 chaque repiquage - tube
souches en tubes de 22, tubes de 22 en Erlenmeyer , Er I enrneyer
en f Iaccns de
t0 Iltres - on ensemencera en môme temps que I es ml I ieux anaerob i es strictes
des milieux aérobies tels que des boufltons nutritifs ordinalrcs. Cette mesure
est jumel& avec la confection de frottis et coloratlon de Grsm de chaque
culture.
.
/
l .* .*.
i
Les bouillons yu-l-ri-tlfs.doivent
rester st&l I es, et les GtXTn ne, !Xs ;jr+
.
senter de bactêries morphologiquement différentes des clostri,jies.
4.3 - Ensemencement d'une série de flacons de 10 Iltres (contenant chacun
3 litres de mllieu)
:
~
Les flacons sont s&tis de l!Stuve et ensemencés cf?acun avec I$I à 1SC: ml
des cultures en Erlenmeyer, introduits grâce à I'effilure de verre sous ia
protection de 1s flamme d'un bec Mecker. Le tube de verre cow:J6, quS pr&s+nte
. .
chaque,flacon, permet de recevoir Iqeffilure de verre Sans que soit rvtirx 1:
coton qui obture le goulot du flacon.
._.
4.4 - Mise en culture à l'étuve
Aussitôt iqensemencement terminS, 'ISS fl'acoris sont port& '3 17&tu?:. a
37OC. Après 20 h Ci'&tuve,
la culture envahit tout le flacon, Ii'3 milieu c'aviont
opaque, et une épaisse couche de mwsse blanche recouvre la surface,
Au bozt du 36 h, la s&dlmentation commence : le milieu sq&laircl"~, ün
culot microbien, plus ou moins Important, sqamasse au fond du fiacon,
Après 48 h, on procédera &'iars au &n%%le de'pu'rctb,
4.5 - Contr8le de pureté et formolage
4.5.1 - Contrôle bactérioscopiguc
------I-_L--------"---
mm
On &aKse'un frottis de '!? cultuVe de chacun des 12 flacons. L'cxnmen se
fait après cclorat~on de Gram. CI, chauvei Sur ces 'cti
. I
tu'res d&Y38' h a;:parat4
plus ou moins Gram nigatif:Les &rps bact&'iens sont parfols lysés, et 13
morphologie classique nPest guère retrouv&. Cependant les contaminations le
plus souvent rencontrées, coccl ou anthracofdes, se s
. . . .
"
i grialent ais&nent à c;-:-
simple examen. En cas de doute, avant de formolar, on peut ensemencer, la cul-
ture dauteuse en houillon nutritif. aérobie. Les flacons souill& seront
. i
;.. .
éllm,ir&.
,,
_
.
-.
. . . / . . .
<<. :.
., . .
- 9
4.5.2 - Addition de formol
--q-----M---------
.
Les flacons ayant sstlsfait au test de pureté sont alors formol& à la
.Y.
concentration finale de 5 p.1000, On utilisera ,le formol techniqu-e (solution
*-
d'aldéhyde fwmique à 40 p.100) à la dose de 45 mi par'flacon, à fvaide d'une
éprouvette graduée. En vleilllssant, le titre du formol à tendance à baisser,
rl est donc recommandé d"en faire le dosage de temps 2 autre,
>
Cette opérailon doit être réalisée par Lia m&me personne, en principe celle
qui dirige la production de ce vaccin ; car l'oubli d'ajouter le for-mot aurait
des répercussions fkheuses.
Après Ivaddl-tfon de formol, les bouchons de gaze qui obturent les flkons
.
sont remplacés par des bouchons de caoutchouc baignant dans une solution formo-
Iée. Les flacons, après avolr subi une agitation vigoureuse, sont alors remis
à I'etuve pour une durée de 4 Jours. Une anaculture totale est ainsi obtenue
.
., ..I.
selon le mode classique de production des anatoxines et des anacultures par
.'
actfon conjuguée du formol et de la chaleur.
4.6 - Precipitation par l'alun de potassium et test d'innocuité sur cobayes
4.6.1 - Addition d'alun de potassium.
-I---m.-------w---w.. --w----w .,
Après 4 jours dPétuve,
la culture reçoit de l'a lun de potassium à la con-
centration finale de 10 p.1000, soit 900 ml d'une SO lution stérile d'alun à
10 p.100 par flacon de 10 litres. Cette soiutIon est pre-parée de ,ia,façon '.
sulvante :
- composition :
- alun de potasstum
r*.*.*....*.*........~.,
1 000 g
(potassium-aiumlnlum-sulfate)
- eau distillée
10 litres
l . . ..***..**.....*.......*.
- technique :
, . .-
premier jour :
- peser 1 OOC g d'alun,' bien l'écraser pour le réduire en poudre,
- verser dans 10 litres d'eau'distilleeP
- faire fondre en agitant le mélange avec une'btig~ette de bois,
- précipiter à l'autoclave, 30 mn à 120°C ;
,,. / . . .
- 10
. . . . . .
i
deux'i&me jour :
- f'ittrerchaque flacon sur papier Laurent, *
i.
/
'/
'.
- réauf&laver le fl'ltrat 30 mn à 110°C.
'.
.
4.62 - Pr6l~vemen-t d'c5chantl
lIc:w : flacon téwfn de 12 &-iv et-&u'ite
pu-- -,-,I--,,,,,,-,-,-,,,;,1,1,,,,-----1--------------------,----
-------
Lo pr&ipi+ztloti des protéinès commence aussi-t% apres I'intruductipn de
Pa'lun. A la pipette, on prél&ve alors 2 a 3 ml deculture dans chaque flacon.
Ces &Chanti!!ons sont rassemblés au fur et à mesure des pt-etèvarnent
dans un
flacon qui sera conservQ comme titmoin de la série produite, Ne pas oubliw
~ d'insc,rire sur le flacon, le numéro de la set-i e et la nature du vaccin pt-cduft,
'
,4.6.3 i Test d'innocuité sur cobsyes
---------~-----------9---
--
A parti r de ce même flacon témoin, on pr8lèvera 3 la seriw;ue de 5 ~1,
4 ml de culture que 190n injectera par wie sous-cutanee 3 2 coi:ayes 2 t-aisor,
de 2 ml par cobaye,
Suivi.s pendant ..E; .jours.,. ces cobayes. ne do I.v.&nt..p.r&&-ar-
.aucl.!.ri. trou!: 1 ,?.
En attendant les r&sull-ats
du test d*innocuité,
les. flacons da 1G Ii-!-r-cs de
.'
.
vaccin sont stockés à la chambre f'r%ide '?'+ 4'C,-
4.7 - Répartition du vaccin
.
Au Laboratoire de Dakar, le vaccin est rQparti en ampoules de 20 PI (d:zz?
vaccinale : 1 ml) dens un calsson à vide,
Au Laboratoire de Farcha (T&adI'i la:f&;~;ii~-;~~ s'effectue dans des fla-
,a
cons (250 ml par flacon).
'.
,,
I ,: . . . . ,.."..<... ‘1.
V- TEST D'IMMUNITE
T
.I
Ce tes-t est à faire sur bovins, à d8faut sur dr?s moutons. If ne fnu-t..pas
utiliser de cobayes oil les résultats sont difficiles à interpriter~et difflcile-
men-t transposables sur bovins...
l .* /
. . .
< <I
- lî
5.1 - Protocole
__.
.
I
Animaux
Epreuve
"' "
R6sultats
4
Vaccination
1.
1
1 ml de vaccin
15 jours après la vac-
tous survivants.
2
sous la peau
cination, dsse d'épreuve :
Quelquefois boitarie
3
de iFencolure
20 à 40 DSPJ et-i intra-
et onflura I0gère
4
musculaire
de 1'6paulc
/
1
T&~ins
0
Marne swche dgépreuve,
1 Tumeurs dans les
I
mais à des doses înfé-
24 heurts I~I- mort
/
rieures 4 2 ci 3.94 et
en 24 à 48 heures.
1 a 2 DSM
5.2.- Préparation de la souche d'Épreuve
5.2.1 - Souche utilisée :
"""""""""""""""
Souche Thiés.
5.2.2 - blode de culture
"""-"""-"""""I-
La culture qui sert à Iqépreuve doit être une culture jeune dc 15 ?I 18 h
en Erlenmeyor. Le bouillon V-F glucosé est utilisé comme milleu.
5.2.3 - Conservation
"""""""I""""
La culture en Erlenmeyer btant tormin6e, on la distribuera en flacons de
20 ml à raison de 5 ml par flacon. Misa ?I la congé I atlon, puis lyophilisatlon.
5.2.4 - Détermination de la DSM
"""""""-"""""""^"""""""
.*
Elle se fait par inkulation sur bovins ou mou,tons. 2 ml de culture lyo-
J
philis6e repr ise doivent correspondre à 20 2 40 DSM.
. . . / l . .
- 12
..,
.,.
;
5.3 - RGalisstion du test
' .
..-.. A.,. ..,_.. ., . . . . ,,
.
._
<,
.,.
.."._
. . . ..-... .._ -_.... . . . ,,.._r,..,
;
.j' 5,3;,1 - LPinjëcticn du vakin se fera sous la peau de I'enkoiur& 2 raison
: L
..-
-..,..
.,....
. . __....,_._., ,, ,,
., ..< I...
.._. _..-. _ _<,._ . .._ .__,..____
de 2 ml par anitiàl.
. _< ~
:
5.3.2 - LPinjection de la dose di6preuve sera faite au centre dee muscles
ancSrt&,
Igévolutl~n de la.tumeur s'y observant slsëment.
.
.
.
, .
.
.
.
. ,
I
.
5.3.3 - Les faibles doses 0,l à O,5 ml seront injectées avec une Gringue
2 tuberculine, Les volumes ne sont pas ramenés ?I 1 ml au woy~n
de dilutions, de façon a.ne pas wdificr la c~,ncentra-i-ion
Ii:cale
de toxine dans le muscle. En outre?
,. . *
<.
1 'eau disti 1 I&"c!A le sjrum
.,
_..
physiologique ne sont pas sans action nocive sur CI. chauvzi ;
- -
1 mi d'une culture dilu6e au l/lO n!a pas la mSme viruierwe.qu~
.
I.
.,
.
O,T ml de cette même culture pure.
.
.
,
._
.’
:
”
1 NST I TUT SENEGALA I S DE RECHERCHES
---e---I-
AGRICOLES (t .S.R.A. 1
--“-.mw--w
YINISTERE DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE
ET TECHN I QUE
LABORATOIRE NATIONAL DE LPELEVAGE
---m-----
ET DE RECHERCHES VETER 1 NAI RES
P R E P A R A T I O N D U V A C C I N C O N T R E L E
CHARBON SYMPTOMAT 1 QUE
R E F . No 37/MtCROBIO.
M A I 1 9 8 3 .
PREPARATION DU VACCIN CONTRE LE
CHARBON SYMPTOMATIQUE
M.P. DOUTRE
Chef de service au L.N.E.R.V.
(I.S.R.A.)
PLAN GENERAL
l- Définition
2- Souche vaccinale
3- Préparation du milieu de culture
4 - Technique de fabrication du vaccin
41 - Généralités
42 - Préparation des inoculums
43 - Ensemencement d'une série de flacons
44 - Mise en culture à I'&tuve
45 - Contrôle de pureté et farmolage
46 - Précipitation par Isalun de potassium et test d'innocuit6 sur cobayes
47 - Rôpartition du vaccin
5 - Test dPimmunité,
PREPARAT1 ON DU VACCIN CONTRE LE
CHARBON SYMPTOMATIQUE
L? . P . DOUTRE
.
Chef de service de’ SactGriologfe
au L.N.E.R.V. (ISRA)
1 - D E F I N I T I O N
Le vacbi n contre le charbon symtomatique, préparé au Laboratoiré de Dakar,
est une anacufture totale de Clostridium chauvei, obtenue sur milieu viande-
fate glucosé à 10 p.1000, formulée à 5 p.1000 et aiunée à 10 p.lOCO.
(
. .
I I - S0UCH.E VACCI NALE
2 . 1 - Origii6
Cette souche sauvage, pleinement virulente, a été isolée d*‘un bovin mort
de charbon symptomatique, près de Sangalkam en 1932.
.,
.
. . _ ..,, y ,-
2.2 - En&-eti&~%
FabrTcatlon
d’une”banque de &%ziies
Pour conserver le pouvoir immunogène
de l,o souche, à chaque préparation
d’un nouveau lot de semence, II est nécessaire de passer Ia[ souche sur bovin.
Prendre des tubes du précédent lot de semence, et repiquer 0,5 ml de
cette semence sur boul I Ion V-F (viande - foie), glucosé à 10 p.1000, sous
huile, en tube de 22, immédiatement après ta regénération de ce dernier.
Après 15 h. d9étuve. à 37’C,
la culture sera en phase exponentiel le. Trois ml.
de cette primocul ture sont réensemencés en bou.1 I Ion V-F gl ucosé, rég6néré dans
s
un Er1enmeye.r
de 1 I itre. Apr.ès 15 à 20 h. dDétuve à 37OC, cette culture
.
seconde servira à inoculer un bovin.
:
2 . 2 . 2 - Passage surbovin
: .‘4T’u’ -u----u---u
. .
Le bovin.choisi sera noti vacciné et bgé de .20 à 30 mois.
L’inoculation se fera par voie intra-musculaire dàns’les muscles anc&&s
de l’épaule. Lginocufum sera constituf: à parties égales de 2,5 ml de la culture
_ 9
..: .,
- 2
seconde de 15 h en Erlen et 2,s ml dvune solutioti de chlorure de csiciw rir
5 p.100 destinse 2 favoriser I 13 réveil ik?S spores et la multiplicsticn du
< * . ‘
clostridium.
-.
II*. .,..
2'3-
0-L.
Fiécelte du sanq & la nhasc se@ic&zigue
-"------------L------~~-----~~
m----- --
15 à 20 h après l'inoculation, Ivanimal est en phase pro-agoniqw ': fl
: est couch4 sur un c6-t6, les 4 membres en extension, avec un oedème volwineux,
~localis6 2 la zone d'inoculat,&?~ ,La prise
,. II. de ,,température
rectale &vh?r: un
début dvhypothermie.
1
On prél&era alors s-t&-ilement du sang B la veine jugulaire dans un flscon
de 500 ml avec billes de verre et citrate de sodium à 5 p.1000.
._..
L'animal ayant succomb6, procéder à IPautopsie, et apr&s avo ir figaturS
les vaisseaux sanguins afferents et effhrents, prélever le coeur. PranCra ~~us.sl
un os long. Ces ~t%l@vements sont destinés S effectuer des hémo c
cultur3s.
2.2.4 - Ensemencements des bouillons V-F g.lti.cos6
-----------'-.----.~Y-*~----~,--~--~ ,*-,,A. sous, .hu i le. ., ww: i-f- !;3n-
--e------ -2. --u-------c
*'
n6s en tube de 22
m.--..m.-.m-.e-------w
g*ussitôt apres la r&zolte, on ensemensera'avec I-e sang, une quarant?iw
de bou il Ions V-F, glucosé, sous huile, en tube de 22, préalablement r&$&-6s
pendant 20 minutes. Par tube de 22, la, (josa ,lnoculum de.$ang ne sers-pas inf&
rleure 3 2 ml si l.'on veut obtenir une bonne culture à démarrage rapide, Yettre
à l'étuve a 37'C, pendsnt 72 h.
.<
2.2.5 - Récolte et stockage
---a...--..------~---
-
'Chaquc~ jour, les tubes sont Observés. On ne retiendra que les tubes ayant
présenté une Woissance rapide -(rejeter les cultures qui n'w+pas dG:r:arr+
-._
dans les 24 h)- avec troubln intense, ascension du'broyat de Vian&, et f-t-i
dhgagement de gaz (visible par les bullas smprisonnies dans Ivhuile de vaseline).
_c
Si les contrôles Indiqués ci-apr&z sont satisfa!$,a,nfs.,.
Ies...bouchons
dc c!~t~n
sont flambes, enfoncés à Iv int&leur du tube donT,.on..protégera 190uvertt;r~:
Dar
un capuchon de cacutchouc. Num&-oter chaque tube, et les inscrire sur 18 re?is-
.
..'
.<:
tre des 'sou&h&s. Stocker a + 4OC.
'
'
1
..* / LI.
83,
*,.
- 3
2.2.6 - Contrôle de eureté
,..“-w-I..-----
-s.---
2.2.6.1 - Ce contrôla est important pour dépister les contamina-
ti,oFs, (pjr exemple germes des rSservoirs gastriques ayant franchi la barrière
intestinale durant la phase agonlque de Ivanimal).
Ce contr8le se fait 5 deux
niveaux :
.
..’
‘..
a) au niveau du flacon-
r6cql te de sang :dg n$rne que I ‘on ensemence des bou i I -
Ions V-r glucos&,
on ensemencera aussi 3 à 4 ,Qouf I Ions nutritifs ordfnatres
pour bien s?assurer que le sang préleve ne contlent que des bactêries sn&ro-
b i e s s t r i c t e s ; .,. .
b) au niveau des tubes souches : après 24 h de culture à 37OC, dans chaque
‘tube souche (boul 1. Ion ‘V-F gl ucosê, SOI~S huile, en tube de 221, on ptié18ve
?&rI I ement, à la p 1 pette Pasteur, quel ques gouttes de tuf tut-o qui: I von
ensemence ai nsi :
- 3 gouttes dans un boui Ilon n u t r i t i f a&oble,
- 3 gouttes sui la pente d ’ u n e gi;lose tiutrltlve,
eni t n une goutte est d&o$e sur lame pour coniect i o n d’un frcttis e t colo-
:
.
ration de grati.
. .
2,Z‘G.Z - I nterpretation des résu I tats
. . ..-... . ..^ .
Les cultures en bouillon et sur gélose nutritive seront suivies pendant
.
i:,
7 jours. Elles doivent demeurer s-t&-iles. Lvasbect mo&hologique des bactéries
”
vues au Grak’doit correspondre aux car&téri&lques d;‘Cl . chauvei .
1.
I...,.“b.,,
>
111
-
PREPAFATION DU Ml Ll iZù‘ &’ ciJi’r(JRE’
’ ’ ’ ’ ’
’
a
3.1 - Généralités . . . .,LL.
.:
. ..*......* a..>,.
Le milieu uti llsé pour la culture de CI.-:c,ha.uvel, .au Laboratoire de Dakar,
est une digestion papafnique d’un mélange d p, viande et de fole de boeuf, glu-
cosëe à 10 p.lf)OC et fil-i-r& sur filtre Seltz EKS 1.
. . . / . . .
- 4
,.
ï
csrta
,
ins'laboratoires (FARCHA, Tchad) Ütit fsent une digestion ch I i::rhydt-o-
pej&que à 48*C, La digestion papalnique offre l'avantage appréciabIs d'i?fte
. - .
beaucoup p lus raside.
Pour les besoins de la fabrication, ce milieu est conditionn5 de 5 façons :
- en flacons Lie 10 litrss : milieu filtrE sur fil-tre'Seitz EKS 1, i~luccsO 5
.10 p.1000 &&rt la fabrication (vair schema A),
- en
ioles Erlenmeyer de 2 Ii,tres (1,5 1 de miliou environ) : milieu filtre
sur EKS 1, glucose à 13 p.1000 avant la fabrfcution. Les fioles Erlenmeyer
uti isées ont 6t6 pourvues d'un tube de verre SOU~~ 5, la base, long de 7 cm
env i ron I-travail du verre dans un a-te! i er sp6cialise);sur lequel est flx5
un tube en rhodordil portant une pince clamp et terminé par une sffilure de
verre (voir schéma 61,
- en tubes de 22C mm x 22 mm.: le miiieu est cette fois non filtré sur EKS 1,
mals prtkipité,
filtre sur papier, rgparti en tubes puis autoclave. i%vant
I 9 autoc I avage, on recouvre le mllieu dvune couche dPhuile da vaseline, de
plus on y ajoute des fragments de viande et de foie cuits, ces tissus Jouant
le rôle dPagants réducteurs (rH bas). Milieu glucosé à 10 p.lC90.
3.2 - Composition du milieu
Les chiffres don& ci-dessous correspondent 2 ta fabrication dvunc skie
de 12 flacons de 10 litres contenant chacun au moment de l'ensemencement 9 Ii-
tres de m'il ieu Y '
Viande de boeuf, parée, hachée .*...........*.*..*.*.
14 kg
Foie de boeuf, pare, hache . ..*....*.................
,4 kcJ
PapaTne
. .
.I ,+Oc). 9 .,
.._.
. ..~..........*.......*................**.....
4
Eau distillée .'....*......*........,.........,..*...
.10O.litres
'.
. "
pi-1
=
7,;,6
à, 79.
.”
.
. . . / l . .
. . .
. .
x
-.
- 5
3.3 - Technique de préparation
3
c
3.3.1 - Déccupe de la carcasse de bovin et parage de la viande. Hachago
de cette dernière et du foie. Conservation en bacs de piastIque
. "
à * 4OC.
i
3.3.2 - Conduite de la dlgostion
-.fe digesteur contenant les 100 litres dveau distillée, la temperature est
e.
port& à 50°C. On ajoute alors la viande et le foie.et l'on homog&Gise la
suspension à Iqaide d'une pagale de bois. La papalne est alors introduite
(les 100 g de paparne sont mis en suspension dans 200 ml d'.eau distillee,
.
et l'homog&éisation peut'être facilitée en utilisant un super-mixer
Yurmix" pendant .l à 2 .mfnutas) .;,
- porter la tempErature du mélanqe à 70°C en une heure. Au bout de ce temps,
la digestion est pratiquement achevée ;
- Qlever alors la température à R5'C, pour détruire la papafne ;
- vérlf.ier le pH ;
- filtrer sur papier filtre ;
- ajouter du glucose pour obtenir 13 CoIIcen+ratlon
finale de 10 p.1000.
..-.
,.
3.3.3 - Filtration du d igestat glucos&-sur-filtres Seltz de iO'"i‘ i tres
EKS 1 (x1
,<
._.
<
2 filtres Seitz de 10 litres, pourvus chacun d'une membrane EKS 1, sont
suffisants pour assurer la filtration du digestat obtenu (série de 12 f'fikons
de 10 litres contenant chacun 9 litres de milieu filtr%), 3 condition de proc&
'der à une clarification préalable sur un filtre Seitz de.10. li.-trss:&quip6 dlune
. membrane AS. Donc, il est indispensable de disposer au total :de 3 filtres Seltz
de 10 litres.
l . . / . . .
.
,’
(*) Remarque : ivemploi de milieu filtré, au' lieu de ,miIleu précipite, 'filtré
sur papier, puis autoclave, assure une croissance bien meilleure de Cl
- •
chauvei et permet un gain de temps constdérabtë.
- 6
.,.
i
- .
Le branchement ffltt-e Seltz d3 10 litres (membrane EKS 1) - flawn de
,hl(j'I'ltres .c,e faif grâ& à I't.rJ-il isatinn de tubes de jotictfon ?I rodage ncrmalisé,
* I-
mâle- femelle, SOVIREL (14/23) emboîtés sous la flamme d'un bec kcker. Le
filtre porte l'element mâle, le flacon de 10 litres 1'6lément femelle et un
tube de verre coudé par 013 sera IntroduI~t
Ivinoculum (voir schema A,et C).
Filtres Soit-z et flacons de 10 litres vides et equlpes sont s-i-erilisi~.s 21 i'auto-
clave (45 mn a 12OOC).
3.3.4 - Filtra-l-ton du milieu destine a I'inoculum
1,5 à 2 litres du digektat glucos ci-dessus sont filtres selon !î même
processus dans 2 Erlenmeyer
de 2 litres pourvus à la base d'un tube de vdt-re
soude (voir ri-dessus). Cette fols, c"est 19Erlanmeyer qui porte le tube de
jonction 2 rodage normalisé femelle SOVIREL (voir sch6ma 8).
Les flacons contenant chacun 9 litres de mtlieu fi If&. et tes Erltinmuyzr
destinés à la culture de I'fnoculum sont conserv&s an attente 2 la chambra
étuve à 37OC.
. . .
.
V- TECHNIQUe;OE FA6RIC,'\\TlON
DU VACCIN
4. 1' - G6néralit&,
L'obtention d'une culture trés riche en formes végétatives, sports et
toxines reclame certaines precautions.
La courbe de croissance commenci.~ dar,s
un tube de 22, poursuivle en krlenmeyer de 2 1, doit continuer dans itis flacons
.,
de 10 1, sans accuser he palier, cvest-à-dire de‘ralentissement, voire dvarr&.
Four ce faire, ii importe :
w-'
- que chaque passage se fass e alors que 19inoculum est en pl.eine croi ssanca
Z-
(phase de croissance exponentieile).
Une telle culture est ,3piXJlle, avec un
.s
fort degagement gazeux qui entraîne à 1.a surface.les, particules :-te 4riat-&-
.<. _
.
_
."
,f6?e. Tout'ensemerkement
tardif, avec une culture qui tiommencc a sedimenter
ne donnera qu7une croissance'lente, pauvre'en batteries i
<
..- _
. . ./ . . .
- 7
- que les clostridies trouvent des conditions optimales de culture :
c
a) présence de tous les éléments nutritifs nécessaires, aux doses precitées.
D
En ce Sens#
la f 1 ltration du mi I ieu constitue un net avantage sur i Qan-
*m
tienne précipitation suivie d’un autociavage ;
b) pH convenable : de 7,5 a .,7r8. ;
CI une temperoture de 37OC : survei i ier regul ièrement
la temperature de I a
chambre étuve ;
dl enfin un pH suffisamment bas. Pour cela, on prlnclpe, dès que les flacons
.
ont atteint ta température de 37OC, i Is doivent être ensemencés.
4.2 - Préparation des i nocul ums
.’
4.2.1 - Cultures en tubes de 22
--------c-----------_I_
Deux souches (au cas où I Q une des souches redémarrerait mal 1 .sont ense-
mencées, en boui I Ion V-F, gl ucose, sous hui le ; tubes de 22 r6générés. La. dose
lnoculum sera de 0,5 ml,
412.2 - Culture en Er lenmeyer do 2 I i tres
--------------w-L ----,a----,------
A’
Après 10 à 12 heures d’ktuve, les tubes de 22 présentent une culture en
pleine croi ssa nce, i I s permettent 1 Qensemencemen~t~ de 2 Er I enmeyer “‘oontenant
__.- -.-
pres de 2 I ii-t-es de bouillon V-F glucosé à lO~p.1000.
Après
16 2 15 h de CU I ture à 37OC, I e contenu des Erl enmeyer. pr&ente
un trouble homogène dense sur toute la hauteur du mi I leu, avec un fort dégage-
ment de gaz qui se traduit par ,la presenc c d’une @usse b I anch.e de ? à 2 cm
d’épafsseur,
au dessus de
a ,surface du liquide.
4.2.3 - Contrô 1 e ‘de
- - w - m - - - - - - - ureté des i nocul ums
--------i---“o-----
Pour sqassurer de I a pureté de i Q i nocu 1 um, 3 chaque repiquage - tube
souches en tubes de 22, tubes de 22 en Erlenmeyer , Er I enrneyer
en f Iaccns de
t0 Iltres - on ensemencera en môme temps que I es ml I ieux anaerob i es strictes
des milieux aérobies tels que des boufltons nutritifs ordinalrcs. Cette mesure
est jumel& avec la confection de frottis et coloratlon de Grsm de chaque
culture.
.
/
l .* .*.
i
Les bouillons yu-l-ri-tlfs.doivent
rester st&l I es, et les GtXTn ne, !Xs ;jr+
.
senter de bactêries morphologiquement différentes des clostri,jies.
4.3 - Ensemencement d'une série de flacons de 10 Iltres (contenant chacun
3 litres de mllieu)
:
~
Les flacons sont s&tis de l!Stuve et ensemencés cf?acun avec I$I à 1SC: ml
des cultures en Erlenmeyer, introduits grâce à I'effilure de verre sous ia
protection de 1s flamme d'un bec Mecker. Le tube de verre cow:J6, quS pr&s+nte
. .
chaque,flacon, permet de recevoir Iqeffilure de verre Sans que soit rvtirx 1:
coton qui obture le goulot du flacon.
._.
4.4 - Mise en culture à l'étuve
Aussitôt iqensemencement terminS, 'ISS fl'acoris sont port& '3 17&tu?:. a
37OC. Après 20 h Ci'&tuve,
la culture envahit tout le flacon, Ii'3 milieu c'aviont
opaque, et une épaisse couche de mwsse blanche recouvre la surface,
Au bozt du 36 h, la s&dlmentation commence : le milieu sq&laircl"~, ün
culot microbien, plus ou moins Important, sqamasse au fond du fiacon,
Après 48 h, on procédera &'iars au &n%%le de'pu'rctb,
4.5 - Contr8le de pureté et formolage
4.5.1 - Contrôle bactérioscopiguc
------I-_L--------"---
mm
On &aKse'un frottis de '!? cultuVe de chacun des 12 flacons. L'cxnmen se
fait après cclorat~on de Gram. CI, chauvei Sur ces 'cti
. I
tu'res d&Y38' h a;:parat4
plus ou moins Gram nigatif:Les &rps bact&'iens sont parfols lysés, et 13
morphologie classique nPest guère retrouv&. Cependant les contaminations le
plus souvent rencontrées, coccl ou anthracofdes, se s
. . . .
"
i grialent ais&nent à c;-:-
simple examen. En cas de doute, avant de formolar, on peut ensemencer, la cul-
ture dauteuse en houillon nutritif. aérobie. Les flacons souill& seront
. i
;.. .
éllm,ir&.
,,
_
.
-.
. . . / . . .
<<. :.
., . .
- 9
4.5.2 - Addition de formol
--q-----M---------
.
Les flacons ayant sstlsfait au test de pureté sont alors formol& à la
.Y.
concentration finale de 5 p.1000, On utilisera ,le formol techniqu-e (solution
*-
d'aldéhyde fwmique à 40 p.100) à la dose de 45 mi par'flacon, à fvaide d'une
éprouvette graduée. En vleilllssant, le titre du formol à tendance à baisser,
rl est donc recommandé d"en faire le dosage de temps 2 autre,
>
Cette opérailon doit être réalisée par Lia m&me personne, en principe celle
qui dirige la production de ce vaccin ; car l'oubli d'ajouter le for-mot aurait
des répercussions fkheuses.
Après Ivaddl-tfon de formol, les bouchons de gaze qui obturent les flkons
.
sont remplacés par des bouchons de caoutchouc baignant dans une solution formo-
Iée. Les flacons, après avolr subi une agitation vigoureuse, sont alors remis
à I'etuve pour une durée de 4 Jours. Une anaculture totale est ainsi obtenue
.
., ..I.
selon le mode classique de production des anatoxines et des anacultures par
.'
actfon conjuguée du formol et de la chaleur.
4.6 - Precipitation par l'alun de potassium et test d'innocuité sur cobayes
4.6.1 - Addition d'alun de potassium.
-I---m.-------w---w.. --w----w .,
Après 4 jours dPétuve,
la culture reçoit de l'a lun de potassium à la con-
centration finale de 10 p.1000, soit 900 ml d'une SO lution stérile d'alun à
10 p.100 par flacon de 10 litres. Cette soiutIon est pre-parée de ,ia,façon '.
sulvante :
- composition :
- alun de potasstum
r*.*.*....*.*........~.,
1 000 g
(potassium-aiumlnlum-sulfate)
- eau distillée
10 litres
l . . ..***..**.....*.......*.
- technique :
, . .-
premier jour :
- peser 1 OOC g d'alun,' bien l'écraser pour le réduire en poudre,
- verser dans 10 litres d'eau'distilleeP
- faire fondre en agitant le mélange avec une'btig~ette de bois,
- précipiter à l'autoclave, 30 mn à 120°C ;
,,. / . . .
- 10
. . . . . .
i
deux'i&me jour :
- f'ittrerchaque flacon sur papier Laurent, *
i.
/
'/
'.
- réauf&laver le fl'ltrat 30 mn à 110°C.
'.
.
4.62 - Pr6l~vemen-t d'c5chantl
lIc:w : flacon téwfn de 12 &-iv et-&u'ite
pu-- -,-,I--,,,,,,-,-,-,,,;,1,1,,,,-----1--------------------,----
-------
Lo pr&ipi+ztloti des protéinès commence aussi-t% apres I'intruductipn de
Pa'lun. A la pipette, on prél&ve alors 2 a 3 ml deculture dans chaque flacon.
Ces &Chanti!!ons sont rassemblés au fur et à mesure des pt-etèvarnent
dans un
flacon qui sera conservQ comme titmoin de la série produite, Ne pas oubliw
~ d'insc,rire sur le flacon, le numéro de la set-i e et la nature du vaccin pt-cduft,
'
,4.6.3 i Test d'innocuité sur cobsyes
---------~-----------9---
--
A parti r de ce même flacon témoin, on pr8lèvera 3 la seriw;ue de 5 ~1,
4 ml de culture que 190n injectera par wie sous-cutanee 3 2 coi:ayes 2 t-aisor,
de 2 ml par cobaye,
Suivi.s pendant ..E; .jours.,. ces cobayes. ne do I.v.&nt..p.r&&-ar-
.aucl.!.ri. trou!: 1 ,?.
En attendant les r&sull-ats
du test d*innocuité,
les. flacons da 1G Ii-!-r-cs de
.'
.
vaccin sont stockés à la chambre f'r%ide '?'+ 4'C,-
4.7 - Répartition du vaccin
.
Au Laboratoire de Dakar, le vaccin est rQparti en ampoules de 20 PI (d:zz?
vaccinale : 1 ml) dens un calsson à vide,
Au Laboratoire de Farcha (T&adI'i la:f&;~;ii~-;~~ s'effectue dans des fla-
,a
cons (250 ml par flacon).
'.
,,
I ,: . . . . ,.."..<... ‘1.
V- TEST D'IMMUNITE
T
.I
Ce tes-t est à faire sur bovins, à d8faut sur dr?s moutons. If ne fnu-t..pas
utiliser de cobayes oil les résultats sont difficiles à interpriter~et difflcile-
men-t transposables sur bovins...
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5.1 - Protocole
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I
Animaux
Epreuve
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R6sultats
4
Vaccination
1.
1
1 ml de vaccin
15 jours après la vac-
tous survivants.
2
sous la peau
cination, dsse d'épreuve :
Quelquefois boitarie
3
de iFencolure
20 à 40 DSPJ et-i intra-
et onflura I0gère
4
musculaire
de 1'6paulc
/
1
T&~ins
0
Marne swche dgépreuve,
1 Tumeurs dans les
I
mais à des doses înfé-
24 heurts I~I- mort
/
rieures 4 2 ci 3.94 et
en 24 à 48 heures.
1 a 2 DSM
5.2.- Préparation de la souche d'Épreuve
5.2.1 - Souche utilisée :
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Souche Thiés.
5.2.2 - blode de culture
"""-"""-"""""I-
La culture qui sert à Iqépreuve doit être une culture jeune dc 15 ?I 18 h
en Erlenmeyor. Le bouillon V-F glucosé est utilisé comme milleu.
5.2.3 - Conservation
"""""""I""""
La culture en Erlenmeyer btant tormin6e, on la distribuera en flacons de
20 ml à raison de 5 ml par flacon. Misa ?I la congé I atlon, puis lyophilisatlon.
5.2.4 - Détermination de la DSM
"""""""-"""""""^"""""""
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Elle se fait par inkulation sur bovins ou mou,tons. 2 ml de culture lyo-
J
philis6e repr ise doivent correspondre à 20 2 40 DSM.
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5.3 - RGalisstion du test
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.j' 5,3;,1 - LPinjëcticn du vakin se fera sous la peau de I'enkoiur& 2 raison
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de 2 ml par anitiàl.
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5.3.2 - LPinjection de la dose di6preuve sera faite au centre dee muscles
ancSrt&,
Igévolutl~n de la.tumeur s'y observant slsëment.
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5.3.3 - Les faibles doses 0,l à O,5 ml seront injectées avec une Gringue
2 tuberculine, Les volumes ne sont pas ramenés ?I 1 ml au woy~n
de dilutions, de façon a.ne pas wdificr la c~,ncentra-i-ion
Ii:cale
de toxine dans le muscle. En outre?
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1 'eau disti 1 I&"c!A le sjrum
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physiologique ne sont pas sans action nocive sur CI. chauvzi ;
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1 mi d'une culture dilu6e au l/lO n!a pas la mSme viruierwe.qu~
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O,T ml de cette même culture pure.
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