INSTI'IUTSWSDERECHERCHES Acxmms (I.S.R.A.) ...
INSTI'IUTSWSDERECHERCHES
Acxmms (I.S.R.A.)
----W-------L-
* I!dllBRAToIRE NATIONAL DE L'ELEVAGE
ETDE RECHERCH?Z$ VmRINAIRES
DAKAR-HA?@J
PROWCI'ION DU VACCIN
CJNTRE LECIZAREON EKTERIDIEN
REF. No 33/BACI'ERIOLoGIE
FEVRIER 1985
“ .
-
PROIXI'ION Du VACCIN
(XINTRE LE CHARPGN BACTERIDIEN
.
.
“,
.
.
.’
1 - mOat DE LA SQUC$IE VACCINALE
Ikux souches vaccinales semnt considérées :
.,
:
1.1 - SOUCHE C5.- Souche /atténuée mis virulente utiliSée par L.P.DELJT à
l~ïx&tit& dfvessarek. Vaccin uniquement destiné à la vacoination~des bovins,
ovins et oaprins.
:
1.1.1 - La dose sQremnt mrtelle de la souche C5 pour un cobaye de
500 ggxrrm%S' &t drenviron 10 spores. Le oontr@le de la virzalence de cette
souche vaccinale s'effectue ainsi : 4 cobayes et 4 lapins sotit .inoculf;s en
sous-cutanée avec 041 ml.. d'une culture en bouillon de 24 heures ;,,les.c+ayes
doivent rrmiri* en mins de 3 jours. Il est adxissible qu'un lapin sur quatre
meure durant la période dt!obsezwtion qui doit être d'une qui&ine de jours,
la mort éventuelle des lapins survenant généralement dans les 5 pretiers jours.
Si la rrmtalité est plus élevée, il est nécessaire de procéder à une nouvelle
série d'inocütatiorssur une'dizaine de lapins. Da&l~ cas oii le pOtientage
/
I i ;..
de mrtalité dépasse 25 '%, il est, selon L.P. DFLPY, pfiférable de &$artir
d'un autre tube de conservation.
1.1.2 -,,,Le.$l,ieu utilj,~ p+r la,sporulation'est la gélom paume'i~
: '.
..
Viande de boeuf ou' de veau . , : .'. i'. . i-;':". ,
500 E
Chlorure de sodium . . ..*..*...*.....*...
SE
Gélose
'. :
. . . . . . . . . . s'....... .'.* . . . . . . . . . . . .
15 à io g
'Eau .'
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l O(f, '.
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. ..*a . . . . l ..o***...;..:* . . . . . ..a...*.
/
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.,
.
Hacheti lti‘viande et laisser,mcérer une n;t à fmid .dans l'eau. Potier
quelques dutes à l'ébullition, en agit&&. Exprirwr le jus?.:Fi.ltmF sur pa-•
$zr muillé, Compléter le volume à un litre avec de l'eau distillée et ajou-
ter le sel.
Ajouter la gélose en poudre. Faim dissoudre à feu doux. Porter à
l'ébullition. Refroidir à 60-65OC. Ajuster le pH.3 7,2. Repartir à raison de
. . . / . . .
-2-
150 cc par boîte de Roux et stériliser 20 minutes à 115*C.
., .
1.1.3 - Avant leur inoculation, les bottes doivent êt~ séchées à l'étu-
ve un OU plusieurs jours, les conditions d'une bonne sprulation sont :
a) DB géloses parfaitemnt sèch& au moment de l'inoculation.
b) Pour chaqua boxte de !%XX, un inoc~n:.j,~~,~~~isiint.pour~h~t~ctër
la smface de g6lose dans sa totalité,
:
. :
1.1.Y - L'irxmi!.um peut provertir d'une hémcultme de 24 heures faite
en bouillori oMinai& 2 partir du sang d'un cobaye 1-16x-t d'urk septicémie mm-
~'k0qu6k'par'la S~uc%e C5 ou d'une culture de 24 heur& en bouillon ordikim
faite 2 partir d'une bo!Tte de Roux syant bien spomléc. .
1.1.5 - La,spxulatio~,,est con:sidér& 'cmme bonnes lorsque :
- les Wtes ensmenc&es ont un aspect giti et non visqueux,
- la spomlation est de 80 à 90 "0 dès le 2èm jour et sue 12 S'E"
joU& on ne trouve guk?+ que des spores libres,de fom et de {aillé uniforw.
Les k#tes retirées de l'&uve de 37OC après 48 heures, sont lafss&s
2 2 3. jOurS 2 20-25Oc, le temps du cxmtr6le de toutes les koirtes.
1.1.6 - La rkolte desSs~zes doit se Faiw en présence du chef dc
Mmxtoire (lavage des boftes de Roux avec du sérum physiologique et cks
billes de verre).
A la. fin de la r<e, on ajoute ,i la suspension de spores un poic!s
égal de glyckim stérile. Cette r&olte.de spores en s&um glycérine est in-
cubée 2 37OC pendant 'trois saines afin de détm.i~~les éléments mycélims.
. . . . 1
. . .
1.1.7 - Après 3 semines at,ine@atio~ à, .37?C,..cette
suspension de S~O~;T,
.,,‘
dite suspension ID&, sera titrée. s,uiymt la titm obtenu, elle sera dilué+
dans du sémm glyckiné stérile (une part +z s&m physiologique, une part
égal@ en poi&"de 'glycérine) de façon 2 obtenir une suspension vaccinale ti-
c
. tr<25tim~~~s&ml. :
: ,,
..,_ ..~
'.
-4
.
..* /
. . .
-3-
SelQn L.p. EU??, les doses vaccinales Tour les ctiffkntes eS$CeS
s'établissent ainsi :
., .<
Butons et chkres
c),2 rd
5%) 0q-l
'L. 25o 'oo* .__,^ . . . :, . . . . i
Veaux
0;5ti
."
E?ovins adultes
.J IF1
2. 500 000 '<
.-
_
.
I.1.8 - Les tests d1ini&mit6 et rl'immnitc-i. sont effectués sw
mutons et ch&res.
.Sclon L.P. IEL.PY , 1'3s mimaux vaccin& &sistent 2 l'in0,culati.m de
1 000 doses sk-emnt mr-telles c.q'une souche sauvage d'&m+we de char%% bac-
t&idien.
1.2 - SO?JCE STEFNE 34 F2
Souche fcurnie par le IAmrat~~i~ dk WeyLPidge. Les souches de ty-e
S'I'ERhsE; sont des snuches avkulentcs, acapsulées, c$tenues.à .pmtir & souches
virulentes par dissociaticn su17 ,gGlwe à 50 % ,de s&un dans une ambi~ance de
CO2 (30 %).
La souche STERNZ 34 F2 spmw.le facilemnt ; la phlose n'a pas besoin
d'être ,aussi skhe. Cette souche peut êtreeqQ$e en tcwte s&urité. Il n'en
est las de m%e de la souche C5, tout pwticulièmmnt en ce qui concerne le
cheval. De plus, il est Lar&v& qu'on isole ?ar hémculture la smche C5 $
partir 6u cadavre (7'un mutcn utilis6 T-icw les tests cl'innmkit6 et titi apres
svnir &té.inoculc-i .awc un grand nombre de s-ores de C5 Cplus dé dix ‘fo'is la
dose vaccinale).' Ce muton &ait certes I?nrt d'une autre maladie, scms 'rivoir
yéseryt6 de Gsicm ned&mtwses~au $zki-A de l'injection, mis il est tout aus-
si certain qu'une septicbie .a.nte~mtiem, Il n'est dmc Ns interdit de priser
que de telles se~ti.c&&s ante-rmrtem yissent se ?m~duire chez des .an-imaux
affaihlis, mccir& ;:eu Te tq-s av~ant leur mt: .a.vec la souche C5.
b souche STENE, certes peu virulente, ne risque pas de tmnsmzttre'la
----
-4-
maladie par contact. Il ne semble pas non plus que l'ingestion &entueile
d'une viande d'un animal frakhemnt vacein~ par cet& souche soit dangereuse
pour l'horrrmv. D'une façon générale, dans les 1abomtiiriEJs africains fmco-
phones, la souche Ci est abandonnée:, en faveur de la souche STBGIE 34 F2.
. ,,,.
r
.
.;
,.
II - PRODUCMO!?~DrUN VACCIN CONTRE IX CHARRON BAC?B?.IDIEN AVEC J.,A SOUC!HE STERr?rl'
II.1 - CONSERVATION DE LA SOUCHE~VACCIN&E
Dès la r&zeption de la souche, és?iter les passages trop nombreux -
mwrir'une ampoule et rwxmstituer son contenu dans de L'e&u distillée ; Cair>-
une dilution dans du bouillon nutritif ou de l'ex-tmit~de levure, Utiliser
cette suspension im&iatemnt (sans l~i&cuber) pmr ensewncer plusieurs
kx&tes de Roux. Me- ces Co?tes à llincubation (37OC).
Quand la spomlation est terminée (au bout de 48 hems,'au rmximm
au bout de 72 heures), les M(ites sont lavées avec le tampon de Weybridge 2
mison d'environ 150 ml par bof-te de Roux (de 600.cmzL
Tampon de Weybridge
Bacto-casitone
.................
50 g
SaCcharOS.?
.....................
mo g
Glutamte de sodium ............
40 R
Eau distillee .................. 1000 g
L3 suspension de spmes est mise à 4OC a&5 avoir éte chauffée 1 h.
à 65OC pour détruim les élémznts ~crlliens. Les contr@les de purete et d'in-
nocuité effectués,, cette suspension est répartie dans des flacons type pC=ni-
ciiline de 5 ml, Zi raison de 1 ml pm flacon. A~&S l~philisation, ces s~ms
peuvent Etre conserv&s pratiquement indéfinimnt à -2OOC et le amtenu d'w
flacon sem le point de &part de la production de chaque nouveau lot de v.?ccin.
“.
. . . / . . .
-5-
II.2 - PREF'ARATIOPJ DE L'INOCWJM D'bT LOT DE 150 MITES
Le contenu d'un des flacons de la banque précédemment prGpar& est re-
constitué avec un millilitre d'eau distillée, Cette suspension de SP-
res est dilu& dans environ 12 ~1 de Ixiuillon ordinaire ou cl'cxtrait de
le=. Treis à quatre boîtes de Roux wuvent être ensemencées, Au but
de 48 h, on choisit une bîte 96 la s-px?Üb.tion est excellente et on
effectue une lég&e suspension de spxes dans environ 600 ml de buil-
lon.ordir&re ou d'extrait de levure (3 â 4 doses de culture pour
500 ml de'liauide). CM-te suspension permettia l'ensenxzncement de 150
boîtes de Roux qui serviront à produire un lot de vaccin, ll~culum
pour chaque boîte étant de 3 3 I+ millilitres.
11.3 - PREPARATION D'UJ LOT DE VACCIN
11.3.1 - FY6parxtion des Wîtes de Roux - Choix du milieu
Les tili-ux à base de mack.tion de vix-de, &$conis6s pur la
sporulation dc la souche C5, ne sont pas les mzillcurs pur 1s bonne sp~~~lr;-
tion de la souche STERNE.
Yil&% dérivé de celui proposé par l'OMS.- FAO :
'.
Bacto-cwitone DIfC0 ..........................
23 p
Extrait de 1ewk-e DIFCO ........................
G
Phosphate lr+otassique (K2Hm4) .................
4R
Phosphate mxwl\\at-assique (KH2pO4) ................
a
Chlorure de c&.cium (C+., 6 H2q) ............ .
0,lg ,
'
Sulfate ferreux (Fe SO,,, 7 H20) ................
O,Ol g
Sulfate de magnésium 0QSO4, '7 H20) ............
GO5
FI;
Sulfate de rrkzng.-inP,se WnSO4, 4 1328) ............
03 ET
GElose .........................................
20 $7
Eau distillée ..................................
1OOOml
pH 7,6
kzs 20 g de Ekto casitone peuvent Ztre rem@ztcée r!ar 20 g de byp-tose.
. . . . / . , .
-6-
Xi.3.2 - QmtMle de la spmilation
_.
.
-
.
. . .
.-.
Les boTtes de Roux doivent &tpe séchées à 37T, un ou plusieuz
j o u r s , avantleurens~n~nt, .
L'inxulum ne doit pas être tmp kportant, 3 2 5 ml par boîte de Roux.
?XE obtenir une bonne sporulation,
ïl cst.indispensable que l'imculum ne soit
pas u& culture en bouillon, mais simplement une suspension de spores en kx.Gl-
lon ordirai= ou extrait de levure.
Après la spmlation à 37OC qui doit Bre obtenue en 48 h, au mximm.
72 h, la mise des hcjftes de Roux K2C~-25°C pendant 3 ou 4 jours est recomndac.
I.
Ceci pekiet la fin de la sprulation et le cwintrgle de toutes les boTtes zvmt
la r&olte (le con'm%e de la spxklation peu-t @tre effectué en colorent les
spores par la m&hode de KWJXR),
^_..
II.3.3 - Récolte des spxes
La.rGcolte desspr~~ se .fait dorie ënvixnn'~5 jours aprÈs l'ino-
culation des boftes de' Roux.
hns des tubes (22 x 2201, on stkilise une vingtaine ,de billes de verx
avec environ 65 ml. de séxwn ^ysiologique. Le contenu d'un tube sera nécesscliz
,
pur laver une bolite de Roux. La suspension de spres sera recueillie dans un
flaconde10litrxs àtrwwsune ga7,A? stériIe,gmtée. sur un entonnoir ad&pat.
150 boTtes de Roux peuvent~foumir~envimn 1O'litres d'une suspension &
spmstitrant3milli~ de~sprcs parmi.
Fbm détruire lès &%n&tk'~ciQiens, onprtelasusmsion de S~u)res
une heure au bain-marie à 65%, ou on ajoute à la suspension de spores deux
fois son poids de gly&%ine k&iik et on laisse cette suspension glycérink
3 semaines 2 37OC afin-de dG?tGuire les éléments mycéliens encore p&sents.
Une fois les él&r$s r?ycéliens d&ruits, il .est.pssible de faire les
c
contrbles suivants sur la susper@on C!e sIx~res qui, en.attendant ces opéra-tions~
. .
. .
est stockée à 4OC.
L
. . ./ . . .
-7-
a) - Contr6le de pur&6
- Coloration de l-7. sus;?ensior pur 13 technique de SELLER - Recher-
che dléléments contamknts.
- Inoculation de 2 OU 3 bo?tes de Pgtri (Qecherche des colonies oon-
taminantes).
b) - Contr9le d'innocuité
- Inoculation de 0,8 ml de la suspension 2 4 cobayes de 500 g en
bonne smt~ : observation une quinzaine de jours. Il ne' doit pas y avoir de
mortalité.
- Inoculation Cl(: 3 ml de cette @me suspwsion à 5 mutons et'chè-
vres - quanti-te sup&icure à 5 millircrds de spots.
.
C> - Numération
- Les diff6tente.s dilutions sont faites en s&mnr. physiologiqye de
. .
10-l à 10%
- Chaque dilution est agitée 10 minu-ks avec un agitateur à bras,
type agitateur JOIHN.
On peut procéder comme suit :
Ikns un flacon -type p6nicilline de 20 ml, mettre 9 rriL de sérum physiologique.
Ajouter 1 ml de suspension de spores, agiter 10 minutes puis procéder à la
dilution suivante.
Pour les 3 derni&os dilutions, enseiTc>noer 3 ti?tns de .Pétri ,pa..r dilution
comme suit : dans chaque bolite de P+&i, mettre 1 ml des dilutions choisies,
couler 20 ml de "tryltose agar", en imprimmnt q.uelques mouvem&nts à la boilte
de PCStri, afin de bien effectuer le mélange avec la suspension despores.
Au bout de 4E à 72 heures, la numération pourra être lue ; on Choisir?a
la dilution 6i le nombre de colcnies par lxîte sera compris entre 50 et 200.
On comptera les colonies obserks par boîte et on fera la moyenne.
. . /. . . .
--
-e-
On obtient ainsi de bonnes num&stions. Lf6cart entre deux nur&?ations
ainsi pmtiquges, dans la majorité des cas, sers inférieur-à, 50 %.
,.
FJcmple : - ls= numémtion = xlnombm maximum
I *;"îE: numémticm =x2.nombremizXimum
Nombre mzmjnmm - nombre .tiirrmn x 100 = (xl -x2) xl00 < J-)
Nombreminimum
x2
"
..,
. .I.
II.3.4 - Dilution de la solution - Conditionnement
La dilution de la suspension r&re doit dtre effectuée de t;:ll.iY:
façon qu'une dose vaccinale bovine contienne 107 spores dsns un ml.
Ainsi par+ exemple, pom une solution m&e co&enant 5 x lO* !yoRS -!Yr
ti, la dilution à effectuer est au U200.
Le liquide de dilution est mnstitu6 par du sémm physiologique &y&-
riné (10 litres de s&um physiologique 4 10 kg de glycérine) r$arti en EL+-
cons de 5 1, stérilis6 2 h à 11OOC.
Pour r6aliser la suspension vaccinale, on put utiliser soit :
- un agitateur horizontc?l : pur avoir une bonne,agitztion, il faut
alors q.ue les flacons de 5 1 ne contiennent que 4 1 de liquide.
- un mixeur de 40 litres (Tchad) :
20 litres de s&um glycérir6 sont versés stérilmmt dans 16: &zm,
le mteur est mis en mute. La quantité nkccssaire de suspension de sures
,est alors ajoute,
'a à la pipette, puis on intmduit progressivement l'mt~? mi-
ti6 de la quantité nécessaire de sérum glyc&iné.
Conditicmmment : en ampmles ou en flacons de 250 ml... AU oxrs ik cm-
.ditionnment en f&mns, il est bon d'agiter quelques semndes a intemm'!Acs
&guliers de 1U minutes.
i
Remarques : Toutes les manipulations doivent êtru? effectuées st&i.le?mt,
car il s'agit d'un vaccin dans Leqyel nlentre aucun antiseptique.
. . . / . . .
Après chaque s&ncc do fonctionnement, tout le matériel (pipette, mi-
xeur, flacons, bouchons de caoutchouc, etc. ,., ) doit ?tre soigne~sement'st&i-
aisé, 1 heure à 120°C, sous peirw de retrouver ries spot charbonneuses au
o.ours d'autres manipulations.
11‘3.5 - Contfil~2 du v+ccin finïL!.
a>- Cknttile de pu%té : Sur boYce de Petri corrme pr&éderruwnt.
b)- C>nMls du titre : Mukktion en boîtes de Pétri, comme
pr&édemrwnt. Une dose vaccinale bovine doit contenir au minimum 1 x 1O'spores.
c >-
chez les espècas 1~s olus sensibles (ca~~%s et Gquins).
Pur cela, cinq animaux de chaque espèce peuvent Wre inoculés avec 2
fois la dose vaccinale p&cc)nis~e,
Quoi qYu'il en soit, il est souhaitable lde respecter les ~)ints d'injec-
tion suivants : lc7. face interne de la cuisse chez les ovins et les caprins,
le poitrail chez les @uins.
- chez les cobayes, l'Épreuve c!'irrmunitG prkonisée par le
Comité d'Experts de 1'O.M.S. (St~~ndardisatinn biologique, rappoti technique
no 361, O.M.S., 1967) est ainsi d&rite : au reins 10 cobayes en bonne santé
pesant en- 300 à 509 - rwevrwt la dose dc vaccin ~XXNTWKG pour l'immu-
nisation du m1utori ; les animaux seront mis en nbscrvation pendant 21 jours
et pur que l'épreuve soit valable, il faut q.u'au reins 60 ck des animaux sur-
vivent 2 la fin de la p&iode d'observation. A la fin de cette $rigde, les
antiux p&cfdents ainsi c(ue 3 cobayes t&wins r-ton vaccin& recevront une dose
appropriF::k r3'uw swchc wnvenable de 9. anthracis (par exemple la souche
Pasteur II (17 JJ3) qu'il est possible de se prYx3ln~.r auprès du Lla~ra-toire
International des ,%lons biologiques, Central Vcterinary Laboratory, Weybrid-
ge, Surrey, England). La &XC: à inoculer est de 200 DLV.
.*. / . . .
-lO-
.
Beaucoup de lakxxwtoi.res ont renmntré des difficultés avec ce test
d'imnunit6. Ceci peut étre d0 à la mauvaise sant6 des cc?haps, mis le ;s--aint
.&xx?tant est la viruknce de la souche d'épreuve, virulence qui doit RE r.i
trop forte, ni tmp faible pmr gmm3-tre une r&lle ap~&ci&ion de In c!r~e
minima ~~xdxlle,e% en cxmsécpence des 200 IlLPI doses dtépreuve à inoculc~.
.
_<,
:.
- cher les mutons et les caprins
.
ks i>Lnirr!aux vaccinés avec 5 mil.Lions de sptis doivent tous r&iistw
à une dose d'épreuve de 1 000 DL?4 (susp&%i& de Sptis en s6m glycérin6
d'une souche sauvage de B. anthracis).
. .
.
BIBLI0~~P~PYIE SOMAIRF 2
-----11---------1-----
1. IJELPY (L.P.1 et KAVEX C?g.) - Lj'infection chmlmnneuse des zximaux et de
1'hm-u~ en Imn. Conditions de ;;&pmatinn et d'utilisr?ti.m d'un
va.ccin sprul~ et stabilisé, Arch. Tnst. Ekssamck 4 rmi1946.
2. ?mF$ (Y.3 et 'TTS! !r,:,) - Production du vaccir~ contre le chwkm bactéridicn
(vaccin lygphilisg, _
s.wonin&). Stage FAO, 17 octobre - 5 novembre
1983 tenu zu Laboratoire de E&m.
3. Noms relatives au vxxxin x&i-chCa&mneux sp-mï!.~ (vivat ?I usage vkt&+i~i.~~~
Dix namième rq)prt du Crm.itG O.M.17, d'l3pert.s de la %nnd,ardi-
sation biologiqw. Rqyn-t technique no 36M?MS, 1967.
4. RAMYAR - A new a~p-m.ch tn ctctive imnuniz?tion of shecr ?y cx&i.ned shee--x
and anthrax vaccine. &ch. Inst. Rai, 1970, 22, 123-128
5, STERW (Y. > - Pr$axtion d'un vaccin chwbxmcu~ avirulent. OMS W.H.O/ZOON/18
4 mi 195i.
Acxmms (I.S.R.A.)
----W-------L-
* I!dllBRAToIRE NATIONAL DE L'ELEVAGE
ETDE RECHERCH?Z$ VmRINAIRES
DAKAR-HA?@J
PROWCI'ION DU VACCIN
CJNTRE LECIZAREON EKTERIDIEN
REF. No 33/BACI'ERIOLoGIE
FEVRIER 1985
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(XINTRE LE CHARPGN BACTERIDIEN
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1 - mOat DE LA SQUC$IE VACCINALE
Ikux souches vaccinales semnt considérées :
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1.1 - SOUCHE C5.- Souche /atténuée mis virulente utiliSée par L.P.DELJT à
l~ïx&tit& dfvessarek. Vaccin uniquement destiné à la vacoination~des bovins,
ovins et oaprins.
:
1.1.1 - La dose sQremnt mrtelle de la souche C5 pour un cobaye de
500 ggxrrm%S' &t drenviron 10 spores. Le oontr@le de la virzalence de cette
souche vaccinale s'effectue ainsi : 4 cobayes et 4 lapins sotit .inoculf;s en
sous-cutanée avec 041 ml.. d'une culture en bouillon de 24 heures ;,,les.c+ayes
doivent rrmiri* en mins de 3 jours. Il est adxissible qu'un lapin sur quatre
meure durant la période dt!obsezwtion qui doit être d'une qui&ine de jours,
la mort éventuelle des lapins survenant généralement dans les 5 pretiers jours.
Si la rrmtalité est plus élevée, il est nécessaire de procéder à une nouvelle
série d'inocütatiorssur une'dizaine de lapins. Da&l~ cas oii le pOtientage
/
I i ;..
de mrtalité dépasse 25 '%, il est, selon L.P. DFLPY, pfiférable de &$artir
d'un autre tube de conservation.
1.1.2 -,,,Le.$l,ieu utilj,~ p+r la,sporulation'est la gélom paume'i~
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Viande de boeuf ou' de veau . , : .'. i'. . i-;':". ,
500 E
Chlorure de sodium . . ..*..*...*.....*...
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Gélose
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15 à io g
'Eau .'
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. ..*a . . . . l ..o***...;..:* . . . . . ..a...*.
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Hacheti lti‘viande et laisser,mcérer une n;t à fmid .dans l'eau. Potier
quelques dutes à l'ébullition, en agit&&. Exprirwr le jus?.:Fi.ltmF sur pa-•
$zr muillé, Compléter le volume à un litre avec de l'eau distillée et ajou-
ter le sel.
Ajouter la gélose en poudre. Faim dissoudre à feu doux. Porter à
l'ébullition. Refroidir à 60-65OC. Ajuster le pH.3 7,2. Repartir à raison de
. . . / . . .
-2-
150 cc par boîte de Roux et stériliser 20 minutes à 115*C.
., .
1.1.3 - Avant leur inoculation, les bottes doivent êt~ séchées à l'étu-
ve un OU plusieurs jours, les conditions d'une bonne sprulation sont :
a) DB géloses parfaitemnt sèch& au moment de l'inoculation.
b) Pour chaqua boxte de !%XX, un inoc~n:.j,~~,~~~isiint.pour~h~t~ctër
la smface de g6lose dans sa totalité,
:
. :
1.1.Y - L'irxmi!.um peut provertir d'une hémcultme de 24 heures faite
en bouillori oMinai& 2 partir du sang d'un cobaye 1-16x-t d'urk septicémie mm-
~'k0qu6k'par'la S~uc%e C5 ou d'une culture de 24 heur& en bouillon ordikim
faite 2 partir d'une bo!Tte de Roux syant bien spomléc. .
1.1.5 - La,spxulatio~,,est con:sidér& 'cmme bonnes lorsque :
- les Wtes ensmenc&es ont un aspect giti et non visqueux,
- la spomlation est de 80 à 90 "0 dès le 2èm jour et sue 12 S'E"
joU& on ne trouve guk?+ que des spores libres,de fom et de {aillé uniforw.
Les k#tes retirées de l'&uve de 37OC après 48 heures, sont lafss&s
2 2 3. jOurS 2 20-25Oc, le temps du cxmtr6le de toutes les koirtes.
1.1.6 - La rkolte desSs~zes doit se Faiw en présence du chef dc
Mmxtoire (lavage des boftes de Roux avec du sérum physiologique et cks
billes de verre).
A la. fin de la r<e, on ajoute ,i la suspension de spores un poic!s
égal de glyckim stérile. Cette r&olte.de spores en s&um glycérine est in-
cubée 2 37OC pendant 'trois saines afin de détm.i~~les éléments mycélims.
. . . . 1
. . .
1.1.7 - Après 3 semines at,ine@atio~ à, .37?C,..cette
suspension de S~O~;T,
.,,‘
dite suspension ID&, sera titrée. s,uiymt la titm obtenu, elle sera dilué+
dans du sémm glyckiné stérile (une part +z s&m physiologique, une part
égal@ en poi&"de 'glycérine) de façon 2 obtenir une suspension vaccinale ti-
c
. tr<25tim~~~s&ml. :
: ,,
..,_ ..~
'.
-4
.
..* /
. . .
-3-
SelQn L.p. EU??, les doses vaccinales Tour les ctiffkntes eS$CeS
s'établissent ainsi :
., .<
Butons et chkres
c),2 rd
5%) 0q-l
'L. 25o 'oo* .__,^ . . . :, . . . . i
Veaux
0;5ti
."
E?ovins adultes
.J IF1
2. 500 000 '<
.-
_
.
I.1.8 - Les tests d1ini&mit6 et rl'immnitc-i. sont effectués sw
mutons et ch&res.
.Sclon L.P. IEL.PY , 1'3s mimaux vaccin& &sistent 2 l'in0,culati.m de
1 000 doses sk-emnt mr-telles c.q'une souche sauvage d'&m+we de char%% bac-
t&idien.
1.2 - SO?JCE STEFNE 34 F2
Souche fcurnie par le IAmrat~~i~ dk WeyLPidge. Les souches de ty-e
S'I'ERhsE; sont des snuches avkulentcs, acapsulées, c$tenues.à .pmtir & souches
virulentes par dissociaticn su17 ,gGlwe à 50 % ,de s&un dans une ambi~ance de
CO2 (30 %).
La souche STERNZ 34 F2 spmw.le facilemnt ; la phlose n'a pas besoin
d'être ,aussi skhe. Cette souche peut êtreeqQ$e en tcwte s&urité. Il n'en
est las de m%e de la souche C5, tout pwticulièmmnt en ce qui concerne le
cheval. De plus, il est Lar&v& qu'on isole ?ar hémculture la smche C5 $
partir 6u cadavre (7'un mutcn utilis6 T-icw les tests cl'innmkit6 et titi apres
svnir &té.inoculc-i .awc un grand nombre de s-ores de C5 Cplus dé dix ‘fo'is la
dose vaccinale).' Ce muton &ait certes I?nrt d'une autre maladie, scms 'rivoir
yéseryt6 de Gsicm ned&mtwses~au $zki-A de l'injection, mis il est tout aus-
si certain qu'une septicbie .a.nte~mtiem, Il n'est dmc Ns interdit de priser
que de telles se~ti.c&&s ante-rmrtem yissent se ?m~duire chez des .an-imaux
affaihlis, mccir& ;:eu Te tq-s av~ant leur mt: .a.vec la souche C5.
b souche STENE, certes peu virulente, ne risque pas de tmnsmzttre'la
----
-4-
maladie par contact. Il ne semble pas non plus que l'ingestion &entueile
d'une viande d'un animal frakhemnt vacein~ par cet& souche soit dangereuse
pour l'horrrmv. D'une façon générale, dans les 1abomtiiriEJs africains fmco-
phones, la souche Ci est abandonnée:, en faveur de la souche STBGIE 34 F2.
. ,,,.
r
.
.;
,.
II - PRODUCMO!?~DrUN VACCIN CONTRE IX CHARRON BAC?B?.IDIEN AVEC J.,A SOUC!HE STERr?rl'
II.1 - CONSERVATION DE LA SOUCHE~VACCIN&E
Dès la r&zeption de la souche, és?iter les passages trop nombreux -
mwrir'une ampoule et rwxmstituer son contenu dans de L'e&u distillée ; Cair>-
une dilution dans du bouillon nutritif ou de l'ex-tmit~de levure, Utiliser
cette suspension im&iatemnt (sans l~i&cuber) pmr ensewncer plusieurs
kx&tes de Roux. Me- ces Co?tes à llincubation (37OC).
Quand la spomlation est terminée (au bout de 48 hems,'au rmximm
au bout de 72 heures), les M(ites sont lavées avec le tampon de Weybridge 2
mison d'environ 150 ml par bof-te de Roux (de 600.cmzL
Tampon de Weybridge
Bacto-casitone
.................
50 g
SaCcharOS.?
.....................
mo g
Glutamte de sodium ............
40 R
Eau distillee .................. 1000 g
L3 suspension de spmes est mise à 4OC a&5 avoir éte chauffée 1 h.
à 65OC pour détruim les élémznts ~crlliens. Les contr@les de purete et d'in-
nocuité effectués,, cette suspension est répartie dans des flacons type pC=ni-
ciiline de 5 ml, Zi raison de 1 ml pm flacon. A~&S l~philisation, ces s~ms
peuvent Etre conserv&s pratiquement indéfinimnt à -2OOC et le amtenu d'w
flacon sem le point de &part de la production de chaque nouveau lot de v.?ccin.
“.
. . . / . . .
-5-
II.2 - PREF'ARATIOPJ DE L'INOCWJM D'bT LOT DE 150 MITES
Le contenu d'un des flacons de la banque précédemment prGpar& est re-
constitué avec un millilitre d'eau distillée, Cette suspension de SP-
res est dilu& dans environ 12 ~1 de Ixiuillon ordinaire ou cl'cxtrait de
le=. Treis à quatre boîtes de Roux wuvent être ensemencées, Au but
de 48 h, on choisit une bîte 96 la s-px?Üb.tion est excellente et on
effectue une lég&e suspension de spxes dans environ 600 ml de buil-
lon.ordir&re ou d'extrait de levure (3 â 4 doses de culture pour
500 ml de'liauide). CM-te suspension permettia l'ensenxzncement de 150
boîtes de Roux qui serviront à produire un lot de vaccin, ll~culum
pour chaque boîte étant de 3 3 I+ millilitres.
11.3 - PREPARATION D'UJ LOT DE VACCIN
11.3.1 - FY6parxtion des Wîtes de Roux - Choix du milieu
Les tili-ux à base de mack.tion de vix-de, &$conis6s pur la
sporulation dc la souche C5, ne sont pas les mzillcurs pur 1s bonne sp~~~lr;-
tion de la souche STERNE.
Yil&% dérivé de celui proposé par l'OMS.- FAO :
'.
Bacto-cwitone DIfC0 ..........................
23 p
Extrait de 1ewk-e DIFCO ........................
G
Phosphate lr+otassique (K2Hm4) .................
4R
Phosphate mxwl\\at-assique (KH2pO4) ................
a
Chlorure de c&.cium (C+., 6 H2q) ............ .
0,lg ,
'
Sulfate ferreux (Fe SO,,, 7 H20) ................
O,Ol g
Sulfate de magnésium 0QSO4, '7 H20) ............
GO5
FI;
Sulfate de rrkzng.-inP,se WnSO4, 4 1328) ............
03 ET
GElose .........................................
20 $7
Eau distillée ..................................
1OOOml
pH 7,6
kzs 20 g de Ekto casitone peuvent Ztre rem@ztcée r!ar 20 g de byp-tose.
. . . . / . , .
-6-
Xi.3.2 - QmtMle de la spmilation
_.
.
-
.
. . .
.-.
Les boTtes de Roux doivent &tpe séchées à 37T, un ou plusieuz
j o u r s , avantleurens~n~nt, .
L'inxulum ne doit pas être tmp kportant, 3 2 5 ml par boîte de Roux.
?XE obtenir une bonne sporulation,
ïl cst.indispensable que l'imculum ne soit
pas u& culture en bouillon, mais simplement une suspension de spores en kx.Gl-
lon ordirai= ou extrait de levure.
Après la spmlation à 37OC qui doit Bre obtenue en 48 h, au mximm.
72 h, la mise des hcjftes de Roux K2C~-25°C pendant 3 ou 4 jours est recomndac.
I.
Ceci pekiet la fin de la sprulation et le cwintrgle de toutes les boTtes zvmt
la r&olte (le con'm%e de la spxklation peu-t @tre effectué en colorent les
spores par la m&hode de KWJXR),
^_..
II.3.3 - Récolte des spxes
La.rGcolte desspr~~ se .fait dorie ënvixnn'~5 jours aprÈs l'ino-
culation des boftes de' Roux.
hns des tubes (22 x 2201, on stkilise une vingtaine ,de billes de verx
avec environ 65 ml. de séxwn ^ysiologique. Le contenu d'un tube sera nécesscliz
,
pur laver une bolite de Roux. La suspension de spres sera recueillie dans un
flaconde10litrxs àtrwwsune ga7,A? stériIe,gmtée. sur un entonnoir ad&pat.
150 boTtes de Roux peuvent~foumir~envimn 1O'litres d'une suspension &
spmstitrant3milli~ de~sprcs parmi.
Fbm détruire lès &%n&tk'~ciQiens, onprtelasusmsion de S~u)res
une heure au bain-marie à 65%, ou on ajoute à la suspension de spores deux
fois son poids de gly&%ine k&iik et on laisse cette suspension glycérink
3 semaines 2 37OC afin-de dG?tGuire les éléments mycéliens encore p&sents.
Une fois les él&r$s r?ycéliens d&ruits, il .est.pssible de faire les
c
contrbles suivants sur la susper@on C!e sIx~res qui, en.attendant ces opéra-tions~
. .
. .
est stockée à 4OC.
L
. . ./ . . .
-7-
a) - Contr6le de pur&6
- Coloration de l-7. sus;?ensior pur 13 technique de SELLER - Recher-
che dléléments contamknts.
- Inoculation de 2 OU 3 bo?tes de Pgtri (Qecherche des colonies oon-
taminantes).
b) - Contr9le d'innocuité
- Inoculation de 0,8 ml de la suspension 2 4 cobayes de 500 g en
bonne smt~ : observation une quinzaine de jours. Il ne' doit pas y avoir de
mortalité.
- Inoculation Cl(: 3 ml de cette @me suspwsion à 5 mutons et'chè-
vres - quanti-te sup&icure à 5 millircrds de spots.
.
C> - Numération
- Les diff6tente.s dilutions sont faites en s&mnr. physiologiqye de
. .
10-l à 10%
- Chaque dilution est agitée 10 minu-ks avec un agitateur à bras,
type agitateur JOIHN.
On peut procéder comme suit :
Ikns un flacon -type p6nicilline de 20 ml, mettre 9 rriL de sérum physiologique.
Ajouter 1 ml de suspension de spores, agiter 10 minutes puis procéder à la
dilution suivante.
Pour les 3 derni&os dilutions, enseiTc>noer 3 ti?tns de .Pétri ,pa..r dilution
comme suit : dans chaque bolite de P+&i, mettre 1 ml des dilutions choisies,
couler 20 ml de "tryltose agar", en imprimmnt q.uelques mouvem&nts à la boilte
de PCStri, afin de bien effectuer le mélange avec la suspension despores.
Au bout de 4E à 72 heures, la numération pourra être lue ; on Choisir?a
la dilution 6i le nombre de colcnies par lxîte sera compris entre 50 et 200.
On comptera les colonies obserks par boîte et on fera la moyenne.
. . /. . . .
--
-e-
On obtient ainsi de bonnes num&stions. Lf6cart entre deux nur&?ations
ainsi pmtiquges, dans la majorité des cas, sers inférieur-à, 50 %.
,.
FJcmple : - ls= numémtion = xlnombm maximum
I *;"îE: numémticm =x2.nombremizXimum
Nombre mzmjnmm - nombre .tiirrmn x 100 = (xl -x2) xl00 < J-)
Nombreminimum
x2
"
..,
. .I.
II.3.4 - Dilution de la solution - Conditionnement
La dilution de la suspension r&re doit dtre effectuée de t;:ll.iY:
façon qu'une dose vaccinale bovine contienne 107 spores dsns un ml.
Ainsi par+ exemple, pom une solution m&e co&enant 5 x lO* !yoRS -!Yr
ti, la dilution à effectuer est au U200.
Le liquide de dilution est mnstitu6 par du sémm physiologique &y&-
riné (10 litres de s&um physiologique 4 10 kg de glycérine) r$arti en EL+-
cons de 5 1, stérilis6 2 h à 11OOC.
Pour r6aliser la suspension vaccinale, on put utiliser soit :
- un agitateur horizontc?l : pur avoir une bonne,agitztion, il faut
alors q.ue les flacons de 5 1 ne contiennent que 4 1 de liquide.
- un mixeur de 40 litres (Tchad) :
20 litres de s&um glycérir6 sont versés stérilmmt dans 16: &zm,
le mteur est mis en mute. La quantité nkccssaire de suspension de sures
,est alors ajoute,
'a à la pipette, puis on intmduit progressivement l'mt~? mi-
ti6 de la quantité nécessaire de sérum glyc&iné.
Conditicmmment : en ampmles ou en flacons de 250 ml... AU oxrs ik cm-
.ditionnment en f&mns, il est bon d'agiter quelques semndes a intemm'!Acs
&guliers de 1U minutes.
i
Remarques : Toutes les manipulations doivent êtru? effectuées st&i.le?mt,
car il s'agit d'un vaccin dans Leqyel nlentre aucun antiseptique.
. . . / . . .
Après chaque s&ncc do fonctionnement, tout le matériel (pipette, mi-
xeur, flacons, bouchons de caoutchouc, etc. ,., ) doit ?tre soigne~sement'st&i-
aisé, 1 heure à 120°C, sous peirw de retrouver ries spot charbonneuses au
o.ours d'autres manipulations.
11‘3.5 - Contfil~2 du v+ccin finïL!.
a>- Cknttile de pu%té : Sur boYce de Petri corrme pr&éderruwnt.
b)- C>nMls du titre : Mukktion en boîtes de Pétri, comme
pr&édemrwnt. Une dose vaccinale bovine doit contenir au minimum 1 x 1O'spores.
c >-
chez les espècas 1~s olus sensibles (ca~~%s et Gquins).
Pur cela, cinq animaux de chaque espèce peuvent Wre inoculés avec 2
fois la dose vaccinale p&cc)nis~e,
Quoi qYu'il en soit, il est souhaitable lde respecter les ~)ints d'injec-
tion suivants : lc7. face interne de la cuisse chez les ovins et les caprins,
le poitrail chez les @uins.
- chez les cobayes, l'Épreuve c!'irrmunitG prkonisée par le
Comité d'Experts de 1'O.M.S. (St~~ndardisatinn biologique, rappoti technique
no 361, O.M.S., 1967) est ainsi d&rite : au reins 10 cobayes en bonne santé
pesant en- 300 à 509 - rwevrwt la dose dc vaccin ~XXNTWKG pour l'immu-
nisation du m1utori ; les animaux seront mis en nbscrvation pendant 21 jours
et pur que l'épreuve soit valable, il faut q.u'au reins 60 ck des animaux sur-
vivent 2 la fin de la p&iode d'observation. A la fin de cette $rigde, les
antiux p&cfdents ainsi c(ue 3 cobayes t&wins r-ton vaccin& recevront une dose
appropriF::k r3'uw swchc wnvenable de 9. anthracis (par exemple la souche
Pasteur II (17 JJ3) qu'il est possible de se prYx3ln~.r auprès du Lla~ra-toire
International des ,%lons biologiques, Central Vcterinary Laboratory, Weybrid-
ge, Surrey, England). La &XC: à inoculer est de 200 DLV.
.*. / . . .
-lO-
.
Beaucoup de lakxxwtoi.res ont renmntré des difficultés avec ce test
d'imnunit6. Ceci peut étre d0 à la mauvaise sant6 des cc?haps, mis le ;s--aint
.&xx?tant est la viruknce de la souche d'épreuve, virulence qui doit RE r.i
trop forte, ni tmp faible pmr gmm3-tre une r&lle ap~&ci&ion de In c!r~e
minima ~~xdxlle,e% en cxmsécpence des 200 IlLPI doses dtépreuve à inoculc~.
.
_<,
:.
- cher les mutons et les caprins
.
ks i>Lnirr!aux vaccinés avec 5 mil.Lions de sptis doivent tous r&iistw
à une dose d'épreuve de 1 000 DL?4 (susp&%i& de Sptis en s6m glycérin6
d'une souche sauvage de B. anthracis).
. .
.
BIBLI0~~P~PYIE SOMAIRF 2
-----11---------1-----
1. IJELPY (L.P.1 et KAVEX C?g.) - Lj'infection chmlmnneuse des zximaux et de
1'hm-u~ en Imn. Conditions de ;;&pmatinn et d'utilisr?ti.m d'un
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2. ?mF$ (Y.3 et 'TTS! !r,:,) - Production du vaccir~ contre le chwkm bactéridicn
(vaccin lygphilisg, _
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1983 tenu zu Laboratoire de E&m.
3. Noms relatives au vxxxin x&i-chCa&mneux sp-mï!.~ (vivat ?I usage vkt&+i~i.~~~
Dix namième rq)prt du Crm.itG O.M.17, d'l3pert.s de la %nnd,ardi-
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4. RAMYAR - A new a~p-m.ch tn ctctive imnuniz?tion of shecr ?y cx&i.ned shee--x
and anthrax vaccine. &ch. Inst. Rai, 1970, 22, 123-128
5, STERW (Y. > - Pr$axtion d'un vaccin chwbxmcu~ avirulent. OMS W.H.O/ZOON/18
4 mi 195i.