Les Rosettes E, chez le mouton marq eur probable ...
Les Rosettes E, chez le mouton marq eur probable
du lymphocyte T
par J. ~ARR*, H. SALMON**, et Ch. LI JAN**
Bull. Acad. Vét, de France, 1978, 51, 323-332
3 2 3
Les Rosettes E, chez le mouton marq
du lymphocyte T
par J. ~ARR”, H. SALMON”“, e t C h . LE JAN**
l
RÉSUMÉ
Le test de rosettes E est utilisé chez lc mouton CO
e un marqueur des
lymphocytes T. Les lymphocytes du sang périphérique,
thymLIs, de la rate
et des ganglions mésentériques sont comparés quant à leu
titude à former des
rosettes avec les globules rouges de différentes espèces
ales (mouton, porc,
chèvre, veau). Pour obtenir de bons résultats, il est impo
t que les lymphocy-
tes et les globules rouges du mouton soient préparés en
nnement protéique,
susceptible de préserver les propriétés des membranes
ellules : la présence
de sérum est une condition essentielle à l’obtention d’un
élevé de rosettes E.
L’action inhibitrice d’un sérum de lapin antithymocyte
de mouton est égalc-
ment étudiée.
SUMMARY
E Rosette test is used in sheep as a T lymphocyte m
Y. Peripheral blood,
thym& spleen and mesenteric lymphnode lymphocytes
compared o n their
capacity 10 form E rosettes with the red blood cells
ferent species of
animal.~ (skeep, pig, goat and calf). TO obtain good resu
is important tkat
lymphocytes and red blood cells might be prepared i
eic environment:
the presence of calf serum in tke test is an essential c
ion for having high
levels of E rosettes.
The inhibitory activity, on rosette formation, of a Y
against skeep thymie cells is also studied.
ABREVIATIONS
s v
Sérum de veau inactivé à 5@/30 mn.
SVF
I Sérum de veau fœtal inactivé à 56” / 30 mn.
E L
: Earle Hydrolysat de lactalbumine.
Rosette E :
Rosette érythrocyte - lymphocyte.
Rosette EA : Rosette érythrocyte - anticorps - lymphocyte.
Rosette ZC :
Rosette zymosan - complément - lymphocyte
* Laboratoire National de I’Elevage (I.S.R.A.), BP 2057, D
** I.N.R.A., Station de Recherches de Virologie et
ologie - 78850 Thiwr-
324
BULLETIN DE L'ACADÉMIE
INTRODUCTION
Les sous-populations lymphocytaires du mouton sont mal connues
[4, 5, 81. Pour identifier les diverses catégories de cellules participant
aux mécanismes immunitaires des ovins nous avons cherché à carac-
tériser les lymphocytes T. Chez l’homme [2, 101, le bovin [6, 91 et
le porc [7, 141, les lymphocytes T fixent les hématies de mouton en
formant des rosettes. Nous avons donc mis en œuvre diverses tech-
niques pour identifier chez le mouton les lymphocytes porteurs de
ce marqueur.
MATERIEL ET METHODES
1.
LES ANIMAUX
Quatre moutons adultes, de formule leucocytaire normale, ont
servi comme donneurs de lymphocytes.
Le mouton, le veau, la chèvre et le porc donneurs d’hématies sont
des animaux sains élevés au laboratoire.
2. LE SÉRUM DE VEAU
Le sérum de veau est recueilli aux abattoirs sur des animaux
de 5 mois (200 kg) ; inactivé 30 mn à 56” C, il est absorbé sur globules
rouges de mouton (deux volumes de sérum pour un volume de culot
globulaire) 1 h à + 37” C, une nuit a + 40 C. Le surnageant recueilli
par centrifugation est alors filtré sur millipore (0,45 PL).
3. HÉMATIES POUR ROSETTES E
‘Les sangs héparinés (Liquémine Roche à 1 p. 100, de mouton, de
chèvre, de porc et de veau sont lavés trois fois en milieu de Earle-
Lactalbumine (EL) par centrifugation à 200 g, puis les hématies sont
ajustées à 1 p. 100 en milieu EL contenant 10 p. 100 de sérum de
veau (EL, SV 10) et conservées à 4 OC. On peut ainsi les utiliser
pendant une semaine.
4. HÉMATIES POUR ROSETTES EA
Des globules rouges de veau sont sensibilisés pendant une heure
au bain-marie à 370 C avec un sérum de porc antiglobules rouges
de veau (EA). Ils sont ensuite lavés trois fois en milieu EL et repris
en suspension à 1 p. 100 dans ce milieu. Conservés à + 4” C, on peut
. . .
COMMUN!CATIONS
5.
LE ZYMOSAN POUR ROSETTES zc
Le zymosan est un résidu insoluble preparé
artir de cellules
de levure. Les grains de zymosan porteurs de
fraction C-b du
complément sont préparés selon une technique
à décrite chez le
porc [16].
6. GRADIENT DE DENSITÉ
Nous employons une solution d’un pol
moléculaire 400 000 (Ficoll 400) à 9 p. 100 en eau
tillée ajustée par
addition d’un opacifiant utilisé en radiologie, le Te
rix, à une densité
d = 1,060.
7. PRÉPARATION DES LYMPHOCYTES DU
Le sang hépariné est dilué au 1/3 en
le gradient dans le rapport : d’eux volume
volume de gradient de ficoll [6]. Après cent
à 200 g, 4” C, l’interface est prélevé et les hematr
par une solution de chlorure d’ammonium
sont lavés trois fois en milieu EL par centr
ajustés à 2.5 106 cellules par millilitre en mi
10 et conservés
dans un bain de glace fondante. Les re
sont de 40 à 60 p. 100 avec une vitalité
cellules à absorber le trypan bleu, de 90 à 98 p. 1
a contamination
par polynucléaires et monocytes après coloratio
wald Giemsa et la péroxydase [ 161 est de 4 à 8 p
8.
PRÉPARATION DES LYMPHOCYTES DU
ET DE LA RATE
Chaque organe est lavé plusieurs fois en mi
fragments, et mis en suspension dans ce milieu
pendant 5 mn à la température du laboratoire
Le filtrat est alors purifié sur gradient de ficoll c
9.
SÉPARATION DES LYMPHOCYTES SUR BOURRE DE N
A. Elimination des macrophages par le fer c
A neuf volumes de sang hépariné, on ajou
n volume d’une
solution de fer carbonyl-gomme arabique [l] ; 1’
mble est incubé
1 h à 370 C, en agitation lente avant la sépara
sur gradient de
ficoll.
B. Préparation de la colonne [ll]
Les fibres de polyamide après cardage sont l a ées plusieurs fois
___ .ee’,Ie.d VT . .
1 , Q --^ - - -
. . .
, P - - - .
326
13ULLETIN DE L'ACADÉMIE
C. Séparation des lymphocytes
La suspension cellulaire est incubée dans la colonne 1 h à 370 C
puis la bourre de nylon est lavée (3 à 5 ml/mn) pour recueillir toutes
les cellules non adhérentes qui sont alors ajustées à 2.5 10” cellules
par ml en milieu EL SV 10.
La bourre de nylon est reprise en milieu EL, triturée pour éluer
les cellules adhérentes qui sont remises en suspension à 2.15 106
cellules par ml en milieu EL SV 10.
La vitalité des cellules n’est pas affectée par ce traitement ; le
rendement moyen en cellules est de 45 à 65 p. 100 par rapport à la
suspension de départ.
10. TEST DE ROSETTE E STANDARD
50 ,111 de suspension leucocytaire repris en EL SV 10 sont ajoutés
à 50 ul de suspension de globules rouges de mouton ; le mélange est
placé 15 mn au bain-marie à 370 C centrifugé 5 mn à 200 g et laissé
une nuit à + 4O C.
Les culots sont remis en suspension et après coloration au ‘bleu
de méthylène [16] on compte sur un total de 400 leucocytes le nombre
de cellules formant rosettes.
RESULTATS
1.
INFLUENCE DE DIVERS FACTEURS SUR I,A FORMATION DE ROSETTE~ E
a) Espèce fournissant les globules rouges
Les hématies de différentes espèces animales ont été éprouvées
avec les leucocytes sanguins de quatre moutons.
Les pourcentages de rosettes obtenus sont regroupk dans le
tableau 1 et montrent que les hématies de mouton donnent m pour-
centage de rosettes bien plus élevé que les hématies de porc, de veau
ou de chèvre.
Lorsque les hématies et les lymphocytes proviennent du même
mouton, le pourcentage de rosettes est le même.
Les mêmes suspensions leucocytaires sont chauffées à 56Q C pen-
dant 30 mn. Avec une vitalité inférieure ou égale à 1 p. 100, 2 à 5 p. 100
des cellules forment encore des rosettes montrant que la vitalité est
une condition nécessaire à la formation des rosettes.
b) Rôle du sérum de veau
Les résultats du tableau II montrent le faible pourcentage de
rnr~+t~r PT-, l’cahcanra rta rPrr,m AP -L,,=c,,, . 10 nnmhro TOP ,-,>l,t,,la. for-
COMMUNICATIONS
327
TABLEAU 1
Influence de l’origine des globules rouges sur le nomb
de rosettes E
pour 100 leucocytes sanguins
Leucocytes\\Origine des
des moutons \\g
Mouton
Porc
l èvre
Veau
-
01
36
16
9
0 2
28
19
0
0 3
34
18
7
0 4
32
17
8
Moyennes
32,5
17,5
825
-
TABLEAU II
Influence du sérum de veau sur le nombre de r zttes E
pour 100 leucocytes sanguins
Concentration
de sérum de
0 p. 100
10 p. 100
20 p. 100’
J. 100
10 p. 100*
veau
Mouton no 1
3
32
nt
nt
17
Mouton no 2
4
29
27
24
22
Mouton no 3
6
34
35
30
25
Moyennes
4,5t1,5
31*3
3154
'$3
21,5&4,5
* Sérum foetal de veau.
mant rosette est maximum avec 10 p. 100 de SC Irn de veau ; le
sérum de veau foetal à cette même concentratio
apparaît un peu
moins efficace que le sérum de veau de 4 mois. F
n- s’assurer qu’il
n’existe pas dans le sérum de veau un anticorps nz u-e1 dirigé contre
328
BULLETIN DE L'ACADÉMIE
EL SV 10 est incubée pendant 30 mn à 370 C en présence de di%-
rentes doses de complément [17] : en présence d’un anticorps anti-
lymphocyte de mouton, le complément devrait provoquer la lyse des
lymphocytes ; or la vitalité des cellules varie de 88 à 92 p. 100 pour
les lymphocytes en milieu EL SV 10 et de 90 à 94 p. 100 dans Ic
milieu sans sérum (EL).
c) Le Dextran
Nous avons également cherché à améliorer le pourcentage de
cellules formant rosette par addition dans le milieu d’un poly-
saccharide de poids moléculaire 70 000, le Dextran T 70, comme cela
avait été obtenu dans d’autres espèces [17].
Le tableau III montre qu’avec 10 p. 100 de Dextran dans la sus-
pension de globules rouges nous avons obtenu une augmentalion du
nombre des lymphocytes formant rosette E qui varie avec ie tissu
d’origine des lymphocytes : les lymphocytes du thymus ou des gan-
glions mésentériques forment beaucoup plus de rosettes lorsque
l’on travaille en présence de Dextran tandis que les lymphocytes
sanguin paraissent peu sensibles à cet agent.
TABLEAU III
Inl’luence du dextran sur le nombre de rosettes E pour 100 leucocytes,
dans le thymus, le ganglion et le sang
I
Source de
lymphocyte
Thymus
Ganglion
mésentérique
Rate
Sang”
_
.i.
Rosettes E
65
62
5 0
34.5 (32-37)
Rosettes ED
80
71
54
40.5 (39-42)
* Il s’agit d’une moyenne sur 4 individus ; valeurs extrêmes entre parenthèses.
Avec 2 et 5 p. 100 de Dextran l’augmentation du nombre de cel-
lules formant rosette E n’est pas significative.
2. DISTRIBUTION DES ROSETTES E DANS LES
DIFFÉRENTS ORGANES LYMPHOIDES
Le tableau IV présente les résultats obtenus avec les lymphocytes
A.. AL-.-..- A,. ,- -^A^ ^A A-- ----lZ..-- . ..i---LL..l-..-- T - .--....--.- Le--
COMMUNICATIONS
329
TABLEAU IV
Influence de l’origine des cellules sur le nombre dc
-osettes E
pour 100 lymphocytes dans le thymus, la r e,
le ganglion mésentérique et le sang
Sang
Lymphocytes
Rate
G M
TH
10 1
no 2
p. 100
6 6
6 0
5 2
de lymphocytes formant rosette E est plus élevé d 1s le thymus que
dans les ganglions, la rate et le sang. Néanmoins le lymus ne fournit
pas 100 p. 100 de cellules formant rosette E.
3. LES LYMPHOCYTES FORMANT ROSETTE E SONT DIS1 \\ICTS
DE CEUX FORMANT ROSETTE EA OU zc
Après séparation de suspensions lymphocytai: s sur bourre de
nylon, nous avons comparé les cellules adhérentes t non adhérentes
à la fibre, ainsi que le montre le tableau V.
T ABLEAU V
Influence de la filtration sur bourre de nylon sur le nom
:e de rosettes E,
EA et ZC pour 100 lymphocytes sanguin
Lymphocytes
sanguins
Fraction
EA
Mouton no 1
T
3 9
1 0
FI
6 5
F2
12
5
Mouton no 2
T
4 2
12
FI
5 9
F2
7
:
T : Témoins lymphocytes avant passage sur bourre de nylc
F, : Cellules non adhérentes.
R : Cellules adhérentes.
330
RLJLLETIN DE L'ACADGMIE
Le passage sur bourre de nylon enrichit nettement les suspensions
en cellules formant rosette E et élimine les cellules capables de for-
mer les rosettes EA et ZC. Au contraire les cellules retenues sur la
bourre de nylon puis éluées forment des rosettes EA et ZC et peu
de rosettes E. Les cellules de thymus de mouton ne forment prati-
quement pas de rosettes EA [9] et ZC [ 13, 171 qui sont des marqueurs
des cellules B dans les autres espèces.
4 .
INHIBITION DE LA FORMATION DES ROSETTES E PAR UN SÉRUM
ANTITHYMUS DE MOUTON
Un sérum de lapin antithymus de mouton en cours de prépa-
ration est utilisé aux dilutions 1/5, l/lO, 1/20 et son action inhi-
bitrice est comparée à celle d’un sérum normal de lapin et à celle
d’un sérum de lapin anti-immunoglobulines de mouton.
Le sérum antithymique” inhibe complètement la formation de
rosettes tandis que le sérum normal et le sérum anti-immunoglo-
bulines ne sont pas inhibiteurs.
DISCUSSION
30 à 40 p. 100 des lymphocytes sanguins de mouton forment des
rosettes E avec les globules rouges de mouton ; dans le thymus ce
pourcentage s’élève à 65-70 p. 100.
Il est important pendant la préparation des suspensions cellu-
laires d’opérer en environnement protéique pour préserver les pro-
priétés de membrane des globules rouges et des lymphocytes ; en
effet, si on lave les lymphocytes en tampon salin (PBS) et non en
milieu de Earle Lactalbumine (EL) on n’observe pas de formation
de rosettes.
La présence de sérum de veau ou de mouton dans les suspensions
de lymphocytes et de globules rouges est essentielle pour la Por-
mation des rosettes. Lorsqu’on ajoute 10 p. 100 de Dextran dans la
suspension de globules rouges, nous augmentons de 5 p. 100 le nombre
de rosettes E formé par les lymphocytes du sang et de la rate ; cetle
augmentation est plus marquée pour les lymphocytes du thymus
et des ganglions mésentériques. Il est possible que d’autres traitements
[3, 151 utilisés dans d’autres espèces pour augmenter le nombre dz
rosettes E, soient aussi efficaces chez le mouton.
Les lymphocytes responsables de la formation des rosettes E
chez le mouton sont vraisemblablement des lymphocytes T parce
que :
COMMUNICATIONS
- les lymphocytes qui adhèrent à la bourre
: nylon forment
peu de rosette E tandis que 60 p. 100 de ceux qu’
le se fixent pas
en forment ;
/
- ces rosettes E ne sont pas inhibées par u sérum de lapin
anti-immunoglobulines de mouton ;
1
- ces rosettes E sont inhibées par un sérum
antithymus de
mouton.
Les rosettes E observées chez le mouton sont :n même temps
des autorosettes puisque les globules rouges du do leur de lympho-
cytes conviennent aussi bien que les globules r( lges d’un autre
individu. La formation des autorosettes chez le I outon, t r è s for-
tement dépendante de la présence de sérum de ve: L ou de mouton,
diffère de celle observée chez la souris [12] puisqu chez cet animal
le sérum homologue est inhibiteur.
Le phénomène des autorosettes spécifiques du imphocyte T du
mouton peut s’expliquer par la présence de récepl
urs à la surface
des lymphocytes ou des hématies. Ce récepteur r :st pas un auto
anticorps fixé à la surface du lymphocyte puisq
‘un sérum anti-
immunoglobulines de mouton n’est pas inhibitel
‘. N o u s n’avws
pas mis en évidence d’anticorps antimouton dans (
sérum de veau,
il ne s’agit donc pas d’un anticorps qui lierait dir :tement ou indi-
rectement les lymphocytes aux globules rouges.
Par ailleurs tous les lymphocytes T ne forment as de rosettes E
avec les globules rouges de mouton dans les conditic 1s où nous avons
travaillé puisque même à partir du thymus on l’obtient jamais
100 p. 100 de cellules formant rosette E. Avec la préparation sur
gradient de ficoll on ne saurait exclure la perte dc
sous-populations
lymphocytaires compte tenu du rendement obtenu (50 p. 100).
Nous pensons utiliser ce marqueur des lym hocytes T dans
l’étude des mécanismes immunitaires lors d’inva:
lns parasitaires,
microbiennes et virales dans l’espèce ovine.
BIBLIOGRAPHIE
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3 3 2
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[171
SRLMON (H.). - Speciiïcity of Pig T lymphocyte antiserum. Ann. Imm. Inst.
Past., 1978, 129 C, 571-584.
MM. GORET, GRIMPRET, GUILLOT et PILET interviennent.
L’inserlion est acceptée à l’unanimité.
Depuis la rédaction de cet article, R. M. BIONS a publié dans le Journal of lmmu-
nological metkods, 1978, 21, 197-210, un article intitulé : Sheep crythrocytes
_r
c .l.--l..--
du lymphocyte T
par J. ~ARR*, H. SALMON**, et Ch. LI JAN**
Bull. Acad. Vét, de France, 1978, 51, 323-332
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Les Rosettes E, chez le mouton marq
du lymphocyte T
par J. ~ARR”, H. SALMON”“, e t C h . LE JAN**
l
RÉSUMÉ
Le test de rosettes E est utilisé chez lc mouton CO
e un marqueur des
lymphocytes T. Les lymphocytes du sang périphérique,
thymLIs, de la rate
et des ganglions mésentériques sont comparés quant à leu
titude à former des
rosettes avec les globules rouges de différentes espèces
ales (mouton, porc,
chèvre, veau). Pour obtenir de bons résultats, il est impo
t que les lymphocy-
tes et les globules rouges du mouton soient préparés en
nnement protéique,
susceptible de préserver les propriétés des membranes
ellules : la présence
de sérum est une condition essentielle à l’obtention d’un
élevé de rosettes E.
L’action inhibitrice d’un sérum de lapin antithymocyte
de mouton est égalc-
ment étudiée.
SUMMARY
E Rosette test is used in sheep as a T lymphocyte m
Y. Peripheral blood,
thym& spleen and mesenteric lymphnode lymphocytes
compared o n their
capacity 10 form E rosettes with the red blood cells
ferent species of
animal.~ (skeep, pig, goat and calf). TO obtain good resu
is important tkat
lymphocytes and red blood cells might be prepared i
eic environment:
the presence of calf serum in tke test is an essential c
ion for having high
levels of E rosettes.
The inhibitory activity, on rosette formation, of a Y
against skeep thymie cells is also studied.
ABREVIATIONS
s v
Sérum de veau inactivé à 5@/30 mn.
SVF
I Sérum de veau fœtal inactivé à 56” / 30 mn.
E L
: Earle Hydrolysat de lactalbumine.
Rosette E :
Rosette érythrocyte - lymphocyte.
Rosette EA : Rosette érythrocyte - anticorps - lymphocyte.
Rosette ZC :
Rosette zymosan - complément - lymphocyte
* Laboratoire National de I’Elevage (I.S.R.A.), BP 2057, D
** I.N.R.A., Station de Recherches de Virologie et
ologie - 78850 Thiwr-
324
BULLETIN DE L'ACADÉMIE
INTRODUCTION
Les sous-populations lymphocytaires du mouton sont mal connues
[4, 5, 81. Pour identifier les diverses catégories de cellules participant
aux mécanismes immunitaires des ovins nous avons cherché à carac-
tériser les lymphocytes T. Chez l’homme [2, 101, le bovin [6, 91 et
le porc [7, 141, les lymphocytes T fixent les hématies de mouton en
formant des rosettes. Nous avons donc mis en œuvre diverses tech-
niques pour identifier chez le mouton les lymphocytes porteurs de
ce marqueur.
MATERIEL ET METHODES
1.
LES ANIMAUX
Quatre moutons adultes, de formule leucocytaire normale, ont
servi comme donneurs de lymphocytes.
Le mouton, le veau, la chèvre et le porc donneurs d’hématies sont
des animaux sains élevés au laboratoire.
2. LE SÉRUM DE VEAU
Le sérum de veau est recueilli aux abattoirs sur des animaux
de 5 mois (200 kg) ; inactivé 30 mn à 56” C, il est absorbé sur globules
rouges de mouton (deux volumes de sérum pour un volume de culot
globulaire) 1 h à + 37” C, une nuit a + 40 C. Le surnageant recueilli
par centrifugation est alors filtré sur millipore (0,45 PL).
3. HÉMATIES POUR ROSETTES E
‘Les sangs héparinés (Liquémine Roche à 1 p. 100, de mouton, de
chèvre, de porc et de veau sont lavés trois fois en milieu de Earle-
Lactalbumine (EL) par centrifugation à 200 g, puis les hématies sont
ajustées à 1 p. 100 en milieu EL contenant 10 p. 100 de sérum de
veau (EL, SV 10) et conservées à 4 OC. On peut ainsi les utiliser
pendant une semaine.
4. HÉMATIES POUR ROSETTES EA
Des globules rouges de veau sont sensibilisés pendant une heure
au bain-marie à 370 C avec un sérum de porc antiglobules rouges
de veau (EA). Ils sont ensuite lavés trois fois en milieu EL et repris
en suspension à 1 p. 100 dans ce milieu. Conservés à + 4” C, on peut
. . .
COMMUN!CATIONS
5.
LE ZYMOSAN POUR ROSETTES zc
Le zymosan est un résidu insoluble preparé
artir de cellules
de levure. Les grains de zymosan porteurs de
fraction C-b du
complément sont préparés selon une technique
à décrite chez le
porc [16].
6. GRADIENT DE DENSITÉ
Nous employons une solution d’un pol
moléculaire 400 000 (Ficoll 400) à 9 p. 100 en eau
tillée ajustée par
addition d’un opacifiant utilisé en radiologie, le Te
rix, à une densité
d = 1,060.
7. PRÉPARATION DES LYMPHOCYTES DU
Le sang hépariné est dilué au 1/3 en
le gradient dans le rapport : d’eux volume
volume de gradient de ficoll [6]. Après cent
à 200 g, 4” C, l’interface est prélevé et les hematr
par une solution de chlorure d’ammonium
sont lavés trois fois en milieu EL par centr
ajustés à 2.5 106 cellules par millilitre en mi
10 et conservés
dans un bain de glace fondante. Les re
sont de 40 à 60 p. 100 avec une vitalité
cellules à absorber le trypan bleu, de 90 à 98 p. 1
a contamination
par polynucléaires et monocytes après coloratio
wald Giemsa et la péroxydase [ 161 est de 4 à 8 p
8.
PRÉPARATION DES LYMPHOCYTES DU
ET DE LA RATE
Chaque organe est lavé plusieurs fois en mi
fragments, et mis en suspension dans ce milieu
pendant 5 mn à la température du laboratoire
Le filtrat est alors purifié sur gradient de ficoll c
9.
SÉPARATION DES LYMPHOCYTES SUR BOURRE DE N
A. Elimination des macrophages par le fer c
A neuf volumes de sang hépariné, on ajou
n volume d’une
solution de fer carbonyl-gomme arabique [l] ; 1’
mble est incubé
1 h à 370 C, en agitation lente avant la sépara
sur gradient de
ficoll.
B. Préparation de la colonne [ll]
Les fibres de polyamide après cardage sont l a ées plusieurs fois
___ .ee’,Ie.d VT . .
1 , Q --^ - - -
. . .
, P - - - .
326
13ULLETIN DE L'ACADÉMIE
C. Séparation des lymphocytes
La suspension cellulaire est incubée dans la colonne 1 h à 370 C
puis la bourre de nylon est lavée (3 à 5 ml/mn) pour recueillir toutes
les cellules non adhérentes qui sont alors ajustées à 2.5 10” cellules
par ml en milieu EL SV 10.
La bourre de nylon est reprise en milieu EL, triturée pour éluer
les cellules adhérentes qui sont remises en suspension à 2.15 106
cellules par ml en milieu EL SV 10.
La vitalité des cellules n’est pas affectée par ce traitement ; le
rendement moyen en cellules est de 45 à 65 p. 100 par rapport à la
suspension de départ.
10. TEST DE ROSETTE E STANDARD
50 ,111 de suspension leucocytaire repris en EL SV 10 sont ajoutés
à 50 ul de suspension de globules rouges de mouton ; le mélange est
placé 15 mn au bain-marie à 370 C centrifugé 5 mn à 200 g et laissé
une nuit à + 4O C.
Les culots sont remis en suspension et après coloration au ‘bleu
de méthylène [16] on compte sur un total de 400 leucocytes le nombre
de cellules formant rosettes.
RESULTATS
1.
INFLUENCE DE DIVERS FACTEURS SUR I,A FORMATION DE ROSETTE~ E
a) Espèce fournissant les globules rouges
Les hématies de différentes espèces animales ont été éprouvées
avec les leucocytes sanguins de quatre moutons.
Les pourcentages de rosettes obtenus sont regroupk dans le
tableau 1 et montrent que les hématies de mouton donnent m pour-
centage de rosettes bien plus élevé que les hématies de porc, de veau
ou de chèvre.
Lorsque les hématies et les lymphocytes proviennent du même
mouton, le pourcentage de rosettes est le même.
Les mêmes suspensions leucocytaires sont chauffées à 56Q C pen-
dant 30 mn. Avec une vitalité inférieure ou égale à 1 p. 100, 2 à 5 p. 100
des cellules forment encore des rosettes montrant que la vitalité est
une condition nécessaire à la formation des rosettes.
b) Rôle du sérum de veau
Les résultats du tableau II montrent le faible pourcentage de
rnr~+t~r PT-, l’cahcanra rta rPrr,m AP -L,,=c,,, . 10 nnmhro TOP ,-,>l,t,,la. for-
COMMUNICATIONS
327
TABLEAU 1
Influence de l’origine des globules rouges sur le nomb
de rosettes E
pour 100 leucocytes sanguins
Leucocytes\\Origine des
des moutons \\g
Mouton
Porc
l èvre
Veau
-
01
36
16
9
0 2
28
19
0
0 3
34
18
7
0 4
32
17
8
Moyennes
32,5
17,5
825
-
TABLEAU II
Influence du sérum de veau sur le nombre de r zttes E
pour 100 leucocytes sanguins
Concentration
de sérum de
0 p. 100
10 p. 100
20 p. 100’
J. 100
10 p. 100*
veau
Mouton no 1
3
32
nt
nt
17
Mouton no 2
4
29
27
24
22
Mouton no 3
6
34
35
30
25
Moyennes
4,5t1,5
31*3
3154
'$3
21,5&4,5
* Sérum foetal de veau.
mant rosette est maximum avec 10 p. 100 de SC Irn de veau ; le
sérum de veau foetal à cette même concentratio
apparaît un peu
moins efficace que le sérum de veau de 4 mois. F
n- s’assurer qu’il
n’existe pas dans le sérum de veau un anticorps nz u-e1 dirigé contre
328
BULLETIN DE L'ACADÉMIE
EL SV 10 est incubée pendant 30 mn à 370 C en présence de di%-
rentes doses de complément [17] : en présence d’un anticorps anti-
lymphocyte de mouton, le complément devrait provoquer la lyse des
lymphocytes ; or la vitalité des cellules varie de 88 à 92 p. 100 pour
les lymphocytes en milieu EL SV 10 et de 90 à 94 p. 100 dans Ic
milieu sans sérum (EL).
c) Le Dextran
Nous avons également cherché à améliorer le pourcentage de
cellules formant rosette par addition dans le milieu d’un poly-
saccharide de poids moléculaire 70 000, le Dextran T 70, comme cela
avait été obtenu dans d’autres espèces [17].
Le tableau III montre qu’avec 10 p. 100 de Dextran dans la sus-
pension de globules rouges nous avons obtenu une augmentalion du
nombre des lymphocytes formant rosette E qui varie avec ie tissu
d’origine des lymphocytes : les lymphocytes du thymus ou des gan-
glions mésentériques forment beaucoup plus de rosettes lorsque
l’on travaille en présence de Dextran tandis que les lymphocytes
sanguin paraissent peu sensibles à cet agent.
TABLEAU III
Inl’luence du dextran sur le nombre de rosettes E pour 100 leucocytes,
dans le thymus, le ganglion et le sang
I
Source de
lymphocyte
Thymus
Ganglion
mésentérique
Rate
Sang”
_
.i.
Rosettes E
65
62
5 0
34.5 (32-37)
Rosettes ED
80
71
54
40.5 (39-42)
* Il s’agit d’une moyenne sur 4 individus ; valeurs extrêmes entre parenthèses.
Avec 2 et 5 p. 100 de Dextran l’augmentation du nombre de cel-
lules formant rosette E n’est pas significative.
2. DISTRIBUTION DES ROSETTES E DANS LES
DIFFÉRENTS ORGANES LYMPHOIDES
Le tableau IV présente les résultats obtenus avec les lymphocytes
A.. AL-.-..- A,. ,- -^A^ ^A A-- ----lZ..-- . ..i---LL..l-..-- T - .--....--.- Le--
COMMUNICATIONS
329
TABLEAU IV
Influence de l’origine des cellules sur le nombre dc
-osettes E
pour 100 lymphocytes dans le thymus, la r e,
le ganglion mésentérique et le sang
Sang
Lymphocytes
Rate
G M
TH
10 1
no 2
p. 100
6 6
6 0
5 2
de lymphocytes formant rosette E est plus élevé d 1s le thymus que
dans les ganglions, la rate et le sang. Néanmoins le lymus ne fournit
pas 100 p. 100 de cellules formant rosette E.
3. LES LYMPHOCYTES FORMANT ROSETTE E SONT DIS1 \\ICTS
DE CEUX FORMANT ROSETTE EA OU zc
Après séparation de suspensions lymphocytai: s sur bourre de
nylon, nous avons comparé les cellules adhérentes t non adhérentes
à la fibre, ainsi que le montre le tableau V.
T ABLEAU V
Influence de la filtration sur bourre de nylon sur le nom
:e de rosettes E,
EA et ZC pour 100 lymphocytes sanguin
Lymphocytes
sanguins
Fraction
EA
Mouton no 1
T
3 9
1 0
FI
6 5
F2
12
5
Mouton no 2
T
4 2
12
FI
5 9
F2
7
:
T : Témoins lymphocytes avant passage sur bourre de nylc
F, : Cellules non adhérentes.
R : Cellules adhérentes.
330
RLJLLETIN DE L'ACADGMIE
Le passage sur bourre de nylon enrichit nettement les suspensions
en cellules formant rosette E et élimine les cellules capables de for-
mer les rosettes EA et ZC. Au contraire les cellules retenues sur la
bourre de nylon puis éluées forment des rosettes EA et ZC et peu
de rosettes E. Les cellules de thymus de mouton ne forment prati-
quement pas de rosettes EA [9] et ZC [ 13, 171 qui sont des marqueurs
des cellules B dans les autres espèces.
4 .
INHIBITION DE LA FORMATION DES ROSETTES E PAR UN SÉRUM
ANTITHYMUS DE MOUTON
Un sérum de lapin antithymus de mouton en cours de prépa-
ration est utilisé aux dilutions 1/5, l/lO, 1/20 et son action inhi-
bitrice est comparée à celle d’un sérum normal de lapin et à celle
d’un sérum de lapin anti-immunoglobulines de mouton.
Le sérum antithymique” inhibe complètement la formation de
rosettes tandis que le sérum normal et le sérum anti-immunoglo-
bulines ne sont pas inhibiteurs.
DISCUSSION
30 à 40 p. 100 des lymphocytes sanguins de mouton forment des
rosettes E avec les globules rouges de mouton ; dans le thymus ce
pourcentage s’élève à 65-70 p. 100.
Il est important pendant la préparation des suspensions cellu-
laires d’opérer en environnement protéique pour préserver les pro-
priétés de membrane des globules rouges et des lymphocytes ; en
effet, si on lave les lymphocytes en tampon salin (PBS) et non en
milieu de Earle Lactalbumine (EL) on n’observe pas de formation
de rosettes.
La présence de sérum de veau ou de mouton dans les suspensions
de lymphocytes et de globules rouges est essentielle pour la Por-
mation des rosettes. Lorsqu’on ajoute 10 p. 100 de Dextran dans la
suspension de globules rouges, nous augmentons de 5 p. 100 le nombre
de rosettes E formé par les lymphocytes du sang et de la rate ; cetle
augmentation est plus marquée pour les lymphocytes du thymus
et des ganglions mésentériques. Il est possible que d’autres traitements
[3, 151 utilisés dans d’autres espèces pour augmenter le nombre dz
rosettes E, soient aussi efficaces chez le mouton.
Les lymphocytes responsables de la formation des rosettes E
chez le mouton sont vraisemblablement des lymphocytes T parce
que :
COMMUNICATIONS
- les lymphocytes qui adhèrent à la bourre
: nylon forment
peu de rosette E tandis que 60 p. 100 de ceux qu’
le se fixent pas
en forment ;
/
- ces rosettes E ne sont pas inhibées par u sérum de lapin
anti-immunoglobulines de mouton ;
1
- ces rosettes E sont inhibées par un sérum
antithymus de
mouton.
Les rosettes E observées chez le mouton sont :n même temps
des autorosettes puisque les globules rouges du do leur de lympho-
cytes conviennent aussi bien que les globules r( lges d’un autre
individu. La formation des autorosettes chez le I outon, t r è s for-
tement dépendante de la présence de sérum de ve: L ou de mouton,
diffère de celle observée chez la souris [12] puisqu chez cet animal
le sérum homologue est inhibiteur.
Le phénomène des autorosettes spécifiques du imphocyte T du
mouton peut s’expliquer par la présence de récepl
urs à la surface
des lymphocytes ou des hématies. Ce récepteur r :st pas un auto
anticorps fixé à la surface du lymphocyte puisq
‘un sérum anti-
immunoglobulines de mouton n’est pas inhibitel
‘. N o u s n’avws
pas mis en évidence d’anticorps antimouton dans (
sérum de veau,
il ne s’agit donc pas d’un anticorps qui lierait dir :tement ou indi-
rectement les lymphocytes aux globules rouges.
Par ailleurs tous les lymphocytes T ne forment as de rosettes E
avec les globules rouges de mouton dans les conditic 1s où nous avons
travaillé puisque même à partir du thymus on l’obtient jamais
100 p. 100 de cellules formant rosette E. Avec la préparation sur
gradient de ficoll on ne saurait exclure la perte dc
sous-populations
lymphocytaires compte tenu du rendement obtenu (50 p. 100).
Nous pensons utiliser ce marqueur des lym hocytes T dans
l’étude des mécanismes immunitaires lors d’inva:
lns parasitaires,
microbiennes et virales dans l’espèce ovine.
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L’inserlion est acceptée à l’unanimité.
Depuis la rédaction de cet article, R. M. BIONS a publié dans le Journal of lmmu-
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_r
c .l.--l..--