REPUBLIQUE DU SEXWL INSTITUI‘SENEC~SDEREc)IFJIcMEs ...
REPUBLIQUE DU SEXWL
INSTITUI‘SENEC~SDEREc)IFJIcMEs
---------
AGRICOLES (I.S.R.A.)
MINIST'EREDEL'ENSEIc=NEMENTS~~
------"-
ET DE LARECHERcHE SCIENTIFIQUE
LABORATOIRE NATIONAL DE L'ELEVAGE
---------
ETDERECI3EXCHESVlZ'ERINAIRES
SECRETARIATD'EXATALAREC=RC~
SCIENTIFIQUE ET TECHNIQUE
RAPPORT SUR UN STAGE
DE PARASITOLOGIE EFFECTUE EN FRANCE
DU 10 OCTOBRE 1980 AU 27 FEVRIER 1981
B-v----
Par Mamadou SEYE
--m-e--
REF. No 068/PARASITO
AVRIL 1981
RAPPORT SUR UN STAGE
DE PARASITOLOGIE EFFECTUE EN FRANCE
DU 10 OCTOBRE 1980 AU 27 FEVRIER 1981
Par Mamadou SEYE (Jt)
INrRODUcrION
La forswtion continue des agents à tous les niveaux est l'une des
options fondamzkales du &wernemant du S&&gal en général, de l'Insti-
tut sénégalais de Recherches agricoles en particulier.
C'est dans le cadre de cette option que j'ai pu bénéficier d'une al-
lwation de stage pour une dur6e de cinq mois, accordée par lf2nstitut
sénégalais de Recherches agricoles (ISRA) sur l'initiative du Laboratoire
national de 1'Elevage et de Recherches &térinaires de Dakar. Cela m'a
permis d'effectuer en France un stage de perfectionnement en Parasitolo-
gie, du 10 octobre 1980 au 27 février 1981, conforrkmznt à un progra~~~~? de
forrration proposé par le chef de Service de Parasitologie du Laboratoire.
Le stage a comporté les deux principales étapes ci-dessous :
- participation au Cours FAO/IEMVT sur les Trypanosomiases anirwles et leurs
vecteurs, organisé à l'Institut d'Elevage et de Médecine vétérinaire des
Pays txwpicaux, à Maisons-AI.fort? d'octobre à décembre 1980.
- stage de séro-knmologie parasitaire au Centre hospitalier r6gional et
universitaire de Grenoble, du 5 janvier au 15 février, puis au Iaborwtoire
de Parasitologie de la Faculté de Médecine de Mrseille, du 16 au 22 fé-
.
vrier 1981.
L'objet du @sent rapport est de rendre compte de ces étapes et d'en
tirer les principaux enseignements.
..* / . . .
(~1 Institut sénégalais de Recherches agricoles, Laboratoire national de l'Ele-
vage et de Recherches vétérinaixes, B,P. 2057, DAKAR, Sénégal.
- .
-2
1 -COURS SURLESTRYPANOSOMIASESANIM&ES
En réalité, ce cours s'est étendu sur cinq mis et a coqrté deux
parties :
-unepremikepartie,
organisée à l'lIES.T, qui a compris des cours théo-
riques et des travaux pratiques SUT les Glossines et les autres vecteurs
des Trypanosomiases.
- une seconde partie, essentiellement pratique, qui a porté su?? des tra-
vaux d'entomlogie sur le terrain, à Bobo-Dioulasso, Haute Volta.
N'ayant pas prix part à cette seconde partie, je me limiterai ici à
la seule partie théorique du COUPS.
L'enseipemnt a fait appz1 à un grand nor&m de spécialistes fran-
çais et étrangers, qui ont abordé l'ensemble des aspects relatifs aux ?!&y-
p3nosoiniases anirrales et à leurs vecteurs Il n'est donc pas possible, dans
le cadre. de ce rapport, de relater en détail. tout ce qui a été étudié. Ne
seront indiqués que les grands thèmes abordés,
Deux gonds thèmes se dégagent du cours :
- l'étude des vecteurs des !l%panosomiases p
- l'étude des 'Bypanosoms et des Trypanosomiases en Afrique.
1.1. Les vecteurs des vosomiases
L'essentiel de ce thème a porté sur les Glossines, tis les autres vec-
teurs ont aussi été étudiés. Le thème se subdivise en deux chapitres trai-
tant respectivement de l'écologie et de lventmlogie proprwrmt dite.
1.1.1. Ecologie des Glossines
--mm- -.m---------a----
Ici se regroupent toutes les études portant sur l'entinnmnt des
vecteurs biologiques : les zones clirratiques en Afrique, la botanique, la
géologie, etc...
L'étroite relation entre les Tsé-tsé et les conditions pluvi&i-
ques, thermiques, floristiques,
dvhumidité atmsphérique et de lumière a
. . . / . . .
- 3
été démnt&e, ainsi que lSimportance de la nature des sols au point de
vue biologique (lieux de ponte). Eh outre, la faune sauvage a été étudiée
cmm principal hôte nourricier.
En plus de ces &néralités, une étude particulière de l'écologie des
principales espèces et sous-espèces de Glossines a été faite, qui a rendu
coqte, pour? chacune d'elles, des connaissances actuelles sur lem con-
ditions optimales de survie et de développement : tempér&ure, humidité,
lumière, pluviomkrie, flore de phdilection, h6tes nourriciers ptiféren-
tiels.
1.1.2. Entoml@e
--1-1..-1'--
L'étude des Glos&es a été très exhaustive. Elle a porté SUT la
mqholopie externe, l'anatcmie interne, la physiologie et la biologie.
Mais c'est surtout la systématique qui a p&dmi&, alliant des cours
théoriques et des séances de travaux pratiques, qui ont permis de se fa-
miliariser avec les clefs utilisées pour la détermination des sous-genres,
espèces et sous-espèces. Iks séances de dissection ont en oui% permis
de s'exercer a isoler des %ypanoms chez les tsé-tsé et à déte&r
l'âge pfrysi.ologique
des femslles.
. . .
Par ailleurs, la lutte contre les Glossines a été étudiée sous tous
ses aspects :
- lutte chimique par épandage d'insecticide au sol ou par voie agrienne ;
piège de Challier- Laveissière et écrans unbibés d'insecticide ;
- lutte biologique : parasites et p&dateurs des Glossines, bactéries,
chmy+mmS, etc.
- lutte génétique : lâchers de nSles stériles, translocations chromsomi-
ques, etc.
- lutte écolo&ue : destructicm des &tes, modification de l'environne-
ment.
Les méthodes d'étude des Glossines sur le terrain ont aussi été abor-
dées : rkolte de pupes, capture d'adultes, techniques de marquage, déter-
mination de l'cwigine du repas de sang, sexe ratio.
a.. / . . .
-4
Enfin, l'élevage des Tsé-tsé en labcrratoire a fait l'objet de leçms
pmticuli&-es, et l'occasion a été donnée de visiter 1'élevaRe de 1'IEMVT.
Au COUTS de cette visite, des informtions ont été donnges sur les condi-
tions nécessaires à l'implantation de tels élevages.
S'agissant des vecteurs mécaniques des Trypanosckases africaines,
une attention particulière a été accordée aux Tabanidgs et aux Stomxes.
De f&nf3, ont été étudiées les Puces et les Punaises, et leur tile vecteur
signalé.
1.2. Trypanosoms et Trg3nosomîases en Afrique
Les chg@.tres qui c-sent ce thème ont fait l'objet d'études très
nombreuses et très approfondies, Les p%ncipmx sont relatés ci-dessous.
1.2.1.
S~témtique
- -m-m--- --
Ce chapitre fait le point des connaissances actuelles en rmtière de
syst&mtique des Trypnosoms et met un accent pwticulier sur les espèces
transmises par, piq&e qui repupent l'ensemble des Trypnosomes pathogènes
d'Afrique, lesquels se retrouvent dans les quatre sous-genres ci-dessous :
- Duttonella (= ancien grcupe de T.vivax)
- Nannomnas (= ancien grmpe de -1
- Wypnomon (= ancien poupe de T.brucei)
- Pycnmnas (= ancien groupe de T.suis).
Les caractères rmpholopiques et les particularités biologiques de ces
sous-genres ont été étudiés ainsi que les clefs de systématique qui pemt-
tent de dis-tin,~er les différentes espèces et sous-es$ces au sein de chaque
sous-.
1.2.2.
E$motiolopie
m ,-,,,-,--2-,
LE chapitre de l'é~izootiologie a covrté deux volets :
- l'épizcotiolo~ie pmmemznt dite, qui étudie l'incidence des Trypanoso-
miases sur le bétail domstique et ses variations dans le temp et dans
l'espace, en liaison avec la &partition des vecteurs, les espèces de
l .
/
. 0..
-5
Trypanosoms en p&.ence, les espèces anjmales réceptives, les varia-
tions climticpes locales.
- le second volet traite des mjthodes d'enquêtes épizootioloPngues qui
font apxzl à des matériels très élabor6s ou au contraire à des myens
rudimntaires, selon le niveau d'équipzmnt des services concern& et
selon les cr6dits alloués.
1.2.3. Pathologie -~x&génî~
-------.e-m-m
L'étude de la patholog6e et de la p&hoFrénie des Trypanosomiases
anim3les aporté sur-trois points principaux :
- des &&alit& qui décrivent les ph&om&es patholop;iques cm aux
Trypanosomiases animles, quelle qu'en soit l'espèce pathogène en cau-
se ; atteintes organiques et fonctionnelles, anatomie et histoloEie pa-
thologiques ;
- une étude particulière de la pathologie résultant de chacune des prin-
cipales espèces de Trypa.nosoms
: T.vivax, T.con,mlense, T.brucei, T.
-
equiw, T.evansi,
T.stis.
- enfin, le tmisièm pint émt des hypothèses d'explication des pro-
cessus pathologiques au cours des Trypanosomiases animles. Selon ces
hypothèses, le schém le plus probable gmur la maladie due à T.vivax
et celle due à T.complense chez les bovins et les petits Ruminants,
est q.ue ces mladies "&xiLter&ent de l'atteinte du tissu sanwin et,
secondaimm nt, de domapres pmxenant des réactions de l'wmnis~ con-
tre les àltémtions du sanp et leurs causes".
1.2.4. Diapostic
--.. --m--I
Le diamostic des Trypanosomiases anirmles fait appel à diffémn-
tes méthodes, qui peuvent se ranger dans les quatre ,mmdes séries ci-
dessous.
- le dia,ppostic clinique : il comr-te de nombreuses causes d'erreur car
les signes de suspiscion attribuables aux Tryjxmosomiases se retrouvent
souvent dans d’autres affections knémie, fièvre, amxipissemnt, etc...).
. . ./ . . .
-6
- La détection directe du Trypanosom en cause : elle comprend l'examen
de sanp 3 l'état frais entre lame et lamlle, l'examn de lames colo-
rées, l'exarren de sana après centr~ation classique ou en microtubes
à h&mtocrite, ou encore aprk lyse des hématies.
- La détection indirecte du parasite .par inoculation de sany suspect à
des animaux de laboratoire, à des Glossines
ténéml.es~xénodiagnostic,
._..
0uparcùLtureinvim.
- Lfes m&-iodes séroloniques
: elles sont no&?euses et de rendemmt varia-
ble. Elles visent toutes à déceler la présence d'anticorps ou dtanti&-
nes dans le sérum d'animuxmpects.
La deuxième partie de ce mpport
est consacrée à ces &hodes, qui ont connu un @ortant développemmt
au cours de ces dernières années.
1.2.5, Culture et conservation des wsomas
_------------^-------~~~~~~~~
-0-0---0
Les recherches sur les Trypanosomes et les Ikypanosomiases nécessi-
tent le. maintien en vie, en laboratoire, de souches parasita&%. Diffé-
mntes m%thodes ont été Utilis&es à cette fin depuis plusieurs décennies,
avec des fortunes diverses : milieux de culture diphasiques ou mnophasi-
ques, passapesssr animux de laboratoire, conservation par le froid. A
l'heure actuelle, ouke les Jlassa,,s sur animux, qui pardent encom tout
leur intérêt, la conservation dans l'azote liquide (-196O C) est celle qui
donne les meilleurs &sultats : durée de conservation pratiqueront illimi-
tée, aucune modification mmhologique ou biologique. CeDemdant, sur le
plan immmolof6que, des travaux &Cents ont fait apmBze la possibilité
d'obtenir par culture des forms sanwines de 'lkypanosomzs.
1.2.6. Chimiothéraaie et chimio~o~laxie
-----I---w
------w---w
e--3-
Des différentes leçons qui ont traité ce sujet, il ressort que le
choix d'un médican-ent trypanocide demuw toujours lié à deux critères
fondammtaux :
- la connaissance de l'espèce de Trypanosome à combattre,
- l'effet recherché.
D'une manière ,&-&ale et sauf chimiorésistance avé&e, le J36r&il
.
.
/
.
..D
- 7
sera utilisé en chimiothkmie et le Trypnidium en chimiopr&ntion chez
les bovins et les petits Ruminants. Fort oppmtunémnt, la résistance à
l'une de ces dmpues est combattue par l'autre.
Il faut enfin sirmaler que l'attention a été atttie sur des cas de
fraude en matière de trypanccides. Une vi$lance constante et une léFis-
lation s&&re sont nécessaires dans ce dmine.
En dehors de ces deux prands thèms qui ont conps6 l'essentiel du
Cours, il y a lieu de mentionner quelques autres chapitres traités :
- la Trypanotolémnce,
- la faune sauvage en Afkique,
- les Tiques et les mladies qu'elles tmnsmttent,
- des notions de cmiptabilité,
- des notions de statistique,
- la documntation biblio,waphique,
- les ommnisations k-rternationales, en particulier la F.A.O.,
- le Ministère français de la Coopération : structures,fmctionnemmt.
. . /
. .e.
- 10
Ici épalemwt, les délais d'obtention des &sultats sont b’WS :
de 1 tordre de deux semaines.
-Contre-immoélectrc&ffusion
ou élec-tmsyn~se : SU??Uneban-
de d'acétate de cellulose prkiL3blemnt lavée à l'eau <isti.llée
et equilibhe à pH 8,8 avec un tm-gmn Tkis-Glycine, on effectue,
3 des endroits définis, un d&ot lin&ire d'anti$ne et un d&x+t
en gouttes de sém. Le gortoir des bandes est placé dans une cu-
ve à électrwhorèse rccnfermnt du t-n pH 8,8. Une tension élec-
trique de 120 V est ensuite appliquée sur la cuve, l'anode coïnci-
dant avec le dégx% des sérms et la cathode avec celui de l'anti-
&ne.
NFm&lemnt, la miwation de l'anti&e come celle des sdrums
devmit se faire dans le sens de la force électmpho&tique,
c'est à dire de la cathode vers l'anode. En réalité, seul l'anti-
Fène mim dans ce sens. En effet, deux autms forces vont com-
biner leurs effets pour faire ~&KW les t'actions sériques en
sens inverse. Ces forces sont :
* le courant électroendomtique sui est un contre-courant li-
quidien allant de l'anode à la cathoce. 11 se p&W-sous
forme d'un mdient dont la chwyre vsitive s*amnuîse à rre-
sure que l'on svappmche de la cathode. On sait par ailleurs
que le pH iso-électricue de l'albumine est épal à 4 envimn, et
celui des ,pamm-plobulines à 6 ou 7. Le padient ~sitif de la
forw électrcendosrr)a3tique
parvient ra~idemnt à népativer les
ions des ~lobulines, ce qui n'est TEE le cas de l'albumine. De
la sorte, les ~lobulines vont rebrousser chemin et mimer dans
le sens anode-cathode, à la rencontre de l'antigène.
. k coumnt d'évaF)ration, qui r&xiLte de l'échauffwnt des
bandes, va du plus humide au plus sec, c'est à dire de chacune
des etimités des banc?es vers leur milieu. Cette force favo-
rise la mimation en sens opposé des antikkes et des ,~lobulines.
- 11
Il est nécessaire de bien choisir les lieux de démt de l'anti,~ène
et des s&ums, ce qui est capital pour obtenir une mipration diri&e dans
les sens ci-dessus indiqués.
L'application de l'électrosynér&se est techniquement simle et délicate :
les manipulations ne covrtent ‘pas de difficulté majeure, mais exizent
un respect ripoureux des conditions dsapplication, ~réalablerrmt définies
par des essais. En revanche, elle est relativement rapide ?uisqupon en
obtient les &süLtats en 4 à 5 heures ; en outre, elle ne requiert q.ue de
faibles quantités de Sactifs.
11.1.2. Détection indirecte des antico%s,
------------------------------
- Immnofluorescence indirecte : cette technique se covse elle
aussi de deux phases :
. le contact antipène-sérum suspect ;
. la révélation de la fixation éventuelle d'imnuno~lobulines du
sérum sur l'anti$ne par un sé??um anti-imnunoplobuline spéci-
fique conjwué à un fl~3rochrYm.
L'a&i+ne, sous forme de parasites entiers lorsque ceux-ci sont
microscopiques, de
fraCwnts ou liquides anti&niques enrobés
dans du mscle lorsqu'il s'aFit de macro-ormnisnm ou d'anti&m
solubles ou rktaboliques, est déposé sur lame puis mis en contact
avec le sérum suspect. Le complexe imnunoloFi.que ainsi obtenu en
cas de sérum msitif r?ésiste aux lava,nes et est révélé par un sé-
rum anti-inmuno~lobuline rendu fluorescent. La réaction se traduit
par une fluorescence des antigènes à la lecture des lames au mi-
croscope à rayons U.V,
Le principal reproche que lpon peut faire à cette technique est
que l'appréciation du de.6 de fluorescence est subjective et
peut varier de mani& significative d'un lecteur à un autre.
Par contre les manipulations en sont faciles et plusieurs diwi-
nes d'échantillons samuins peuvent être analysés dans la jour-
née.
. . /
. ..m
- 12
- Essai drimmmoadsorption ml? couplage enzymatique (F&I%) : le prkCipe
de cette technique est le r&me que dans l'immnofluorescenoe indirecte :
tivélation de la r6action anti&e- anticorps pm un sérum anti - imnuno-
p,laf;uluies conjucrué.
Ikux données fondarrientales
sont mises en oeuvre :
. la ?rwpriété des surfaces clastiques d'absorber des mmt6ines ;
la possibilité de marquer des qlobulkes -ar des enzymes qui zewent
l
être, à leur tour,colD~par des substrats chmmorrènes spécifiques.
Les cupules de plaques en matik plastique sont sensibiliccées avec l'an-
tipène. Après lavaTes les sérum sont dé~sés et laissés 3 r6apir pendant
30 minutes 3 la tm&ature an-biante. Une seconde série de lavaes pticèck
le dépot de sérum anti-imnuno~lobulines
marqué par l'enzyme. L'incubation
se fait dans les &ms conditions que pour les sérum et est suivie de la-
vals identiques. Puis le substrat chrmmène est déposé et laissé en &ac-
tion à la temp5mture ambiante. Tous ces réactifs sont utilisés à raisonrk
100 PR pr apiLe. Selon le substrat ewloy6, il y aum lieu ou non d'arrê-
ter la &action par adjonction de soude. La lectuzx des &sultats peut se
faire à l'oeil nu ou, de p&férence, au s~ctrophotcmètre qui les exorirre
en densités optiques.
Un avanta= kgxxkant de cette technique est qu'elle n'utilise que de-très
petites quantités de &actifs d9une part, et d'autre part ses r6süLtats
peuvent être chiffkks. En outre, la plupart de ses étapes peuvent aujour-
d'hui être effectuées par des appareils automatiques qui pallient les
impr+cisions et font ,va,mer du temps. U-I mand nombre de sérums peuvent
ainsi êixx analy&s dans la journée.
- Inhibition de l'h&mwlutination : cette technique peut se ranger parmi
les n&thodes indirectes puisque la visualisation des r&üLtats nécessite
un réactif biolo,crictue inter&diaire : des hématies. Les hémties sont sen-
sibilisées avec un anti,+ne, puis mises en contact avec le sérum suspect.
En présence d'anticorps, ceux-oi se fixent sur 19anti,$me et de ce fait
les hématies sont reliées entre-eX&spour~mr
un voile horngène. En
.
.
/
.
..D
- 13
cas de sérwn nésatif, les hémties sont libres ; elles sédimzntent et
s'ayjP1utinen-t:
au fond des cupules.
C'est une techni+e rapide et de mniemmt facile. L'obstacle à son
emploi à ,grande échelle est sans douela difficulté a ~F?$ERr les hémties
sensibilisées, dans le cacfre de lalmmtoires non équi?6 sp6cialmt.
II.1.3. titection des anti&es
,,,,,,,,,,,,,,,---i----
Pour l'instant, la détection des anti&es solubles ou r&taboli-
ques présents dans les s&ums r?e mlades fait appel à la technique EXJSA.
La sensibilisation des plaques se fait avec un anticorps connu,
q.ui est ensuite mis en contact avec le sérum suspect. L'adjonction ?u r&-
me anticorps marq&. cette fois par une enzym réalise un parfait sand-
wich en cas de &action positive ; la r&Zlation se fait avec un substrat
chrmr~,yène de l'en~ utilisée.
Cette techniqge reste encore à l'état d'essais, et les conditions
optimales d'application n'en sont pas encore pr&isées.
11.2. pripamtion et titmm de tiactifs bioloçrigms
11.2.1. P&~ation dlanti&nes
".I- ---,,,,-,,,,,,I,,,,
La JW$aration des anti&nes wie avec les parasites et
avec la techniaue sémlo~ique utilisée.
Les antirzènes figu&s utilisés en imu.mofluomscm.ze sont
soit des suspensions parasitaires dépzées telles quelles sur lares
et conservées au con&ateur, soit des parmites entiers ou des
fmpnts parasitaires enmulés &ns du muscle. Les rouleaux ainsi
obtenus sont rendus solides et résistants par cxmélation, ce q.ui.
peut une coupe en fine énaisseur au micmtome à congélation. Les
coupes sont déposées sur lames et stockées au cong&rteur.
Au nm-ent de lpemploi, les lams d'antigène sorties du con-
&ateur smt mpiderrmt séchées au ventilateur puis fides 10 mi-
nutes dans l'acétone.
..m / .*.
- 14
Quant aux antigènes utilisés en ELISA, ils résultent de l'isolment et de
la sonification de parasites. L'étape la plus délicate est la sonification
qui doit aboutiràuncülottrès réduit, un surnageant abondant, horrwène
et sans débrits mrasitaires. C'est ce surnapeant qui est utilisé. Il est
inpérieux d'éviter qu'un échauffement excessif ne d&truise les pmt6ines
antipkiques au cours de la sonification.
Une autre &thode consistwait à recueillir les antinènes prkents
dans les sérums de mlades en ~r6cipitar-k les ,globulines pw le sulfate
d'km-onium et en recueillant le sumweant renfermant les anti$nes.
11.2.2. e!$aration de qlobulines
_--------------------
La préparation de plobulines destinées aux &actions SércloPioues
covrte trois étapes : l'isolement, le dosage des protéines, la conjwai-
son avec un fluorochro~ ou une enzyme.
a) Isolerrmt
: les immmo~lobulines comme les anti- immmqlobulines sont le
tisultat de la réaction classique de l'hôte face3 une substance &ran&e
intmduite dans son or~mnism. Dans le cas des inmuno~lobulines, l'injection
de Damsites, par exerrple, conduit à la formation d'anticorps spécifioues
Trésents dans le sérum de l'animal inoculé. Les anti-immuno~lobulines,
elles,
résultent de l'injection r$$tée d'imnunoP-lobulines à un animal d'une espèce
diffknte de celle cui les a fournies. Le Lqin, le Rat et le Houton sont
des animux de choix pouf l'obtention de sérum anti-imnuno~lobulines.
Les
solutions ~lobuliniwes, accmpamées pwfois d'un adjuvant de l'irmunité,
mrmettent d'obtenir en 4 à 5 semines suffisamnent d'anticorps sérioues,
ou'il faudra isoler.
L'isolement se fait par pr&ipitati~n de la f73=kction ~lobullkkue avec
du sulfate d'Ammnium en solution satur6e ou en cristaux r6duits en noudre
t&s fine. Après centrifugation à mande vitesse et à basse température, le
culot est remis en susTension dans Au sérum physiolopique et dialysé r>our
éliminer les r&idus de sulfate d'Ammnium. La dialyse est suivie d'une
redissolution dans du tarrpm pour obtenir à nouveau le volume initial de
sérum.
0.. / .
.
.
- 15
b) Dosace de prot6ines
: la dgtermination du taux de prot6ines des Flobu-
lines isolées et une étape tr&s irq-rtante, puiscrue les quantités de
fluoro&rome ou d'enzyme utilisées dans la conjwaison sont fonction de ce
taux.
Plusieurs procédés peuvent être utilisés. A l'heure actuelle, c'est la
&thode de Bradford qui serrble donner les meilleurs rkiltats, en raison de
sa fialisation très facile n&s surtout de sa haute sensibilité. Elle con-
siste à mélawer une solution à base de bleu de Coomssie avec, d'une part,
plusieurs dilutions des slobulines à doser, et d'autre part, les mZm% dilu-
tions d'une solution protéinique de titre connu. La liaison des protéines
avec le colorant donne une coloration bleue, dont l'intensité est prono??-
tionnelle à la concentration prwtéinieue de chaque dilution. Les densités
opticrues obtenues ?i la lecture au spectro~hotomkre mttent d'établir une
courbe d'étatiace et, par comparaison, de calculer la teneur en FrotGines
des ,qlobulines $ doser.
c) Conjwaison : les r;lobulines ainsi isolées et dosées peuvent être conju-
puées à diverses substances selon l'usage en vue.
Pour les r5actions d'imrraulofluorescence, le fluorochro~ le plus uti-
lisé est l'iso-thiocyanate de Eluoresc&ine. Je n'ai rus eu l'occasion de
suivre cette conjugaison au C.H.R.U., les conjuw& utilisés ici étant
achetés dans le comnerce, mis Xe service de Parasitolopie de Hann la pra-
tique assez souvent.
Par contre, j'ai pris part au mquage enzymatique de ~lobulin~destinées
aux énreuves ELSA. Les méthodes de mquame sont variables et utilisent -.--
tantôt le plutaraldéhyde, tantôt le Sodium mkapériodate. Cette dernik
variante est de dalisation facile et rapide, elle donne en plus de tins
Iîésultats.
11.2.3. Pkparation de substrats chro'ro&nes
----------------------l------=----,
Absente dans les autres techni+es, 1'6tape du détit d'un substrat
chrom&ne de l'enzyme fait partie inté~te de l'épreuve ETJSA. Pour r&
véler la Péroxydase par exemple, plusieurs substrats peuvent être utilisés :
.,. /
..,
- 16
ortho-tolikine, ortho-phgnylène-diamine,
acide-5-amino-salycilique,
ortho-
dianisidine. P&is c'est l'ortho-tolidine qui semble actuellement l'enpsor-
ter sur les autres, en raison de la r&uction considkable du teps de
rkction qu'elle P=ure (de l'ordre de 4 heures) et surtout parce que les
concentrations ~rotéiniques des antisènes sont, lorsqu'on utilise ce subs-
trat, de loin inférieures à celles nécessaires avec les autres.
De FrGparation extemwxxnée, l'ortho-tolidine est d'eboti dissoute
dans dudtithylfom'de (bMf') à raison de 21,2 rnF r>our 1 mil. de TJMF, La
solution est ensuite nortée à 100 ml par adjonction d'un t-031 acéto-a&-
tique de pH 3,7. Au moment de l'er@oi, la pr+aration est complétée nar
50 UR d'eau ov,$née à 30 volumes.
11.2.4. Titrage de fiactifs biologiques_
---a- --.--------------WI -
L'obtention d'un nouveau lot d'antigène, de globulines ou de conju-
gué et nGme l'acquisition de plaques d'une marque différente de celle utili-
sée habituellement doivent toujours conduire à des essais rigoureux et va-
riés afin de définir de nouvelles conditions de travail ou le cas échéant, de
c0nfirx-w les anciennes. Dans tous les cas, seront retenues les combinaisons
donnant à laiDis et de mière repxwductible, les plus fortes réactions avez
les témnins positifs, les réactions les plus faibles avec les t&ins néga-
tifs, des réactions pratiq.uement nulles avec les témkns sans sérum 9%lanks",
et qui utilisent en m%e temps les plus faibles quantités de réactifs.
A l'issue de ce stage de 6 semaines à Grenoble, je me suis rendu à la
Faculté de Médecine de Mrseille pour y suivre l'application de certaines
de ces techniques à la Trypanosomiase humaine africaine. Les principes géné-
raux et les modalités de réalisation étant à peu près identiques à ceux en
cours à Grenoble, je me limiterai à relater la préparation de lran-tigène
trypanosomien utilisé en ELISA.
. . /
. .*a
- 17
La souche de T.brucei brucei utilisée à Marseille est conservée au
congélateur à -7OOC. Une petite quantité en est inoculée à des souris.
Lorsque la parasitémie est suffisamment riche, une ponction cardiaque est
faite, et le sang parasité es-t filtre sur colonne de DEAE-cellulose selon
la kLhode de LANHAP?. L'éluat renfc-wn-t les Trypanosomes est concen-tr-6
par cen-lP5 zgation puis passé à la sonification. Le surnageant repr&ente
l'antigèny, qui est titré par une méthode colori.m&iq,ue ou par des essais
sur plaques ELISA
De re-tOL?? a lQxvT, J"ai consacré la dernière semaine du mois de
février à des séances de travaux pratiques d'titcmologie sous la conduite
du docteur J. ITARD, chef du service d9Entomologie. P+i, j'ai pu procé-
der à de nombreuses dissections de Glossines, m'exerçant notamment à isoler
les appareils digestif, reproducteur et nerveux. La détermination des sous-
genres à l'examen des cerques, celle des espèces et sous-espèces par les pa-
ram?Pes,
la definition de l'age physiologique des femelles à la configu-
ration des ovarioles ont fait l'objet d'une insis?-.nce particuli&e au cours
de ces travaux pratiques.
e.. / e..
- 18
CONCLUSION
Du cours de 1'IEMVT, on retiendra essentiellement :
- la qualité exceptionnelle des enseignements prodigués par un corps pro-
fessoral constitu& par des sotités du monde scientifique travaillant sur
les Trypanosomiases. Cela a permis aux étudiants d'acquérir de nombreuses
connaissances et surtout d'avoir une conscience nouvelle de l'intérêt à
accorder à ces maladies, qui demeurent l'un des plus importants facteurs
1imiWnts du développement du cheptel africain.
- qu'une coordination et une rationnalisation des progrms de lutte
anti-vectorielle est indispensable pour leur assurer un & de chan-
ces de succès.
- que l'organisation pratique du cours serait sans reproche si la saison
choisie était plus clémente que celle d'hiver, q-ui contraint les parti-
cipants à consacrer une bonne partie de leur allocation à l'achat de vê-
tements d'hiver, au détriment dsouvrages scientifiqus. En outre, il se-
rait utile que le cours comporte un chapitre exhaustif sur lphématologie,
étant donné la prrépondérance des atteintes sanguines et leurs r@ercus-
sions dans les Trypanosomiases animales.
S'agissant du stage de séro-biologie, il y a lieu d'indiquer d'em-
blée que le service de Parasitologie du Centre hospitalier Agiona et uni-
versitaire de Grenoble est arrivé à une maîtrise remarquable de la plupart
des techniques décrites ci-dessus. Celles-ci y sont d'utilisation courante
tout en faisant l'objet de recherches suivies pour en améliorer et Pr&iser
les conditions optimales d'application. Une mention particulière revient aux
essais actuelle~nt en cours, qui étudient la possibilité d'utiliser en ELISA
des plaques sensibilisées à l'avance et conservées plus ou moins longtemps
aucangélateur. Le succès de ces essais pernusttrait en effet de mer du
temps et, surtout, d'analyser un grand nombre de sérums avec la même p¶-
tion antigénique, ce qui donnerait davantage de fiabilité aux rkultats.
Une seconde roque ri?side dans 19importance à accorder au pH des tam-
pons utilisés dans les différentes techniques. Une vérification rGgulière et
- 19
systématique stimpose à ce sujet car les conditions optimales de travail
sont toujours le fruit d'essais qui auront permis de d&erminer avec pr&i-
sb l'ensemble des paramètres. Parmi ces paramètres, la dilution optimale
des réactifs occupe une bonne place. Et les dilutions sont toujours faites
à l'aide de t-s à pH défini. Le meilleur contile en la matière serait
peut être de ne ptiparer tout au plus que les quantités de t;urg-on n&essai-
res pour les travaux de la semaine, pour éviter les altérations dues à un
sto&ageprolon$.
Enfin, le survol des techniques sémlogiques ci-dessus décrites con-
duit a roquer leur grande diversité. Et l'on est tenté, à premi&x! vue,
d'en conclure que leur application simüLtanée ne se justifie pas, en rai-
son notamment de l'identité du principe qui est, dans tous les cas, la
réalisation d'une &action antigène-anticorps. En r&lité, il s'agit de
techniques cowl6mentaires, dont les un~pallient les inconvénients des
autres : certakes techniques exigent des d&ais assez longs alors que
d'autres peuvent être &alisées en quelques heures ; certaines requièrent
un matériel de wde prkision, d'autres font appel à un matériel quasi-
rudimentaire ; certaines sont quantitatives, d'autres plutôt qualitatives.
Il s'agira donc à chaque fois, dgop&er une orientation des échantillons à
analyser, en fonction de critères tels que l'urgence de l'analyse, la nature
de la parasitose recherchée, l'objectif du protocole de recherche, etc...
En outre, il arrive bien souvent que la combinaison de plusieurs techniques
et la confrontation de leurs r&ultats respectifs soient indispensables
pourconfkrwou infitxwunr&ultatdouteux,
C'est l'évidence : la combinaison de techniques aussi dissemblables
dans leur réalisation n'est possible qu'avec une organisation rxtionnelle
des activités et une séparation des matériels. Cette séparation, sans être
systématique, devrait être très judicieuse et en tout cas permettre d'évi-
ter les fâcheuses contaminations r&ultxrt des interf&ences. Une étroite
collaboration entre les agents travaillant dans les différentes techniques
fawriserait de telles mesures, lesquelles seraient consolidées par une
discipline unanime dans l'usage de la verrerie collective.
- 20
Au service de Parasitolo~ie du C.H.R.U. de Grenoble, l'ensemble de ces
conditions sont à prkent &Unies. Et il n'y a pas de doute que, dms les
années à venir, d'importants propp?+s y seront accomplis dans les domines
du diagnostic sérologique et des recherches immnolo~iques destin6es 3
mieux c-m& les m&nismes des maladies parasitaires.
A Dakar, j'avais eu l'occasion de pratiquer plusieurs techniques
séro-Wolor)iques
avant ce stage. Cependant l'ex$rience acquise à Gre-
noble pem&Wa de les affirm tout en les adaptant 3 nos mens.
- 21
REMERCIEMENTS
- M. le docteur J. GRWEL, chef de la Division de l'Enseignement et des Etu-
des pédagogiques de 1'IEMVT a bien voulu assurer toute 190rpnisation de
ce stage, et a déployé des efforts inlassables pour en assurer le succès.
Je tiens à l'en remercier chaleureusement.
- M. le docteur J. ITARD, chef du service dsEntonûlcxie de 1'IEMVT et direc-
teur du Cours sur les Trypanosomiases, amganisé remarquablement le cours
et, tout au long, a fait preuve d'une activit6 et d'une disponibilité cons-
tantes. Je lui pr&ente mes sincères remerciemnts.
- Le concours anthousiaste du personnel du secrétariat de la Division de 1%~
se&nement n'a ps fait défaut, en particulier de tis MILOT et GANDIOLE.
Qu'elles veuillent accepter mes remerciements.
- M. le Professeur P. AMBROISE-THOMAS, chef du Service de Parasitoloxie du
Centre hospitalier &gi~l et universitaire de Grenoble, a bien voulu m'ac-
cueillir dans son service, et tout au long de mon stage, m'a nrodigué de
judicieux conseils, m'a manifesté une attention constante et m'a offert des
facili.6 de toutes sortes. Qu'il veuille bien trouver ici llexpr+assion de
m3 reconnaissance.
- A Nadame le docteur GOULLIER, assistante au service de Parasitologie du
C.H.R.U. de Grenoble, je présente mes vifs remxciements pxr lfint&&
quotidien manifesté à ce stage.
- Mes amitiés et IIW remxciements vont kzalement à tout le nersonnel du ser-
vice de Parasitolopie du C.H.R.U. de Grenoble, qui m'a pxidé tous les jours
et m'a fait découwir mille choses int&essantes.
- J'associe à ces remerciements M. le Professeur OUILICI qui a bien voulu
m'acceuillir au Laboratoire de Parasitologie de la Faculté de Médecine de
meille, MM, les docteurs DUMONT et FAUGERE ainsi que l'ensemble du per-
sonnel de ce laboratoire pour les efforts déployés en ma faveur au cours
de mx séjour à Marseille.
. . /. .e.
-
. . .
-
7
- 22
- Enfin, je dis toute m reconnaissance et tout mn respect au CO~~S pro-
fessoral du Cours sur les Trypanoscmiases, mur la qualité des enseigne-
t
mmts et la chaleur qui en a marqu6 la conmnication.
INSTITUI‘SENEC~SDEREc)IFJIcMEs
---------
AGRICOLES (I.S.R.A.)
MINIST'EREDEL'ENSEIc=NEMENTS~~
------"-
ET DE LARECHERcHE SCIENTIFIQUE
LABORATOIRE NATIONAL DE L'ELEVAGE
---------
ETDERECI3EXCHESVlZ'ERINAIRES
SECRETARIATD'EXATALAREC=RC~
SCIENTIFIQUE ET TECHNIQUE
RAPPORT SUR UN STAGE
DE PARASITOLOGIE EFFECTUE EN FRANCE
DU 10 OCTOBRE 1980 AU 27 FEVRIER 1981
B-v----
Par Mamadou SEYE
--m-e--
REF. No 068/PARASITO
AVRIL 1981
RAPPORT SUR UN STAGE
DE PARASITOLOGIE EFFECTUE EN FRANCE
DU 10 OCTOBRE 1980 AU 27 FEVRIER 1981
Par Mamadou SEYE (Jt)
INrRODUcrION
La forswtion continue des agents à tous les niveaux est l'une des
options fondamzkales du &wernemant du S&&gal en général, de l'Insti-
tut sénégalais de Recherches agricoles en particulier.
C'est dans le cadre de cette option que j'ai pu bénéficier d'une al-
lwation de stage pour une dur6e de cinq mois, accordée par lf2nstitut
sénégalais de Recherches agricoles (ISRA) sur l'initiative du Laboratoire
national de 1'Elevage et de Recherches &térinaires de Dakar. Cela m'a
permis d'effectuer en France un stage de perfectionnement en Parasitolo-
gie, du 10 octobre 1980 au 27 février 1981, conforrkmznt à un progra~~~~? de
forrration proposé par le chef de Service de Parasitologie du Laboratoire.
Le stage a comporté les deux principales étapes ci-dessous :
- participation au Cours FAO/IEMVT sur les Trypanosomiases anirwles et leurs
vecteurs, organisé à l'Institut d'Elevage et de Médecine vétérinaire des
Pays txwpicaux, à Maisons-AI.fort? d'octobre à décembre 1980.
- stage de séro-knmologie parasitaire au Centre hospitalier r6gional et
universitaire de Grenoble, du 5 janvier au 15 février, puis au Iaborwtoire
de Parasitologie de la Faculté de Médecine de Mrseille, du 16 au 22 fé-
.
vrier 1981.
L'objet du @sent rapport est de rendre compte de ces étapes et d'en
tirer les principaux enseignements.
..* / . . .
(~1 Institut sénégalais de Recherches agricoles, Laboratoire national de l'Ele-
vage et de Recherches vétérinaixes, B,P. 2057, DAKAR, Sénégal.
- .
-2
1 -COURS SURLESTRYPANOSOMIASESANIM&ES
En réalité, ce cours s'est étendu sur cinq mis et a coqrté deux
parties :
-unepremikepartie,
organisée à l'lIES.T, qui a compris des cours théo-
riques et des travaux pratiques SUT les Glossines et les autres vecteurs
des Trypanosomiases.
- une seconde partie, essentiellement pratique, qui a porté su?? des tra-
vaux d'entomlogie sur le terrain, à Bobo-Dioulasso, Haute Volta.
N'ayant pas prix part à cette seconde partie, je me limiterai ici à
la seule partie théorique du COUPS.
L'enseipemnt a fait appz1 à un grand nor&m de spécialistes fran-
çais et étrangers, qui ont abordé l'ensemble des aspects relatifs aux ?!&y-
p3nosoiniases anirrales et à leurs vecteurs Il n'est donc pas possible, dans
le cadre. de ce rapport, de relater en détail. tout ce qui a été étudié. Ne
seront indiqués que les grands thèmes abordés,
Deux gonds thèmes se dégagent du cours :
- l'étude des vecteurs des !l%panosomiases p
- l'étude des 'Bypanosoms et des Trypanosomiases en Afrique.
1.1. Les vecteurs des vosomiases
L'essentiel de ce thème a porté sur les Glossines, tis les autres vec-
teurs ont aussi été étudiés. Le thème se subdivise en deux chapitres trai-
tant respectivement de l'écologie et de lventmlogie proprwrmt dite.
1.1.1. Ecologie des Glossines
--mm- -.m---------a----
Ici se regroupent toutes les études portant sur l'entinnmnt des
vecteurs biologiques : les zones clirratiques en Afrique, la botanique, la
géologie, etc...
L'étroite relation entre les Tsé-tsé et les conditions pluvi&i-
ques, thermiques, floristiques,
dvhumidité atmsphérique et de lumière a
. . . / . . .
- 3
été démnt&e, ainsi que lSimportance de la nature des sols au point de
vue biologique (lieux de ponte). Eh outre, la faune sauvage a été étudiée
cmm principal hôte nourricier.
En plus de ces &néralités, une étude particulière de l'écologie des
principales espèces et sous-espèces de Glossines a été faite, qui a rendu
coqte, pour? chacune d'elles, des connaissances actuelles sur lem con-
ditions optimales de survie et de développement : tempér&ure, humidité,
lumière, pluviomkrie, flore de phdilection, h6tes nourriciers ptiféren-
tiels.
1.1.2. Entoml@e
--1-1..-1'--
L'étude des Glos&es a été très exhaustive. Elle a porté SUT la
mqholopie externe, l'anatcmie interne, la physiologie et la biologie.
Mais c'est surtout la systématique qui a p&dmi&, alliant des cours
théoriques et des séances de travaux pratiques, qui ont permis de se fa-
miliariser avec les clefs utilisées pour la détermination des sous-genres,
espèces et sous-espèces. Iks séances de dissection ont en oui% permis
de s'exercer a isoler des %ypanoms chez les tsé-tsé et à déte&r
l'âge pfrysi.ologique
des femslles.
. . .
Par ailleurs, la lutte contre les Glossines a été étudiée sous tous
ses aspects :
- lutte chimique par épandage d'insecticide au sol ou par voie agrienne ;
piège de Challier- Laveissière et écrans unbibés d'insecticide ;
- lutte biologique : parasites et p&dateurs des Glossines, bactéries,
chmy+mmS, etc.
- lutte génétique : lâchers de nSles stériles, translocations chromsomi-
ques, etc.
- lutte écolo&ue : destructicm des &tes, modification de l'environne-
ment.
Les méthodes d'étude des Glossines sur le terrain ont aussi été abor-
dées : rkolte de pupes, capture d'adultes, techniques de marquage, déter-
mination de l'cwigine du repas de sang, sexe ratio.
a.. / . . .
-4
Enfin, l'élevage des Tsé-tsé en labcrratoire a fait l'objet de leçms
pmticuli&-es, et l'occasion a été donnée de visiter 1'élevaRe de 1'IEMVT.
Au COUTS de cette visite, des informtions ont été donnges sur les condi-
tions nécessaires à l'implantation de tels élevages.
S'agissant des vecteurs mécaniques des Trypanosckases africaines,
une attention particulière a été accordée aux Tabanidgs et aux Stomxes.
De f&nf3, ont été étudiées les Puces et les Punaises, et leur tile vecteur
signalé.
1.2. Trypanosoms et Trg3nosomîases en Afrique
Les chg@.tres qui c-sent ce thème ont fait l'objet d'études très
nombreuses et très approfondies, Les p%ncipmx sont relatés ci-dessous.
1.2.1.
S~témtique
- -m-m--- --
Ce chapitre fait le point des connaissances actuelles en rmtière de
syst&mtique des Trypnosoms et met un accent pwticulier sur les espèces
transmises par, piq&e qui repupent l'ensemble des Trypnosomes pathogènes
d'Afrique, lesquels se retrouvent dans les quatre sous-genres ci-dessous :
- Duttonella (= ancien grcupe de T.vivax)
- Nannomnas (= ancien grmpe de -1
- Wypnomon (= ancien poupe de T.brucei)
- Pycnmnas (= ancien groupe de T.suis).
Les caractères rmpholopiques et les particularités biologiques de ces
sous-genres ont été étudiés ainsi que les clefs de systématique qui pemt-
tent de dis-tin,~er les différentes espèces et sous-es$ces au sein de chaque
sous-.
1.2.2.
E$motiolopie
m ,-,,,-,--2-,
LE chapitre de l'é~izootiologie a covrté deux volets :
- l'épizcotiolo~ie pmmemznt dite, qui étudie l'incidence des Trypanoso-
miases sur le bétail domstique et ses variations dans le temp et dans
l'espace, en liaison avec la &partition des vecteurs, les espèces de
l .
/
. 0..
-5
Trypanosoms en p&.ence, les espèces anjmales réceptives, les varia-
tions climticpes locales.
- le second volet traite des mjthodes d'enquêtes épizootioloPngues qui
font apxzl à des matériels très élabor6s ou au contraire à des myens
rudimntaires, selon le niveau d'équipzmnt des services concern& et
selon les cr6dits alloués.
1.2.3. Pathologie -~x&génî~
-------.e-m-m
L'étude de la patholog6e et de la p&hoFrénie des Trypanosomiases
anim3les aporté sur-trois points principaux :
- des &&alit& qui décrivent les ph&om&es patholop;iques cm aux
Trypanosomiases animles, quelle qu'en soit l'espèce pathogène en cau-
se ; atteintes organiques et fonctionnelles, anatomie et histoloEie pa-
thologiques ;
- une étude particulière de la pathologie résultant de chacune des prin-
cipales espèces de Trypa.nosoms
: T.vivax, T.con,mlense, T.brucei, T.
-
equiw, T.evansi,
T.stis.
- enfin, le tmisièm pint émt des hypothèses d'explication des pro-
cessus pathologiques au cours des Trypanosomiases animles. Selon ces
hypothèses, le schém le plus probable gmur la maladie due à T.vivax
et celle due à T.complense chez les bovins et les petits Ruminants,
est q.ue ces mladies "&xiLter&ent de l'atteinte du tissu sanwin et,
secondaimm nt, de domapres pmxenant des réactions de l'wmnis~ con-
tre les àltémtions du sanp et leurs causes".
1.2.4. Diapostic
--.. --m--I
Le diamostic des Trypanosomiases anirmles fait appel à diffémn-
tes méthodes, qui peuvent se ranger dans les quatre ,mmdes séries ci-
dessous.
- le dia,ppostic clinique : il comr-te de nombreuses causes d'erreur car
les signes de suspiscion attribuables aux Tryjxmosomiases se retrouvent
souvent dans d’autres affections knémie, fièvre, amxipissemnt, etc...).
. . ./ . . .
-6
- La détection directe du Trypanosom en cause : elle comprend l'examen
de sanp 3 l'état frais entre lame et lamlle, l'examn de lames colo-
rées, l'exarren de sana après centr~ation classique ou en microtubes
à h&mtocrite, ou encore aprk lyse des hématies.
- La détection indirecte du parasite .par inoculation de sany suspect à
des animaux de laboratoire, à des Glossines
ténéml.es~xénodiagnostic,
._..
0uparcùLtureinvim.
- Lfes m&-iodes séroloniques
: elles sont no&?euses et de rendemmt varia-
ble. Elles visent toutes à déceler la présence d'anticorps ou dtanti&-
nes dans le sérum d'animuxmpects.
La deuxième partie de ce mpport
est consacrée à ces &hodes, qui ont connu un @ortant développemmt
au cours de ces dernières années.
1.2.5, Culture et conservation des wsomas
_------------^-------~~~~~~~~
-0-0---0
Les recherches sur les Trypanosomes et les Ikypanosomiases nécessi-
tent le. maintien en vie, en laboratoire, de souches parasita&%. Diffé-
mntes m%thodes ont été Utilis&es à cette fin depuis plusieurs décennies,
avec des fortunes diverses : milieux de culture diphasiques ou mnophasi-
ques, passapesssr animux de laboratoire, conservation par le froid. A
l'heure actuelle, ouke les Jlassa,,s sur animux, qui pardent encom tout
leur intérêt, la conservation dans l'azote liquide (-196O C) est celle qui
donne les meilleurs &sultats : durée de conservation pratiqueront illimi-
tée, aucune modification mmhologique ou biologique. CeDemdant, sur le
plan immmolof6que, des travaux &Cents ont fait apmBze la possibilité
d'obtenir par culture des forms sanwines de 'lkypanosomzs.
1.2.6. Chimiothéraaie et chimio~o~laxie
-----I---w
------w---w
e--3-
Des différentes leçons qui ont traité ce sujet, il ressort que le
choix d'un médican-ent trypanocide demuw toujours lié à deux critères
fondammtaux :
- la connaissance de l'espèce de Trypanosome à combattre,
- l'effet recherché.
D'une manière ,&-&ale et sauf chimiorésistance avé&e, le J36r&il
.
.
/
.
..D
- 7
sera utilisé en chimiothkmie et le Trypnidium en chimiopr&ntion chez
les bovins et les petits Ruminants. Fort oppmtunémnt, la résistance à
l'une de ces dmpues est combattue par l'autre.
Il faut enfin sirmaler que l'attention a été atttie sur des cas de
fraude en matière de trypanccides. Une vi$lance constante et une léFis-
lation s&&re sont nécessaires dans ce dmine.
En dehors de ces deux prands thèms qui ont conps6 l'essentiel du
Cours, il y a lieu de mentionner quelques autres chapitres traités :
- la Trypanotolémnce,
- la faune sauvage en Afkique,
- les Tiques et les mladies qu'elles tmnsmttent,
- des notions de cmiptabilité,
- des notions de statistique,
- la documntation biblio,waphique,
- les ommnisations k-rternationales, en particulier la F.A.O.,
- le Ministère français de la Coopération : structures,fmctionnemmt.
. . /
. .e.
- 10
Ici épalemwt, les délais d'obtention des &sultats sont b’WS :
de 1 tordre de deux semaines.
-Contre-immoélectrc&ffusion
ou élec-tmsyn~se : SU??Uneban-
de d'acétate de cellulose prkiL3blemnt lavée à l'eau <isti.llée
et equilibhe à pH 8,8 avec un tm-gmn Tkis-Glycine, on effectue,
3 des endroits définis, un d&ot lin&ire d'anti$ne et un d&x+t
en gouttes de sém. Le gortoir des bandes est placé dans une cu-
ve à électrwhorèse rccnfermnt du t-n pH 8,8. Une tension élec-
trique de 120 V est ensuite appliquée sur la cuve, l'anode coïnci-
dant avec le dégx% des sérms et la cathode avec celui de l'anti-
&ne.
NFm&lemnt, la miwation de l'anti&e come celle des sdrums
devmit se faire dans le sens de la force électmpho&tique,
c'est à dire de la cathode vers l'anode. En réalité, seul l'anti-
Fène mim dans ce sens. En effet, deux autms forces vont com-
biner leurs effets pour faire ~&KW les t'actions sériques en
sens inverse. Ces forces sont :
* le courant électroendomtique sui est un contre-courant li-
quidien allant de l'anode à la cathoce. 11 se p&W-sous
forme d'un mdient dont la chwyre vsitive s*amnuîse à rre-
sure que l'on svappmche de la cathode. On sait par ailleurs
que le pH iso-électricue de l'albumine est épal à 4 envimn, et
celui des ,pamm-plobulines à 6 ou 7. Le padient ~sitif de la
forw électrcendosrr)a3tique
parvient ra~idemnt à népativer les
ions des ~lobulines, ce qui n'est TEE le cas de l'albumine. De
la sorte, les ~lobulines vont rebrousser chemin et mimer dans
le sens anode-cathode, à la rencontre de l'antigène.
. k coumnt d'évaF)ration, qui r&xiLte de l'échauffwnt des
bandes, va du plus humide au plus sec, c'est à dire de chacune
des etimités des banc?es vers leur milieu. Cette force favo-
rise la mimation en sens opposé des antikkes et des ,~lobulines.
- 11
Il est nécessaire de bien choisir les lieux de démt de l'anti,~ène
et des s&ums, ce qui est capital pour obtenir une mipration diri&e dans
les sens ci-dessus indiqués.
L'application de l'électrosynér&se est techniquement simle et délicate :
les manipulations ne covrtent ‘pas de difficulté majeure, mais exizent
un respect ripoureux des conditions dsapplication, ~réalablerrmt définies
par des essais. En revanche, elle est relativement rapide ?uisqupon en
obtient les &süLtats en 4 à 5 heures ; en outre, elle ne requiert q.ue de
faibles quantités de Sactifs.
11.1.2. Détection indirecte des antico%s,
------------------------------
- Immnofluorescence indirecte : cette technique se covse elle
aussi de deux phases :
. le contact antipène-sérum suspect ;
. la révélation de la fixation éventuelle d'imnuno~lobulines du
sérum sur l'anti$ne par un sé??um anti-imnunoplobuline spéci-
fique conjwué à un fl~3rochrYm.
L'a&i+ne, sous forme de parasites entiers lorsque ceux-ci sont
microscopiques, de
fraCwnts ou liquides anti&niques enrobés
dans du mscle lorsqu'il s'aFit de macro-ormnisnm ou d'anti&m
solubles ou rktaboliques, est déposé sur lame puis mis en contact
avec le sérum suspect. Le complexe imnunoloFi.que ainsi obtenu en
cas de sérum msitif r?ésiste aux lava,nes et est révélé par un sé-
rum anti-inmuno~lobuline rendu fluorescent. La réaction se traduit
par une fluorescence des antigènes à la lecture des lames au mi-
croscope à rayons U.V,
Le principal reproche que lpon peut faire à cette technique est
que l'appréciation du de.6 de fluorescence est subjective et
peut varier de mani& significative d'un lecteur à un autre.
Par contre les manipulations en sont faciles et plusieurs diwi-
nes d'échantillons samuins peuvent être analysés dans la jour-
née.
. . /
. ..m
- 12
- Essai drimmmoadsorption ml? couplage enzymatique (F&I%) : le prkCipe
de cette technique est le r&me que dans l'immnofluorescenoe indirecte :
tivélation de la r6action anti&e- anticorps pm un sérum anti - imnuno-
p,laf;uluies conjucrué.
Ikux données fondarrientales
sont mises en oeuvre :
. la ?rwpriété des surfaces clastiques d'absorber des mmt6ines ;
la possibilité de marquer des qlobulkes -ar des enzymes qui zewent
l
être, à leur tour,colD~par des substrats chmmorrènes spécifiques.
Les cupules de plaques en matik plastique sont sensibiliccées avec l'an-
tipène. Après lavaTes les sérum sont dé~sés et laissés 3 r6apir pendant
30 minutes 3 la tm&ature an-biante. Une seconde série de lavaes pticèck
le dépot de sérum anti-imnuno~lobulines
marqué par l'enzyme. L'incubation
se fait dans les &ms conditions que pour les sérum et est suivie de la-
vals identiques. Puis le substrat chrmmène est déposé et laissé en &ac-
tion à la temp5mture ambiante. Tous ces réactifs sont utilisés à raisonrk
100 PR pr apiLe. Selon le substrat ewloy6, il y aum lieu ou non d'arrê-
ter la &action par adjonction de soude. La lectuzx des &sultats peut se
faire à l'oeil nu ou, de p&férence, au s~ctrophotcmètre qui les exorirre
en densités optiques.
Un avanta= kgxxkant de cette technique est qu'elle n'utilise que de-très
petites quantités de &actifs d9une part, et d'autre part ses r6süLtats
peuvent être chiffkks. En outre, la plupart de ses étapes peuvent aujour-
d'hui être effectuées par des appareils automatiques qui pallient les
impr+cisions et font ,va,mer du temps. U-I mand nombre de sérums peuvent
ainsi êixx analy&s dans la journée.
- Inhibition de l'h&mwlutination : cette technique peut se ranger parmi
les n&thodes indirectes puisque la visualisation des r&üLtats nécessite
un réactif biolo,crictue inter&diaire : des hématies. Les hémties sont sen-
sibilisées avec un anti,+ne, puis mises en contact avec le sérum suspect.
En présence d'anticorps, ceux-oi se fixent sur 19anti,$me et de ce fait
les hématies sont reliées entre-eX&spour~mr
un voile horngène. En
.
.
/
.
..D
- 13
cas de sérwn nésatif, les hémties sont libres ; elles sédimzntent et
s'ayjP1utinen-t:
au fond des cupules.
C'est une techni+e rapide et de mniemmt facile. L'obstacle à son
emploi à ,grande échelle est sans douela difficulté a ~F?$ERr les hémties
sensibilisées, dans le cacfre de lalmmtoires non équi?6 sp6cialmt.
II.1.3. titection des anti&es
,,,,,,,,,,,,,,,---i----
Pour l'instant, la détection des anti&es solubles ou r&taboli-
ques présents dans les s&ums r?e mlades fait appel à la technique EXJSA.
La sensibilisation des plaques se fait avec un anticorps connu,
q.ui est ensuite mis en contact avec le sérum suspect. L'adjonction ?u r&-
me anticorps marq&. cette fois par une enzym réalise un parfait sand-
wich en cas de &action positive ; la r&Zlation se fait avec un substrat
chrmr~,yène de l'en~ utilisée.
Cette techniqge reste encore à l'état d'essais, et les conditions
optimales d'application n'en sont pas encore pr&isées.
11.2. pripamtion et titmm de tiactifs bioloçrigms
11.2.1. P&~ation dlanti&nes
".I- ---,,,,-,,,,,,I,,,,
La JW$aration des anti&nes wie avec les parasites et
avec la techniaue sémlo~ique utilisée.
Les antirzènes figu&s utilisés en imu.mofluomscm.ze sont
soit des suspensions parasitaires dépzées telles quelles sur lares
et conservées au con&ateur, soit des parmites entiers ou des
fmpnts parasitaires enmulés &ns du muscle. Les rouleaux ainsi
obtenus sont rendus solides et résistants par cxmélation, ce q.ui.
peut une coupe en fine énaisseur au micmtome à congélation. Les
coupes sont déposées sur lames et stockées au cong&rteur.
Au nm-ent de lpemploi, les lams d'antigène sorties du con-
&ateur smt mpiderrmt séchées au ventilateur puis fides 10 mi-
nutes dans l'acétone.
..m / .*.
- 14
Quant aux antigènes utilisés en ELISA, ils résultent de l'isolment et de
la sonification de parasites. L'étape la plus délicate est la sonification
qui doit aboutiràuncülottrès réduit, un surnageant abondant, horrwène
et sans débrits mrasitaires. C'est ce surnapeant qui est utilisé. Il est
inpérieux d'éviter qu'un échauffement excessif ne d&truise les pmt6ines
antipkiques au cours de la sonification.
Une autre &thode consistwait à recueillir les antinènes prkents
dans les sérums de mlades en ~r6cipitar-k les ,globulines pw le sulfate
d'km-onium et en recueillant le sumweant renfermant les anti$nes.
11.2.2. e!$aration de qlobulines
_--------------------
La préparation de plobulines destinées aux &actions SércloPioues
covrte trois étapes : l'isolement, le dosage des protéines, la conjwai-
son avec un fluorochro~ ou une enzyme.
a) Isolerrmt
: les immmo~lobulines comme les anti- immmqlobulines sont le
tisultat de la réaction classique de l'hôte face3 une substance &ran&e
intmduite dans son or~mnism. Dans le cas des inmuno~lobulines, l'injection
de Damsites, par exerrple, conduit à la formation d'anticorps spécifioues
Trésents dans le sérum de l'animal inoculé. Les anti-immuno~lobulines,
elles,
résultent de l'injection r$$tée d'imnunoP-lobulines à un animal d'une espèce
diffknte de celle cui les a fournies. Le Lqin, le Rat et le Houton sont
des animux de choix pouf l'obtention de sérum anti-imnuno~lobulines.
Les
solutions ~lobuliniwes, accmpamées pwfois d'un adjuvant de l'irmunité,
mrmettent d'obtenir en 4 à 5 semines suffisamnent d'anticorps sérioues,
ou'il faudra isoler.
L'isolement se fait par pr&ipitati~n de la f73=kction ~lobullkkue avec
du sulfate d'Ammnium en solution satur6e ou en cristaux r6duits en noudre
t&s fine. Après centrifugation à mande vitesse et à basse température, le
culot est remis en susTension dans Au sérum physiolopique et dialysé r>our
éliminer les r&idus de sulfate d'Ammnium. La dialyse est suivie d'une
redissolution dans du tarrpm pour obtenir à nouveau le volume initial de
sérum.
0.. / .
.
.
- 15
b) Dosace de prot6ines
: la dgtermination du taux de prot6ines des Flobu-
lines isolées et une étape tr&s irq-rtante, puiscrue les quantités de
fluoro&rome ou d'enzyme utilisées dans la conjwaison sont fonction de ce
taux.
Plusieurs procédés peuvent être utilisés. A l'heure actuelle, c'est la
&thode de Bradford qui serrble donner les meilleurs rkiltats, en raison de
sa fialisation très facile n&s surtout de sa haute sensibilité. Elle con-
siste à mélawer une solution à base de bleu de Coomssie avec, d'une part,
plusieurs dilutions des slobulines à doser, et d'autre part, les mZm% dilu-
tions d'une solution protéinique de titre connu. La liaison des protéines
avec le colorant donne une coloration bleue, dont l'intensité est prono??-
tionnelle à la concentration prwtéinieue de chaque dilution. Les densités
opticrues obtenues ?i la lecture au spectro~hotomkre mttent d'établir une
courbe d'étatiace et, par comparaison, de calculer la teneur en FrotGines
des ,qlobulines $ doser.
c) Conjwaison : les r;lobulines ainsi isolées et dosées peuvent être conju-
puées à diverses substances selon l'usage en vue.
Pour les r5actions d'imrraulofluorescence, le fluorochro~ le plus uti-
lisé est l'iso-thiocyanate de Eluoresc&ine. Je n'ai rus eu l'occasion de
suivre cette conjugaison au C.H.R.U., les conjuw& utilisés ici étant
achetés dans le comnerce, mis Xe service de Parasitolopie de Hann la pra-
tique assez souvent.
Par contre, j'ai pris part au mquage enzymatique de ~lobulin~destinées
aux énreuves ELSA. Les méthodes de mquame sont variables et utilisent -.--
tantôt le plutaraldéhyde, tantôt le Sodium mkapériodate. Cette dernik
variante est de dalisation facile et rapide, elle donne en plus de tins
Iîésultats.
11.2.3. Pkparation de substrats chro'ro&nes
----------------------l------=----,
Absente dans les autres techni+es, 1'6tape du détit d'un substrat
chrom&ne de l'enzyme fait partie inté~te de l'épreuve ETJSA. Pour r&
véler la Péroxydase par exemple, plusieurs substrats peuvent être utilisés :
.,. /
..,
- 16
ortho-tolikine, ortho-phgnylène-diamine,
acide-5-amino-salycilique,
ortho-
dianisidine. P&is c'est l'ortho-tolidine qui semble actuellement l'enpsor-
ter sur les autres, en raison de la r&uction considkable du teps de
rkction qu'elle P=ure (de l'ordre de 4 heures) et surtout parce que les
concentrations ~rotéiniques des antisènes sont, lorsqu'on utilise ce subs-
trat, de loin inférieures à celles nécessaires avec les autres.
De FrGparation extemwxxnée, l'ortho-tolidine est d'eboti dissoute
dans dudtithylfom'de (bMf') à raison de 21,2 rnF r>our 1 mil. de TJMF, La
solution est ensuite nortée à 100 ml par adjonction d'un t-031 acéto-a&-
tique de pH 3,7. Au moment de l'er@oi, la pr+aration est complétée nar
50 UR d'eau ov,$née à 30 volumes.
11.2.4. Titrage de fiactifs biologiques_
---a- --.--------------WI -
L'obtention d'un nouveau lot d'antigène, de globulines ou de conju-
gué et nGme l'acquisition de plaques d'une marque différente de celle utili-
sée habituellement doivent toujours conduire à des essais rigoureux et va-
riés afin de définir de nouvelles conditions de travail ou le cas échéant, de
c0nfirx-w les anciennes. Dans tous les cas, seront retenues les combinaisons
donnant à laiDis et de mière repxwductible, les plus fortes réactions avez
les témnins positifs, les réactions les plus faibles avec les t&ins néga-
tifs, des réactions pratiq.uement nulles avec les témkns sans sérum 9%lanks",
et qui utilisent en m%e temps les plus faibles quantités de réactifs.
A l'issue de ce stage de 6 semaines à Grenoble, je me suis rendu à la
Faculté de Médecine de Mrseille pour y suivre l'application de certaines
de ces techniques à la Trypanosomiase humaine africaine. Les principes géné-
raux et les modalités de réalisation étant à peu près identiques à ceux en
cours à Grenoble, je me limiterai à relater la préparation de lran-tigène
trypanosomien utilisé en ELISA.
. . /
. .*a
- 17
La souche de T.brucei brucei utilisée à Marseille est conservée au
congélateur à -7OOC. Une petite quantité en est inoculée à des souris.
Lorsque la parasitémie est suffisamment riche, une ponction cardiaque est
faite, et le sang parasité es-t filtre sur colonne de DEAE-cellulose selon
la kLhode de LANHAP?. L'éluat renfc-wn-t les Trypanosomes est concen-tr-6
par cen-lP5 zgation puis passé à la sonification. Le surnageant repr&ente
l'antigèny, qui est titré par une méthode colori.m&iq,ue ou par des essais
sur plaques ELISA
De re-tOL?? a lQxvT, J"ai consacré la dernière semaine du mois de
février à des séances de travaux pratiques d'titcmologie sous la conduite
du docteur J. ITARD, chef du service d9Entomologie. P+i, j'ai pu procé-
der à de nombreuses dissections de Glossines, m'exerçant notamment à isoler
les appareils digestif, reproducteur et nerveux. La détermination des sous-
genres à l'examen des cerques, celle des espèces et sous-espèces par les pa-
ram?Pes,
la definition de l'age physiologique des femelles à la configu-
ration des ovarioles ont fait l'objet d'une insis?-.nce particuli&e au cours
de ces travaux pratiques.
e.. / e..
- 18
CONCLUSION
Du cours de 1'IEMVT, on retiendra essentiellement :
- la qualité exceptionnelle des enseignements prodigués par un corps pro-
fessoral constitu& par des sotités du monde scientifique travaillant sur
les Trypanosomiases. Cela a permis aux étudiants d'acquérir de nombreuses
connaissances et surtout d'avoir une conscience nouvelle de l'intérêt à
accorder à ces maladies, qui demeurent l'un des plus importants facteurs
1imiWnts du développement du cheptel africain.
- qu'une coordination et une rationnalisation des progrms de lutte
anti-vectorielle est indispensable pour leur assurer un & de chan-
ces de succès.
- que l'organisation pratique du cours serait sans reproche si la saison
choisie était plus clémente que celle d'hiver, q-ui contraint les parti-
cipants à consacrer une bonne partie de leur allocation à l'achat de vê-
tements d'hiver, au détriment dsouvrages scientifiqus. En outre, il se-
rait utile que le cours comporte un chapitre exhaustif sur lphématologie,
étant donné la prrépondérance des atteintes sanguines et leurs r@ercus-
sions dans les Trypanosomiases animales.
S'agissant du stage de séro-biologie, il y a lieu d'indiquer d'em-
blée que le service de Parasitologie du Centre hospitalier Agiona et uni-
versitaire de Grenoble est arrivé à une maîtrise remarquable de la plupart
des techniques décrites ci-dessus. Celles-ci y sont d'utilisation courante
tout en faisant l'objet de recherches suivies pour en améliorer et Pr&iser
les conditions optimales d'application. Une mention particulière revient aux
essais actuelle~nt en cours, qui étudient la possibilité d'utiliser en ELISA
des plaques sensibilisées à l'avance et conservées plus ou moins longtemps
aucangélateur. Le succès de ces essais pernusttrait en effet de mer du
temps et, surtout, d'analyser un grand nombre de sérums avec la même p¶-
tion antigénique, ce qui donnerait davantage de fiabilité aux rkultats.
Une seconde roque ri?side dans 19importance à accorder au pH des tam-
pons utilisés dans les différentes techniques. Une vérification rGgulière et
- 19
systématique stimpose à ce sujet car les conditions optimales de travail
sont toujours le fruit d'essais qui auront permis de d&erminer avec pr&i-
sb l'ensemble des paramètres. Parmi ces paramètres, la dilution optimale
des réactifs occupe une bonne place. Et les dilutions sont toujours faites
à l'aide de t-s à pH défini. Le meilleur contile en la matière serait
peut être de ne ptiparer tout au plus que les quantités de t;urg-on n&essai-
res pour les travaux de la semaine, pour éviter les altérations dues à un
sto&ageprolon$.
Enfin, le survol des techniques sémlogiques ci-dessus décrites con-
duit a roquer leur grande diversité. Et l'on est tenté, à premi&x! vue,
d'en conclure que leur application simüLtanée ne se justifie pas, en rai-
son notamment de l'identité du principe qui est, dans tous les cas, la
réalisation d'une &action antigène-anticorps. En r&lité, il s'agit de
techniques cowl6mentaires, dont les un~pallient les inconvénients des
autres : certakes techniques exigent des d&ais assez longs alors que
d'autres peuvent être &alisées en quelques heures ; certaines requièrent
un matériel de wde prkision, d'autres font appel à un matériel quasi-
rudimentaire ; certaines sont quantitatives, d'autres plutôt qualitatives.
Il s'agira donc à chaque fois, dgop&er une orientation des échantillons à
analyser, en fonction de critères tels que l'urgence de l'analyse, la nature
de la parasitose recherchée, l'objectif du protocole de recherche, etc...
En outre, il arrive bien souvent que la combinaison de plusieurs techniques
et la confrontation de leurs r&ultats respectifs soient indispensables
pourconfkrwou infitxwunr&ultatdouteux,
C'est l'évidence : la combinaison de techniques aussi dissemblables
dans leur réalisation n'est possible qu'avec une organisation rxtionnelle
des activités et une séparation des matériels. Cette séparation, sans être
systématique, devrait être très judicieuse et en tout cas permettre d'évi-
ter les fâcheuses contaminations r&ultxrt des interf&ences. Une étroite
collaboration entre les agents travaillant dans les différentes techniques
fawriserait de telles mesures, lesquelles seraient consolidées par une
discipline unanime dans l'usage de la verrerie collective.
- 20
Au service de Parasitolo~ie du C.H.R.U. de Grenoble, l'ensemble de ces
conditions sont à prkent &Unies. Et il n'y a pas de doute que, dms les
années à venir, d'importants propp?+s y seront accomplis dans les domines
du diagnostic sérologique et des recherches immnolo~iques destin6es 3
mieux c-m& les m&nismes des maladies parasitaires.
A Dakar, j'avais eu l'occasion de pratiquer plusieurs techniques
séro-Wolor)iques
avant ce stage. Cependant l'ex$rience acquise à Gre-
noble pem&Wa de les affirm tout en les adaptant 3 nos mens.
- 21
REMERCIEMENTS
- M. le docteur J. GRWEL, chef de la Division de l'Enseignement et des Etu-
des pédagogiques de 1'IEMVT a bien voulu assurer toute 190rpnisation de
ce stage, et a déployé des efforts inlassables pour en assurer le succès.
Je tiens à l'en remercier chaleureusement.
- M. le docteur J. ITARD, chef du service dsEntonûlcxie de 1'IEMVT et direc-
teur du Cours sur les Trypanosomiases, amganisé remarquablement le cours
et, tout au long, a fait preuve d'une activit6 et d'une disponibilité cons-
tantes. Je lui pr&ente mes sincères remerciemnts.
- Le concours anthousiaste du personnel du secrétariat de la Division de 1%~
se&nement n'a ps fait défaut, en particulier de tis MILOT et GANDIOLE.
Qu'elles veuillent accepter mes remerciements.
- M. le Professeur P. AMBROISE-THOMAS, chef du Service de Parasitoloxie du
Centre hospitalier &gi~l et universitaire de Grenoble, a bien voulu m'ac-
cueillir dans son service, et tout au long de mon stage, m'a nrodigué de
judicieux conseils, m'a manifesté une attention constante et m'a offert des
facili.6 de toutes sortes. Qu'il veuille bien trouver ici llexpr+assion de
m3 reconnaissance.
- A Nadame le docteur GOULLIER, assistante au service de Parasitologie du
C.H.R.U. de Grenoble, je présente mes vifs remxciements pxr lfint&&
quotidien manifesté à ce stage.
- Mes amitiés et IIW remxciements vont kzalement à tout le nersonnel du ser-
vice de Parasitolopie du C.H.R.U. de Grenoble, qui m'a pxidé tous les jours
et m'a fait découwir mille choses int&essantes.
- J'associe à ces remerciements M. le Professeur OUILICI qui a bien voulu
m'acceuillir au Laboratoire de Parasitologie de la Faculté de Médecine de
meille, MM, les docteurs DUMONT et FAUGERE ainsi que l'ensemble du per-
sonnel de ce laboratoire pour les efforts déployés en ma faveur au cours
de mx séjour à Marseille.
. . /. .e.
-
. . .
-
7
- 22
- Enfin, je dis toute m reconnaissance et tout mn respect au CO~~S pro-
fessoral du Cours sur les Trypanoscmiases, mur la qualité des enseigne-
t
mmts et la chaleur qui en a marqu6 la conmnication.