INSTITUT SENEGALAIS DE RECHERCHES AGRICOLES...
INSTITUT SENEGALAIS DE RECHERCHES
AGRICOLES (1.S.R.A.)
LABORATOIRE NATIONAL DE L'ELEVAGE
ET DE RECHERCHES VETERINAIRES
DAKAR-HANN
%
./ ,! ,, r: (
d”’ 1 .
NOTE TECHNIQUE
PREPAEUTION D'IMMUI%ERUMS DE REFEREhCE
ANTI-MYCOPLASMA
Par M. 'KONTE
REF. N* 24/MICROBIO
EIARS 1987
NOTE TECHNIQUE
PREPARATION D'IMMUNSERUMS DE REFERENCE
ANTI-MYCOPLASMA
Par M. KONTE
L'identification des souches de Mycoplasmes n'est que partiellement réa-
lisée au L.N.E.R.V.. En effet, seul l'isolement y est effectué, la diagnose
d'espèce étant faite par le laboratoire de Pathologie infectieuse dc l'I.E.M.V.T.
à Maisons-Alfort.
Dans l'optique de la réalisation complète de l'identification de ces germes
au Sénégal, il a été acquis des souches de réféirence qui vont permettre la pro,-
duction locale d'irmnunsérums spécifiques,
1 - SOUCHES DE REFERENCE CONCERNEES
a> - Première série
---.,.-.m.w.s---.--
- Mycoplasma ovipneumoniae (rhf. 86 118 MNP/23-10-1986, IEMVT)
- Mycoplasma sp. F. 38 (22 - G7 - 1786, IEMVT)
- Mycoplasma conjunctivae (réf. HRC '531 - 7,06.1984, IEXVT)
- Mycoplasma bovigenitalium (réf. Pg II - 24.09,1985, IEMVT)
b: - Deuxième série
--w-1--------
Mycoplasma bovis, H, bovirhinis, M. bycoides subsp. mycoides, M. my-
coidewubsp. mycoides SC 10114, M. mycoides subsp. mycoides LC Y-Coat, M. my-
coides subsp. capri Pg 3, Pl. capricolum C. Kid, M. sp, Pg 50....
. . . / l . .
-2-
I I - ANIMAUX PRODUCTEURS
- Moutons : production d6 skrums anti-F. 38 et anti-X. ovipneumoniae
- Lapins
: production anti-(F, 38, M. ovipneumoniae, M. conjunctivce et
M. bovigenitalium),
I I I - PROTOCOLES D’IMMUNISATION
a> - Protocole A (Moutons et lapins) (2)
- - - - - - I - - - - - - w -
- Une injection initiale sous-cutanee d’un mélange à parties égales
d’adjuvant de Freund (Bacto-Adjuvant Difco:} et de suspension de Mycoplasmes lavés
OQ tampon physiologique (opacité du tube no 10 ou 20 de Brown), sous le volume de
5 ml chez le mouton et de 2 ml chez le lapin.
- Apris un délai de quatre semaines, une série d’injections intrer
veineuses de la même suspension de Mycoplasmes ajustée au tube no 2,5 de Brown,
au rythme dc deux injections par semaine (,2 ml chez le mouton et 1 ml chez le
lapin) o
Le noubre d’injections nécessaires est au minimum de 5. ED cas d’insuffi-
sance du titre d’anticorps au bout de 7 à 8 injections, celles-ci sont interrom-
pues et, après un nouveau délai de un à deux mois, une nouvelle serie d’intra-
veineuses identiques et recommencée, avec ‘un rtssultat satisfaisant le plus souvent O
Les sérums ainsi obtenus conviennent très bien à l’immunofluorescence ;
ils sont très agglutinants et prkipitants.
Toutefois, ils sont rarement satisfaisants pour les tests d’inhibition de
croissance et de métabolisme, très employés pour l’identification des esp&ces de
mycoplasmes ; aussi a-t-on intérêt 9 si l’on veut que les immunsérums soient plus
adaptés à ces derniers’ tests, à’adopter la méthode définie dans le protocole B.
.
.
. / .e.
b) - -----------
Protocole B (pour lapins) (1)
Avec un mélange à parties égales d’adjuvant complet de Freund et d’une
suspension concentrée de mycoplasmes (tube no 20 à 40 de Brown), on immunise
chaque lapin par une seule intervention qui consiste en plusieurs injections :
- 0,2 ml dans chacun des coussinets plantaires arrières (total = 0,4 ml),
- 0,s ml dans les muscles des épaules, en quatre sites (total = 2 ml par
la voie intramusculaire),
- 0,2 ml dans la peau du dos 9 en quatre sites (total =z 0,8 ml par la voie
intradermique).
Trois semaines après, une première saignée permet de voir si le sérum est
satisfaisant
; dans la négative, on réinjecte 4 x 0,5 ml par 13 voie intra-
musculaire, On saigne l‘animal trois semaines aprés.
Toutefois, les suspensions lavées de mycoplasmes n’induisent pas toujours
un haut titre d’anticorps inhibant la croissance, aussi faut-il quelquefois
terminer cette immunisation par une série d’injections intraveineuses avec des
mycoplasmes non lavés (cultures en milieu à fraction sérique Bifco à 1 p 100,
Zigée de 24 heures), à raison de deux inoculations par semaine sous un volume de
0,s à 1 ml. Ce protocole ne cesse que lorsqu’un titre satisfaisant d’anticorps
inhibant la croissance est obtenu (3).
N.B.
: Il est recommandé d’utili.ser pour La préparation du milieu qui servira à
la rkolte de l’antigène un sérum de la même espèce que celle de l’animal qui four-
nira l’immunsérum (système homologue >* L’idéal est le système autologue : le
sérum pour le milieueest donné par l’animal m&ne qui produire le sérum (2).
En conséquence, les animaux producteurs seront saignés avant toute immuni-
sation, et le sérum ajouté aux milieux de cultuoe des souches de référence. Ce
sérum sera préparé de la façon suivante (2) :
1”) -- premier procédé (méthode traditionnelle) o pnnction à la jugulaire,
récolte du sang en pots à saignée., coagulation, exsudation du sérum et récolte
. . . / l . .
-4-
par décantation après quelques jours de séjour à la chambre froide.
Ce type de sérum est souvent plus ou moins hémolysé, surtout si on a dû
transporter les bocaux ou décoller manuellement les caillots.
2O)‘ - Deuxi&me procedé
Il permet d’obtenir un sérum qui, en principe, n’est jamais rouge,
A chaque litre de sang reweilli, on ajoute immédiatement 10 ml d’oxalate
de potassium à 10 p 100 et on agite vigoureusement ; il est préférable de recueil-
lir le sang dans un récipient dont on connaît le volume et dans &uel on a déj8
introduit la quantité d’oxalate nécessaire.
Le plasma est ensuite recueilli par centrifugation ou plus simplement par
décantation apres avoir laissé les hématies sédimenter durant une nuit au réfri-
gérat eur .
Chaque litre de plasma reçoit alors 30 ml d’une solution à 4 p 100 de
chlorure de calcium anhydre ; on agite vigoureusement et on laisse coaguler.
Le sérum exsude alors d’un caillot blanc et on le recueille par simple
décantation.
La stérilisation se fait ensuite par les méthodes habituelles de filtration
et le titrage par la méthode de fifation du complément.
B I B L I O G R A P H I E
1 - AL-AUBAIDI (J.M.) et FABRICANT (J.) - Corne11 Veterinarian, 1971, fi : 490-518
2 -ANONYME- Mycoplesmes et mycoplasmoses des Ruminants - Documents techniques -
I.E.M.V.T./C.I.R.A,D. - Juin 1985.
3 - TULLY et coll. - Journal of General Microbiology, 1974, 85 ; 102-120
AGRICOLES (1.S.R.A.)
LABORATOIRE NATIONAL DE L'ELEVAGE
ET DE RECHERCHES VETERINAIRES
DAKAR-HANN
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./ ,! ,, r: (
d”’ 1 .
NOTE TECHNIQUE
PREPAEUTION D'IMMUI%ERUMS DE REFEREhCE
ANTI-MYCOPLASMA
Par M. 'KONTE
REF. N* 24/MICROBIO
EIARS 1987
NOTE TECHNIQUE
PREPARATION D'IMMUNSERUMS DE REFERENCE
ANTI-MYCOPLASMA
Par M. KONTE
L'identification des souches de Mycoplasmes n'est que partiellement réa-
lisée au L.N.E.R.V.. En effet, seul l'isolement y est effectué, la diagnose
d'espèce étant faite par le laboratoire de Pathologie infectieuse dc l'I.E.M.V.T.
à Maisons-Alfort.
Dans l'optique de la réalisation complète de l'identification de ces germes
au Sénégal, il a été acquis des souches de réféirence qui vont permettre la pro,-
duction locale d'irmnunsérums spécifiques,
1 - SOUCHES DE REFERENCE CONCERNEES
a> - Première série
---.,.-.m.w.s---.--
- Mycoplasma ovipneumoniae (rhf. 86 118 MNP/23-10-1986, IEMVT)
- Mycoplasma sp. F. 38 (22 - G7 - 1786, IEMVT)
- Mycoplasma conjunctivae (réf. HRC '531 - 7,06.1984, IEXVT)
- Mycoplasma bovigenitalium (réf. Pg II - 24.09,1985, IEMVT)
b: - Deuxième série
--w-1--------
Mycoplasma bovis, H, bovirhinis, M. bycoides subsp. mycoides, M. my-
coidewubsp. mycoides SC 10114, M. mycoides subsp. mycoides LC Y-Coat, M. my-
coides subsp. capri Pg 3, Pl. capricolum C. Kid, M. sp, Pg 50....
. . . / l . .
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I I - ANIMAUX PRODUCTEURS
- Moutons : production d6 skrums anti-F. 38 et anti-X. ovipneumoniae
- Lapins
: production anti-(F, 38, M. ovipneumoniae, M. conjunctivce et
M. bovigenitalium),
I I I - PROTOCOLES D’IMMUNISATION
a> - Protocole A (Moutons et lapins) (2)
- - - - - - I - - - - - - w -
- Une injection initiale sous-cutanee d’un mélange à parties égales
d’adjuvant de Freund (Bacto-Adjuvant Difco:} et de suspension de Mycoplasmes lavés
OQ tampon physiologique (opacité du tube no 10 ou 20 de Brown), sous le volume de
5 ml chez le mouton et de 2 ml chez le lapin.
- Apris un délai de quatre semaines, une série d’injections intrer
veineuses de la même suspension de Mycoplasmes ajustée au tube no 2,5 de Brown,
au rythme dc deux injections par semaine (,2 ml chez le mouton et 1 ml chez le
lapin) o
Le noubre d’injections nécessaires est au minimum de 5. ED cas d’insuffi-
sance du titre d’anticorps au bout de 7 à 8 injections, celles-ci sont interrom-
pues et, après un nouveau délai de un à deux mois, une nouvelle serie d’intra-
veineuses identiques et recommencée, avec ‘un rtssultat satisfaisant le plus souvent O
Les sérums ainsi obtenus conviennent très bien à l’immunofluorescence ;
ils sont très agglutinants et prkipitants.
Toutefois, ils sont rarement satisfaisants pour les tests d’inhibition de
croissance et de métabolisme, très employés pour l’identification des esp&ces de
mycoplasmes ; aussi a-t-on intérêt 9 si l’on veut que les immunsérums soient plus
adaptés à ces derniers’ tests, à’adopter la méthode définie dans le protocole B.
.
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. / .e.
b) - -----------
Protocole B (pour lapins) (1)
Avec un mélange à parties égales d’adjuvant complet de Freund et d’une
suspension concentrée de mycoplasmes (tube no 20 à 40 de Brown), on immunise
chaque lapin par une seule intervention qui consiste en plusieurs injections :
- 0,2 ml dans chacun des coussinets plantaires arrières (total = 0,4 ml),
- 0,s ml dans les muscles des épaules, en quatre sites (total = 2 ml par
la voie intramusculaire),
- 0,2 ml dans la peau du dos 9 en quatre sites (total =z 0,8 ml par la voie
intradermique).
Trois semaines après, une première saignée permet de voir si le sérum est
satisfaisant
; dans la négative, on réinjecte 4 x 0,5 ml par 13 voie intra-
musculaire, On saigne l‘animal trois semaines aprés.
Toutefois, les suspensions lavées de mycoplasmes n’induisent pas toujours
un haut titre d’anticorps inhibant la croissance, aussi faut-il quelquefois
terminer cette immunisation par une série d’injections intraveineuses avec des
mycoplasmes non lavés (cultures en milieu à fraction sérique Bifco à 1 p 100,
Zigée de 24 heures), à raison de deux inoculations par semaine sous un volume de
0,s à 1 ml. Ce protocole ne cesse que lorsqu’un titre satisfaisant d’anticorps
inhibant la croissance est obtenu (3).
N.B.
: Il est recommandé d’utili.ser pour La préparation du milieu qui servira à
la rkolte de l’antigène un sérum de la même espèce que celle de l’animal qui four-
nira l’immunsérum (système homologue >* L’idéal est le système autologue : le
sérum pour le milieueest donné par l’animal m&ne qui produire le sérum (2).
En conséquence, les animaux producteurs seront saignés avant toute immuni-
sation, et le sérum ajouté aux milieux de cultuoe des souches de référence. Ce
sérum sera préparé de la façon suivante (2) :
1”) -- premier procédé (méthode traditionnelle) o pnnction à la jugulaire,
récolte du sang en pots à saignée., coagulation, exsudation du sérum et récolte
. . . / l . .
-4-
par décantation après quelques jours de séjour à la chambre froide.
Ce type de sérum est souvent plus ou moins hémolysé, surtout si on a dû
transporter les bocaux ou décoller manuellement les caillots.
2O)‘ - Deuxi&me procedé
Il permet d’obtenir un sérum qui, en principe, n’est jamais rouge,
A chaque litre de sang reweilli, on ajoute immédiatement 10 ml d’oxalate
de potassium à 10 p 100 et on agite vigoureusement ; il est préférable de recueil-
lir le sang dans un récipient dont on connaît le volume et dans &uel on a déj8
introduit la quantité d’oxalate nécessaire.
Le plasma est ensuite recueilli par centrifugation ou plus simplement par
décantation apres avoir laissé les hématies sédimenter durant une nuit au réfri-
gérat eur .
Chaque litre de plasma reçoit alors 30 ml d’une solution à 4 p 100 de
chlorure de calcium anhydre ; on agite vigoureusement et on laisse coaguler.
Le sérum exsude alors d’un caillot blanc et on le recueille par simple
décantation.
La stérilisation se fait ensuite par les méthodes habituelles de filtration
et le titrage par la méthode de fifation du complément.
B I B L I O G R A P H I E
1 - AL-AUBAIDI (J.M.) et FABRICANT (J.) - Corne11 Veterinarian, 1971, fi : 490-518
2 -ANONYME- Mycoplesmes et mycoplasmoses des Ruminants - Documents techniques -
I.E.M.V.T./C.I.R.A,D. - Juin 1985.
3 - TULLY et coll. - Journal of General Microbiology, 1974, 85 ; 102-120