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MfNISTERE D2 L'ENSEIGNEMENT SUPERIEUR
INSTITUT SENEGALAIS DE RECHERCHES
ET DE LA RECHERCHE SCIENTIFTQUE
AGRICOLES (I.S.R.AJ
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SECIIEIIARIPITP'ETATALARECHERME
LJ%KX?A'IXXlXE NATIONALDE LsELE.XAGE
SCIENTIFIQUEET TECHNIQUE
ET DE RECHERCHES VETERINAIRES
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DIAGNOSTIC DE LA TRYPANOSOMIASE ANIMALE
DONNEES RECENTES
Par S.M. KXJRE(")
REF. No lOO/PARASITO.
AOUT 1981
DIAGNOSTIC DE LA TRYPANOSOMIASE ANIMALE
DONNEES RECENTES
Par S.M. TOURE?
R E S U M E
Le pr&ent &icle est une mise à jour d'une synthèse parue en 1977 (38).
Les techniques de diagnostic de la Trypanosomiase ont connu des progrès ces
dernières années : g&-&al.isation de la centrifugation microhémtocrite suivie
d'examn de l!interphase sur fond noir ; très nombreuses applications de
l'épreuve micro ELISA ; enfin grande sensibilité de l'irmunopémxydase indirecte
qui peut remplacer l'imnunofluorescence ; importance croissante du test
d'infectivi-té du sang incubé.
INTRODUCTION
Les techniques de diagnostic des Trypanosomiases, tant hw-aines qu'anim-
les, ont fait l*objet de plusieurs notes au cours de ces dernières années (10)
('27) (38) (39) (30). Ces notes, accompagnées d'une bibliographie abondante,
sont des revues assez exhaustives des techniques de diagnostic des Trypanoso-
miases et, pour cette raison, nous nous limiterons, dans le ptisent exposé,
à des faits nouveaux ou à des comntaires inédits. Dans cette mise à jour,
nous suivrons pour l'essentiel le nx%z plan que celui adopté par ailleurs (38)
(39). Cette revue étant complémntaire de celles déjà publiées, plusieurs
techniques seront- citées successivement et seuls des faits nouveaux semnt
rapportés après ces citations. Le diagnostic clinique est volontairerrmt0ti.
1- DETECTIONDIPXC'IE CHEZ L'HOTE DE PARASITES F'IGURES
l/l - Observation microscopique immédiate
1/2 - Observation après concentration
1/2/1 - Centrifugation classique
1/2/2 - Centrifugaticm dans des tubes à micmhémtocrite
1/2/3 - Centrifugation d'éluat recueilli après filtration à travers
une colonne de DEAE - cellulose
1/2/4 - Centrifugation après lyse de globules muges.
(*> Institut sé&galais de Recherches agricoles - Laboratoire national de
1'Elevage et de Recherches &térinaires - B.P. 2057 - DAKAR-HANN (Sénégal),
-2
1.3. Observation de lames colorées
Les lecms, au microscope, de frottis classiques et de gouttes
épaisses, ou de sang frais entre lame et lamlle, sont toujours couram-
ment pratiquées mis ces procédés sont nettemmt inférieurs à ceux qui
permettent de concentrer les Trypanosomes.
J. CARRIE et D. TIMSIT (6) rapportent une &thode simplifiée de con-
centration des Trypanosomes qui consiste à laisser sédimenter le sang, re-
cueilli sur anticoagulant, et à centrifuger le plasma : les r&xiLtats ob-
tenus sont, semble-t-il, sup&ieurs à la triple centrifugation.
Cependant les techniques qui connaissent actuellement la plus large
utilisation sont celles de Woo et l'examen sur fond noir dsune pr$ara-
tion d'interphase de centrifugation micmhémtocrite. Elles sont même as-
sez fréquenment appliq&es sur le terrain. G. DUVALLET et al, 1979 (91,
ont pratiqué la technique de Woo dans un%yer de Trypanosomiase humine à
Vavoua en côte d'ivoire, en procédant à la lecture microscopique à l'aide
d'un objectif 2 imersion (G x 50). Ils ont pu dépister par cette kthode
18 sujets parasitémiques mis sans signes cliniques et qui n'auraient pu
être dkelés que par la sérologie ou par des techniques de concentration
de valeur au moins égale à celle de kbo.
La lecture sur fond noir de pr@amtion entre l.amz et lamlle d'inter-
phase de centrifugation microhémtocrite a été largemnt décrite quant aux
procédés et aux avantages (M. MURRAY et al, 1977 ; J. PARIS, M. MURRAY et
R. AGUFE, 1980, non publié (28) (30). Il n'est pas nécessake de revenir
sur cette technique, sinon pom relever des remarques, celles de L. GRIF'F'IN,
1978 (17) qui eStime que cette &I%ode est difficilement applicable sur le
terrain et, pour cette raison, a une moindre valeur pratique. Nous ne sau-
rions partager cet avis, pour avoir pratiqué ce procédé de diagnostic, en
milieu éleveur, concumement avec d'autres méthodes UUJRE, 1981) (40).
Ses avantages &ident dans lafàcilité, la pkision et surtout la possi-
bilité d'évaluer l'hémtocrite qui est 10 meilleur indice de l'état de
santé vis à vis de la Trypanosomiase. Enfin, lorsqu'elle est associée à
d'autres
investigations, la méthcde permet de mieux cmprendre les faits
pathologiques dans un cheptel. Ainsi, au cours de plusieurs tournées, des
prélèvements faits dans les diverses zones écologiques du Sénégal, en
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0..
-3
utilisant plusieurs techniques sur un r&me animal (tittis et gouttes
épaisses, centrifugation micmh&ratocrite + examen sur fond noir (CWEFN),
des renseignemnts précis sont obtenus sur plusieurs parasites : Trypano-
mm congolense, T.vivax. Theileria mxtans, Ekbesia bigemina, Anaplasm
sp., les micmfilaires de Setaria labiatopapillosa.
L'idéal est de pratiquer plusieurs techniques et de faire une synthè-
se globale des données. Mais si l'objectif visé est d'appliquer des trai-
tements trypanocides adéquats, on peut se contenter des seuls examens par
WEFN, car on juge d'après l'hémtocrite et la parasitémie. La &thode
microhématocrite peut donc valablement être appliquée sur le terrain (C%RI@,
1979) (16). Les critiques avancées n'enlèvent rien a la valeur de la mé-
thode CWEFN et c'est avec juste raison que MURRAY et al, 1979 (29) en re-
tracent les avantages. On lira avec profit les critères d'évaluation qui
ressortent de plusieurs études comparatives faisant intervenir des rr&ho-
des différentes dans divers types d'infections dues à T.vivax, T.congolen-
se ou T.brucei (31).
-
La concentration de Trypanosomes par filtration à travers une colonne
de DEAF, - cellulose (selon Lariham) est restéelongtemps réservée aux labo-
ratoires bien équipés. Récent, LUMSDEN et al (21) (22) (23) ont pmpo-
sé une miniaturisation du matériel requis et une application sur le terrain
dans le dépistage de la Maladie du somil. Les r&ultats obtenus en 1980
indiquent que cette adaptation technologique peut arkliorer le diagnostic
de routine de la Trypanosomiase humaine africaine. Sans doute serait-il
souhaitable d'appliquer aussi la technique dans les Txypanoscmiases ani-
mles à des fins derecher&e.
II - DETECTION INDIRECTE DE PARASITES FIGURES
11.1. Inoculation ZI des anim.~~ d'expérience
11.2. Culture en vitro
11.3. Xéncdiagnostic
Peu de faits nouveaux sont à signaler dans cette partie, tout au
mins en ce qui concerne les épreuves pouvant avoir une valeur pmtique
de diamstic des 'Ikypanosomiases animles. Mention doit être faite ce-
. . /. . . .
-4
~ndant de difficult&a rencon&es pur caractériser avec certitude des
semd&mes de T.brucei et T.rhodesiense. Il a été démont& récemnt, au
cours de tests d'infectivité de sang incubé (TISI ou BIIT de Rickman et
Robson), des réponses mdoxales chez des Qps antig&iques variables
de semdks connus (E'Tat T.rhodesiense et AnTat T.brucei). Un nouveau
Drotocole de RICKNAN et KOLALA, 1980 (32) a -permis d'étudier ces r$mn-
ses pradmales. Trois souches connues de T.brucei, après avoir d'abord
entra%-& des &sultats négatifs au TISI,ont ensuite constamtent donné
des r&ultats positifs. D'autres épreuves ont confirmé ces faits, à ver-
ser au dossier de l'identification des sous-espèces de Tbrucei, que nous
reprendmns d'ailleurs à la fin de cette revue de techniques. Il est à
noter cpe dans le TISI, il n'y a pas nécessa irement corrélation entre la
utilité des Ttypmosoms et l'infectivité pur des Rats ou des Souris
QiOBSON et RIClQ#N, 1977) (33).
Des modifications du TISI ont permis à HAWKING (18) d'étudier la
résistance au sérum humin de diverses espèces de Trypanosomes.
III - MEX'HODES SERO-IMMUNOLOCICUES
111.1. Méthodes mn mécifiques
- Foml-leucogel ou réaction de Caté et Pacstas
- Test au chlorure mercuriaue et ses variantes
- Evaluation des immmoglobulines <IgM>
Dans cette rubrique, on wut citer les tmvaux de LUCKINS et al,
1979 (20) et ceux de MAHMOUD et GRAY, 1980 (26) qui comnt entre elles
ces techniques non spécifiques et des techniques plus modernes pur éva-
luer la Trypanosomiase due à T.evansi.
111.2. Méthodes spécificpes-
111.2.1. Fixation du cmpl&mt CU test d'hémlyse
Elle est toujours utilisée (36) mais ses applications sont
devenues plus rares pame qu'il existe des moyens sérologiques plus
faciles à appliquer et tout aussi fiables. Elle est passible dra&-
lioration pour des épreuves encore plus spécifiques (37).
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..D
-5
111.2.2. Hén-agglutination indirecte ou passive
111.2.3. ereuve d'ag@&Anation directe
BINZ et al, 1979 (4) ont prkenté une évaluation du test d'hémg-
glutination indirecte en tube capillaire. MAGNE et a1,1979 (24) donnent
des pécisions sur l'épreuve d'a,gWtination directe sur carte en utili-
sant corme antig&e des Trypanosomes isolés sur DISE-cellulose et colorés
par bleu Coomassie. Ces deux techniaues, jusqu'à mintenant, n'ont été uti-
lisées que dans le dépistage de la Maladie du somil. L'agglutination sur
carte a fait an?1 à un antigène T.brucei brwei
(VAT) AnTat 8 qui con-
duit à des r&ultats indiquant une forte +%omtion de Trypanosomiase si
les titres sérologicpes d'agglutination vont de 1:4 à 1:64.
111.2.4. Inmuno&ectzmQm&se
et imnunodiffusion
111.2.5. Immnofluorescence indirecte
III.2.6. Immmopemxydase induiecte
111.2.7. MicroELISA
Nous insisterons sur les trois dernières techniques q.ui sont ac-
tuellement les ylus utilisées dCans les laboratoires pour diagnostiquer
les Trypanosomiases humaines et animales.
L'imnumfluorescence indirecte est désormais classique. PWgré ses
-très nombreuses applications dans la recherche des maladies parasitaires,
ce procédé de diagnostic n'est pratiqué qu'assez rarement dans les labo-
ratoires africains. Il a conduit à de bons r&ultats dans le diagnostic
et l'étude ~&zc&iologique de la Ik-yanosomiase bovine. Son utilisation
pratiaue sur le terrain dans le dépistage de la Trypanosomiase humaine a
fait B'objet d'une note de G. DUVALLET et P. SALIOU, 1978 (8). Les appli-
cations en épidémiologie citées dans la littérature scientifique sont pres-
que toujours réalisées dans les laboratoires situés dans les capitalesou
les grandes villes (11) (12) (13) (14) (34). Les raisons de cette restric-
tion tiennent en partie à la nécessité d'utiliser un microscope à éclaira-
ge ultraviolet qui coûte sensiblement plus cher que les micmsco~s à
éclairage ordinaire et qu'on ne peut pas déplacer en brousse. Il est pas-
sible de pallier cet inconvénient en pratiquant la &thode ixrmunoenzyrnnlo-
gique, tout en utilisant des antigènes figurés. Cette méthode a été r&m-
. . ./ . . .
- 6
mnt ex&rimntée, mur ce gui est de la Trypanosomiase humaine. Elle a
une aussi bonne sensibilité que l'imumofluozescence, tout en ne nécessi-
tant q-u'un éclairage courant. Nous lVavons ex$rimntée dans le diagnostic
de la Trypanosomiase bovine, en la corgarant à l'immmofluorescence indi-
recte (41).
La kthcde suivie est celle décrite w CAILLIEZ, que nous avions ci-
té dans une note antérieure (39). Elle comporte notammt les étapes sui-
vantes :
- dilution des sérums en tampon de Coons (*) ,
- réaction anti$ne-anticorps pendant 60 minutes à la tex@kkure anrbiante,
- lampe 10 minutes par le tampon de Coons,
- Réaction avec un sérum de lapin anti- imnunoglobul~s
bovines conjupué
à la +mxydase C*e) et dilué à 1/50, pendant 60 minutes,
- lavage deux fois mr le tampon de Ccmns = 1 minute et dix minutes,
- r&Glation v le rSactif de Gmham-lCarnowsky pendant 15 minutes (**+) 3
- lavage à l'eau distillée,
- mnta)re en milieu glycériné et examen au microscope en lumière blanche.
Les rkctions positives se traduisent par une coloration brun&re des
Try-nosames .
Des études visant 2 comparer des bovins Zébus indemnes et des Ndam
S~~JXX& de Trypanoscmiase ont donné les résultats respectifs suivants,
exprim& en myenne géo&trique des titres réciproques dtanticows WGTR) :
- Ndam suspects :
IGTR en irrmno~xydase
indirecte
= 57,58
FEI'R en inmnofluorescence indirecte = 54,96
- Zébus indemnes :
l%TR en immmopemxydase indirecte
= 13,84
KTR en jarnunofluomsœnce indirecte = 3,98
. . ./ . . .
(*) Tamon de Ccons , pH 7,2 = V&mmZ sodiwe 20,6 g : sodiwn chlowe 85g ;
l
acide &lor~d~Que 1 N : 80,6 mg ; eau d&tiZMe : q& 5 2 0 Au mmnt de
l'e~~@oi ce tamwm est diZué ÙT parties dgaZes avec 2 seau dZstiZZ4e et on
ajoute 0,3 p.lU0 d’aZbumine bovine. (*t) Miles Ltd. (***)Réactif de Gr&am-
-@ diamidhzo-3,3 - benzidh (t&trachZorhydratel .J 100 m g ; hnnpon
!@&3 -HC-L C?~!I 7,6 : 200 ml :: eau oxyg&zée d 10 vo Zwnes 0 2 mi?.
-7
Les Ndam sus~cts ont p&senté des t'actions positives 3 des dilu-
tions élevées (1/1280), aussi bien en immnofluorescence cmu'en immnop&
roxydase indirectes ; par contre, aucun zébu ne donne de r6action positive
par les deux rkthodes, entre les dilutions 1/320 et 1/1280.
Avec l'une ou l'autre &I%ode, il y a des différmces significatives
entre les zébus et les Ndam.
L'%rm.mop&xydase indirecte se &vèle l&&ement sup&ieure à l'im-
mmofluorescence, tuut en 6tant d'application et de lecture ?lus rapides.
Dans ces conditions, il serrible tout indiqué de pow?suivre des re-
cherches sur lesag$lications pratimes de la rkthode d'immno&mcydase
indirecte dans les enquêtes sur les Trypmosomiases animales.
La technique par micm?ZLISA (Enzyme Linked Inmmospecific Assay) a
fait l'objet de rmibrwses mises au point et applications pratiques. Des
prkisions techniq.ues sont apportées par AMBROISE-THOMAS et a1 (1) (2)
(31, par CARLIER, BOUT et al (5) ainsi que DESGEORGES et AMBROISE-THOMAS
(7). Le choix des substrats chmm@nes a scm importance. Parmi ceux qui
sont utilisables (acide amino-5-salicylique, orthophénylène diamine, ortho-
dianisidine,
ortholidine dichlorhydrate), l'ortholidine semble p&fé-
rable dans les laboratoires équipés de lecteur automtiq.ue. La technique
micmELISA est très spécific,ue et très fiable. Fklheureusemmt elle ne
peut être applic&e qu'en laboratoire pour le niommt. C'est un excellent
outil de recherche rrais il est tout à fait vraisemblable qu'une simplifi-
cation des procédés techniques en pemtte l'application sur le terrain,
dans les années à venir. Son utilisation en laboratoire pour la détection
d'antigènes m%boliques de Plasmdium a été r&ssie et, très certaine-
mnt, les expériences en cours sur les Trypanosomiases seront tout aussi
concluantes. Dans ces 6gmeuves, les plaques sont d'aboti sensibilisées
avec des anticorps spkifiqucs de '&ypanosorm puis reçoivent le sérum
suspect. L'adjonction des mêmes anticorps mués à la pémxydase fiali-
se un parfait sandwich quand le sérum est positif.
Toutes ces épreuves sont praticables dans les diverses forms de '&y-
panoscmiases anismles, cm myen de diagnostic ou d'évaluation épizoo-
tiologicrlae (39). L'utilisation d'anti$nes de culture (35) pourmitper-
/
. . . l . .
mettre de standard.iser plus facilemt les techniques, pour ce qui est des
diverses espèces de Trypanosonurs d'anirmux~ La conservation des antigènes à
très basse te&rature est reconurmdée (25) : cela peut de travailler assez
longtemps avec le &-ne mt&iel standardisé. A titre d'exemple (VAT) Antat 8
de T.brucei brucei qui donne encore de bons résultats dans les épreuves ELISA
(42).
IV - IDENTIFICATION
Il est Important de conq?léter cette =Vue par l'identification des
Trypanosomes. En plus du test d'infectivité de sang incubé dont il a été ques-
tion plus haut, il faut pouvoir appliquer plusfr@mment les épreuves de
caractérisation par isoenzymes. Elles sont utiles non seulement pour mieux
conna$ti les réservoirs de Trypanosomes pathogènes pour 1'Hom-e (GIBSON et al
-'
1978 (15) mis aussi pour saisir les differences entre souches de Trypanosomes
de la m%e espèce chez les anirraux : selon KILGOUR et al, 1980 (19) il y aurait
-
ainsi trois sortes de T. vivax chez les bovins d'Afrique. Ils demandent à être
mieux identifik.
Telles sont les quelques comnentaires qu'appelle la lecture de publications
de ces deux dernières années sur les techniques de diagnostic des Trypanosomiases
et d'identification des Trypanosoms. Il n'a pas été question dans cette revue,
exclusivemnt de parasites d'animaux, tant leurs frontières avec les parasites
de 1'Horma sont incertaines, rral dgfinies. Ne voyons-nous pas, d'après les tests
que T.brucei. brucei peut virtuellement se comporter en vitro com T.brucei
rhodesiense ? Cette dkouvertedoit inciter à beaucoup de prudence 2 l'ggard
de T.brucei sensu stricto, ?mt dans les manipulations en laboratoire que dans
les considérations sur l'aspect monotique de la Trypanosomiase.
S U M M A R Y
DIAGNOSIS OF ANIMAL TRYPANOSOMIASIS. RECENT PROGRESS
'Ibis article brings up to date a synthesis published in 1977 (38). The
diapostic techniques of Trypanosomiasis have been impmved during these past
few years : generalization of the micmhemtocrite centrifugation technique
follmd by dark gmund observation of the bufZy coat ; higher sensitivity of
the blood incubated infectivity test ; large scZLe use of micro ELISA ; high
sensitivity of indirect imnumpemxydase technique which my replace
i-nwnoflmrescence. . .
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MfNISTERE D2 L'ENSEIGNEMENT SUPERIEUR
INSTITUT SENEGALAIS DE RECHERCHES
ET DE LA RECHERCHE SCIENTIFTQUE
AGRICOLES (I.S.R.AJ
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SECIIEIIARIPITP'ETATALARECHERME
LJ%KX?A'IXXlXE NATIONALDE LsELE.XAGE
SCIENTIFIQUEET TECHNIQUE
ET DE RECHERCHES VETERINAIRES
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DIAGNOSTIC DE LA TRYPANOSOMIASE ANIMALE
DONNEES RECENTES
Par S.M. KXJRE(")
REF. No lOO/PARASITO.
AOUT 1981
DIAGNOSTIC DE LA TRYPANOSOMIASE ANIMALE
DONNEES RECENTES
Par S.M. TOURE?
R E S U M E
Le pr&ent &icle est une mise à jour d'une synthèse parue en 1977 (38).
Les techniques de diagnostic de la Trypanosomiase ont connu des progrès ces
dernières années : g&-&al.isation de la centrifugation microhémtocrite suivie
d'examn de l!interphase sur fond noir ; très nombreuses applications de
l'épreuve micro ELISA ; enfin grande sensibilité de l'irmunopémxydase indirecte
qui peut remplacer l'imnunofluorescence ; importance croissante du test
d'infectivi-té du sang incubé.
INTRODUCTION
Les techniques de diagnostic des Trypanosomiases, tant hw-aines qu'anim-
les, ont fait l*objet de plusieurs notes au cours de ces dernières années (10)
('27) (38) (39) (30). Ces notes, accompagnées d'une bibliographie abondante,
sont des revues assez exhaustives des techniques de diagnostic des Trypanoso-
miases et, pour cette raison, nous nous limiterons, dans le ptisent exposé,
à des faits nouveaux ou à des comntaires inédits. Dans cette mise à jour,
nous suivrons pour l'essentiel le nx%z plan que celui adopté par ailleurs (38)
(39). Cette revue étant complémntaire de celles déjà publiées, plusieurs
techniques seront- citées successivement et seuls des faits nouveaux semnt
rapportés après ces citations. Le diagnostic clinique est volontairerrmt0ti.
1- DETECTIONDIPXC'IE CHEZ L'HOTE DE PARASITES F'IGURES
l/l - Observation microscopique immédiate
1/2 - Observation après concentration
1/2/1 - Centrifugation classique
1/2/2 - Centrifugaticm dans des tubes à micmhémtocrite
1/2/3 - Centrifugation d'éluat recueilli après filtration à travers
une colonne de DEAE - cellulose
1/2/4 - Centrifugation après lyse de globules muges.
(*> Institut sé&galais de Recherches agricoles - Laboratoire national de
1'Elevage et de Recherches &térinaires - B.P. 2057 - DAKAR-HANN (Sénégal),
-2
1.3. Observation de lames colorées
Les lecms, au microscope, de frottis classiques et de gouttes
épaisses, ou de sang frais entre lame et lamlle, sont toujours couram-
ment pratiquées mis ces procédés sont nettemmt inférieurs à ceux qui
permettent de concentrer les Trypanosomes.
J. CARRIE et D. TIMSIT (6) rapportent une &thode simplifiée de con-
centration des Trypanosomes qui consiste à laisser sédimenter le sang, re-
cueilli sur anticoagulant, et à centrifuger le plasma : les r&xiLtats ob-
tenus sont, semble-t-il, sup&ieurs à la triple centrifugation.
Cependant les techniques qui connaissent actuellement la plus large
utilisation sont celles de Woo et l'examen sur fond noir dsune pr$ara-
tion d'interphase de centrifugation micmhémtocrite. Elles sont même as-
sez fréquenment appliq&es sur le terrain. G. DUVALLET et al, 1979 (91,
ont pratiqué la technique de Woo dans un%yer de Trypanosomiase humine à
Vavoua en côte d'ivoire, en procédant à la lecture microscopique à l'aide
d'un objectif 2 imersion (G x 50). Ils ont pu dépister par cette kthode
18 sujets parasitémiques mis sans signes cliniques et qui n'auraient pu
être dkelés que par la sérologie ou par des techniques de concentration
de valeur au moins égale à celle de kbo.
La lecture sur fond noir de pr@amtion entre l.amz et lamlle d'inter-
phase de centrifugation microhémtocrite a été largemnt décrite quant aux
procédés et aux avantages (M. MURRAY et al, 1977 ; J. PARIS, M. MURRAY et
R. AGUFE, 1980, non publié (28) (30). Il n'est pas nécessake de revenir
sur cette technique, sinon pom relever des remarques, celles de L. GRIF'F'IN,
1978 (17) qui eStime que cette &I%ode est difficilement applicable sur le
terrain et, pour cette raison, a une moindre valeur pratique. Nous ne sau-
rions partager cet avis, pour avoir pratiqué ce procédé de diagnostic, en
milieu éleveur, concumement avec d'autres méthodes UUJRE, 1981) (40).
Ses avantages &ident dans lafàcilité, la pkision et surtout la possi-
bilité d'évaluer l'hémtocrite qui est 10 meilleur indice de l'état de
santé vis à vis de la Trypanosomiase. Enfin, lorsqu'elle est associée à
d'autres
investigations, la méthcde permet de mieux cmprendre les faits
pathologiques dans un cheptel. Ainsi, au cours de plusieurs tournées, des
prélèvements faits dans les diverses zones écologiques du Sénégal, en
.
.
/
.
0..
-3
utilisant plusieurs techniques sur un r&me animal (tittis et gouttes
épaisses, centrifugation micmh&ratocrite + examen sur fond noir (CWEFN),
des renseignemnts précis sont obtenus sur plusieurs parasites : Trypano-
mm congolense, T.vivax. Theileria mxtans, Ekbesia bigemina, Anaplasm
sp., les micmfilaires de Setaria labiatopapillosa.
L'idéal est de pratiquer plusieurs techniques et de faire une synthè-
se globale des données. Mais si l'objectif visé est d'appliquer des trai-
tements trypanocides adéquats, on peut se contenter des seuls examens par
WEFN, car on juge d'après l'hémtocrite et la parasitémie. La &thode
microhématocrite peut donc valablement être appliquée sur le terrain (C%RI@,
1979) (16). Les critiques avancées n'enlèvent rien a la valeur de la mé-
thode CWEFN et c'est avec juste raison que MURRAY et al, 1979 (29) en re-
tracent les avantages. On lira avec profit les critères d'évaluation qui
ressortent de plusieurs études comparatives faisant intervenir des rr&ho-
des différentes dans divers types d'infections dues à T.vivax, T.congolen-
se ou T.brucei (31).
-
La concentration de Trypanosomes par filtration à travers une colonne
de DEAF, - cellulose (selon Lariham) est restéelongtemps réservée aux labo-
ratoires bien équipés. Récent, LUMSDEN et al (21) (22) (23) ont pmpo-
sé une miniaturisation du matériel requis et une application sur le terrain
dans le dépistage de la Maladie du somil. Les r&ultats obtenus en 1980
indiquent que cette adaptation technologique peut arkliorer le diagnostic
de routine de la Trypanosomiase humaine africaine. Sans doute serait-il
souhaitable d'appliquer aussi la technique dans les Txypanoscmiases ani-
mles à des fins derecher&e.
II - DETECTION INDIRECTE DE PARASITES FIGURES
11.1. Inoculation ZI des anim.~~ d'expérience
11.2. Culture en vitro
11.3. Xéncdiagnostic
Peu de faits nouveaux sont à signaler dans cette partie, tout au
mins en ce qui concerne les épreuves pouvant avoir une valeur pmtique
de diamstic des 'Ikypanosomiases animles. Mention doit être faite ce-
. . /. . . .
-4
~ndant de difficult&a rencon&es pur caractériser avec certitude des
semd&mes de T.brucei et T.rhodesiense. Il a été démont& récemnt, au
cours de tests d'infectivité de sang incubé (TISI ou BIIT de Rickman et
Robson), des réponses mdoxales chez des Qps antig&iques variables
de semdks connus (E'Tat T.rhodesiense et AnTat T.brucei). Un nouveau
Drotocole de RICKNAN et KOLALA, 1980 (32) a -permis d'étudier ces r$mn-
ses pradmales. Trois souches connues de T.brucei, après avoir d'abord
entra%-& des &sultats négatifs au TISI,ont ensuite constamtent donné
des r&ultats positifs. D'autres épreuves ont confirmé ces faits, à ver-
ser au dossier de l'identification des sous-espèces de Tbrucei, que nous
reprendmns d'ailleurs à la fin de cette revue de techniques. Il est à
noter cpe dans le TISI, il n'y a pas nécessa irement corrélation entre la
utilité des Ttypmosoms et l'infectivité pur des Rats ou des Souris
QiOBSON et RIClQ#N, 1977) (33).
Des modifications du TISI ont permis à HAWKING (18) d'étudier la
résistance au sérum humin de diverses espèces de Trypanosomes.
III - MEX'HODES SERO-IMMUNOLOCICUES
111.1. Méthodes mn mécifiques
- Foml-leucogel ou réaction de Caté et Pacstas
- Test au chlorure mercuriaue et ses variantes
- Evaluation des immmoglobulines <IgM>
Dans cette rubrique, on wut citer les tmvaux de LUCKINS et al,
1979 (20) et ceux de MAHMOUD et GRAY, 1980 (26) qui comnt entre elles
ces techniques non spécifiques et des techniques plus modernes pur éva-
luer la Trypanosomiase due à T.evansi.
111.2. Méthodes spécificpes-
111.2.1. Fixation du cmpl&mt CU test d'hémlyse
Elle est toujours utilisée (36) mais ses applications sont
devenues plus rares pame qu'il existe des moyens sérologiques plus
faciles à appliquer et tout aussi fiables. Elle est passible dra&-
lioration pour des épreuves encore plus spécifiques (37).
.
.
/
.
..D
-5
111.2.2. Hén-agglutination indirecte ou passive
111.2.3. ereuve d'ag@&Anation directe
BINZ et al, 1979 (4) ont prkenté une évaluation du test d'hémg-
glutination indirecte en tube capillaire. MAGNE et a1,1979 (24) donnent
des pécisions sur l'épreuve d'a,gWtination directe sur carte en utili-
sant corme antig&e des Trypanosomes isolés sur DISE-cellulose et colorés
par bleu Coomassie. Ces deux techniaues, jusqu'à mintenant, n'ont été uti-
lisées que dans le dépistage de la Maladie du somil. L'agglutination sur
carte a fait an?1 à un antigène T.brucei brwei
(VAT) AnTat 8 qui con-
duit à des r&ultats indiquant une forte +%omtion de Trypanosomiase si
les titres sérologicpes d'agglutination vont de 1:4 à 1:64.
111.2.4. Inmuno&ectzmQm&se
et imnunodiffusion
111.2.5. Immnofluorescence indirecte
III.2.6. Immmopemxydase induiecte
111.2.7. MicroELISA
Nous insisterons sur les trois dernières techniques q.ui sont ac-
tuellement les ylus utilisées dCans les laboratoires pour diagnostiquer
les Trypanosomiases humaines et animales.
L'imnumfluorescence indirecte est désormais classique. PWgré ses
-très nombreuses applications dans la recherche des maladies parasitaires,
ce procédé de diagnostic n'est pratiqué qu'assez rarement dans les labo-
ratoires africains. Il a conduit à de bons r&ultats dans le diagnostic
et l'étude ~&zc&iologique de la Ik-yanosomiase bovine. Son utilisation
pratiaue sur le terrain dans le dépistage de la Trypanosomiase humaine a
fait B'objet d'une note de G. DUVALLET et P. SALIOU, 1978 (8). Les appli-
cations en épidémiologie citées dans la littérature scientifique sont pres-
que toujours réalisées dans les laboratoires situés dans les capitalesou
les grandes villes (11) (12) (13) (14) (34). Les raisons de cette restric-
tion tiennent en partie à la nécessité d'utiliser un microscope à éclaira-
ge ultraviolet qui coûte sensiblement plus cher que les micmsco~s à
éclairage ordinaire et qu'on ne peut pas déplacer en brousse. Il est pas-
sible de pallier cet inconvénient en pratiquant la &thode ixrmunoenzyrnnlo-
gique, tout en utilisant des antigènes figurés. Cette méthode a été r&m-
. . ./ . . .
- 6
mnt ex&rimntée, mur ce gui est de la Trypanosomiase humaine. Elle a
une aussi bonne sensibilité que l'imumofluozescence, tout en ne nécessi-
tant q-u'un éclairage courant. Nous lVavons ex$rimntée dans le diagnostic
de la Trypanosomiase bovine, en la corgarant à l'immmofluorescence indi-
recte (41).
La kthcde suivie est celle décrite w CAILLIEZ, que nous avions ci-
té dans une note antérieure (39). Elle comporte notammt les étapes sui-
vantes :
- dilution des sérums en tampon de Coons (*) ,
- réaction anti$ne-anticorps pendant 60 minutes à la tex@kkure anrbiante,
- lampe 10 minutes par le tampon de Coons,
- Réaction avec un sérum de lapin anti- imnunoglobul~s
bovines conjupué
à la +mxydase C*e) et dilué à 1/50, pendant 60 minutes,
- lavage deux fois mr le tampon de Ccmns = 1 minute et dix minutes,
- r&Glation v le rSactif de Gmham-lCarnowsky pendant 15 minutes (**+) 3
- lavage à l'eau distillée,
- mnta)re en milieu glycériné et examen au microscope en lumière blanche.
Les rkctions positives se traduisent par une coloration brun&re des
Try-nosames .
Des études visant 2 comparer des bovins Zébus indemnes et des Ndam
S~~JXX& de Trypanoscmiase ont donné les résultats respectifs suivants,
exprim& en myenne géo&trique des titres réciproques dtanticows WGTR) :
- Ndam suspects :
IGTR en irrmno~xydase
indirecte
= 57,58
FEI'R en inmnofluorescence indirecte = 54,96
- Zébus indemnes :
l%TR en immmopemxydase indirecte
= 13,84
KTR en jarnunofluomsœnce indirecte = 3,98
. . ./ . . .
(*) Tamon de Ccons , pH 7,2 = V&mmZ sodiwe 20,6 g : sodiwn chlowe 85g ;
l
acide &lor~d~Que 1 N : 80,6 mg ; eau d&tiZMe : q& 5 2 0 Au mmnt de
l'e~~@oi ce tamwm est diZué ÙT parties dgaZes avec 2 seau dZstiZZ4e et on
ajoute 0,3 p.lU0 d’aZbumine bovine. (*t) Miles Ltd. (***)Réactif de Gr&am-
-@ diamidhzo-3,3 - benzidh (t&trachZorhydratel .J 100 m g ; hnnpon
!@&3 -HC-L C?~!I 7,6 : 200 ml :: eau oxyg&zée d 10 vo Zwnes 0 2 mi?.
-7
Les Ndam sus~cts ont p&senté des t'actions positives 3 des dilu-
tions élevées (1/1280), aussi bien en immnofluorescence cmu'en immnop&
roxydase indirectes ; par contre, aucun zébu ne donne de r6action positive
par les deux rkthodes, entre les dilutions 1/320 et 1/1280.
Avec l'une ou l'autre &I%ode, il y a des différmces significatives
entre les zébus et les Ndam.
L'%rm.mop&xydase indirecte se &vèle l&&ement sup&ieure à l'im-
mmofluorescence, tuut en 6tant d'application et de lecture ?lus rapides.
Dans ces conditions, il serrible tout indiqué de pow?suivre des re-
cherches sur lesag$lications pratimes de la rkthode d'immno&mcydase
indirecte dans les enquêtes sur les Trypmosomiases animales.
La technique par micm?ZLISA (Enzyme Linked Inmmospecific Assay) a
fait l'objet de rmibrwses mises au point et applications pratiques. Des
prkisions techniq.ues sont apportées par AMBROISE-THOMAS et a1 (1) (2)
(31, par CARLIER, BOUT et al (5) ainsi que DESGEORGES et AMBROISE-THOMAS
(7). Le choix des substrats chmm@nes a scm importance. Parmi ceux qui
sont utilisables (acide amino-5-salicylique, orthophénylène diamine, ortho-
dianisidine,
ortholidine dichlorhydrate), l'ortholidine semble p&fé-
rable dans les laboratoires équipés de lecteur automtiq.ue. La technique
micmELISA est très spécific,ue et très fiable. Fklheureusemmt elle ne
peut être applic&e qu'en laboratoire pour le niommt. C'est un excellent
outil de recherche rrais il est tout à fait vraisemblable qu'une simplifi-
cation des procédés techniques en pemtte l'application sur le terrain,
dans les années à venir. Son utilisation en laboratoire pour la détection
d'antigènes m%boliques de Plasmdium a été r&ssie et, très certaine-
mnt, les expériences en cours sur les Trypanosomiases seront tout aussi
concluantes. Dans ces 6gmeuves, les plaques sont d'aboti sensibilisées
avec des anticorps spkifiqucs de '&ypanosorm puis reçoivent le sérum
suspect. L'adjonction des mêmes anticorps mués à la pémxydase fiali-
se un parfait sandwich quand le sérum est positif.
Toutes ces épreuves sont praticables dans les diverses forms de '&y-
panoscmiases anismles, cm myen de diagnostic ou d'évaluation épizoo-
tiologicrlae (39). L'utilisation d'anti$nes de culture (35) pourmitper-
/
. . . l . .
mettre de standard.iser plus facilemt les techniques, pour ce qui est des
diverses espèces de Trypanosonurs d'anirmux~ La conservation des antigènes à
très basse te&rature est reconurmdée (25) : cela peut de travailler assez
longtemps avec le &-ne mt&iel standardisé. A titre d'exemple (VAT) Antat 8
de T.brucei brucei qui donne encore de bons résultats dans les épreuves ELISA
(42).
IV - IDENTIFICATION
Il est Important de conq?léter cette =Vue par l'identification des
Trypanosomes. En plus du test d'infectivité de sang incubé dont il a été ques-
tion plus haut, il faut pouvoir appliquer plusfr@mment les épreuves de
caractérisation par isoenzymes. Elles sont utiles non seulement pour mieux
conna$ti les réservoirs de Trypanosomes pathogènes pour 1'Hom-e (GIBSON et al
-'
1978 (15) mis aussi pour saisir les differences entre souches de Trypanosomes
de la m%e espèce chez les anirraux : selon KILGOUR et al, 1980 (19) il y aurait
-
ainsi trois sortes de T. vivax chez les bovins d'Afrique. Ils demandent à être
mieux identifik.
Telles sont les quelques comnentaires qu'appelle la lecture de publications
de ces deux dernières années sur les techniques de diagnostic des Trypanosomiases
et d'identification des Trypanosoms. Il n'a pas été question dans cette revue,
exclusivemnt de parasites d'animaux, tant leurs frontières avec les parasites
de 1'Horma sont incertaines, rral dgfinies. Ne voyons-nous pas, d'après les tests
que T.brucei. brucei peut virtuellement se comporter en vitro com T.brucei
rhodesiense ? Cette dkouvertedoit inciter à beaucoup de prudence 2 l'ggard
de T.brucei sensu stricto, ?mt dans les manipulations en laboratoire que dans
les considérations sur l'aspect monotique de la Trypanosomiase.
S U M M A R Y
DIAGNOSIS OF ANIMAL TRYPANOSOMIASIS. RECENT PROGRESS
'Ibis article brings up to date a synthesis published in 1977 (38). The
diapostic techniques of Trypanosomiasis have been impmved during these past
few years : generalization of the micmhemtocrite centrifugation technique
follmd by dark gmund observation of the bufZy coat ; higher sensitivity of
the blood incubated infectivity test ; large scZLe use of micro ELISA ; high
sensitivity of indirect imnumpemxydase technique which my replace
i-nwnoflmrescence. . .
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