C. R. Acad. SC. Paris, t. 271, p. 1148-1151 (28...
C. R. Acad. SC. Paris, t. 271, p. 1148-1151 (28 septembre 1970)
/
S é r i e D
CANCÉROLOGIE. - Culture in vitro cle cellules de came primitif dejbie hm~ain.
Note (*) de M. Michel Rioche, M me Simone Quelin MM. Ibrahima Seck,
Marcel Jacquesson, Bernard Basteris et René M sseyeff, présentée par
M. Bernard Halpern.
Des cultures de cancer primitif de foie bumain ont été réalisées et ent etenues in vitro durant des
périodes de trois semaines à deux mois ; aucune subculture n’a été obtenu :.
De nombreux travaux ont déjà été consacrés à
in vitro de ce]]u]es
d’hépatomes induits chez le rat, permettant non se
‘établir des lignées
cellulaires permanentes, mais aussi de comparer le
me de ces ce]]u]es
et celui des hépatocytes normaux. En outre, les rech
es cultures d’hépa-
tomes induits chez le rat [Abelev et coll. (‘), Abelev
et le singe [Dawe et coll. (4), Hull et coll. (“)] ont permis
montrer que ces cul-
tures synthétisaient, au moins pendant un certain temps,
toprotéine spécifique
(a-FP) produite normalement par le foie fœtal et,
carcinomes primitifs ou, plus rarement, par certains t
es. Chez l’homme,
Baylet et Camain (“) ont cultivé des cellules de cancer
je sur membrane
chorioallantoïde d’œuf embryonné et Chen (‘) a établi et
tretenu pendant plus
de deux ans une souche d’hépatocarcinome humain
le métabolisme des cellules cultivées n’a pas été étudié.
C’est pourquoi nous nous sommes proposé d’
iver des Ce]]&s
de cancer primitif du foie (CPF) humain et de mett
temps, une production éventuelle d’a-FP par ces cellules.
Nous n’exposons ici que les méthodes et l’a
observations relatives à la production d’a-FP étant
MATÉRIEL ET MÉTHODES. - Les fragments utilisés SO
obtenus à partir de
ponctions-biopsies du foie (PBF), d’hépatectomies partiel
) ou de prélèvements
nécropsiques (PN) effectués à l’hôpital et immédiate
s dans un récipient
stérile (contenant une solution saline tamponnée pour les
Ils sont transportés
sous glace au laboratoire et conservés à + 4 OC lorsque la
Ise en culture ne peut
être immédiate.
Les prélèvements sont d’abord finement hach
pipette Pasteur, puis lavés trois fois dans une solution salin
ns calcium ni magné-
sium (les PBF de faible volume ne sont pas lavées). Dans
ains cas, quelques-uns
des menus fragments obtenus sont utilisés comme exp
s et placés alors sur
coagulum plasmatique ou directement sur le support
ulture. La dispersion
des fragments restants est réalisée soit par digestion dans
e solution de trypsine
selon les méthodes classiques (trypsine Difco 1 : 2
Salt Solution, le temps d’action variant selon le vo
dispersion mécanique à la pipette. La suspensio
pendant 5 mn à 1 500 tr/mn et, après élimination
(2)
est mis en suspension dans le milieu de culture ( 105 à 5 x 105 cellules/ml selon les
essais).
Lorsque les fragments sont difficiles à dissocier (cancer sur cirrhose), ils sont
mis en culture sans numération préalable des cellules. Les cultures sont faites en
flacons de verre ou de polystyrène revêtus ou non d’un gel d’agar ou d’agar-gélatine.
Nous avons employé les milieux de base suivants :
1. Minimum essentiel de Eagle (“).
2. 199 de Parker.
3. Earle (“).
4. HBSS à 0,5 x d’hydrolysat de lactalbumine.
5. Même milieu sans rouge de phénol ni autre indicateur de pH.
6. Milieu no 5 + 0,l /o d’extrait de levure (Yeastolate Difco) + 0,6 //i de
L-glutamine (solution à 0,5 x).
7. Milieu no 6 + 1 000 ltg p. 100 de vitamine B 12 + 5 mg p. 100 de vitamine C.
Au moment de leur utilisation, tous les milieux reçoivent des antibiotiques aux
concentrations usuelles et 10 à 30 % de sérum humain normal (SH). Les milieux 5,
6 et 7 reçoivent, en outre, 1 mg p. 100 de dipyramidol dont Lenoir et coll. (“) ont
montré l’action favorable sur les cultures d’hépatocytes. Le pH est ajusté à 6,7 ou
7,0. Les cultures sont incubées à 37 OC. Sauf quelques essais en tubes roulants,
il s’agit toujours de cultures statiques en tubes ou flacons hermétiquement bouchés.
RÉSULTATS ET DISCUSSION. - Les onze prélèvements actuellement étudiés
(8 PBF, 2 HP, 1 PN) proviennent de carcinomes hépatocellulaires. Parmi ceux-ci,
quatre nous ont permis d’obtenir la survie et la multiplication des cellules.
Les périodes pendant lesquelles nous avons pu entretenir ces cultures ont duré
respectivement 54 (T), 55 (II), 27 (III) et 35 (IV) jours. Les essais de transfert ont
toujours échoué ; au premier passage, il y a parfois un début de multiplication,
mais ensuite les cellules meurent rapidement.
C’est le milieu no 7 à 30 % de SH qui a donné les meilleurs résultats. Viennent
ensuite les milieux 4, 5 et 6 ; les milieux 1 et 2 ne donnent que des cultures fugaces
durant au plus 7 à 8 jours. Le milieu no 3 n’a permis aucune prolifération.
Des supports éprouvés, le verre est le meilleur, bien que l’adhérence des cellules
cancéreuses n’y soit pas très bonne. Les tubes roulants sont préférables à cet égard,
mais la prolifération n’y est pas améliorée.
La trypsination dans les conditions décrites donne de meilleurs résultats que
la dilacération mécanique.
Les cellules cancéreuses en culture se différencient nettement des hépatocytes
normaux par leur forme arrondie ou polygonale à angles mousses et leurs dimensions
irrégulières alors que l’hépatocyte normal a une forme polygonale à angles nets et
une taille assez régulière. Les cellules cancéreuses ont souvent tendance à l’auto-
agrégation et forment alors des amas plus ou moins importants comparables
à ceux décrits par Kuroda (‘“) dans les cultures de foie embryonnaire de poulet.
Ces agrégats peuvent adhérer au support et se comporter alors comme des explants.
(3)
Au cours de la culture les cellules peuvent conserver leur orphologie originelle ;
elles se multiplient alors sur le support ou en suspension en formant des amas irré-
guliers OLI des couches monocellulaires. Dans d’autres cas la culture a un aspect
classique : Tes cellules adhèrent au support, s’étalent plus u moins et se divisent
en formant des îlots de cellules épithéliales ou fibroblastiqu s.
/
Fig. I
Fig. 3
Fig. 1. - Tapis épithélial développé à partir d’un petit amas de cellules.
atériel vivant (culture corres-
pondant au 2’ type décrit) (Obj. : 10 Y, Oc. : 5 X ).
Fig. 2. - Culture 3. Au centre, une cellule à 8 noyaux. Colorat
oc. : 12 ‘d).
Fig. 3. - Migration cellulaire et début de formation d’une me
lulaire ayant adhéré au verre. Matériel vivant (culture cor
oc. : 5 > ).
Fig. 4. - Ilot de multiplication. Matériel vivant (culture corr
Oc. : 5 >’ ).
Non seulement nous avons observé la multiplication
llulaire en constatant,
par les examens microscopiques journaliers, l’augmentati
u nombre des cellules,
mais nous l’avons aussi vérifiée par numération cellulaire : ant ensemencé 1 x 106
cellules, nous en avons compté 5 jours après 3 x ICP en
pension. Leur nombre
avait donc augmenté plus de trois fois puisque les cellules
hérant au flacon n’ont
pas été dénombrées. Cette multiplication, relativemen
dans les cultures 1,
III, IV a été très lente dans la culture II.
Après un temps variable et quel que soit le type de
Iture, la multiplication
cesse, les cellules dégénèrent puis meurent.
( 4 )
La production d’a-FP par deux de ces cultures peut être considérée comme la
preuve que ce sont bien les hépatocytes tumoraux qui ont proliféré (“).
CONCLUSION. - La culture des cellules d’hépatocarcinome humain est possible,
bien que difficile, avec une proportion élevée d’échecs et l’impossibilité jusqu’ici
de réussir des subcultures. Outre l’intérêt de l’étude métabolique de l’hépatocyte
tumoral, les progrès réalisés dans ce domaine pourront éventuellement être utiles
à une autre culture très délicate, celle de l’hépatocyte humain normal.
(*) Séance du 14 septembre 1970.
(‘) G. 1. AB~LEV, S. D. PEROVA, N. 1. KHRAMKOVA, Z. A. P~STNIK~VA et 1. S. TRLIN, ~nn.sl)/untntiorz,
1,
1963, p. 174.
(2) G. 1. ABELEV, Progr. Exp. Tumor. Res., 7, 1965, p. 104.
.
(3) 1. S. IRLIN, S. D. PEROVA et 0. 1. ABELEV, ht. J. Cancer, 1, 1966, p. 337.
(4) C. J. DAWI?, J. WHANG-PEN~;, W. D. MOR<;AN, R. W. O’GARA ct M. G. KELLY, J, Nat. Cancer Inst.,
40, 1968, p. 1167.
(5) N. W. HULL, R. P. CARBONE, W. R. O’GARA et M. G. KELZ.Y, Proc. Assoc. Cancer Res., 9,
1968, p. 33.
(6) R. BAYLET et R. CAMAIN, C. R. Soc. Biol., 156 (2), 1962, p. 324.
(7) J. M. CHEN, Unio Inter. Contra Cancrum, 20, 1964, p. 1314.
(8) S. QUELIN, M. RI~CHE, R. MASSEYEFF, 1. SECK, M, JA~QUESS~N et B. BASTERIS, Synthèse if7 vitro,
d’et-FPpar les cellules de foie humain cancéreux en culture.
(9) H. EAGLE, Science, 130, 1959, p. 432.
(10) J. F. MORGAN, H. J. MORTON et R. C. PARKER, Proc. Soc. Exp. Binl. Med., 73, 1950, p, 1.
(1’) W. R. EARLE, J. Nat. Cancer Inst., 4, 1943, p. 165.
(12) P. LENOIR, Y. LE GUILLY et M. BOUREL, Comptes rendus, 267, Série D, 1969, p. 1522.
(1”) Y. KURODA, Exptl. Cell. Res., 49, 1968, p. 626.
(Service des cultures de Tissus, 1. E. M. 1’. T.,
Laboratoire National de Recherches Vétérinaires, Dakar, Sénlgal;
Service de Biaclzirnie Médicale, Faculté de Médecine et Pharmacie,
Dakar, Sénégal ;
HGpital Le Dantec, Dakar, Sén<:gal ;
Ecole Nationale de Médecine, 06-Nice, Alpes-Mtrritir,lPs.)
-
-
13. - Tmp. JOUVE, 12, rue de Tournon, Paris (6”)
Imprimé en France
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S é r i e D
CANCÉROLOGIE. - Culture in vitro cle cellules de came primitif dejbie hm~ain.
Note (*) de M. Michel Rioche, M me Simone Quelin MM. Ibrahima Seck,
Marcel Jacquesson, Bernard Basteris et René M sseyeff, présentée par
M. Bernard Halpern.
Des cultures de cancer primitif de foie bumain ont été réalisées et ent etenues in vitro durant des
périodes de trois semaines à deux mois ; aucune subculture n’a été obtenu :.
De nombreux travaux ont déjà été consacrés à
in vitro de ce]]u]es
d’hépatomes induits chez le rat, permettant non se
‘établir des lignées
cellulaires permanentes, mais aussi de comparer le
me de ces ce]]u]es
et celui des hépatocytes normaux. En outre, les rech
es cultures d’hépa-
tomes induits chez le rat [Abelev et coll. (‘), Abelev
et le singe [Dawe et coll. (4), Hull et coll. (“)] ont permis
montrer que ces cul-
tures synthétisaient, au moins pendant un certain temps,
toprotéine spécifique
(a-FP) produite normalement par le foie fœtal et,
carcinomes primitifs ou, plus rarement, par certains t
es. Chez l’homme,
Baylet et Camain (“) ont cultivé des cellules de cancer
je sur membrane
chorioallantoïde d’œuf embryonné et Chen (‘) a établi et
tretenu pendant plus
de deux ans une souche d’hépatocarcinome humain
le métabolisme des cellules cultivées n’a pas été étudié.
C’est pourquoi nous nous sommes proposé d’
iver des Ce]]&s
de cancer primitif du foie (CPF) humain et de mett
temps, une production éventuelle d’a-FP par ces cellules.
Nous n’exposons ici que les méthodes et l’a
observations relatives à la production d’a-FP étant
MATÉRIEL ET MÉTHODES. - Les fragments utilisés SO
obtenus à partir de
ponctions-biopsies du foie (PBF), d’hépatectomies partiel
) ou de prélèvements
nécropsiques (PN) effectués à l’hôpital et immédiate
s dans un récipient
stérile (contenant une solution saline tamponnée pour les
Ils sont transportés
sous glace au laboratoire et conservés à + 4 OC lorsque la
Ise en culture ne peut
être immédiate.
Les prélèvements sont d’abord finement hach
pipette Pasteur, puis lavés trois fois dans une solution salin
ns calcium ni magné-
sium (les PBF de faible volume ne sont pas lavées). Dans
ains cas, quelques-uns
des menus fragments obtenus sont utilisés comme exp
s et placés alors sur
coagulum plasmatique ou directement sur le support
ulture. La dispersion
des fragments restants est réalisée soit par digestion dans
e solution de trypsine
selon les méthodes classiques (trypsine Difco 1 : 2
Salt Solution, le temps d’action variant selon le vo
dispersion mécanique à la pipette. La suspensio
pendant 5 mn à 1 500 tr/mn et, après élimination
(2)
est mis en suspension dans le milieu de culture ( 105 à 5 x 105 cellules/ml selon les
essais).
Lorsque les fragments sont difficiles à dissocier (cancer sur cirrhose), ils sont
mis en culture sans numération préalable des cellules. Les cultures sont faites en
flacons de verre ou de polystyrène revêtus ou non d’un gel d’agar ou d’agar-gélatine.
Nous avons employé les milieux de base suivants :
1. Minimum essentiel de Eagle (“).
2. 199 de Parker.
3. Earle (“).
4. HBSS à 0,5 x d’hydrolysat de lactalbumine.
5. Même milieu sans rouge de phénol ni autre indicateur de pH.
6. Milieu no 5 + 0,l /o d’extrait de levure (Yeastolate Difco) + 0,6 //i de
L-glutamine (solution à 0,5 x).
7. Milieu no 6 + 1 000 ltg p. 100 de vitamine B 12 + 5 mg p. 100 de vitamine C.
Au moment de leur utilisation, tous les milieux reçoivent des antibiotiques aux
concentrations usuelles et 10 à 30 % de sérum humain normal (SH). Les milieux 5,
6 et 7 reçoivent, en outre, 1 mg p. 100 de dipyramidol dont Lenoir et coll. (“) ont
montré l’action favorable sur les cultures d’hépatocytes. Le pH est ajusté à 6,7 ou
7,0. Les cultures sont incubées à 37 OC. Sauf quelques essais en tubes roulants,
il s’agit toujours de cultures statiques en tubes ou flacons hermétiquement bouchés.
RÉSULTATS ET DISCUSSION. - Les onze prélèvements actuellement étudiés
(8 PBF, 2 HP, 1 PN) proviennent de carcinomes hépatocellulaires. Parmi ceux-ci,
quatre nous ont permis d’obtenir la survie et la multiplication des cellules.
Les périodes pendant lesquelles nous avons pu entretenir ces cultures ont duré
respectivement 54 (T), 55 (II), 27 (III) et 35 (IV) jours. Les essais de transfert ont
toujours échoué ; au premier passage, il y a parfois un début de multiplication,
mais ensuite les cellules meurent rapidement.
C’est le milieu no 7 à 30 % de SH qui a donné les meilleurs résultats. Viennent
ensuite les milieux 4, 5 et 6 ; les milieux 1 et 2 ne donnent que des cultures fugaces
durant au plus 7 à 8 jours. Le milieu no 3 n’a permis aucune prolifération.
Des supports éprouvés, le verre est le meilleur, bien que l’adhérence des cellules
cancéreuses n’y soit pas très bonne. Les tubes roulants sont préférables à cet égard,
mais la prolifération n’y est pas améliorée.
La trypsination dans les conditions décrites donne de meilleurs résultats que
la dilacération mécanique.
Les cellules cancéreuses en culture se différencient nettement des hépatocytes
normaux par leur forme arrondie ou polygonale à angles mousses et leurs dimensions
irrégulières alors que l’hépatocyte normal a une forme polygonale à angles nets et
une taille assez régulière. Les cellules cancéreuses ont souvent tendance à l’auto-
agrégation et forment alors des amas plus ou moins importants comparables
à ceux décrits par Kuroda (‘“) dans les cultures de foie embryonnaire de poulet.
Ces agrégats peuvent adhérer au support et se comporter alors comme des explants.
(3)
Au cours de la culture les cellules peuvent conserver leur orphologie originelle ;
elles se multiplient alors sur le support ou en suspension en formant des amas irré-
guliers OLI des couches monocellulaires. Dans d’autres cas la culture a un aspect
classique : Tes cellules adhèrent au support, s’étalent plus u moins et se divisent
en formant des îlots de cellules épithéliales ou fibroblastiqu s.
/
Fig. I
Fig. 3
Fig. 1. - Tapis épithélial développé à partir d’un petit amas de cellules.
atériel vivant (culture corres-
pondant au 2’ type décrit) (Obj. : 10 Y, Oc. : 5 X ).
Fig. 2. - Culture 3. Au centre, une cellule à 8 noyaux. Colorat
oc. : 12 ‘d).
Fig. 3. - Migration cellulaire et début de formation d’une me
lulaire ayant adhéré au verre. Matériel vivant (culture cor
oc. : 5 > ).
Fig. 4. - Ilot de multiplication. Matériel vivant (culture corr
Oc. : 5 >’ ).
Non seulement nous avons observé la multiplication
llulaire en constatant,
par les examens microscopiques journaliers, l’augmentati
u nombre des cellules,
mais nous l’avons aussi vérifiée par numération cellulaire : ant ensemencé 1 x 106
cellules, nous en avons compté 5 jours après 3 x ICP en
pension. Leur nombre
avait donc augmenté plus de trois fois puisque les cellules
hérant au flacon n’ont
pas été dénombrées. Cette multiplication, relativemen
dans les cultures 1,
III, IV a été très lente dans la culture II.
Après un temps variable et quel que soit le type de
Iture, la multiplication
cesse, les cellules dégénèrent puis meurent.
( 4 )
La production d’a-FP par deux de ces cultures peut être considérée comme la
preuve que ce sont bien les hépatocytes tumoraux qui ont proliféré (“).
CONCLUSION. - La culture des cellules d’hépatocarcinome humain est possible,
bien que difficile, avec une proportion élevée d’échecs et l’impossibilité jusqu’ici
de réussir des subcultures. Outre l’intérêt de l’étude métabolique de l’hépatocyte
tumoral, les progrès réalisés dans ce domaine pourront éventuellement être utiles
à une autre culture très délicate, celle de l’hépatocyte humain normal.
(*) Séance du 14 septembre 1970.
(‘) G. 1. AB~LEV, S. D. PEROVA, N. 1. KHRAMKOVA, Z. A. P~STNIK~VA et 1. S. TRLIN, ~nn.sl)/untntiorz,
1,
1963, p. 174.
(2) G. 1. ABELEV, Progr. Exp. Tumor. Res., 7, 1965, p. 104.
.
(3) 1. S. IRLIN, S. D. PEROVA et 0. 1. ABELEV, ht. J. Cancer, 1, 1966, p. 337.
(4) C. J. DAWI?, J. WHANG-PEN~;, W. D. MOR<;AN, R. W. O’GARA ct M. G. KELLY, J, Nat. Cancer Inst.,
40, 1968, p. 1167.
(5) N. W. HULL, R. P. CARBONE, W. R. O’GARA et M. G. KELZ.Y, Proc. Assoc. Cancer Res., 9,
1968, p. 33.
(6) R. BAYLET et R. CAMAIN, C. R. Soc. Biol., 156 (2), 1962, p. 324.
(7) J. M. CHEN, Unio Inter. Contra Cancrum, 20, 1964, p. 1314.
(8) S. QUELIN, M. RI~CHE, R. MASSEYEFF, 1. SECK, M, JA~QUESS~N et B. BASTERIS, Synthèse if7 vitro,
d’et-FPpar les cellules de foie humain cancéreux en culture.
(9) H. EAGLE, Science, 130, 1959, p. 432.
(10) J. F. MORGAN, H. J. MORTON et R. C. PARKER, Proc. Soc. Exp. Binl. Med., 73, 1950, p, 1.
(1’) W. R. EARLE, J. Nat. Cancer Inst., 4, 1943, p. 165.
(12) P. LENOIR, Y. LE GUILLY et M. BOUREL, Comptes rendus, 267, Série D, 1969, p. 1522.
(1”) Y. KURODA, Exptl. Cell. Res., 49, 1968, p. 626.
(Service des cultures de Tissus, 1. E. M. 1’. T.,
Laboratoire National de Recherches Vétérinaires, Dakar, Sénlgal;
Service de Biaclzirnie Médicale, Faculté de Médecine et Pharmacie,
Dakar, Sénégal ;
HGpital Le Dantec, Dakar, Sén<:gal ;
Ecole Nationale de Médecine, 06-Nice, Alpes-Mtrritir,lPs.)
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13. - Tmp. JOUVE, 12, rue de Tournon, Paris (6”)
Imprimé en France