no d’ordre 122 <I> Université Cheikh ...
no d’ordre 122
<I>
Université Cheikh Anta-Diop de Dakar
.
Faculté des Sciences et Techniques
MEMOIRE DE D. E. A. DE BIOLOGIE ANIMALE
Présenté par
N’DEYE FATOU .TALL
soutenu le 28 Juin 1999 devant la commission d’examen :
Président : Mr.
Mady
NDIAYE
Membres :
mi Omar Thiom
THIAW
Yaya
THIONGANE
Meïssa
TOURl3
Aux membres de ma famille,
A mes amis
Affection et Estime.
REMERCIEMENTS
Ce travail a été réalisé au Laboratoire National de 1’Elevage et de Recherche
Vétérinaire (L.N.E.R.V) de l’Institut Sénégalais de Recherche Agricole (I.S.R.A),
II
au département de virologie.
Je remercie très sincèrement le Professeur 0. T. THIAW de l’Université
Cheikh Anta DIOP de Dakar pour sa collaboration efficace et chaleureuse. Vos
suggestions pour une rédaction claire et concise m’ont beaucoup éclairé tout au
long de la réalisation de ce document. Veuillez trouvez ici l’expression de toute ma
gratitude.
Mes remerciements vont également :
Au Dr. Y. THIONGANE chercheur à I’ISRA, qui a bien voulu m’encadrer malgré
ses nombreuses sollicitations quotidiennes. La rigueur scientifique qui vous anime,
les remarques pertinentes que vous faites à chaque fois que l’on vous présente un
travail, m’ont beaucoup aidé quant à l’orientation de mes recherches. Soyez assuré
de ma gratitude et de mon respect.
Au Dr M. NDIAYE de la Faculté des Sciences et Techniques de Dakar qui nous
fait l’honneur de présider le jury.
-
Au Professeur M. TOURE de la Faculté de Médecine et de Pharmacie: c’est un
grand honneur pour nous de vous compter parmi les membres de notre jury.
A tout le personnel technique du département de virologie du L.N.E.R.V qui m’a
apporté toute l’assistance technique nécessaire à l’élaboration de ce travail.
A Monsieur 0. MBODJ, responsable du centre de formation et des bases de
données du service informatique de la Direction Générale de I’ISRA, qui a mis
toute sa compétence et son savoir faire à ma disposition.
S O M M A I R E
-
.
INTRODUCTION . * . , . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . , . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
*. 2
I
l.Généralités sur la Dermatose Nodulaire Contagieuse Bovine (DNCB)... . . . . . . . . . . . . 3
1 ADéfinition . . . . . , . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3
II,
1.2. Symptômes .,.... . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .., . . . . . . . . . . . . . . . * . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
4
1.3. Importance de cette maladie. ..................................................................
4
2.Généralités sur les cultures de cellules.........................................................
8
2.1. Définitions .............................................................................................
9
I
2.2. Principe des systèmes de cultures de cellules ............................................
9
2.3. Types de cultures cellulaires...................................................................
11
2..3.1. Les cellules de première explantation ou cellules primaires.. ................ . 1
2.3.2. Les cellules de souche ..................................................................
13
2.3.3. Les cellules de lignée continue........................................................
13
2.4. Intérêt des cultures de cellule..................................................................
15
MATERIEL ET METHODES .............................................................................
15
1. Matériel ....................................................................................................
16
1 .l . Choix du foetus .....................................................................................
16
1.2. Souche virale ou inoculum......................................................................
16
1.3. Milieux de cultures et solutions tampons de trypsine ................................... .16
1.3.1. Les solutions salines.......................................................................
16
1.3.2. Les milieux nutritifs .......................................................................
..16
l -
1.4. Les antibiotiques et antifongiques ............................................................
17
1.5. Matériels de laboratoire ..........................................................................
17
2. Méthodes ...................................................................................................
18
2.1. Technique de culture de reins de mouton................................................ ..18
2.1 .l. Prélèvement des reins...................................................................
.18
I
2.1.2. Dissection du rein ..........................................................................
18
2.1.3. Trypsination du cortex rénal ............................................................
21
2.1.4. Entretien des cellules.....................................................................
23
2.1.5. Conservation des cellules ................................................................
24
a/ Une conservation par ralentissement du métabolisme ......................... ..2 4
-
b/ Une conservation par congélation ou cryoconservation ...................... ..2 4
2.2. Technique de culture de testicules de mouton ............................................... 24
2.3. Technique d’inoculation des cellules ............ ................................................ 25
2.3.1. Dilution de la souche virale ................................................................
25
2.3.2. Infection des cellules........................................................................
26
2.4. Méthodes d’identification du virus de la DNCB et titrage ................................. 26
2.4.1. Observation de l’effet cytopathogène (ECP) ........................................ ..2 7
a/ Examen à l’état frais............................................................................
27
bl Examen après coloration au Giemsa .................................................... ..2 7
2.4.2. Fixation des anticorps fluorescents .................................................... .28
2.4.3. Titrage du virus de la D.N.C.B. dans les différentes récoltes................... .30
2.4.4. Calcul de la dose infectante 50% (Dl 50% ou DICT 50) ......................... .32
2.4.5. Application du test U de MANN ET WHITHNEY...................................... 33
RESULTATS ...................................................................................................
34
1. Evolution des tapis cellulaires non infectés ................................................... .34
u
1.1. Observation des cellules rénales ............................................................. ..34
1.2. Observation des cellules de testicules . . . . . . . . . ., . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..34
.
2. Evolution des tapis de cellules infectées . . . . . . . . . ” . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .35
2.1. Observation de l’effet cytopathogène (ECP) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 35
I
2.2. Observation de la fluorescence spécifique . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . , . . . . . . . . . . . . . . . . . . , . . . . . . .39
2.3. Lecture des plaques de titrage... . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..39
2.4. Calcul de titre par la méthode de SPEERMANN - KARBER... . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .40
-_.
2.5. Test U de MANN ET WITHNEY. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . e.. . . . . . . . . . . . . . . . .I... . . . . . . . . . . . . . . . . . . 40
DISCUSSION . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . * . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 43
I
1. Caractères de cellules non infectées. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ~ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 43
2. Caractères des cellules infectbes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .44
RESUME ET PERSPECTIVES .......................................................................... ..4 5
-
BIBLIOGRAPHIE ............................................................................................
..4 8
-
-
INTRODUCTION
2
Les êtres vivants sont caractérisés par une organisation ou plutôt une hiérarchie
d’organisations complexes qui va de l’atome à la molécule. Ces molécules s’imbriquent
à leur tour selon des schémas précis en organites intracellulaires. Ceux-ci s’intègrent
pour former des cellules en obéissant à quelques plans fort simples. En effet, les
cellules de même genre se groupent (dans la majorité des espèces) en tissus.
Plusieurs tissus différents forment des organes, associés pour constituer des individus
harmonieux.
La cellule représente la plus petite portion de matière vivante qui puisse vivre
isolée de manière complète et, capable de se reproduire. En effet, toutes les cellules
d’un organisme dérivent les unes des autres par mitose, qui est l’un des phénomènes
les plus fondamentaux de toute la biologie. A l’issue de la mitose, une cellule
somatique initialement diploïde (2N chromosomes) conduit à deux cellules filles
identiques porteuses de la même information génétique. Ce phénomène si bien réglé,
dont la fréquence est rigoureusement contrôlée dans un tissu normal, peut devenir
incohérent (CAROSELLA, 1995). Cette anomalie donne naissance à une cellule dite
transformée. Cette transformation se traduit par une modification du nombre de
chromosomes, c’est I’hétéroploïdie; au lieu d’avoir 2N chromosomes (diploïdie), ces
cellules transformées en acquièrent 3N, 4N, E!N chromosomes. De plus, les cellllles se
présentent sous des formes très variées. Dans chaque tissu, les cellules ont souvent
une morphologie caractéristique, elles sont soit de type fibroblastique, soit de type
épithélial, soit de type endothélial. Cette morphologie peut être influencée par
l’environnement de la cellule, surtout lorsqu’elle est en culture. Par exemple, le
fibroblaste en culture, peut être quasi sphérique en milieu liquide (agarose), en forme
de triangle ou de losange aplati sur couche mince de plasma coagulé non orienté, ou
en fuseau épais et allongé sur une lame de verre striée. L’utilisation de la culture de
cellules a contribué à une meilleure compréhension des grandes questions que se
pose la biologie des eucatyotes, notamment immortalité et cancer, la différenciation
cellulaire, le développement embryonnaire, le phénomène de réparation tissulaire.
Parallèlement à cette cellule vivante totalement autonome, il existe d’autres
organismes comme les virus qui sont des parasites stricts.
De nos jours, la culture in vitro de cellules en provenance d’organismes animaux est
devenue une des techniques les plus utilisées pour l’étude des virus. Elle permet de
faire face aux exigences des virus qui ne se multiplient qu’au sein des cellules vivantes
et nous évite de travailler sur un animal ou un organe maintenu en survie.
Le virion ou particule infectieuse présente quatre traits distinctifs dont les trois
premiers caractérisent un parasitisme absolu. En effet, le virion contient un seul type
d’acide nucléique, soit ribonucleique, soit désoxyribonucléiquc, jamais les deux à la
fois. Incapable de croître ou de se diviser, il se reproduit uniquement à partir de son
matériel génétique. II ne possède pas dans son génome l’information nécessaire à la
synthèse de ses métabolites essentiels et à la formation des liaisons de haut potentiel
énergétique que cette synthèse exige. Le virion ne la trouve que dans la cellule où il se
multiplie et dont il détourne à son usage les systèmes enzymatiques préexistants. De
même, pour synthétiser ses propres protéines, il utilise les ribosomes et les acides
ribonucléiques de transfert de la cellule qu’il infecte. Le génome des virus ne porte
aucune information qui permette la production des enzymes du cycle énergétique, la
synthèse de protéines ribosomiques, celle de I’ARN ribosomique et de I’ARN de
transfert. Enfin, dernière caractéristique, le virion présente une structure définie, à
symétrie cubique, ou hélicoïdale (TOURNIER, 1976).
En virologie vétérinaire, les cultures cellulaires sont utilisées dans l’isolement,
l’identification et la multiplication du virus (ASSO, 1964). Elles permettent la mise au
point et la production de vaccins utilisés dans les campagnes de prophylaxie des
maladies virales du bétail. Ainsi que l’élaboration de tests de diagnostic tels que la
technique de neutralisation des effets cytopatlhogènes du virus in vitro.
1. Généralités sur la Dermatose Nodulaire Contagieuse Bovine
(DNCB)
1 .l, Définition
La Dermatose Nodulaire Contagieuse Bovine (DNCB) est une maladie
infectieuse d’origine virale qui affecte principalement les bovins notamment les zébus,
-
les taurins et les buffles domestiques.
L’agent responsable est un virus de la famille des poxviridae, genre
I
Capripoxvirus, dont le virus type est le virus Neethling.
4
II s’agit d’un virus à ADN à symétrie hélicoi’dale, enveloppé. Ce virus est transmis par
le contact direct avec les animaux malades mais, surtout par l’intermédiaire de piqûres
4
II s’agit d’un virus à ADN à symétrie hélicoi’dale, enveloppé. Ce virus est transmis par
I
le contact direct avec les animaux malades mais, surtout par l’intermédiaire de piqûres
de divers arthropodes comme les mouches, moustiques.
1.2. Symptômes
Cette maladie peut évoluer sous différentes formes allant de la forme aiguë
grave à la forme frustre bénigne.
Dans la forme aiguë, après une incubation de 4 à 14 jours, le premier signe
clinique est une hyperthermie (41°C) d’une dizaine de
jours associée à des
-
symptômes généraux tels que l’abattement, le manque d’appétit. Ensuite, apparaissent
des signes cutanés caractéristiques de cette virose : des poils hérissés et des nodules
I
dont la taille varie entre 0,2 et 5 cm de diamètre sur l’encolure, le dos, les cuisses et les
jambes de l’animal, (Fig. 1). Ces nodules cutanés persistent pendant une semaine, puis
se dessèchent et tombent laissant place à des lésions qui cicatrisent en peu de temps
en l’absence d’infections bactériennes secondaires.
En plus de ces signes cutanés, des nodules se développent dans certains
organes profonds comme la trachée et l’intestin. C’est la forme grave de la DNCB qui
conduit à une asphyxie, une inrumination, un avortement voire la mort dans 2 à 10 %
1LI
des cas (LEFEVRE, 1991).
1.3. Importance de cette maladie
La DNCB est une maladie remarquable par son incidence économique dans les
élevages de bovins. Outre la mortalité que la dermatose provoque dans 2 à 10 % des
cas, elle cause des pertes économiques consécutives à l’amaigrissement associé à
une infertilité et à des avortements. Elle laisse généralement des lésions indélébiles sur
les cuirs. La qualité de ces derniers, sérieusement affectée, leur fait perdre toute valeur
L
marchande dans l’industrie du cuir (NEGALBAYE, 1988).
De plus, la DNCB est inscrite sur la liste A selon le code zoo-sanitaire
international de l’office International des Epizooties (0.I.E). Cette liste A comprend des
L
maladies transmissibles qui ont un grand pouvoir de diffusion et une gravité
particulière.
Figure 1 : Un bovin atteint de DNCB. La flèche indique les nodules cutanés.
_.
6
111
Ces maladies sont à déclaration obligatoire car elles sont capables de s’étendre
au-delà des frontières nationales, avec des conséquences socio-économiques et
sanitaires qui peuvent être graves. Surtout leurs incidences sur le commerce
international des animaux et des produits animaux sont importantes (CHILLAUD, 1996).
Sur le plan épidémiologique, la DNCB est une virose rencontrée exclusivement
sur le continent africain, au sud .tfti Sahara et à Madagascar. Elle y sévit sous forme
d’épizooties séparées par des périodes de silences plus ou moins longues. Toutefois,
son extension depuis 1970 est préoccupante (Fig. 2).
Au Sénégal, cette maladie a été signalée, pour la première fois, en 1988. Les
premiers cas furent notés en saison sèche chez les buffles élevés aux environs de la
ville de Saint-Louis. Et, au cours de la saison des pluies, la maladie s’est propagée aux
bovins vivant dans toutes les zones écologiques du Sénégal (THIONGANE, 1988).
Aucun traitement spécifique n’est disponible à ce jour. Mais il est possible de
-
combattre les infections secondaires, par un traitement genéral à base d’antibiotiques
associé à un traitement local des nodules et plaies cutanés. Le moyen de lutte le plus
-
efficace contre la DNCB reste la vaccination. A l’heure actuefle, un vaccin contre la
clavelée, maladie des moutons due à un poxvirus voisin de celui de la DNCB, est
utilisée dans les campagnes de vaccination contre la DNCB. Ce vaccin hétérologue est
efficace mais présente I?nconvénient de provoquer une immunité moins solide et moins
durable qu’un vaccin homologue. De plus, ce vaccin ne peut être utiliser dans les pays
où la clavelée n’existe pas.
Ce travail s’inscrit dans un objectif global de mise au point d’un vaccin
homologue, c’est à dire d’un vaccin issu d’un virus de la DNCB. Particulièrement, notre
I
étude tente de déterminer les conditions in vitro optimales de réplication d’une souche
de virus de DNCB, isolée lors d’une épizootie survenue chez les bovins du Sénégal en
1988 ( THIONGANE ,
1988). A cet effet, nous analysons l’évolution de la
cytopathogénéicité de la souche virale sur des cellules de reins et de testicules de
Ic
mouton pour sélectionner la lignée cellulaire la plus sensible.
-
Figure 2 : Carte épidémiologique de la D.N.C.B.
(Annuaire de la Santé animale FAO - WHO -OIE, 1989).
a
8
En pratique, nous allons d’abord réaliser des cultures de cellules de reins et de
testicules de mouton, ensuite les inoculer avec la souche virale. Le degré de sensibilité
de ces cellules est déterminé par l’observation de l’évolution des lésions cytopathiques
dans le temps. Des inclusions intracellulaires caractéristiques de cette infection virale
pourront être mises en évidence grâce à des techniques de coloration cytologique (la
coloration de Giemsa) et immunologique (le test d’immunofluorescence indirecte). Un
calcul du titre viral sera effectué en foncticn du type de cellules utilisées avant de
conclure sur la différence de sensibilité entre ces deux types de cellules.
2. Généralités sur les cultures cellulaires
La culture cellulaire s’enracine dans deux concepts formulés dès le milieu du
XIXème siècle. Le premier faisait de la cellule l’unité vitale fondamentale, capable d’avoir
une existence autonome (SCHLEIDEN et SCHWANN, cités par FIRKET, 1964). Le second
énoncé par CLAUDE BERNARD (cité par MA~RIN 1976a) établissait la notion
L
d’homéostasie et de constance du milieu interne.
Ensuite, au XXème siècle, la culture de tissus fit ses premiers pas grâce à
HARRISON qui, en 1907, démontra le phénomène de croissance des cellules nerveuses
en mettant en culture des fragments de ganglions spinaux de grenouille dans du
coagulum. En 1912, CARREL définit les règles d’asepsie et mit en évidence le rôle de
certains extraits embryonnaires sur le développement du tissu conjonctif. Ces travaux
posent les bases de l’étude des besoins nutritionnels des cellules.
Mais, c’est seulement au milieu de notre siècle, à partir de 1950, qu’est
véritablement née la culture cellulaire. Elle bénéficia à la fois du développement de la
technique de dispersion des cellules à partir de tissus et organes par l’action des
enzymes protéolytiques et de l’utilisation d’un support de culture comme le verre neutre
qui évite l’emploi de coagulum.
En 1952, GEY et coll. isolent la première lignée de cellules tumorales d’origine
humaine, les cellules HeLa. Depuis lors, la culture de cellules est devenue l’outil de
-
choix de la biologie des organismes eucatyotes.
2.1. Définitions :
L
Ces définitions concernent les différents types de cultures.
La culture de cellules indique les systèmes où les cellules sont capables, non
seulement de survivre, mais aussi de se diviser, tout en restant séparées les unes des
-
autres, ou du moins sans conserver une organisation structurale rappelant le tissu
d’origine (FRESHNEY, 1986).
La culture de tissus concerne un tissu qui a conservé une organisation qui lui est
spécifique et continue soit à fonctionner, soit à croître tout au long des manipulations.
La culture d’organe désigne des cultures où un organe a conservé sa structure
organisée et ses fonctions spécifiques (Fig. 3).
2.2. Principe des systèmes de cultures de cellules
Le problème consiste à transformer le tissu en une suspension homogène de
cellules séparées qui peuvent être cultivées de deux manières :
- soit une culture en suspension : c’est le cas des cellules lymphoblastiques de souris
(OWENS et coll., 1953). Ce sont des cultures dont la richesse en cellules évolue à la
manière des cultures bactériennes (sous forme de colonies). Elles se prêtent
particulièrement bien aux études sur la production massive de virus. Cette méthode
présente cependant une limite qui est
l’utilisation d’un milieu spécial conçu pour
cellules non adhérentes. C’est pourquoi, seules les cellules dites transformées se
prêtent à cette technique car elles n’exigent pas un support pour croître.
- soit une culture en stationnaire : c’est le cas des cellules véro provenant de rein de
singe vert d’Afrique. Ce sont des cellules qui tombent au fond et se collent au support.
C’est la technique la plus répandue car presque toutes les cellules s’y prêtent. Ici, la
qualité du support devient essentielle : verre Pyrex ou verre neutre, plastique spécial.
Cependant, l’adhésion des cellules à leur support est un processus assez mal connu. II
nécessite l’intervention de facteurs d’attachement protéiques (fibronectine, collagene,..)
apportés par le milieu de culture notamment le sérum ou sécrétés par les cellules. Ces
facteurs d’attachement s’adsorbent aux surfaces et fixent les cellules par l’intermédiaire
de récepteurs spécifiques.
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‘.‘i.,.’
il,
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‘Xx r’
Figure 3 : Les Techniques de préparation des différents types de culture
[ FRESHNEY, 19871
L
L
11
Actuellement, aussi bien pour la culture en stationnaire que pour celle en
-
suspension, on peut avoir divers systèmes de culture de cellules notamment le
système dit ouvert de type spinner (Fig. 4) ou roller (Fig. 5) et le système dit fermé.
Ce système fermé correspond à des cytoculteurs de conception sophistiquée
dans lesquels tous les paramètres de culture sont contrôlés de façon à maintenir
constants la densité cellulaire et les échanges gazeux. Ces syst6mes fermés se
répartissent eux mêmes en deux catégories :
* le système fermé avec agitation, proche des fermenteurs bactériens. II donne des
densités cellulaires limitées car n’excédant pas 10’ cellules/ml. Développé à l’origine
pour la culture en suspension, il permet la culture des cellules adhérentes grâce à
l’utilisation de microporteurs ou de techniques d’encapsulation.
I
. le système fermé sans agitation, avec circulation de milieu en continu. Ces systèmes
fournissent des densités cellulaires très élevées (10” celluleslml), proches de celles
des tissus. Ils s’appliquent aussi bien à la culture de cellules adhérentes que non
adhérentes.
Lorsque toutes les conditions requises pour le bon développement d’un tissu
sont réunies (pH, température, nutriments, stérilité...) les cellules croissent et se
multiplient. On peut parler ainsi de culture in vitro.
2.3. Types de cultures cellulaires
Les cultures de cellules peuvent être différenciées par leur capacité à être
entretenues par passages successifs. On distingue essentiellement deux types :
2.3.1 Les cellules de première explantation ou cellules primaires.
Elles ont une durée de vie très limitée car une dégénérescence non spécifique
finit toujours par apparaître au bout de 2, 3, ou 4 trypsinations ou passages. Elles
résultent de la dissociation d’un organe, soit en petits fragments explantés, ou soit en
unités cellulaires obtenues par la méthode de trypsination. Celle-ci permet d‘obtenir, à
partir d’un organe donné, une suspension de cellules susceptibles de se fixer au verre
et de se multiplier pour donner une couche continue d’une seule assise ou couche
-
monocellulaire. Ce résultat est obtenu par digestion de la trame conjonctive de l’organe
au moyen d’une solution de trypsine.
IL
Figure 4 : Culture en suspension Type spinner,
Figure 5 : Culture en stationnaire type roller.
1 3
La trypsine, enzyme extraite du pancréas du porc est susceptible de couper toute
liaison protéique de type lys - arg ou arg - arg. Aujourd’hui grâce au génie génétique, la
trypsine que l’on trouve dans le commerce est purifiée et lyophilisée.
Lorsque la culture primaire est réussie, il apparaît de belles cellules en couche
monocellulaire que l’on a intérêt à repiquer pour constituer des cultures secondaires.
Cette opération s’effectue en décollant les cellules par la trypsine, en les remettant en
suspension dans du milieu neuf et en les ensemençant de nouveau dans d’autres
II
flacons de culture. Pour un meilleur rendement, il est d’usage de les utiliser le plus tôt
possible, car leur sensibilité à certains virus diminue au fil des passages.
2.3.2 Les cellules de souche.
Ce sont des cellules génétiquement normales. Elles peuvent être entretenues
II
pendant un grand nombre de passages (de 40 à 60). C’est le cas des cellules diploïdes
humaines.
2.3.3 Les cellules de lignée continue.
Ce sont des cellules tumorales, pathologiques et repiquables indéfiniment. Elles
proviennent soit de I’explantation d’une tumeur maligne humaine ou animale, soit de la
transformation in W-0 ou in vive de cellules normales (MONTAGNIER, 1976). Cette
transformation pouvant résulter d’une mutation spontanée ou provoquée par un agent
mutagéne de type oncogène physique, chimique ou viral. C’est le cas des cellules véro
issues de cellules de rein de singe vert d’Afrique.
La transformation se manifeste généralement par :
- une brusque augmentation de la vitesse de croissance des cellules, par exemple si
le cycle de multiplication normal des cellules était de 24 heures, il est réduit à 14 ou 16
heures (Fig. 6).
- une tendance au chevauchement des cellules qui ont perdu ainsi leur inhibition de
contact.
- des cellules qui peuvent pousser en suspension (sans s’accrocher à un support du fait
de la perte de leur cytosquelette).
- un changement du nombre de chromosomes, les cellules deviennent hétéroploi‘des.
- une diminution des besoins en sérum nutritif.
-
Compte tenu de leur grande résistance, on peut les conserver pendant très longtemps
par congélation à -70°C ou dans de l’azote liquide (-196°C).
14
!
I
t
Figure 6: Courbe d’évolution d’une cellule en culture [ FRESHNEY, 1987 ]
15
2.4. Intérêt des cultures de cellules
Le développement des techniques de cultures cellulaires a permis de grandes
avancées dans la biologie en général et la virologie en particulier. Elle a permis d’avoir
une production massive de cellules homogènes et toutes les cellules peuvent provenir
d’un même clone. On peut les synchroniser (par choc thermique, blocage de certaines
synthèses, déplacement mécanique ou enzymatique de cellules en mitoses), les
astreindre à une fonction bien définie, avec une très grande reproductibiiiik
Plus particulièrement en virologie, puisque les virus ne se multiplient que dans
des cellules vivantes, les cultures de cellules constituent un support à l’activité du virus
(MA~RIN, 1976a), elles permettent alors :
- l’isolement et l’identification par neutralisation du virus,
- le titrage du virus,
- la production éventuelle de vaccins.
De plus, la culture de cellules a contribué à l’étude des différentes étapes
biochimiques du développement des virus animaux. Cette étude étant impossible à
effectuer chez l’animal, compte tenu de la diversité des réactions enregistrées (Asso,
1964).
MATERIEL
ET METHODES
16
1. Matériel
Des souches virales de DNCB sont cultivées sur des cellules de reins et de
testicules de mouton.
1.1. Choix du foetus
Les reins et les testicules sont issus d’un embryon mâle de mouton de 30 cm de
long et âgé de 14 à 15 semaines environ.
1.2. Souche virale ou inoculum
II s’agit d’une souche virale isolée à partir d’un nodule cutané de bovin atteint de
DNCB en 1988. Cette souche a subi 20 passages sur cultures de reins de mouton et
-
elle titre : 10 6,4 DICT 50.
1.3. Milieux de cultures et solutions tampons de trypsine
Les catégories de solutions et de milieux sont au nombre de deux :
1.3.1 Les solutions salines.
Elles sont communément appelées solutions de lavage, comme celles de
Phosphate Buffer Saline (ou PBS) ou de HANKS Balanced Saline Solution (ou HANKS
BSS). Le soluté est disponible sous forme de comprimé à reconstituer dans un litre
d’eau distillée. Ensuite, il faudra stériliser cette solution (pH = 7,2 - 7,4) par filtration.
Ces solutions servent à laver les menus fragments d’organes comme les reins ou les
testicules et à préparer des solutions enzymatiques.
1.3.2 Les milieux nutritifs.
II s”agit du milieu de EAGLE modifié par GLASGOW (ou MEMG) que l’on trouve
sous forme lyophilisée dans le commerce. II est dissout dans de l’eau distillée puis
I
stérilisé par filtration (pH = 7,2 - 7,4). Cette préparation est riche en élements nutritifs
indispensables à la croissance des cellules. Elle contient des vitamines, du sucre, des
acides aminés, des sels minéraux etc. Cependant, ce milieu synthétique ne suffit pas à
lui seul à faire démarrer une culture de cellules. II est recommandé d’ajouter une
substance naturelle comme le sérum de veau foetal qui est riche en facteurs de
croissance permettant à la cellule de s’accrocher au support avant de commencer à se
111
diviser.
17
Dans cette expérience, une solution de MEMG à 10% de sérum de veau foetal et 1%
d’antibiotiques est utilisée pour la culture des cellules.
Des solutions salines tamponnées de P.B.S ou de HANKS B.S.S auxquelles on
ajoute de l’enzyme comme de la trypsine à des concentrations différentes, sont dites
solutions tampons de trypsine. Elles sont de deux types :
- La trypsine versène est une solution de P.B.S à laquelle on ajoute de la trypsine à
1”/0, et du versénate à 0,5’?1/00. Elle est surtout utilisée pour dissocier le tapis cellulaire
II)
d’un flacon de culture. Elle permet d’effectuer des passages de cellules pour avoir des
cultures dites secondaires.
- La trypsine HANKS B.S.S. (HANKS balanced sait solution) est une solution de HANKS
B.S.S à laquelle on ajoute de la trypsine à 3’/,,. On l’utilise pour dissocier les fragments
d’organe en unités cellulaires.
1.4. Les antibiotiques et antifongiques
Ces substances permettent d’éviter les contaminations fréquentes en culture de
cellules. II s’agit d’antibactériens comme la pénicilline souvent utilisée à la concentration
100 ui/mI et la streptomycine à 50 ug/ml.
Quant aux antifongiques, on utilise principalement la fungizone à 5 pg/ml qui
inhibe la prolifération et l’action des champignons.
1.5. Matériels de laboratoire
- Boîte à instruments stérile contenant : 2 paires de ciseaux droits, 2 pinces à dents
de souris, 2 lames de bistouris montées sur une tige métallique, une cuillère à café,
- des gants,
- des boîtes de pétri stériles,
- des boîtes de culture de 75 cm2,
- de l’alcool à 90”,
- des pipettes de 2 ml, 5 ml, 10 ml,
- un entonnoir muni de gaze stérile (3 ou 4 épaisseurs de gaze),
- un erlenmeyer stérile et un autre contenant un barreau aimanté,
- un agitateur magnétique,
- les tubes de centrifugation stériles,
- un récipient de vidange,
18
- flacons de 5 ml,
- des lames de verre à une extrémité dépolie pour le test d’immunofluorescence,
- des lamelles,
- un grattoir en caoutchouc,
- une hotte à flux laminaire,
- une étuve à CO, à 37X,
- une centrifugeuse réfrig+réc,
- un bain marie à 37’C,
- un microscope inversé muni d’un dispositif à fluorescence,
- un bec bunsen.
2. Méthodes
2.1. Technique de culture de reins de mouton
2.1.1 Prélèvement des reins.
L’utérus {Fig. 7), nettoyé avec une solution d’alcool à 90”, est ouvert avec des
ciseaux. Le foetus (Fig. 8) est prélevé puis transféré sur un plateau. Le foetus est
saigné. Le flanc est désinfecté à l’endroit où il faut faire une incision pour accéder aux
reins. Les deux reins sont prélevés stérilement et sont recueillis dans une bolte de pétri
(Fig. 9).
2.1.2 Dissection du rein.
Elle est réalisée sous la hotte à l’aide de bistouri, de pince et de ciseaux. Les
reins sont dégagés de leur capsule recouverte de tissu adipeux et sont placés dans
une boîte de pétri stérile (Fig. 10). Le cortex rénal est séparé par grattage avec le
bistouri en prenant soin de ne pas entraîner les masses médullaires indésirables. Les
fragments de cortex sont découpés en menus morceaux à l’aide de ciseaux. Ces
morceaux du cortex rénal sont transférés dans un erlenmeyer muni de barreau
aimanté.
Figure 7 : L’utérus contenant l’embryon
Figure 8 : Fœtus de 14 semaines
20
Figure 9 : Reins fraîchement prélevés.
Figure 10 : Reins décapsulés.
2.1.3 Trypsination du cortex rénal
Les morceaux de cortex sont lavés trois fois avec une solution de tampon PBS.
Le procédé est le suivant : les fragments des deux reins sont repris dans un volume de
150 à 200 ml de solution de P.B,S dans I’erlenmeyer et, après une légère agitation,
sont laissés décanter au fond du récipient pour que le surnageant puisse être éliminé.
Au bout de trois lavages, le surnageant devien? clair et limpide (sans trace de sang) et
les fragments de cortex sont considérés propres.
Ensuite, Le dernier liquide de rinçage est remplacé par une solution d’enzyme :
la trypsine HANKS BSS. L’erlenmeyer, avec les fragments de cortex rénal est déposé
sur l’agitateur magnétique pendant 45 à 60 mn. Au bout de cette période, les fragments
sont digérés et la solution devient alors trouble. Cette solution, filtrée avec de la gaze,
est recueillie dans un erlenmeyer. Le digestat filtré est réparti dans des tubes et
centrifugé pendant 5 à 10 mn à 2500 tfmn à 18°C (Fig. 11).
Le culot de centrifugation contenant les cellules est repris dans une solution de
milieu MEMG enrichi avec 10% de sérum de veau et 1% d’inhibiteurs que sont les
antibiotiques et les antifongiques.
La concentration cellulaire de la suspension est déterminée par un comptage à
l’aide de la cellule de Thoma en utilisant la formule suivante : N = n/2 x 10000 x 10
où :
- N est le total nombre de celluleslml,
- n est le nombre de cellules comptées dans les deux chambres,
- 2 est le coefficient de division pour obtenir la moyenne des cellules
comptées dans les deux compartiments de I’hémacytomètre,
- 10000 est la constante de la chambre de comptage et ramène le nombre de
cellules comptées à un volume égal à 1 ml,
- 10 est le facteur de dilution
Ce comptage est nécessaire pour déterminer la concentration cellulaire
convenable pour un bon développement des cellules lorsqu’elles seront mises en
culture.
22
Figure 11 : Ttypsination à température ambiante du cortex rénal.
23
2.1.4 Entretien des cellules.
Une fois ensemencées, les cellules sont examinées tous les jours. Le
développement du tapis cellulaire se traduit par une modification du milieu de culture.
En effet, II est souvent nécessaire de changer le milieu lorsqu’il devient acide
(apparition d’une coloration jaune orangé) et ce, jusqu’à ce que le tapis cellulaire
devienne complet ou confitient. A ce stade, toute ta surface de culture du flacon est
occupée par les cellules en une couche continue d’une seule assise (dite parfois
couche monocellulaire). La croissance des cellules est très variable et dépend, entre
autres facteurs, de la qualité des prélèvements et des milieux de culture, surtout la
valeur du sérum de veau.
Lorsque le flacon de culture est complet, on peut avoir intérêt à les repiquer pour
constituer des cultures secondaires ou subcultures. Cette opération s’effectue en
décollant les cellules par la trypsine, en les remettant en suspension dans du milieu
neuf et en les ensemençant de nouveau dans d’autres flacons. La technique utilisée
est la suivante : le milieu surnageant la culture confluent est éliminé, de la trypsine, à
raison de 2 ml par flacon de culture, est étalée sur les cellules et est laissée en contact
pendant 30 secondes avant d’être éliminée. Pour une deuxième fois, la trypsine est
étalée sur le tapis cellulaire pendant 30 à 60 secondes. Au bout de ce temps, une
partie de la trypsine est éliminée. Le flacon est placé à 37°C pendant 3 à 5 mn, le
restant de la trypsine continuant à agir. Les cellules se décollent facilement et sont
reprises, avec soin, dans du milieu de culture neuf. La dispersion des cellules est
favorisée par des aspirations et des refoulements successifs du milieu de culture avec
une pipette stérile. Lorsque la culture est satisfaisante, avec un flacon de cellules
confluentes, on peut préparer deux du même type.
On replace les deux flacons à 37°C après avoir inscrit sur le flacon le numéro de
passage de ces cellules et la date de manipulation. Ce chiffre augmente d’une unité
après chaque subculture, passage ou trypsination. Puisqu’il s’agit de cellules de
première explantation, la multiplication des cellules en culture est volontairement limitée
à 2 ou 3 passages.
24
2.1.5 Conservation des cellules.
II est très utile pour éviter de perdre les cellules, de les conserver. Elles peuvent
être conservées de deux manières :
a/ Une conservation par ralentissement du métabolisme.
Elle est obtenue en remplaçant la solution de MEMG à 10% de sérum par du
MEMG à 5 ou 2% de sérum. Ou bien, les flacons de culture confluer;te sont retrrés de
l’étuve à 37°C pour être placés à la température ambiante (30°C) dans un endroit
obscur ou dans une armoire à basse température (18°C). Par ces techniques, le
métabolisme cellulaire est ralenti et les cellules sont conservées en l’état pendant
quelques jours.
bl Une conservation par congélation ou cryoconservation.
Ceci est possible en plaçant les cellules à des températures inférieures à - 70°C.
La technique de cryoconservation que nous avons utilisée met en jeu des cellules qui
sont en phase exponentielle de croissance, il s’agit généralement de cultures de
cellules de 24 à 48 heures. Les cultures sont trypsinées, comme pour les passages ou
les subcultures. Les cellules dissociées sont centrifugées pendant 10 mn à 2000 tours
par minute, Elles font l’objet d’un comptage et sont ajustées à la concentration 1,5 à 2
millions de cellules par ml dans un milieu constitué de : MEMG (69%), sérum de veau
foetal (20%), Diméthylsulfoxyde (1 O%),
Péni-streptomycine (1%). Puis, cette
suspension est répartie dans des cryotubes à raison de ? ml par tube que l’on garde
successivement dans un congélateur à -20°C (pendant 3 h), puis dans un congélateur
à -70°C où elles pourront rester pendant 6 mois. Cette durée de conservation peut être
de plusieurs années lorsque les cellules sont gardées dans de l’azote liquide (-196°C).
Donc, il est possible, par cette cryoconservation, d’éviter d’avoir le souci permanent de
l’entretien des cultures cellulaires.
2.2. Technique de culture de testicules de mouton
Les testicules sont prélevés aseptiquement et recueillis dans une boîte de pétri
stérile. Ils sont ensuite décapsulés à l’aide de pinces et de ciseaux, puis découpés en
menus morceaux.
2 5
Le hachis est repris avec une solution de MEMG t 10% de sérum de veau foetal t 1%
d’inhibiteurs. Cette suspension de tissus est transférée dans un flacon de culture qui
est placé à l’étuve à 37”C, pendant au moins 72 h. Au cours de cette période, les
cultures présentant des contaminations indésirables (bactérienne ou fongique) sont
écartées, au contraire celles avec un développement cellulaire vont servir aux études
virologiques, notamment les isolements et les identifications.
2.3. Technique d’inoculation des cellules
La majorité des virus pathogènes se multiplient dans quelques cellules. Pour
chaque virus, il est nécessaire de déterminer les conditions optimales de réplication qui
sont entre autres, la période qui s’écoule entre la période d’inoculation et la présence
des modifications cellulaires.
Pour le virus de la DNCB, l’existence de l’infection spécifique est étudiée par
l’inoculation de culture de cellules primaires de mouton.
Cette technique d’inoculation est appliquée aussi bien aux cellules rénales
I
qu’aux cellules testiculaires. Elle suit le processus suivant :
2.3.1 Dilution de la souche virale.
La dilution virale est utilisée aux quatre dilutions qui sont : IO-‘, iO>*, 10w3 et 10M4.
I
Ces dilutions sont réalisées avec le milieu de culture MEMG. Le milieu, servant de
diluant, est réparti dans quatre tubes, à raison de 1,8 ml par tube. Chaque tube
correspond à une dilution. Dans le premier tube, 0,2 ml de la souche virale est ajouté
pour obtenir la dilution 10-l. Avec une pipette stérile, la suspension est bien
homogénéisée.
De ce premier tube, on préléve 0,2 ml que l’on transfére dans le deuxième tube
pour obtenir la dilution IO-*. Après chaque dilution, on prend le soin de changer de
I
pipette et de bien mélanger.
La dilution 10m3 est obtenue dans le troisième tube qui reçoit CI,2 ml du deuxième
tube. Et enfin, le quatrième tube correspond à la dilution 10V4.
I
Les opérations de dilution de I’inoculum viral sont réalisées dans de la glace
fondante, c’est à dire à la température de 0°C.
26
2.3.2 Infection des cellules.
L’infection des cellules est réalisée avec I’inoculum viral. Des flacons de culture
de cellules confluentes (de rein et de testicule) sont choisis. Pour chaque type de
cellules, deux flacons seront utilisés : un flacon recevra I’inoculum viral et le deuxième
flacon est considéré comme témoin négatif c’est à dire ne recevant pas d’inoculum
viral.
Pour l’inoculation des cellules proprement dite, on procède ainsi : les flacons de
culture sont vidés de leur milieu de culture et sont égouttés très soigneusement. On
met sur les cellules par 1 ml de suspension virale à la dilution ‘10m4. II est nécessaire de
bien étaler I’inoculum sur les cellules. Cet inoculum est laissé en contact avec les
cellules pendant une heure à 37”C, temps nécessaire pour que les particules virales
s’adsorbent sur les cellules.
Au bout de cette période, I’inoculum est éliminé et est remplacé par 10 ml de
MEMG à 5% de sérum de veau. Ce milieu à 5% de sérum de veau est dit milieu
d’entretien contrairement au milieu à 10% de sérum de veau ou milieu de croissance.
Ces flacons inoculés ainsi que les flacons témoins sont placés à l’étuve à 37°C.
Dès le lendemain, on vérifie que les flacons ne sont pas contaminés par des
bactéries ou champignons. Les flacons présentant une croissance bactérienne ou
fongique sont éliminés. Au contraire, les flacons de culture non contaminés sont remis
à l’étuve jusqu’au quatrième jour à partir duquel l’examen des boîtes devient quotidien.
De plus, des prélèvements de 0,5 ml du milieu surnageant les cultures sont
effectués et gardés à la température de -20°C. Ces prélèvements doivent permettre de
déterminer l’évolution dans le temps de la production de virus par les cellules infectées.
2.4. Méthodes d’identification du virus de la DNCB et titrage
La plupart des virus provoque des modifications cellulaires variées, et
généralement spécifiques : ce sont les effets cytopathogènes. Ceux-ci sont consécutifs
à l’invasion du virus dans la cellule hôte où il se multiplie à ses dépens.
27
II provoque des altérations cellulaires de plus en plus importantes au fil du temps qui
conduisent finalement à la mort de la cellule. Ces lésions cytopathiques sont facilement
décelables par simple examen optique des cellules à l’état frais et après coloration.
Cependant, d’autres virus provoquent des modifications intracellulaires, qui ne
sont pas apparentes au microscope optique malgré une activité effective du virus dans
la cellule.
Dans ce cas, on utilise des méthodes indirectes de détection telles que : la
technique d’utilisation des anticorps fluorescents (ATANASIU, 1976). Ces derniers se
fixent sur l’antigène viral et le complexe formé pourra être révélé grâce à la
fluorescence visible au microscope à ultraviolet. C’est cette technique que nous avons
utilisée pour confirmer l’examen des lésions spécifiques.
2.4.1 Observation de l’effet cytopathogène (ECP)
Les lésions cytopathiques sont facilement décelables avec ou sans coloration.
a/ Examen à l’état frais : il faut toujours se référer aux témoins pour noter les
éventuels changements cytologiques. L’observation des effets cytopathogènes au
microscope est poursuivie jusqu’à la destruction quasi - complète du tapis cellulaire.
bl Examen après coloration au Giemsa : cette technique présente les étapes
suivantes :
la fixation.
Pour fixer les cellules, on enlève le milieu de culture. On lave une fois à l’eau
physiologique et on met le méthanol de manière à bien recouvrir les cellules. La fixation
est rapide car 3 à 5 minutes suffisent.
la coloration.
On utilise la solution de Giemsa suivante : 1 ml de Giemsa pour 14 ml d’eau
distillée. On recouvre la culture de ce colorant et on laisse agir pendant 20 mn. Au bout
de ce temps d’incubation, on élimine l’excès de colorant puis on rince la culture à l’eau
distillée.
28
On déshydrate pendant 15 secondes en plongeant la plaque dans un bain d’acétone
puis pendant 15 secondes dans un bain de toluène. On laisse sécher avant d’observer
au microscope optique.
2.4.2 Fixation des anticorps fluorescents.
Le principe consiste à déterminer la présence d’un antigène dans une cellule au
-
moyen d’anticorps spécifiques rendus visibles à la lumière ultraviolette, par couplage
avec une substance fluorescente (isothiocyanate de fluorescéine).
La technique d’immunofluorescence indirecte utilisée est la suivante : deux
flacons de cellules rénales et deux de cellules testiculaires (flacon inoculé et un témoin)
sont utilisés, les milieux de culture sont éliminés. Avec le grattoir en caoutchouc, on
racle une petite zone du tapis de cellules. Ces cellules grattées sont reprises dans un
tube contenant 1 ml d’eau distillée. Elles sont déposées en “spot” sur des lames porte-
objet à raison de 10 1.11 de suspension cellulaire par spot (Fig. 12). On met des cellules
saines sur la première ligne et sur la deuxième ligne des cellules infectées. On laisse
sécher sous la hotte avant de fixer à l’acétone pendant 10 mn à 4°C. Les lames sont
séchées à nouveau, puis on met les sérums dilués au 1/20ème dans du PBS. En effet,
on dispose d’un sérum positif en anticorps provenant d’un animal malade (sérum
positif) et d’un sérum de veau foetal (sérum négatif) Une goutte de sérum positif est
déposée dans le premier trou et une du sérum négatif dans le deuxième trou et ainsi de
suite. On incube pendant 40 mn à 37°C avant de laver 2 fois pendant 10 mn avec du
PBS.
Une goutte de conjugué (anti-sérum) est déposée dans chaque trou, le conjugué
est utilisé aux dilutions suivantes : I/l 0, 1120, 1/40, l/lOO.
L’incubation se fait pendant 40 mn à 37°C dans une chambre humide puis on
lave 2 fois pendant 10 mn avec du PBS. Le rinçage se fait à l’eau distillée et on laisse
LI
sécher à l’air.
Lorsque la lame est sèche, on dépose une goutte de glycérine tamponnée sur
chaque trou avant de recouvrir d’une lamelle.
c
-
29
Figure 12 : Lame porte-objet pour immunofluorescence
30
Enfin, la lecture se fait grâce à un microscope à fluorescence dans une chambre
noire.
2.4.3 Titrage du virus de la D.N.C.B. dans les différentes récoltes.
Le titrage d’une suspension de virus est une évaluation du nombre de particules
virales susceptibles de provoquer une manifestation déterminée chez un hôte sensible.
Pour atteindre ce résultat, la suspension 6 titrer est diluée suivant une progression
géométrique et on inocule un groupe d’hôtes pour chaque dilution. Le choix du facteur
de dilution dépend du système virus - hôte étudié et des conditions de travail. Dans
notre expérience, des dilutions logarithmiques (facteur de dilution = 10) sont utilisées,
l’hôte est une culture cellulaire et le phénomène qui représente la réponse à l’action du
virus est l’effet cytopathogène.
II existe plusieurs sortes de titrages : la méthode des plages, le titrage en tube
(macrométhode) et le titrage sur plaque (microméthode). C’est cette dernière
technique que nous utiliserons dans notre étude. Elle présente l’avantage d’être
beaucoup plus sensible que les autres méthodes.
Les plaques utilisées sont de matière plastique traitée portant 96 godets (8 x12)
à fond plat circulaire de 7 mm de diamètre,. Elles sont munies d’un couvercle non
étanche.
Une étuve pour gazage en mélange air - CO, (95% et 5% respectivement) est
donc indispensable pour la culture dans les plaques de ce type.
Exécution de la réaction :
D’abord une dilution de 10 en 10 allant de 10-l à 1 O-7 est effectuée sur la récolte
du premier jour. La dilution 10-l est distribuée dans les 8 godets de la première ligne de
la plaque (à raison de 100 ul par godet), ensuite la dilution 10.’ dans la deuxième ligne
et ainsi de suite jusqu’à la dilution 10e7 (Fig. 13).
Les deux dernières lignes de godets de la plaque sont des témoin - cellules donc
au lieu de mettre une suspension virale, on ne mettra que 100 1-11 de diluant (M.EM.G).
31
Dilutions virales
Témoin-cellules
10-l
10.*
10-3
104
10-5
1 o-6
1 o-’
Figure 13 : Schéma d’une plaque de titrage
32
Puis, on distribue sur la plaque les cellules en suspension dans du milieu nutritif
(M.E.M.G à 10% de sérum de veau) toujours à raison de 100 l-11 par godet. La
suspension cellulaire utilisée a une concentration cellulaire = 150000 cellules/ ml.
Pour chaque récolte, le titrage s’effectuera sur les deux types de cellules étudiées
(rein et testicule) qui sont de la même origine et de la même génération. Les mêmes
procédés de .ditution et de distribution sont répétés pour les réc;o!tes des 2ème au 10*me
jours.
Toutes les plaques sont ensuite gardées à l’étuve à CO, après les avoir
identifiées correctement en marquant sur la plaque le jour de récolte et le type de
-
cellules utilisées.
II est nécessaire de surveiller I’acidification de la culture les jours suivants pour
-
l’ajuster au besoin. La lecture des plaques se fait après une durée d’incubation
arbitraire de 4 jours habituellement et doit être poursuivie jusqu’au 1 Oème jour.
L
2.4.4 Calcul de la dose infectante 50% (Dl 50% ou DICT SO).
Le calcul peut se faire de deux façons :
- soit en utilisant la méthode de REED et MUENCH qui a pour but d’améliorer par un
artifice de calcul, l’alignement de points expérimentaux qui se trouvent répartis
symétriquement de part et d’autre du point 50%. Puis, de calculer la Dl 50% par
interpolation entre l’échelle des dilutions et l’échelle des pourcentages. Cette méthode
est basée sur le principe suivant : tout hôte atteint à une dilution donnée, aurait
obligatoirement été atteint à une dilution plus forte et inversement, tout hôte indemne à
une dilution donnée, l’aurait été à fortiori à une dilution plus faible. Ce raisonnement
implique évidemment l’existence d’un “seuil ” individuel. La faiblesse de cette méthode
réside donc sur le cumul des réponses qui ne se justifie nullement dans le cas de
titrage en cultures cellulaires, où la réponse de l’hôte ne dépend que de la présence ou
--
non d’unités infectieuses.
- soit par la méthode de SPEERMANN - KARBER. Les points expérimentaux doivent
s’échelonner entre 0 et 100% et avoir une distribution à peu près symétrique.
3 3
Le calcul du titre se fait grâce à la formule statistique suivante : t =X 0 + d (P - 0,s )
où :
t = log dose d’effet cytopathogène 50% (DICT50) par volume d’inoculation
X,= log de la dernière dilution donnant 100% de positifs (E. C. P.)
d = échelle logarithmique de dilution (ici, d = 1 car dilution de 10 en 10)
P = somme des proportions des positifs à partir de la dernière dilution (incluse)
donnant 100% de positifs.
Le titre du virus rapporté à un volume de 1 ml est : T = 10 f+t DICT50 / ml, où,
f = log du facteur de X pour avoir 1 ml; il est égal à 1 (log 10) dans le cas de cette
étude, puisque 100 ul de suspension virale sont utilisés comme volume d’infection
2.4.5 Application du test U de MANN et WHITHNEY
Ce test a pour objectif de comparer 2 échantillons d’une variable quantitative sans
rien supposer des lois de probabilité de la variable dans ces échantillons. On procède
comme suit : d’abord on classe les titres de la série “testicules” (X) et celles de la série
“reins ” (Y) du plus petit au plus grand. Ensuite on compte pour chaque ” X ” le nombre
de ” Y ” qui lui sont inférieur et on les additionne. La somme est notée U, pour les ” X ”
et U, pour les ” Y “. La plus petite valeur entre U, et U, sera notée U. Elle sera
comparée à U,, que l’on lira sur la table (annexe), si U ) U,, au seuil fixé (5%) on en
conclura que la différence de sensibilité entre les deux types de cellules n’est pas très
significative. Dans le cas où U < U,, alors on pourra en déduire que la différence de
sensibilité est assez significative.
RESULTATS
34
1. Evolution des tapis cellulaires non infectés
Du fait de la similitude des stades ler,2ème et 3émejours d’une part et 5ème au 7ème
jours d’autre part les lectures sont faites aux Ier, 4éme et 7ème jours.
1.1 Observation des cellules rénales.
Au premier jour, les cellules individualisées sont arrondies et ont tendance à
tomber au fond du support. Par endroits, on a des fragments de tissus qui
correspondent à des néphrons. L’ensemencement d’environ 175000 cellules/ml permet
d’avoir un tapis confluent sans que les cellules n’aient trop à s’étirer pour occuper toute
la surface.
Au quatrième jour, les cellules prolifèrent et tendent à s’assembler pour occuper
toute la surface du support. Le tapis cellulaire naissant forme alors un épithélium
simple. Quelques rares foyers de cellules fibroblastiques sont observés. Puisque la
mitose dure en moyenne 2 h, il apparaît très vite des densités importantes de cellules
I*
qui croissent de façon exponentielle. Néanmoins, les cellules forment toujours une
culture en monocouche.
Au septième jour, le tapis cellulaire est pratiquement complet avec de
nombreuses cellules épithéliales et quelques cellules fibroblastiques. Toute la surface
du support est maintenant recouverte de cellules. Le tapis est très confluent avec des
cellules jointives. La croissance des cellules semble arrêtée(Fig. 14 et 15).
1.2 Observation des cellules de testicules
Au premier jour, les fragments de tissus baignent dans un mince film de milieu. II
ZL
n’y a pas de cellules individualisées mais plutôt des amas initiaux de cellules.
Au quatrième jour, on voit des cellules d’apparence épithéliale qui rayonnent
autour des fragments. Ces derniers s’étant adsorbés au support, initient la prolifération
cellulaire. On commence à voir des cellules bien définies qui se sont détachées du
II)
tissu originel.
35
Au septième jour, la boîte est confluente à 80%. Il apparaît deux types de
cellules associés aux fragments initiaux.
Certaines cellules sont allongées et s’organisent en faisceaux. D’autres sont
cubiques et se disposent en couches concentriques autour des faisceaux.
2. Evolutkm des tapis de cehles infectées
2.1 Observation de l’effet cytopathogène (ECP)
Nous avons observé des cellules rénales et testiculaires à l’état frais et après
coloration.
Pour les cellules rénales à l’état frais, au quatrième jour, il y a par endroits des
cellules plus grosses et arrondies qui sont réfringentes. Elles semblent se détacher du
reste du tapis comportant des cellules plus petites. La boîte témoin ne présente aucune
modification cytologique.
Après coloration, quelques inclusions acidophiles sont colorées en rouge dans la
portion cytoplasmique de la cellule. Ces rares inclusions colorées n’existent pas dans la
boite témoin (Fig. 16 et 17).
Au septième jour, on a des foyers de lésion sur presque toute la surface. La
cellule n’éclate pas encore, elle finit par se recroqueviller en un amas de débris qui
renferme la plus grande part des virions qu’elle a produits. Aussi, les inclusions
colorées qui apparaissent dans le cytoplasme deviennent plus importantes. Leur
abondance dans la cellule infectée est proportionnelle à la multiplicité d’infection. La
boîte témoin reste intacte (Fig. 18).
Les cellules du testicule examinées à l’état frais, révèlent au quatrième jour un
nombre relativement important de cellules réfringentes. Après coloration, les cellules de
testicules infectées, comparées aux cellules témoins, présentent quelques inclusions
colorées. Ces dernières s’avèrent cependant plus importantes que dans les cellules de
reins.
Au septième jour, la destruction du tapis cellulaire est quasi - complète. II n’est
pas observé de cellule testiculaire intacte.
36
Figure 14 : Tapis complet d’une culture primaire de reins au septième jour.
Figure 15 : Agrandissement d’une partie de la photo ci dessus, les bordures des
cellules sont plus nettes . On note la présence de fragments de tissus résiduels qui
forment des amas plus foncés d’où partent des cellules allongées d’allure
fibroblastique.
Figure 16 : Cellules rénales colorées au Giemsa après 4 jours d’infection.
L’ECP est diffus avec beaucoup d’inclusions colorées dans les cellules. Le tapis
commence à se dégrader.
Figure 17: Cellules rénales témoins , colorées après 4 jours d’incubation sans virus. Le
tapis est intact et on ne décèle aucune coloration dans les cellules.
Figure 18 : Cellules rénales infectées, observées au septième jour. Les cellules
semblent se détacher du tapis en s’arrondissant , la coloration dans les cellules devient
plus vive.
Figure 19 : Amas de cellules rénales fluorescentes au 7eme jour
39
Les cellules de testicules se prêtent particulièrement bien à la multiplication virale, le
virus se réplique efficacement avant I’autolyse de son hôte. Cela explique le grand
nombre de virions visibles après coloration dans le cytoplasme de ces cellules.
2.2 Observation de la fluorescence spécifique.
-
Pour les cellules renaies comme pour les cellules testiculaires les resuitats
obtenus pour les trous témoins (cellules saines et/ou sérum négatif) ne montrent
-
aucune fluorescence. Ceci témoigne de l’absence de réaction immunocytochimique.
-
Dans le cas des trous avec du sérum positif et cellules infectées, nous
observons au quatrième jour une fluorescence relativement faible pour les cellules
rénales. Cette fluorescence apparaît plus importante pour les cellules testiculaires.
Au septième jour, la fluorescence augmente pour les deux types cellulaires.
Mais elle est toujours plus élevée pour les cellules de testicules (Fig. 19)~
2.3 Lecture des plaques de titrage.
-
Le résultat des titrages effectués sur les récoltes des 1”’ au 10éme jours des deux
types cellulaires, sont présentés dans le tableau 1.
Au niveau des prélèvements du 1”’ jour, on observe la présence d’effet
cytopathogène aussi bien pour les cellules testiculaires que pour les cellules rénales,
avec des titres respectifs de 103.87 et 103.75 DCP50 par ml. Ces titres vont en
augmentant jusqu’au 8ème jour et commencent à baisser à partir du gème jour.
La représentation graphique de ces observations (Fig. 20), décrit une
superposition de deux arcs à partir du 7ème jour. Du 1”’ au gème jour on a un léger
décalage entre les deux courbes. D’une manière générale ces deux courbes ont une
même cinétique.
40
2.4’ Calcul de titre par la méthode de SPEERMANN - KARBER
Exemple du premier jour (J 1) :
cellules de testicules : t = 2 + 1 ( Il/8 - 0,5 ) = 2,87
T = 10’*2,87= 103~87DICT50/ml
cellules de reins :
t = 2 + ( 1018 - 0,5 ) = 2,75
T = 10”7~75=Î03~75DlCT50/ml
Dans la pratique la méthode de SPEERMANN - KARBER est la plus usitée,
parce que plus facile et plus rapide à calculer.
Les titres des 9 autres jours sont calculés de la même manière et sont confinés dans le
tableau 1.
2.5 Test U de MANN et WHITHNEY.
Les titres calculés pour chaque jour sont ici remplacés par des classements par
ordre croissant. Aussi le plus grand titre occupe la première position et ainsi de suite
jusqu’à la 20ème place sans tenir compte du type de cellule. Lorsqu’on a 2 fois le même
titre on ajoute 0,5 au rang occupé et le nombre (rang) qui vient aussitôt après est
éliminé (Tableau 2).
41
Jl J2 J3 J4 J5 J6 J7 J8
J9
J?O
DICT
(test)
3,87
4,62
512
5,62
5,87
6,00
6,25
6,50
6,37
6,25
DICT
Tableau 1 : Titres des récoltes en fonction du temps d’infection.
Jl
J 2
J3 J4
J5 J6 J7
J 8
J 9
JIO
Total
rang
2
5
7
9
11
1:2,5
15,5
20
18,5
15,5
116
de X
,i.,.,.,,i;-,,;;i,
Tableau 2 : Classement des rangs de ” X ” et de ” Y ”
n,= ‘l0 et n2 = 10 (on a 10 titres pour chaque type de cellule)
alors n= n,xn,=10x10=100
U,=n+n,(n,+1)/2-Total(Y) ad’où
U, = 100 + 10 (1 12) - 92,5 = 62,5
L
U, = n + n, (n, + 1) / 2 - Total (X) c3 d’où
U,=100+10(11/2)-116=39
U étant le plus petit entre U, et U, (39), U,, (23) : étant celle qui est donnée par la table
L
jointe en annexe. U est donc supérieur à U,, au risque 5%.
m
4 2
TITRE EN FONCTION DU TEMPS
7
6
5
I
4
- MCT(test)
3
- lXT(rein)
2
I
1
0
Jl
J2
J3
J4
J5
J6
J 7
J 8
J9
J 10
Figure 20 : Evolution du titre en fonction du temps
9
1
9
9
J
9
1
1
1
1
0 z
J
9
I
J
J
43
Cette série d’expériences nous a permis de suivre l’évolution de la cellule vivante
en culture in vifro.
1. Caractères des cellules non infectées :
Ces deux systèmes cellulaires nous permettent d’apprécier l’une et l’autre des
méthodes de mise en culture.
En effet, pour une culture de fragments de tissus comme dans le cas du
testicule, il apparaÎt fréquemment autour des fragments cultivés, des proliférations et
des migrations cellulaires moins différenciées” Cette méthode représente la transition
avec les cultures cellulaires proprement dites qui offrent une plus grande homogénéité,
comme dans le cas du rein. L’introduction de la trypsine dans la préparation de cultures
cellulaires destinées à la virologie est due à DULBECCO (1952). Elle permet d’avoir une
suspension homogène de cellules séparées. Le tapis cellulaire qui en résulte est
beaucoup plus uniforme, avec la mise en oeuvre d’une plus grande quantité de
cellules.
Outre la technique de mise en culture choisie, l’aspect des cellules peut changer
selon les conditions et l’intensité du rnétabolisme. Les cellules des tissus
embryonnaires qui “poussent” dans un milieu artificiel diffèrent de celles qui existent
dans l’organisme; notamment par l’utilisation d’un support solide, par l’apport d’un
-
milieu modifié riche en facteurs de croissance contenus dans le sérum d’un animal
jeune. Cependant, ces cultures sont soumises à des régulations dont on retrouve les
analogues dans l’organisme. Lorsque les cellules sont ensemencées, leur orientation
est quelconque, mais lorsqu’elles se rencontrent elles tendent à s’orienter parallèlement
l’une à l’autre. Au stade de la confluence, les cellules sont jointives et leur division
s’arrête quelle que soit la richesse du milieu en métabolites. C’est le phénomène de
-
topo-inhibition. Ensuite, on a vu que leur croissance était aussi limitée dans le temps
(2 ou 3 passages). Nos résultats sont conformes à ceux décrits par MONTAGNIER (1976)
qui parlait ainsi de la “régulation du comportement social des cellules”.
II apparaît plus commode d’employer les reins qui assurent un rendement
cellulaire plus important et évitent les interventions fréquentes comme les trypsinations.
44
En effet, les deux reins, dès leur première trypsination fournissent suffisamment
de matériel cellulaire pour les opérations ultérieures de titrage, d’isolement et de
production de vaccins. Alors que pour les testicules, plusieurs passages sont
nécessaires pour obtenir une même quantité de cellules. Ces trypsinations fréquentes
provoquent des altérations de la membrane cellulaire donc la mort de la cellule.
2. Caractères des cellules infectees :
La forme de la cellule est altérée pour les deux exemples. Elle devient plus
grosse et s’arrondit. On constate également une baisse de l’adhésivité des cellules par
rapport au support et des cellules entre elles. Le tapis confluent auparavant doté de
cellules jointives devient plus lâche. Ceci s’explique par la phagocytose des particules
virales, qui désorganise le cytosquelette. C’est ce dernier qui donne à la cellule normale
sa forme caractéristique.
Il ressort de cette étude que les cellules testiculaires sont légèrement plus
sensibles au virus de la DNCB que celles du rein. En effet, d’abord les différentes
colorations (Giemsa et immunofluorescence) révèlent une présence toujours plus
marquée de particules virales dans les cellules testiculaires par rapport aux cellules
rénales. II apparaît aussi à la lecture des titrages que le taux de virus est toujours
sensiblement plus important dans les cellules de testicules. Toutefois, la similarité de
l’allure des deux courbes d’évolution indique que le virus se comporterait de la même
façon dans les deux types cellulaires. La virémie est maximale au 8ème jour ensuite aux
gème et 10ème jours, la quantité de virus circulants est dégressive. Cette observation est
d’autant plus importante qu’elle témoigne encore une fois de l’état de parasite strict du
virus. Lorsqu’il n’y a plus de cellules viables pour ” héberger ” le virus, celui-ci meurt à
son tour. Ici, le tapis est totalement détruit à partir du 8ème jour, d’où la baisse du titre
notée aux 9 et 10ème jours. Le décalage enregistré entre les deux tracés s’expliquerait
par la différence de sensibilité entre les deux types cellulaires et d’après le graphique,
les cellules de testicules sont plus sensibles au virus DNCB que les cellules de reins,
surtout lors des premiers jours d’infection. D’ailleurs ce degré de sensibilité a pu être
évalué grâce au test U de MANN ET WHITHNEY qui nous a montré que la différence
de sensibilité n’était pas significative entre les deux types de cellules.
45
Ces observations répondent à nos attentes car selon le Manuel de VOIE (1996),
les tissus testiculaires de mouton sont les plus sensibles à la DNCB, ensuite viennent
les reins, puis les muscles et bien d’autres tissus épithéliaux.
La DNCB peut conduire à une infertilité temporaire ou permanente chez le mâle
ce qui traduit donc une lésion des organes génitaux in vive. Ce tropisme pour cet
-
organe se retrouve même lorsqu’il s’agit de tissus testiculaires cultivés in vitro.
Pourtant, les cellules rénales deviennent sensibles au virus après explantation et
culture in vitro, tandis que l’organe ne semble pas affecté in situ. C’est une observation
classique en virologie que le spectre de sensibilité des cultures vis à vis des virus est
L
beaucoup plus large que celui des tissus ou organes dont elles dérivent. Le fait qu’une
cellule insensible dans l’organisme le devienne lorsqu’on la met en culture peut
s’expliquer soit par un remodélement des motifs antigéniques (démasquage de
récepteurs préexistants), soit par un processus de différenciation (acquisition de
récepteurs nouveaux). Cela nous amène tout naturellement à une question. Comment
des cellules d’un même individu, issues d’un même oeuf avec une hérédité identique
peuvent elles devenir aussi différentes les unes des autres ? C’est la différenciation
cellulaire. A la suite de cette dernière, les cellules acquièrent des protéines
particulières, avec une morphologie et des possibilités fonctionnelles caractéristiques.
Les récepteurs des cellules testiculaires seraient donc très tôt fonctionnels in vive alors
que ceux des cellules rénales le deviennent in vitro. II s’agirait donc pour les cellules
rénales d’un démasquage de récepteurs préexistants. La mise en contact d’un virus
avec une cellule sensible entraîne l’attachement des virions à la surface de la cellule
par le biais d’une attraction électrostatique. Cette attraction s’établit entre les charges
complémentaires de l’enveloppe virale et celles des récepteurs spécifiques de la
cellule.
Les cellules rénales comme les cellules testiculaires sont permissives au virus
de la DNCB mais avec une sensibilité différentielle. Cependant il serait plus avantageux
d’utiliser les cellules rénales pour une production massive de virus, puisque les cultures
de rein offrent plus de matériel biologique.
46
Souvent caractéristique d’un virus donné, I’ECP même s’il ne permet pas une
détermination complète du virus, oriente l’expérimentateur quant à la nature de
l’infection, en précisant le groupe de virus auquel on a à faire.
Pour une meilleure analyse des ECP il est important d’avoir des cultures témoins
car, souvent les cultures d’explants sont sujets à des dégradations non spécifiques qui
pourraient conduire à des interprétations erronées
Des lésions spécifiques sont observées et la coloration au Giemsa a pu révéler
la présence de particules virales dans le cytoplasme des cellules. Ces inclusions sont
semblables à celles qui sont décrites dans la littérature plus connues sous le nom de
corps de GUARNIERI et que l’on confert généralement à l’activité d’un poxvirus.
L’identité du virus est confirmée par la fixation élective d’anticorps anti-DNCB, couplés
à un fluochrome, sur les cellules infectées. Les observations faites après chaque
technique utilisée, ont conduit à des conclusions partielles mais encore incomplètes
lorsqu’elles sont exploitées individuellement.
Ainsi étape après étape, on est arrivé à identifier de façon assez précise le virus
de la DNCB. Néanmoins les méthodes utilisées dans ce travail ne permettent pas
toujours à elles seules la détermination complète du type de virus. Souvent des
épreuves sérologiques viennent corroborer ces résultats.
Mieux, avec la naissance de la microscopie électronique comme le montrait
NDIAYE (1986) “lorsqu’aucune donnée sérologique ne permet de rattacher un virus à
un groupe donné, seul l’examen en microscopie électronique s’avère d’un apport
considérable pour la classification des virus.”
c
L
C
I
RESUME ET
I
PERSPECTIVES
47
Des cultures de premières explantations de reins et de testicules de mouton sont
réalisées puis infectées par le virus de la Dermatose Nodulaire Contagieuse Bovine
(DNCB).
Différentes techniques de mise en évidence des effets cytopathogènes
consécutifs à l’activité du virus dans la cellule hôte ont pu être observées puis
analysées.
II ressort de cette étude que les cellules de testicules sont légèrement plus
sensibles au virus de la DNCB que les cellules de reins.
Mais à ce jour, le mode de pénétration du virus dans la cellule hôte est sujet à
-
controverses. Certains comme KIRN (1976), pensaient que seule l’attraction de charges
complémentaires suffisait. II est maintenant avancé la théorie des récepteurs
spécifiques (GIRARD et HIRTH, 1985). Aussi, une étude minutieuse des mécanismes
d’adsorption virale s’impose. Et cela ne peut se faire sans la microscopie électronique
associée à la biologie moléculaire. Ces deux techniques permettront l’étude
ultrastructurale, l’isolement et la purification des récepteurs membranaires. Des
inhibiteurs spécifiques et compétitifs de ce virus pourront être utilisés à des fins
thérapeutiques; aucun traitement spécifique de cette virose n’est encore disponible.
Avec l’avènement de la PCR (polymerase chain reaction), les nouvelles techniques de
Q
biologie moléculaire ont tendance à prendre le relais dans la préparation des vaccins.
En 1993, ROMERO et coll ont mis au point un vaccin recombinant peste bovine -
DNCB. Pourtant son utilisation reste encore balbutiante. Ce type de vaccin bivalent ne
risque - il pas de remettre en circulation le virus de la peste bovine dans les pays où
cette maladie est éradiquée?
Les avantages qu’offrent les biotechnologies sont nombreux : sensibilité exceptionnelle
de la PCR, précocité du diagnostic et sa grande fiabilité. Mais il n’en demeure pas
I
moins vrai que les principaux tests virologiques sont encore réalisés par sérologie. Les
vaccins produits à partir de cellules en culture offrent toujours des résultats
satisfaisants quant à la facilité d’exécution, de reproductibilité et surtout de coût.
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C
I
c
-
mn
-
I
SIb
-
L
II.
J
ANNEXE
#9
C
-
-
-
m
L
Mm
-
TABLE DES VALEURS DE U
n1
nc
2
3
4
S 6 r7 8
9 10 11
1 2 1 3
1 4 1J
1 6 17 1: 1 9 20
2
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0
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1
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1
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1
2
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6
6
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4
0
l
2
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4
S 6
7
t
9 10 11 11 12 43 13
‘5
0
1
2 3
S 6. 7
t 9 11 1 2 1 3 1 4 II 17 18
19 20
6
1
2
3 J
6
8 10 11 13 14. 16
1 7
1 9 21
22 24 2S 27
7
l
3
S 6
t 10
12 14”16 16 20 Z 24 26 21 30 32 34
8
0
2
4
6 8 t0 13 lS 17 19 22 Y 26 W 31 34 36 38 41
9
0
2
4
7 10 12 15
17 2 0 23 26 28 3 1
34 37 39 42 45 U
10
0
3
S
: 11
14 17 20 23 26 29 33 36 39 42 4S 48 S2 S S
II
0
3
6
9 13
16 19 22 2 6 30 33 37 40 44 47 SI
S S 58
62
1 2
1
4
7 l l 14 18 22 26 29 33 37 41 45 49 S3 51 61 6) 69
-
13
1
4
8
12 16 20 24 28 33 37 41
4S S O S4 49 63 67 72 76
m
1 4
1
S
9 13 17 22 26 3 1
3 6 40 4J S O S S S P 64 67 74’ 78 13
1s
1
S
10
14 19 24 W 34 39 U 49 S4 SP 64 70 71 80 8S 90
16
1
6 11
1S 21 26 31
37 ,42 4 7 If 59 64 70 7S 81
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1 7
2
6 11 17 22 28 34 39 4S Sl S7 63 67 71 81 87 93 99 1QS
w
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2
7 1 2 18 2 4 30 3 6 42 U SS 6 1 67 74 80 86 93 99 106 112
1 9
2
7 13
1 9 2S 32 38 4s 51 S(I
6S 72 78 ts P2 P P 106 Ii3 119
20
2
8 13 20 27 34 41 48 SS 62 69 76 83 90 91 SOS 112 Il9 127
Calculer U, et U2 (test de Mann-Whi tney, p. 30 >.
Prendre le “U” le plus faible et le comparer a la valeur lue dans
!a table à la croisée de n1 (effectif de l’échantillon 1) et de n2 (effectif de
I’~~:h~3nt.ili~y-i
2,)
‘3 ‘I W. C&.IS p e t i t qw? 1s valeur d e 1s t a b l e , l a diffh-enci e s t
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-.
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,
Titre : Contribution à l’étude du virus de la Dermatose Nodulaire
. Contagieuse Bovine sur culture de cellules primaires de moutoh.
Nom du candidat :
NDEYE FATOU TALL
Nature du Mémoire :
D.E.A. de Biologie Animale
Jury :
Président :
M. M ADY
NDIAYE
Membres :
MM. OMAR THIOM
TH IAW
YAYA
THIONGANE
MEïSSA
TOURE
111
- Soutenu le 28 Juin 1999 à 9h30 à I’Amphi 7
Résumé : Dans cette étude deux cultures de cellules de premières explantations
(reins et testicules de mouton) sont réalisées puis infectées par le virus de la
-
Dermatose Nodulaire Contagieuse Bovine (DNCB).
Les modifications cytologiques ou effets cytopathogènes (ECP)
consécutives à cette infection sont mises en évidence par des techniques de
111
colorations cytologique (Giemsa) et immunologique (immunofluorescence).
Le degré d’infection de ces cellules ou titre viral est déterminé grâce à la
méthode de SPEERMANN - KARBER. Les courbes d’évolution des titres en fonction
du temps d’infection, des deux espèces cellulaires ont montré une différence de
ol
sensibilité peu significative entre ces deux types de cellules. Ce qui a pu être
confirmé par le test U de MANN et WHITHNEY.
Mots-clefs : culture de cellules, première explantation, DNCB, ECP, titre
viral, sensibilité.
**.œ..?*
--lrr.-“*.--.
Titre : Contribution à I”étude du virus de la Dermatose Nodulaire
Contagieuse Bovine sur culture de cellules primaires de rnoutorx
Non? du candidat :
NDEYE FATOU TALL
Nature du Mémoire :
D.E.A. de Biologie Animale
Jury
Président :
M. MADY
NDIAYE
Membres :
MM. OMAR THIOM
II-i IAW
YA~A
TI-iIONGANE
MEïSSA
TOURE
- Soutenu le 28 Juin 1999 à 9h30 à I’Amphi 7
Résumé : Dans cette étude deux cultures de cellules de premières explantations
(reins et testicules de mouton) sont réalisées puis infectées par le virus de la
Dermatose Nodulaire Contagieuse Bovine (DNCB),
Les modifications cytologiques
ou effets cytopathogènes (ECP)
consécutives à cette infection sont mises en évidence par des techniques de
colorations cytologique (Giemsa) et immunologique (immunoflbloresr~eaPr-)
Le degré d’infection de ces cellules ou titre viral est déterminé grâce à la
méthode de SPEERMANN L KARBER. Les courbes d’evolution des titres en fonction
du temps d’infection, des deux espèces cellulaires wnt montré une drfference de
sensibilité peu significative entre ces deux types de cellules Ce qur a pu etre
confirmé par le test U de MANN et WHITHNEY.
.
Mots-clefs : culture de cellules, première explantatisn, DNCB, ECP, titre
viral, sensibilité,
<I>
Université Cheikh Anta-Diop de Dakar
.
Faculté des Sciences et Techniques
MEMOIRE DE D. E. A. DE BIOLOGIE ANIMALE
Présenté par
N’DEYE FATOU .TALL
soutenu le 28 Juin 1999 devant la commission d’examen :
Président : Mr.
Mady
NDIAYE
Membres :
mi Omar Thiom
THIAW
Yaya
THIONGANE
Meïssa
TOURl3
Aux membres de ma famille,
A mes amis
Affection et Estime.
REMERCIEMENTS
Ce travail a été réalisé au Laboratoire National de 1’Elevage et de Recherche
Vétérinaire (L.N.E.R.V) de l’Institut Sénégalais de Recherche Agricole (I.S.R.A),
II
au département de virologie.
Je remercie très sincèrement le Professeur 0. T. THIAW de l’Université
Cheikh Anta DIOP de Dakar pour sa collaboration efficace et chaleureuse. Vos
suggestions pour une rédaction claire et concise m’ont beaucoup éclairé tout au
long de la réalisation de ce document. Veuillez trouvez ici l’expression de toute ma
gratitude.
Mes remerciements vont également :
Au Dr. Y. THIONGANE chercheur à I’ISRA, qui a bien voulu m’encadrer malgré
ses nombreuses sollicitations quotidiennes. La rigueur scientifique qui vous anime,
les remarques pertinentes que vous faites à chaque fois que l’on vous présente un
travail, m’ont beaucoup aidé quant à l’orientation de mes recherches. Soyez assuré
de ma gratitude et de mon respect.
Au Dr M. NDIAYE de la Faculté des Sciences et Techniques de Dakar qui nous
fait l’honneur de présider le jury.
-
Au Professeur M. TOURE de la Faculté de Médecine et de Pharmacie: c’est un
grand honneur pour nous de vous compter parmi les membres de notre jury.
A tout le personnel technique du département de virologie du L.N.E.R.V qui m’a
apporté toute l’assistance technique nécessaire à l’élaboration de ce travail.
A Monsieur 0. MBODJ, responsable du centre de formation et des bases de
données du service informatique de la Direction Générale de I’ISRA, qui a mis
toute sa compétence et son savoir faire à ma disposition.
S O M M A I R E
-
.
INTRODUCTION . * . , . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . , . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
*. 2
I
l.Généralités sur la Dermatose Nodulaire Contagieuse Bovine (DNCB)... . . . . . . . . . . . . 3
1 ADéfinition . . . . . , . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3
II,
1.2. Symptômes .,.... . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .., . . . . . . . . . . . . . . . * . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
4
1.3. Importance de cette maladie. ..................................................................
4
2.Généralités sur les cultures de cellules.........................................................
8
2.1. Définitions .............................................................................................
9
I
2.2. Principe des systèmes de cultures de cellules ............................................
9
2.3. Types de cultures cellulaires...................................................................
11
2..3.1. Les cellules de première explantation ou cellules primaires.. ................ . 1
2.3.2. Les cellules de souche ..................................................................
13
2.3.3. Les cellules de lignée continue........................................................
13
2.4. Intérêt des cultures de cellule..................................................................
15
MATERIEL ET METHODES .............................................................................
15
1. Matériel ....................................................................................................
16
1 .l . Choix du foetus .....................................................................................
16
1.2. Souche virale ou inoculum......................................................................
16
1.3. Milieux de cultures et solutions tampons de trypsine ................................... .16
1.3.1. Les solutions salines.......................................................................
16
1.3.2. Les milieux nutritifs .......................................................................
..16
l -
1.4. Les antibiotiques et antifongiques ............................................................
17
1.5. Matériels de laboratoire ..........................................................................
17
2. Méthodes ...................................................................................................
18
2.1. Technique de culture de reins de mouton................................................ ..18
2.1 .l. Prélèvement des reins...................................................................
.18
I
2.1.2. Dissection du rein ..........................................................................
18
2.1.3. Trypsination du cortex rénal ............................................................
21
2.1.4. Entretien des cellules.....................................................................
23
2.1.5. Conservation des cellules ................................................................
24
a/ Une conservation par ralentissement du métabolisme ......................... ..2 4
-
b/ Une conservation par congélation ou cryoconservation ...................... ..2 4
2.2. Technique de culture de testicules de mouton ............................................... 24
2.3. Technique d’inoculation des cellules ............ ................................................ 25
2.3.1. Dilution de la souche virale ................................................................
25
2.3.2. Infection des cellules........................................................................
26
2.4. Méthodes d’identification du virus de la DNCB et titrage ................................. 26
2.4.1. Observation de l’effet cytopathogène (ECP) ........................................ ..2 7
a/ Examen à l’état frais............................................................................
27
bl Examen après coloration au Giemsa .................................................... ..2 7
2.4.2. Fixation des anticorps fluorescents .................................................... .28
2.4.3. Titrage du virus de la D.N.C.B. dans les différentes récoltes................... .30
2.4.4. Calcul de la dose infectante 50% (Dl 50% ou DICT 50) ......................... .32
2.4.5. Application du test U de MANN ET WHITHNEY...................................... 33
RESULTATS ...................................................................................................
34
1. Evolution des tapis cellulaires non infectés ................................................... .34
u
1.1. Observation des cellules rénales ............................................................. ..34
1.2. Observation des cellules de testicules . . . . . . . . . ., . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..34
.
2. Evolution des tapis de cellules infectées . . . . . . . . . ” . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .35
2.1. Observation de l’effet cytopathogène (ECP) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 35
I
2.2. Observation de la fluorescence spécifique . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . , . . . . . . . . . . . . . . . . . . , . . . . . . .39
2.3. Lecture des plaques de titrage... . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..39
2.4. Calcul de titre par la méthode de SPEERMANN - KARBER... . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .40
-_.
2.5. Test U de MANN ET WITHNEY. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . e.. . . . . . . . . . . . . . . . .I... . . . . . . . . . . . . . . . . . . 40
DISCUSSION . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . * . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 43
I
1. Caractères de cellules non infectées. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ~ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 43
2. Caractères des cellules infectbes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .44
RESUME ET PERSPECTIVES .......................................................................... ..4 5
-
BIBLIOGRAPHIE ............................................................................................
..4 8
-
-
INTRODUCTION
2
Les êtres vivants sont caractérisés par une organisation ou plutôt une hiérarchie
d’organisations complexes qui va de l’atome à la molécule. Ces molécules s’imbriquent
à leur tour selon des schémas précis en organites intracellulaires. Ceux-ci s’intègrent
pour former des cellules en obéissant à quelques plans fort simples. En effet, les
cellules de même genre se groupent (dans la majorité des espèces) en tissus.
Plusieurs tissus différents forment des organes, associés pour constituer des individus
harmonieux.
La cellule représente la plus petite portion de matière vivante qui puisse vivre
isolée de manière complète et, capable de se reproduire. En effet, toutes les cellules
d’un organisme dérivent les unes des autres par mitose, qui est l’un des phénomènes
les plus fondamentaux de toute la biologie. A l’issue de la mitose, une cellule
somatique initialement diploïde (2N chromosomes) conduit à deux cellules filles
identiques porteuses de la même information génétique. Ce phénomène si bien réglé,
dont la fréquence est rigoureusement contrôlée dans un tissu normal, peut devenir
incohérent (CAROSELLA, 1995). Cette anomalie donne naissance à une cellule dite
transformée. Cette transformation se traduit par une modification du nombre de
chromosomes, c’est I’hétéroploïdie; au lieu d’avoir 2N chromosomes (diploïdie), ces
cellules transformées en acquièrent 3N, 4N, E!N chromosomes. De plus, les cellllles se
présentent sous des formes très variées. Dans chaque tissu, les cellules ont souvent
une morphologie caractéristique, elles sont soit de type fibroblastique, soit de type
épithélial, soit de type endothélial. Cette morphologie peut être influencée par
l’environnement de la cellule, surtout lorsqu’elle est en culture. Par exemple, le
fibroblaste en culture, peut être quasi sphérique en milieu liquide (agarose), en forme
de triangle ou de losange aplati sur couche mince de plasma coagulé non orienté, ou
en fuseau épais et allongé sur une lame de verre striée. L’utilisation de la culture de
cellules a contribué à une meilleure compréhension des grandes questions que se
pose la biologie des eucatyotes, notamment immortalité et cancer, la différenciation
cellulaire, le développement embryonnaire, le phénomène de réparation tissulaire.
Parallèlement à cette cellule vivante totalement autonome, il existe d’autres
organismes comme les virus qui sont des parasites stricts.
De nos jours, la culture in vitro de cellules en provenance d’organismes animaux est
devenue une des techniques les plus utilisées pour l’étude des virus. Elle permet de
faire face aux exigences des virus qui ne se multiplient qu’au sein des cellules vivantes
et nous évite de travailler sur un animal ou un organe maintenu en survie.
Le virion ou particule infectieuse présente quatre traits distinctifs dont les trois
premiers caractérisent un parasitisme absolu. En effet, le virion contient un seul type
d’acide nucléique, soit ribonucleique, soit désoxyribonucléiquc, jamais les deux à la
fois. Incapable de croître ou de se diviser, il se reproduit uniquement à partir de son
matériel génétique. II ne possède pas dans son génome l’information nécessaire à la
synthèse de ses métabolites essentiels et à la formation des liaisons de haut potentiel
énergétique que cette synthèse exige. Le virion ne la trouve que dans la cellule où il se
multiplie et dont il détourne à son usage les systèmes enzymatiques préexistants. De
même, pour synthétiser ses propres protéines, il utilise les ribosomes et les acides
ribonucléiques de transfert de la cellule qu’il infecte. Le génome des virus ne porte
aucune information qui permette la production des enzymes du cycle énergétique, la
synthèse de protéines ribosomiques, celle de I’ARN ribosomique et de I’ARN de
transfert. Enfin, dernière caractéristique, le virion présente une structure définie, à
symétrie cubique, ou hélicoïdale (TOURNIER, 1976).
En virologie vétérinaire, les cultures cellulaires sont utilisées dans l’isolement,
l’identification et la multiplication du virus (ASSO, 1964). Elles permettent la mise au
point et la production de vaccins utilisés dans les campagnes de prophylaxie des
maladies virales du bétail. Ainsi que l’élaboration de tests de diagnostic tels que la
technique de neutralisation des effets cytopatlhogènes du virus in vitro.
1. Généralités sur la Dermatose Nodulaire Contagieuse Bovine
(DNCB)
1 .l, Définition
La Dermatose Nodulaire Contagieuse Bovine (DNCB) est une maladie
infectieuse d’origine virale qui affecte principalement les bovins notamment les zébus,
-
les taurins et les buffles domestiques.
L’agent responsable est un virus de la famille des poxviridae, genre
I
Capripoxvirus, dont le virus type est le virus Neethling.
4
II s’agit d’un virus à ADN à symétrie hélicoi’dale, enveloppé. Ce virus est transmis par
le contact direct avec les animaux malades mais, surtout par l’intermédiaire de piqûres
4
II s’agit d’un virus à ADN à symétrie hélicoi’dale, enveloppé. Ce virus est transmis par
I
le contact direct avec les animaux malades mais, surtout par l’intermédiaire de piqûres
de divers arthropodes comme les mouches, moustiques.
1.2. Symptômes
Cette maladie peut évoluer sous différentes formes allant de la forme aiguë
grave à la forme frustre bénigne.
Dans la forme aiguë, après une incubation de 4 à 14 jours, le premier signe
clinique est une hyperthermie (41°C) d’une dizaine de
jours associée à des
-
symptômes généraux tels que l’abattement, le manque d’appétit. Ensuite, apparaissent
des signes cutanés caractéristiques de cette virose : des poils hérissés et des nodules
I
dont la taille varie entre 0,2 et 5 cm de diamètre sur l’encolure, le dos, les cuisses et les
jambes de l’animal, (Fig. 1). Ces nodules cutanés persistent pendant une semaine, puis
se dessèchent et tombent laissant place à des lésions qui cicatrisent en peu de temps
en l’absence d’infections bactériennes secondaires.
En plus de ces signes cutanés, des nodules se développent dans certains
organes profonds comme la trachée et l’intestin. C’est la forme grave de la DNCB qui
conduit à une asphyxie, une inrumination, un avortement voire la mort dans 2 à 10 %
1LI
des cas (LEFEVRE, 1991).
1.3. Importance de cette maladie
La DNCB est une maladie remarquable par son incidence économique dans les
élevages de bovins. Outre la mortalité que la dermatose provoque dans 2 à 10 % des
cas, elle cause des pertes économiques consécutives à l’amaigrissement associé à
une infertilité et à des avortements. Elle laisse généralement des lésions indélébiles sur
les cuirs. La qualité de ces derniers, sérieusement affectée, leur fait perdre toute valeur
L
marchande dans l’industrie du cuir (NEGALBAYE, 1988).
De plus, la DNCB est inscrite sur la liste A selon le code zoo-sanitaire
international de l’office International des Epizooties (0.I.E). Cette liste A comprend des
L
maladies transmissibles qui ont un grand pouvoir de diffusion et une gravité
particulière.
Figure 1 : Un bovin atteint de DNCB. La flèche indique les nodules cutanés.
_.
6
111
Ces maladies sont à déclaration obligatoire car elles sont capables de s’étendre
au-delà des frontières nationales, avec des conséquences socio-économiques et
sanitaires qui peuvent être graves. Surtout leurs incidences sur le commerce
international des animaux et des produits animaux sont importantes (CHILLAUD, 1996).
Sur le plan épidémiologique, la DNCB est une virose rencontrée exclusivement
sur le continent africain, au sud .tfti Sahara et à Madagascar. Elle y sévit sous forme
d’épizooties séparées par des périodes de silences plus ou moins longues. Toutefois,
son extension depuis 1970 est préoccupante (Fig. 2).
Au Sénégal, cette maladie a été signalée, pour la première fois, en 1988. Les
premiers cas furent notés en saison sèche chez les buffles élevés aux environs de la
ville de Saint-Louis. Et, au cours de la saison des pluies, la maladie s’est propagée aux
bovins vivant dans toutes les zones écologiques du Sénégal (THIONGANE, 1988).
Aucun traitement spécifique n’est disponible à ce jour. Mais il est possible de
-
combattre les infections secondaires, par un traitement genéral à base d’antibiotiques
associé à un traitement local des nodules et plaies cutanés. Le moyen de lutte le plus
-
efficace contre la DNCB reste la vaccination. A l’heure actuefle, un vaccin contre la
clavelée, maladie des moutons due à un poxvirus voisin de celui de la DNCB, est
utilisée dans les campagnes de vaccination contre la DNCB. Ce vaccin hétérologue est
efficace mais présente I?nconvénient de provoquer une immunité moins solide et moins
durable qu’un vaccin homologue. De plus, ce vaccin ne peut être utiliser dans les pays
où la clavelée n’existe pas.
Ce travail s’inscrit dans un objectif global de mise au point d’un vaccin
homologue, c’est à dire d’un vaccin issu d’un virus de la DNCB. Particulièrement, notre
I
étude tente de déterminer les conditions in vitro optimales de réplication d’une souche
de virus de DNCB, isolée lors d’une épizootie survenue chez les bovins du Sénégal en
1988 ( THIONGANE ,
1988). A cet effet, nous analysons l’évolution de la
cytopathogénéicité de la souche virale sur des cellules de reins et de testicules de
Ic
mouton pour sélectionner la lignée cellulaire la plus sensible.
-
Figure 2 : Carte épidémiologique de la D.N.C.B.
(Annuaire de la Santé animale FAO - WHO -OIE, 1989).
a
8
En pratique, nous allons d’abord réaliser des cultures de cellules de reins et de
testicules de mouton, ensuite les inoculer avec la souche virale. Le degré de sensibilité
de ces cellules est déterminé par l’observation de l’évolution des lésions cytopathiques
dans le temps. Des inclusions intracellulaires caractéristiques de cette infection virale
pourront être mises en évidence grâce à des techniques de coloration cytologique (la
coloration de Giemsa) et immunologique (le test d’immunofluorescence indirecte). Un
calcul du titre viral sera effectué en foncticn du type de cellules utilisées avant de
conclure sur la différence de sensibilité entre ces deux types de cellules.
2. Généralités sur les cultures cellulaires
La culture cellulaire s’enracine dans deux concepts formulés dès le milieu du
XIXème siècle. Le premier faisait de la cellule l’unité vitale fondamentale, capable d’avoir
une existence autonome (SCHLEIDEN et SCHWANN, cités par FIRKET, 1964). Le second
énoncé par CLAUDE BERNARD (cité par MA~RIN 1976a) établissait la notion
L
d’homéostasie et de constance du milieu interne.
Ensuite, au XXème siècle, la culture de tissus fit ses premiers pas grâce à
HARRISON qui, en 1907, démontra le phénomène de croissance des cellules nerveuses
en mettant en culture des fragments de ganglions spinaux de grenouille dans du
coagulum. En 1912, CARREL définit les règles d’asepsie et mit en évidence le rôle de
certains extraits embryonnaires sur le développement du tissu conjonctif. Ces travaux
posent les bases de l’étude des besoins nutritionnels des cellules.
Mais, c’est seulement au milieu de notre siècle, à partir de 1950, qu’est
véritablement née la culture cellulaire. Elle bénéficia à la fois du développement de la
technique de dispersion des cellules à partir de tissus et organes par l’action des
enzymes protéolytiques et de l’utilisation d’un support de culture comme le verre neutre
qui évite l’emploi de coagulum.
En 1952, GEY et coll. isolent la première lignée de cellules tumorales d’origine
humaine, les cellules HeLa. Depuis lors, la culture de cellules est devenue l’outil de
-
choix de la biologie des organismes eucatyotes.
2.1. Définitions :
L
Ces définitions concernent les différents types de cultures.
La culture de cellules indique les systèmes où les cellules sont capables, non
seulement de survivre, mais aussi de se diviser, tout en restant séparées les unes des
-
autres, ou du moins sans conserver une organisation structurale rappelant le tissu
d’origine (FRESHNEY, 1986).
La culture de tissus concerne un tissu qui a conservé une organisation qui lui est
spécifique et continue soit à fonctionner, soit à croître tout au long des manipulations.
La culture d’organe désigne des cultures où un organe a conservé sa structure
organisée et ses fonctions spécifiques (Fig. 3).
2.2. Principe des systèmes de cultures de cellules
Le problème consiste à transformer le tissu en une suspension homogène de
cellules séparées qui peuvent être cultivées de deux manières :
- soit une culture en suspension : c’est le cas des cellules lymphoblastiques de souris
(OWENS et coll., 1953). Ce sont des cultures dont la richesse en cellules évolue à la
manière des cultures bactériennes (sous forme de colonies). Elles se prêtent
particulièrement bien aux études sur la production massive de virus. Cette méthode
présente cependant une limite qui est
l’utilisation d’un milieu spécial conçu pour
cellules non adhérentes. C’est pourquoi, seules les cellules dites transformées se
prêtent à cette technique car elles n’exigent pas un support pour croître.
- soit une culture en stationnaire : c’est le cas des cellules véro provenant de rein de
singe vert d’Afrique. Ce sont des cellules qui tombent au fond et se collent au support.
C’est la technique la plus répandue car presque toutes les cellules s’y prêtent. Ici, la
qualité du support devient essentielle : verre Pyrex ou verre neutre, plastique spécial.
Cependant, l’adhésion des cellules à leur support est un processus assez mal connu. II
nécessite l’intervention de facteurs d’attachement protéiques (fibronectine, collagene,..)
apportés par le milieu de culture notamment le sérum ou sécrétés par les cellules. Ces
facteurs d’attachement s’adsorbent aux surfaces et fixent les cellules par l’intermédiaire
de récepteurs spécifiques.
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d7
‘.‘i.,.’
il,
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‘Xx r’
Figure 3 : Les Techniques de préparation des différents types de culture
[ FRESHNEY, 19871
L
L
11
Actuellement, aussi bien pour la culture en stationnaire que pour celle en
-
suspension, on peut avoir divers systèmes de culture de cellules notamment le
système dit ouvert de type spinner (Fig. 4) ou roller (Fig. 5) et le système dit fermé.
Ce système fermé correspond à des cytoculteurs de conception sophistiquée
dans lesquels tous les paramètres de culture sont contrôlés de façon à maintenir
constants la densité cellulaire et les échanges gazeux. Ces syst6mes fermés se
répartissent eux mêmes en deux catégories :
* le système fermé avec agitation, proche des fermenteurs bactériens. II donne des
densités cellulaires limitées car n’excédant pas 10’ cellules/ml. Développé à l’origine
pour la culture en suspension, il permet la culture des cellules adhérentes grâce à
l’utilisation de microporteurs ou de techniques d’encapsulation.
I
. le système fermé sans agitation, avec circulation de milieu en continu. Ces systèmes
fournissent des densités cellulaires très élevées (10” celluleslml), proches de celles
des tissus. Ils s’appliquent aussi bien à la culture de cellules adhérentes que non
adhérentes.
Lorsque toutes les conditions requises pour le bon développement d’un tissu
sont réunies (pH, température, nutriments, stérilité...) les cellules croissent et se
multiplient. On peut parler ainsi de culture in vitro.
2.3. Types de cultures cellulaires
Les cultures de cellules peuvent être différenciées par leur capacité à être
entretenues par passages successifs. On distingue essentiellement deux types :
2.3.1 Les cellules de première explantation ou cellules primaires.
Elles ont une durée de vie très limitée car une dégénérescence non spécifique
finit toujours par apparaître au bout de 2, 3, ou 4 trypsinations ou passages. Elles
résultent de la dissociation d’un organe, soit en petits fragments explantés, ou soit en
unités cellulaires obtenues par la méthode de trypsination. Celle-ci permet d‘obtenir, à
partir d’un organe donné, une suspension de cellules susceptibles de se fixer au verre
et de se multiplier pour donner une couche continue d’une seule assise ou couche
-
monocellulaire. Ce résultat est obtenu par digestion de la trame conjonctive de l’organe
au moyen d’une solution de trypsine.
IL
Figure 4 : Culture en suspension Type spinner,
Figure 5 : Culture en stationnaire type roller.
1 3
La trypsine, enzyme extraite du pancréas du porc est susceptible de couper toute
liaison protéique de type lys - arg ou arg - arg. Aujourd’hui grâce au génie génétique, la
trypsine que l’on trouve dans le commerce est purifiée et lyophilisée.
Lorsque la culture primaire est réussie, il apparaît de belles cellules en couche
monocellulaire que l’on a intérêt à repiquer pour constituer des cultures secondaires.
Cette opération s’effectue en décollant les cellules par la trypsine, en les remettant en
suspension dans du milieu neuf et en les ensemençant de nouveau dans d’autres
II
flacons de culture. Pour un meilleur rendement, il est d’usage de les utiliser le plus tôt
possible, car leur sensibilité à certains virus diminue au fil des passages.
2.3.2 Les cellules de souche.
Ce sont des cellules génétiquement normales. Elles peuvent être entretenues
II
pendant un grand nombre de passages (de 40 à 60). C’est le cas des cellules diploïdes
humaines.
2.3.3 Les cellules de lignée continue.
Ce sont des cellules tumorales, pathologiques et repiquables indéfiniment. Elles
proviennent soit de I’explantation d’une tumeur maligne humaine ou animale, soit de la
transformation in W-0 ou in vive de cellules normales (MONTAGNIER, 1976). Cette
transformation pouvant résulter d’une mutation spontanée ou provoquée par un agent
mutagéne de type oncogène physique, chimique ou viral. C’est le cas des cellules véro
issues de cellules de rein de singe vert d’Afrique.
La transformation se manifeste généralement par :
- une brusque augmentation de la vitesse de croissance des cellules, par exemple si
le cycle de multiplication normal des cellules était de 24 heures, il est réduit à 14 ou 16
heures (Fig. 6).
- une tendance au chevauchement des cellules qui ont perdu ainsi leur inhibition de
contact.
- des cellules qui peuvent pousser en suspension (sans s’accrocher à un support du fait
de la perte de leur cytosquelette).
- un changement du nombre de chromosomes, les cellules deviennent hétéroploi‘des.
- une diminution des besoins en sérum nutritif.
-
Compte tenu de leur grande résistance, on peut les conserver pendant très longtemps
par congélation à -70°C ou dans de l’azote liquide (-196°C).
14
!
I
t
Figure 6: Courbe d’évolution d’une cellule en culture [ FRESHNEY, 1987 ]
15
2.4. Intérêt des cultures de cellules
Le développement des techniques de cultures cellulaires a permis de grandes
avancées dans la biologie en général et la virologie en particulier. Elle a permis d’avoir
une production massive de cellules homogènes et toutes les cellules peuvent provenir
d’un même clone. On peut les synchroniser (par choc thermique, blocage de certaines
synthèses, déplacement mécanique ou enzymatique de cellules en mitoses), les
astreindre à une fonction bien définie, avec une très grande reproductibiiiik
Plus particulièrement en virologie, puisque les virus ne se multiplient que dans
des cellules vivantes, les cultures de cellules constituent un support à l’activité du virus
(MA~RIN, 1976a), elles permettent alors :
- l’isolement et l’identification par neutralisation du virus,
- le titrage du virus,
- la production éventuelle de vaccins.
De plus, la culture de cellules a contribué à l’étude des différentes étapes
biochimiques du développement des virus animaux. Cette étude étant impossible à
effectuer chez l’animal, compte tenu de la diversité des réactions enregistrées (Asso,
1964).
MATERIEL
ET METHODES
16
1. Matériel
Des souches virales de DNCB sont cultivées sur des cellules de reins et de
testicules de mouton.
1.1. Choix du foetus
Les reins et les testicules sont issus d’un embryon mâle de mouton de 30 cm de
long et âgé de 14 à 15 semaines environ.
1.2. Souche virale ou inoculum
II s’agit d’une souche virale isolée à partir d’un nodule cutané de bovin atteint de
DNCB en 1988. Cette souche a subi 20 passages sur cultures de reins de mouton et
-
elle titre : 10 6,4 DICT 50.
1.3. Milieux de cultures et solutions tampons de trypsine
Les catégories de solutions et de milieux sont au nombre de deux :
1.3.1 Les solutions salines.
Elles sont communément appelées solutions de lavage, comme celles de
Phosphate Buffer Saline (ou PBS) ou de HANKS Balanced Saline Solution (ou HANKS
BSS). Le soluté est disponible sous forme de comprimé à reconstituer dans un litre
d’eau distillée. Ensuite, il faudra stériliser cette solution (pH = 7,2 - 7,4) par filtration.
Ces solutions servent à laver les menus fragments d’organes comme les reins ou les
testicules et à préparer des solutions enzymatiques.
1.3.2 Les milieux nutritifs.
II s”agit du milieu de EAGLE modifié par GLASGOW (ou MEMG) que l’on trouve
sous forme lyophilisée dans le commerce. II est dissout dans de l’eau distillée puis
I
stérilisé par filtration (pH = 7,2 - 7,4). Cette préparation est riche en élements nutritifs
indispensables à la croissance des cellules. Elle contient des vitamines, du sucre, des
acides aminés, des sels minéraux etc. Cependant, ce milieu synthétique ne suffit pas à
lui seul à faire démarrer une culture de cellules. II est recommandé d’ajouter une
substance naturelle comme le sérum de veau foetal qui est riche en facteurs de
croissance permettant à la cellule de s’accrocher au support avant de commencer à se
111
diviser.
17
Dans cette expérience, une solution de MEMG à 10% de sérum de veau foetal et 1%
d’antibiotiques est utilisée pour la culture des cellules.
Des solutions salines tamponnées de P.B.S ou de HANKS B.S.S auxquelles on
ajoute de l’enzyme comme de la trypsine à des concentrations différentes, sont dites
solutions tampons de trypsine. Elles sont de deux types :
- La trypsine versène est une solution de P.B.S à laquelle on ajoute de la trypsine à
1”/0, et du versénate à 0,5’?1/00. Elle est surtout utilisée pour dissocier le tapis cellulaire
II)
d’un flacon de culture. Elle permet d’effectuer des passages de cellules pour avoir des
cultures dites secondaires.
- La trypsine HANKS B.S.S. (HANKS balanced sait solution) est une solution de HANKS
B.S.S à laquelle on ajoute de la trypsine à 3’/,,. On l’utilise pour dissocier les fragments
d’organe en unités cellulaires.
1.4. Les antibiotiques et antifongiques
Ces substances permettent d’éviter les contaminations fréquentes en culture de
cellules. II s’agit d’antibactériens comme la pénicilline souvent utilisée à la concentration
100 ui/mI et la streptomycine à 50 ug/ml.
Quant aux antifongiques, on utilise principalement la fungizone à 5 pg/ml qui
inhibe la prolifération et l’action des champignons.
1.5. Matériels de laboratoire
- Boîte à instruments stérile contenant : 2 paires de ciseaux droits, 2 pinces à dents
de souris, 2 lames de bistouris montées sur une tige métallique, une cuillère à café,
- des gants,
- des boîtes de pétri stériles,
- des boîtes de culture de 75 cm2,
- de l’alcool à 90”,
- des pipettes de 2 ml, 5 ml, 10 ml,
- un entonnoir muni de gaze stérile (3 ou 4 épaisseurs de gaze),
- un erlenmeyer stérile et un autre contenant un barreau aimanté,
- un agitateur magnétique,
- les tubes de centrifugation stériles,
- un récipient de vidange,
18
- flacons de 5 ml,
- des lames de verre à une extrémité dépolie pour le test d’immunofluorescence,
- des lamelles,
- un grattoir en caoutchouc,
- une hotte à flux laminaire,
- une étuve à CO, à 37X,
- une centrifugeuse réfrig+réc,
- un bain marie à 37’C,
- un microscope inversé muni d’un dispositif à fluorescence,
- un bec bunsen.
2. Méthodes
2.1. Technique de culture de reins de mouton
2.1.1 Prélèvement des reins.
L’utérus {Fig. 7), nettoyé avec une solution d’alcool à 90”, est ouvert avec des
ciseaux. Le foetus (Fig. 8) est prélevé puis transféré sur un plateau. Le foetus est
saigné. Le flanc est désinfecté à l’endroit où il faut faire une incision pour accéder aux
reins. Les deux reins sont prélevés stérilement et sont recueillis dans une bolte de pétri
(Fig. 9).
2.1.2 Dissection du rein.
Elle est réalisée sous la hotte à l’aide de bistouri, de pince et de ciseaux. Les
reins sont dégagés de leur capsule recouverte de tissu adipeux et sont placés dans
une boîte de pétri stérile (Fig. 10). Le cortex rénal est séparé par grattage avec le
bistouri en prenant soin de ne pas entraîner les masses médullaires indésirables. Les
fragments de cortex sont découpés en menus morceaux à l’aide de ciseaux. Ces
morceaux du cortex rénal sont transférés dans un erlenmeyer muni de barreau
aimanté.
Figure 7 : L’utérus contenant l’embryon
Figure 8 : Fœtus de 14 semaines
20
Figure 9 : Reins fraîchement prélevés.
Figure 10 : Reins décapsulés.
2.1.3 Trypsination du cortex rénal
Les morceaux de cortex sont lavés trois fois avec une solution de tampon PBS.
Le procédé est le suivant : les fragments des deux reins sont repris dans un volume de
150 à 200 ml de solution de P.B,S dans I’erlenmeyer et, après une légère agitation,
sont laissés décanter au fond du récipient pour que le surnageant puisse être éliminé.
Au bout de trois lavages, le surnageant devien? clair et limpide (sans trace de sang) et
les fragments de cortex sont considérés propres.
Ensuite, Le dernier liquide de rinçage est remplacé par une solution d’enzyme :
la trypsine HANKS BSS. L’erlenmeyer, avec les fragments de cortex rénal est déposé
sur l’agitateur magnétique pendant 45 à 60 mn. Au bout de cette période, les fragments
sont digérés et la solution devient alors trouble. Cette solution, filtrée avec de la gaze,
est recueillie dans un erlenmeyer. Le digestat filtré est réparti dans des tubes et
centrifugé pendant 5 à 10 mn à 2500 tfmn à 18°C (Fig. 11).
Le culot de centrifugation contenant les cellules est repris dans une solution de
milieu MEMG enrichi avec 10% de sérum de veau et 1% d’inhibiteurs que sont les
antibiotiques et les antifongiques.
La concentration cellulaire de la suspension est déterminée par un comptage à
l’aide de la cellule de Thoma en utilisant la formule suivante : N = n/2 x 10000 x 10
où :
- N est le total nombre de celluleslml,
- n est le nombre de cellules comptées dans les deux chambres,
- 2 est le coefficient de division pour obtenir la moyenne des cellules
comptées dans les deux compartiments de I’hémacytomètre,
- 10000 est la constante de la chambre de comptage et ramène le nombre de
cellules comptées à un volume égal à 1 ml,
- 10 est le facteur de dilution
Ce comptage est nécessaire pour déterminer la concentration cellulaire
convenable pour un bon développement des cellules lorsqu’elles seront mises en
culture.
22
Figure 11 : Ttypsination à température ambiante du cortex rénal.
23
2.1.4 Entretien des cellules.
Une fois ensemencées, les cellules sont examinées tous les jours. Le
développement du tapis cellulaire se traduit par une modification du milieu de culture.
En effet, II est souvent nécessaire de changer le milieu lorsqu’il devient acide
(apparition d’une coloration jaune orangé) et ce, jusqu’à ce que le tapis cellulaire
devienne complet ou confitient. A ce stade, toute ta surface de culture du flacon est
occupée par les cellules en une couche continue d’une seule assise (dite parfois
couche monocellulaire). La croissance des cellules est très variable et dépend, entre
autres facteurs, de la qualité des prélèvements et des milieux de culture, surtout la
valeur du sérum de veau.
Lorsque le flacon de culture est complet, on peut avoir intérêt à les repiquer pour
constituer des cultures secondaires ou subcultures. Cette opération s’effectue en
décollant les cellules par la trypsine, en les remettant en suspension dans du milieu
neuf et en les ensemençant de nouveau dans d’autres flacons. La technique utilisée
est la suivante : le milieu surnageant la culture confluent est éliminé, de la trypsine, à
raison de 2 ml par flacon de culture, est étalée sur les cellules et est laissée en contact
pendant 30 secondes avant d’être éliminée. Pour une deuxième fois, la trypsine est
étalée sur le tapis cellulaire pendant 30 à 60 secondes. Au bout de ce temps, une
partie de la trypsine est éliminée. Le flacon est placé à 37°C pendant 3 à 5 mn, le
restant de la trypsine continuant à agir. Les cellules se décollent facilement et sont
reprises, avec soin, dans du milieu de culture neuf. La dispersion des cellules est
favorisée par des aspirations et des refoulements successifs du milieu de culture avec
une pipette stérile. Lorsque la culture est satisfaisante, avec un flacon de cellules
confluentes, on peut préparer deux du même type.
On replace les deux flacons à 37°C après avoir inscrit sur le flacon le numéro de
passage de ces cellules et la date de manipulation. Ce chiffre augmente d’une unité
après chaque subculture, passage ou trypsination. Puisqu’il s’agit de cellules de
première explantation, la multiplication des cellules en culture est volontairement limitée
à 2 ou 3 passages.
24
2.1.5 Conservation des cellules.
II est très utile pour éviter de perdre les cellules, de les conserver. Elles peuvent
être conservées de deux manières :
a/ Une conservation par ralentissement du métabolisme.
Elle est obtenue en remplaçant la solution de MEMG à 10% de sérum par du
MEMG à 5 ou 2% de sérum. Ou bien, les flacons de culture confluer;te sont retrrés de
l’étuve à 37°C pour être placés à la température ambiante (30°C) dans un endroit
obscur ou dans une armoire à basse température (18°C). Par ces techniques, le
métabolisme cellulaire est ralenti et les cellules sont conservées en l’état pendant
quelques jours.
bl Une conservation par congélation ou cryoconservation.
Ceci est possible en plaçant les cellules à des températures inférieures à - 70°C.
La technique de cryoconservation que nous avons utilisée met en jeu des cellules qui
sont en phase exponentielle de croissance, il s’agit généralement de cultures de
cellules de 24 à 48 heures. Les cultures sont trypsinées, comme pour les passages ou
les subcultures. Les cellules dissociées sont centrifugées pendant 10 mn à 2000 tours
par minute, Elles font l’objet d’un comptage et sont ajustées à la concentration 1,5 à 2
millions de cellules par ml dans un milieu constitué de : MEMG (69%), sérum de veau
foetal (20%), Diméthylsulfoxyde (1 O%),
Péni-streptomycine (1%). Puis, cette
suspension est répartie dans des cryotubes à raison de ? ml par tube que l’on garde
successivement dans un congélateur à -20°C (pendant 3 h), puis dans un congélateur
à -70°C où elles pourront rester pendant 6 mois. Cette durée de conservation peut être
de plusieurs années lorsque les cellules sont gardées dans de l’azote liquide (-196°C).
Donc, il est possible, par cette cryoconservation, d’éviter d’avoir le souci permanent de
l’entretien des cultures cellulaires.
2.2. Technique de culture de testicules de mouton
Les testicules sont prélevés aseptiquement et recueillis dans une boîte de pétri
stérile. Ils sont ensuite décapsulés à l’aide de pinces et de ciseaux, puis découpés en
menus morceaux.
2 5
Le hachis est repris avec une solution de MEMG t 10% de sérum de veau foetal t 1%
d’inhibiteurs. Cette suspension de tissus est transférée dans un flacon de culture qui
est placé à l’étuve à 37”C, pendant au moins 72 h. Au cours de cette période, les
cultures présentant des contaminations indésirables (bactérienne ou fongique) sont
écartées, au contraire celles avec un développement cellulaire vont servir aux études
virologiques, notamment les isolements et les identifications.
2.3. Technique d’inoculation des cellules
La majorité des virus pathogènes se multiplient dans quelques cellules. Pour
chaque virus, il est nécessaire de déterminer les conditions optimales de réplication qui
sont entre autres, la période qui s’écoule entre la période d’inoculation et la présence
des modifications cellulaires.
Pour le virus de la DNCB, l’existence de l’infection spécifique est étudiée par
l’inoculation de culture de cellules primaires de mouton.
Cette technique d’inoculation est appliquée aussi bien aux cellules rénales
I
qu’aux cellules testiculaires. Elle suit le processus suivant :
2.3.1 Dilution de la souche virale.
La dilution virale est utilisée aux quatre dilutions qui sont : IO-‘, iO>*, 10w3 et 10M4.
I
Ces dilutions sont réalisées avec le milieu de culture MEMG. Le milieu, servant de
diluant, est réparti dans quatre tubes, à raison de 1,8 ml par tube. Chaque tube
correspond à une dilution. Dans le premier tube, 0,2 ml de la souche virale est ajouté
pour obtenir la dilution 10-l. Avec une pipette stérile, la suspension est bien
homogénéisée.
De ce premier tube, on préléve 0,2 ml que l’on transfére dans le deuxième tube
pour obtenir la dilution IO-*. Après chaque dilution, on prend le soin de changer de
I
pipette et de bien mélanger.
La dilution 10m3 est obtenue dans le troisième tube qui reçoit CI,2 ml du deuxième
tube. Et enfin, le quatrième tube correspond à la dilution 10V4.
I
Les opérations de dilution de I’inoculum viral sont réalisées dans de la glace
fondante, c’est à dire à la température de 0°C.
26
2.3.2 Infection des cellules.
L’infection des cellules est réalisée avec I’inoculum viral. Des flacons de culture
de cellules confluentes (de rein et de testicule) sont choisis. Pour chaque type de
cellules, deux flacons seront utilisés : un flacon recevra I’inoculum viral et le deuxième
flacon est considéré comme témoin négatif c’est à dire ne recevant pas d’inoculum
viral.
Pour l’inoculation des cellules proprement dite, on procède ainsi : les flacons de
culture sont vidés de leur milieu de culture et sont égouttés très soigneusement. On
met sur les cellules par 1 ml de suspension virale à la dilution ‘10m4. II est nécessaire de
bien étaler I’inoculum sur les cellules. Cet inoculum est laissé en contact avec les
cellules pendant une heure à 37”C, temps nécessaire pour que les particules virales
s’adsorbent sur les cellules.
Au bout de cette période, I’inoculum est éliminé et est remplacé par 10 ml de
MEMG à 5% de sérum de veau. Ce milieu à 5% de sérum de veau est dit milieu
d’entretien contrairement au milieu à 10% de sérum de veau ou milieu de croissance.
Ces flacons inoculés ainsi que les flacons témoins sont placés à l’étuve à 37°C.
Dès le lendemain, on vérifie que les flacons ne sont pas contaminés par des
bactéries ou champignons. Les flacons présentant une croissance bactérienne ou
fongique sont éliminés. Au contraire, les flacons de culture non contaminés sont remis
à l’étuve jusqu’au quatrième jour à partir duquel l’examen des boîtes devient quotidien.
De plus, des prélèvements de 0,5 ml du milieu surnageant les cultures sont
effectués et gardés à la température de -20°C. Ces prélèvements doivent permettre de
déterminer l’évolution dans le temps de la production de virus par les cellules infectées.
2.4. Méthodes d’identification du virus de la DNCB et titrage
La plupart des virus provoque des modifications cellulaires variées, et
généralement spécifiques : ce sont les effets cytopathogènes. Ceux-ci sont consécutifs
à l’invasion du virus dans la cellule hôte où il se multiplie à ses dépens.
27
II provoque des altérations cellulaires de plus en plus importantes au fil du temps qui
conduisent finalement à la mort de la cellule. Ces lésions cytopathiques sont facilement
décelables par simple examen optique des cellules à l’état frais et après coloration.
Cependant, d’autres virus provoquent des modifications intracellulaires, qui ne
sont pas apparentes au microscope optique malgré une activité effective du virus dans
la cellule.
Dans ce cas, on utilise des méthodes indirectes de détection telles que : la
technique d’utilisation des anticorps fluorescents (ATANASIU, 1976). Ces derniers se
fixent sur l’antigène viral et le complexe formé pourra être révélé grâce à la
fluorescence visible au microscope à ultraviolet. C’est cette technique que nous avons
utilisée pour confirmer l’examen des lésions spécifiques.
2.4.1 Observation de l’effet cytopathogène (ECP)
Les lésions cytopathiques sont facilement décelables avec ou sans coloration.
a/ Examen à l’état frais : il faut toujours se référer aux témoins pour noter les
éventuels changements cytologiques. L’observation des effets cytopathogènes au
microscope est poursuivie jusqu’à la destruction quasi - complète du tapis cellulaire.
bl Examen après coloration au Giemsa : cette technique présente les étapes
suivantes :
la fixation.
Pour fixer les cellules, on enlève le milieu de culture. On lave une fois à l’eau
physiologique et on met le méthanol de manière à bien recouvrir les cellules. La fixation
est rapide car 3 à 5 minutes suffisent.
la coloration.
On utilise la solution de Giemsa suivante : 1 ml de Giemsa pour 14 ml d’eau
distillée. On recouvre la culture de ce colorant et on laisse agir pendant 20 mn. Au bout
de ce temps d’incubation, on élimine l’excès de colorant puis on rince la culture à l’eau
distillée.
28
On déshydrate pendant 15 secondes en plongeant la plaque dans un bain d’acétone
puis pendant 15 secondes dans un bain de toluène. On laisse sécher avant d’observer
au microscope optique.
2.4.2 Fixation des anticorps fluorescents.
Le principe consiste à déterminer la présence d’un antigène dans une cellule au
-
moyen d’anticorps spécifiques rendus visibles à la lumière ultraviolette, par couplage
avec une substance fluorescente (isothiocyanate de fluorescéine).
La technique d’immunofluorescence indirecte utilisée est la suivante : deux
flacons de cellules rénales et deux de cellules testiculaires (flacon inoculé et un témoin)
sont utilisés, les milieux de culture sont éliminés. Avec le grattoir en caoutchouc, on
racle une petite zone du tapis de cellules. Ces cellules grattées sont reprises dans un
tube contenant 1 ml d’eau distillée. Elles sont déposées en “spot” sur des lames porte-
objet à raison de 10 1.11 de suspension cellulaire par spot (Fig. 12). On met des cellules
saines sur la première ligne et sur la deuxième ligne des cellules infectées. On laisse
sécher sous la hotte avant de fixer à l’acétone pendant 10 mn à 4°C. Les lames sont
séchées à nouveau, puis on met les sérums dilués au 1/20ème dans du PBS. En effet,
on dispose d’un sérum positif en anticorps provenant d’un animal malade (sérum
positif) et d’un sérum de veau foetal (sérum négatif) Une goutte de sérum positif est
déposée dans le premier trou et une du sérum négatif dans le deuxième trou et ainsi de
suite. On incube pendant 40 mn à 37°C avant de laver 2 fois pendant 10 mn avec du
PBS.
Une goutte de conjugué (anti-sérum) est déposée dans chaque trou, le conjugué
est utilisé aux dilutions suivantes : I/l 0, 1120, 1/40, l/lOO.
L’incubation se fait pendant 40 mn à 37°C dans une chambre humide puis on
lave 2 fois pendant 10 mn avec du PBS. Le rinçage se fait à l’eau distillée et on laisse
LI
sécher à l’air.
Lorsque la lame est sèche, on dépose une goutte de glycérine tamponnée sur
chaque trou avant de recouvrir d’une lamelle.
c
-
29
Figure 12 : Lame porte-objet pour immunofluorescence
30
Enfin, la lecture se fait grâce à un microscope à fluorescence dans une chambre
noire.
2.4.3 Titrage du virus de la D.N.C.B. dans les différentes récoltes.
Le titrage d’une suspension de virus est une évaluation du nombre de particules
virales susceptibles de provoquer une manifestation déterminée chez un hôte sensible.
Pour atteindre ce résultat, la suspension 6 titrer est diluée suivant une progression
géométrique et on inocule un groupe d’hôtes pour chaque dilution. Le choix du facteur
de dilution dépend du système virus - hôte étudié et des conditions de travail. Dans
notre expérience, des dilutions logarithmiques (facteur de dilution = 10) sont utilisées,
l’hôte est une culture cellulaire et le phénomène qui représente la réponse à l’action du
virus est l’effet cytopathogène.
II existe plusieurs sortes de titrages : la méthode des plages, le titrage en tube
(macrométhode) et le titrage sur plaque (microméthode). C’est cette dernière
technique que nous utiliserons dans notre étude. Elle présente l’avantage d’être
beaucoup plus sensible que les autres méthodes.
Les plaques utilisées sont de matière plastique traitée portant 96 godets (8 x12)
à fond plat circulaire de 7 mm de diamètre,. Elles sont munies d’un couvercle non
étanche.
Une étuve pour gazage en mélange air - CO, (95% et 5% respectivement) est
donc indispensable pour la culture dans les plaques de ce type.
Exécution de la réaction :
D’abord une dilution de 10 en 10 allant de 10-l à 1 O-7 est effectuée sur la récolte
du premier jour. La dilution 10-l est distribuée dans les 8 godets de la première ligne de
la plaque (à raison de 100 ul par godet), ensuite la dilution 10.’ dans la deuxième ligne
et ainsi de suite jusqu’à la dilution 10e7 (Fig. 13).
Les deux dernières lignes de godets de la plaque sont des témoin - cellules donc
au lieu de mettre une suspension virale, on ne mettra que 100 1-11 de diluant (M.EM.G).
31
Dilutions virales
Témoin-cellules
10-l
10.*
10-3
104
10-5
1 o-6
1 o-’
Figure 13 : Schéma d’une plaque de titrage
32
Puis, on distribue sur la plaque les cellules en suspension dans du milieu nutritif
(M.E.M.G à 10% de sérum de veau) toujours à raison de 100 l-11 par godet. La
suspension cellulaire utilisée a une concentration cellulaire = 150000 cellules/ ml.
Pour chaque récolte, le titrage s’effectuera sur les deux types de cellules étudiées
(rein et testicule) qui sont de la même origine et de la même génération. Les mêmes
procédés de .ditution et de distribution sont répétés pour les réc;o!tes des 2ème au 10*me
jours.
Toutes les plaques sont ensuite gardées à l’étuve à CO, après les avoir
identifiées correctement en marquant sur la plaque le jour de récolte et le type de
-
cellules utilisées.
II est nécessaire de surveiller I’acidification de la culture les jours suivants pour
-
l’ajuster au besoin. La lecture des plaques se fait après une durée d’incubation
arbitraire de 4 jours habituellement et doit être poursuivie jusqu’au 1 Oème jour.
L
2.4.4 Calcul de la dose infectante 50% (Dl 50% ou DICT SO).
Le calcul peut se faire de deux façons :
- soit en utilisant la méthode de REED et MUENCH qui a pour but d’améliorer par un
artifice de calcul, l’alignement de points expérimentaux qui se trouvent répartis
symétriquement de part et d’autre du point 50%. Puis, de calculer la Dl 50% par
interpolation entre l’échelle des dilutions et l’échelle des pourcentages. Cette méthode
est basée sur le principe suivant : tout hôte atteint à une dilution donnée, aurait
obligatoirement été atteint à une dilution plus forte et inversement, tout hôte indemne à
une dilution donnée, l’aurait été à fortiori à une dilution plus faible. Ce raisonnement
implique évidemment l’existence d’un “seuil ” individuel. La faiblesse de cette méthode
réside donc sur le cumul des réponses qui ne se justifie nullement dans le cas de
titrage en cultures cellulaires, où la réponse de l’hôte ne dépend que de la présence ou
--
non d’unités infectieuses.
- soit par la méthode de SPEERMANN - KARBER. Les points expérimentaux doivent
s’échelonner entre 0 et 100% et avoir une distribution à peu près symétrique.
3 3
Le calcul du titre se fait grâce à la formule statistique suivante : t =X 0 + d (P - 0,s )
où :
t = log dose d’effet cytopathogène 50% (DICT50) par volume d’inoculation
X,= log de la dernière dilution donnant 100% de positifs (E. C. P.)
d = échelle logarithmique de dilution (ici, d = 1 car dilution de 10 en 10)
P = somme des proportions des positifs à partir de la dernière dilution (incluse)
donnant 100% de positifs.
Le titre du virus rapporté à un volume de 1 ml est : T = 10 f+t DICT50 / ml, où,
f = log du facteur de X pour avoir 1 ml; il est égal à 1 (log 10) dans le cas de cette
étude, puisque 100 ul de suspension virale sont utilisés comme volume d’infection
2.4.5 Application du test U de MANN et WHITHNEY
Ce test a pour objectif de comparer 2 échantillons d’une variable quantitative sans
rien supposer des lois de probabilité de la variable dans ces échantillons. On procède
comme suit : d’abord on classe les titres de la série “testicules” (X) et celles de la série
“reins ” (Y) du plus petit au plus grand. Ensuite on compte pour chaque ” X ” le nombre
de ” Y ” qui lui sont inférieur et on les additionne. La somme est notée U, pour les ” X ”
et U, pour les ” Y “. La plus petite valeur entre U, et U, sera notée U. Elle sera
comparée à U,, que l’on lira sur la table (annexe), si U ) U,, au seuil fixé (5%) on en
conclura que la différence de sensibilité entre les deux types de cellules n’est pas très
significative. Dans le cas où U < U,, alors on pourra en déduire que la différence de
sensibilité est assez significative.
RESULTATS
34
1. Evolution des tapis cellulaires non infectés
Du fait de la similitude des stades ler,2ème et 3émejours d’une part et 5ème au 7ème
jours d’autre part les lectures sont faites aux Ier, 4éme et 7ème jours.
1.1 Observation des cellules rénales.
Au premier jour, les cellules individualisées sont arrondies et ont tendance à
tomber au fond du support. Par endroits, on a des fragments de tissus qui
correspondent à des néphrons. L’ensemencement d’environ 175000 cellules/ml permet
d’avoir un tapis confluent sans que les cellules n’aient trop à s’étirer pour occuper toute
la surface.
Au quatrième jour, les cellules prolifèrent et tendent à s’assembler pour occuper
toute la surface du support. Le tapis cellulaire naissant forme alors un épithélium
simple. Quelques rares foyers de cellules fibroblastiques sont observés. Puisque la
mitose dure en moyenne 2 h, il apparaît très vite des densités importantes de cellules
I*
qui croissent de façon exponentielle. Néanmoins, les cellules forment toujours une
culture en monocouche.
Au septième jour, le tapis cellulaire est pratiquement complet avec de
nombreuses cellules épithéliales et quelques cellules fibroblastiques. Toute la surface
du support est maintenant recouverte de cellules. Le tapis est très confluent avec des
cellules jointives. La croissance des cellules semble arrêtée(Fig. 14 et 15).
1.2 Observation des cellules de testicules
Au premier jour, les fragments de tissus baignent dans un mince film de milieu. II
ZL
n’y a pas de cellules individualisées mais plutôt des amas initiaux de cellules.
Au quatrième jour, on voit des cellules d’apparence épithéliale qui rayonnent
autour des fragments. Ces derniers s’étant adsorbés au support, initient la prolifération
cellulaire. On commence à voir des cellules bien définies qui se sont détachées du
II)
tissu originel.
35
Au septième jour, la boîte est confluente à 80%. Il apparaît deux types de
cellules associés aux fragments initiaux.
Certaines cellules sont allongées et s’organisent en faisceaux. D’autres sont
cubiques et se disposent en couches concentriques autour des faisceaux.
2. Evolutkm des tapis de cehles infectées
2.1 Observation de l’effet cytopathogène (ECP)
Nous avons observé des cellules rénales et testiculaires à l’état frais et après
coloration.
Pour les cellules rénales à l’état frais, au quatrième jour, il y a par endroits des
cellules plus grosses et arrondies qui sont réfringentes. Elles semblent se détacher du
reste du tapis comportant des cellules plus petites. La boîte témoin ne présente aucune
modification cytologique.
Après coloration, quelques inclusions acidophiles sont colorées en rouge dans la
portion cytoplasmique de la cellule. Ces rares inclusions colorées n’existent pas dans la
boite témoin (Fig. 16 et 17).
Au septième jour, on a des foyers de lésion sur presque toute la surface. La
cellule n’éclate pas encore, elle finit par se recroqueviller en un amas de débris qui
renferme la plus grande part des virions qu’elle a produits. Aussi, les inclusions
colorées qui apparaissent dans le cytoplasme deviennent plus importantes. Leur
abondance dans la cellule infectée est proportionnelle à la multiplicité d’infection. La
boîte témoin reste intacte (Fig. 18).
Les cellules du testicule examinées à l’état frais, révèlent au quatrième jour un
nombre relativement important de cellules réfringentes. Après coloration, les cellules de
testicules infectées, comparées aux cellules témoins, présentent quelques inclusions
colorées. Ces dernières s’avèrent cependant plus importantes que dans les cellules de
reins.
Au septième jour, la destruction du tapis cellulaire est quasi - complète. II n’est
pas observé de cellule testiculaire intacte.
36
Figure 14 : Tapis complet d’une culture primaire de reins au septième jour.
Figure 15 : Agrandissement d’une partie de la photo ci dessus, les bordures des
cellules sont plus nettes . On note la présence de fragments de tissus résiduels qui
forment des amas plus foncés d’où partent des cellules allongées d’allure
fibroblastique.
Figure 16 : Cellules rénales colorées au Giemsa après 4 jours d’infection.
L’ECP est diffus avec beaucoup d’inclusions colorées dans les cellules. Le tapis
commence à se dégrader.
Figure 17: Cellules rénales témoins , colorées après 4 jours d’incubation sans virus. Le
tapis est intact et on ne décèle aucune coloration dans les cellules.
Figure 18 : Cellules rénales infectées, observées au septième jour. Les cellules
semblent se détacher du tapis en s’arrondissant , la coloration dans les cellules devient
plus vive.
Figure 19 : Amas de cellules rénales fluorescentes au 7eme jour
39
Les cellules de testicules se prêtent particulièrement bien à la multiplication virale, le
virus se réplique efficacement avant I’autolyse de son hôte. Cela explique le grand
nombre de virions visibles après coloration dans le cytoplasme de ces cellules.
2.2 Observation de la fluorescence spécifique.
-
Pour les cellules renaies comme pour les cellules testiculaires les resuitats
obtenus pour les trous témoins (cellules saines et/ou sérum négatif) ne montrent
-
aucune fluorescence. Ceci témoigne de l’absence de réaction immunocytochimique.
-
Dans le cas des trous avec du sérum positif et cellules infectées, nous
observons au quatrième jour une fluorescence relativement faible pour les cellules
rénales. Cette fluorescence apparaît plus importante pour les cellules testiculaires.
Au septième jour, la fluorescence augmente pour les deux types cellulaires.
Mais elle est toujours plus élevée pour les cellules de testicules (Fig. 19)~
2.3 Lecture des plaques de titrage.
-
Le résultat des titrages effectués sur les récoltes des 1”’ au 10éme jours des deux
types cellulaires, sont présentés dans le tableau 1.
Au niveau des prélèvements du 1”’ jour, on observe la présence d’effet
cytopathogène aussi bien pour les cellules testiculaires que pour les cellules rénales,
avec des titres respectifs de 103.87 et 103.75 DCP50 par ml. Ces titres vont en
augmentant jusqu’au 8ème jour et commencent à baisser à partir du gème jour.
La représentation graphique de ces observations (Fig. 20), décrit une
superposition de deux arcs à partir du 7ème jour. Du 1”’ au gème jour on a un léger
décalage entre les deux courbes. D’une manière générale ces deux courbes ont une
même cinétique.
40
2.4’ Calcul de titre par la méthode de SPEERMANN - KARBER
Exemple du premier jour (J 1) :
cellules de testicules : t = 2 + 1 ( Il/8 - 0,5 ) = 2,87
T = 10’*2,87= 103~87DICT50/ml
cellules de reins :
t = 2 + ( 1018 - 0,5 ) = 2,75
T = 10”7~75=Î03~75DlCT50/ml
Dans la pratique la méthode de SPEERMANN - KARBER est la plus usitée,
parce que plus facile et plus rapide à calculer.
Les titres des 9 autres jours sont calculés de la même manière et sont confinés dans le
tableau 1.
2.5 Test U de MANN et WHITHNEY.
Les titres calculés pour chaque jour sont ici remplacés par des classements par
ordre croissant. Aussi le plus grand titre occupe la première position et ainsi de suite
jusqu’à la 20ème place sans tenir compte du type de cellule. Lorsqu’on a 2 fois le même
titre on ajoute 0,5 au rang occupé et le nombre (rang) qui vient aussitôt après est
éliminé (Tableau 2).
41
Jl J2 J3 J4 J5 J6 J7 J8
J9
J?O
DICT
(test)
3,87
4,62
512
5,62
5,87
6,00
6,25
6,50
6,37
6,25
DICT
Tableau 1 : Titres des récoltes en fonction du temps d’infection.
Jl
J 2
J3 J4
J5 J6 J7
J 8
J 9
JIO
Total
rang
2
5
7
9
11
1:2,5
15,5
20
18,5
15,5
116
de X
,i.,.,.,,i;-,,;;i,
Tableau 2 : Classement des rangs de ” X ” et de ” Y ”
n,= ‘l0 et n2 = 10 (on a 10 titres pour chaque type de cellule)
alors n= n,xn,=10x10=100
U,=n+n,(n,+1)/2-Total(Y) ad’où
U, = 100 + 10 (1 12) - 92,5 = 62,5
L
U, = n + n, (n, + 1) / 2 - Total (X) c3 d’où
U,=100+10(11/2)-116=39
U étant le plus petit entre U, et U, (39), U,, (23) : étant celle qui est donnée par la table
L
jointe en annexe. U est donc supérieur à U,, au risque 5%.
m
4 2
TITRE EN FONCTION DU TEMPS
7
6
5
I
4
- MCT(test)
3
- lXT(rein)
2
I
1
0
Jl
J2
J3
J4
J5
J6
J 7
J 8
J9
J 10
Figure 20 : Evolution du titre en fonction du temps
9
1
9
9
J
9
1
1
1
1
0 z
J
9
I
J
J
43
Cette série d’expériences nous a permis de suivre l’évolution de la cellule vivante
en culture in vifro.
1. Caractères des cellules non infectées :
Ces deux systèmes cellulaires nous permettent d’apprécier l’une et l’autre des
méthodes de mise en culture.
En effet, pour une culture de fragments de tissus comme dans le cas du
testicule, il apparaÎt fréquemment autour des fragments cultivés, des proliférations et
des migrations cellulaires moins différenciées” Cette méthode représente la transition
avec les cultures cellulaires proprement dites qui offrent une plus grande homogénéité,
comme dans le cas du rein. L’introduction de la trypsine dans la préparation de cultures
cellulaires destinées à la virologie est due à DULBECCO (1952). Elle permet d’avoir une
suspension homogène de cellules séparées. Le tapis cellulaire qui en résulte est
beaucoup plus uniforme, avec la mise en oeuvre d’une plus grande quantité de
cellules.
Outre la technique de mise en culture choisie, l’aspect des cellules peut changer
selon les conditions et l’intensité du rnétabolisme. Les cellules des tissus
embryonnaires qui “poussent” dans un milieu artificiel diffèrent de celles qui existent
dans l’organisme; notamment par l’utilisation d’un support solide, par l’apport d’un
-
milieu modifié riche en facteurs de croissance contenus dans le sérum d’un animal
jeune. Cependant, ces cultures sont soumises à des régulations dont on retrouve les
analogues dans l’organisme. Lorsque les cellules sont ensemencées, leur orientation
est quelconque, mais lorsqu’elles se rencontrent elles tendent à s’orienter parallèlement
l’une à l’autre. Au stade de la confluence, les cellules sont jointives et leur division
s’arrête quelle que soit la richesse du milieu en métabolites. C’est le phénomène de
-
topo-inhibition. Ensuite, on a vu que leur croissance était aussi limitée dans le temps
(2 ou 3 passages). Nos résultats sont conformes à ceux décrits par MONTAGNIER (1976)
qui parlait ainsi de la “régulation du comportement social des cellules”.
II apparaît plus commode d’employer les reins qui assurent un rendement
cellulaire plus important et évitent les interventions fréquentes comme les trypsinations.
44
En effet, les deux reins, dès leur première trypsination fournissent suffisamment
de matériel cellulaire pour les opérations ultérieures de titrage, d’isolement et de
production de vaccins. Alors que pour les testicules, plusieurs passages sont
nécessaires pour obtenir une même quantité de cellules. Ces trypsinations fréquentes
provoquent des altérations de la membrane cellulaire donc la mort de la cellule.
2. Caractères des cellules infectees :
La forme de la cellule est altérée pour les deux exemples. Elle devient plus
grosse et s’arrondit. On constate également une baisse de l’adhésivité des cellules par
rapport au support et des cellules entre elles. Le tapis confluent auparavant doté de
cellules jointives devient plus lâche. Ceci s’explique par la phagocytose des particules
virales, qui désorganise le cytosquelette. C’est ce dernier qui donne à la cellule normale
sa forme caractéristique.
Il ressort de cette étude que les cellules testiculaires sont légèrement plus
sensibles au virus de la DNCB que celles du rein. En effet, d’abord les différentes
colorations (Giemsa et immunofluorescence) révèlent une présence toujours plus
marquée de particules virales dans les cellules testiculaires par rapport aux cellules
rénales. II apparaît aussi à la lecture des titrages que le taux de virus est toujours
sensiblement plus important dans les cellules de testicules. Toutefois, la similarité de
l’allure des deux courbes d’évolution indique que le virus se comporterait de la même
façon dans les deux types cellulaires. La virémie est maximale au 8ème jour ensuite aux
gème et 10ème jours, la quantité de virus circulants est dégressive. Cette observation est
d’autant plus importante qu’elle témoigne encore une fois de l’état de parasite strict du
virus. Lorsqu’il n’y a plus de cellules viables pour ” héberger ” le virus, celui-ci meurt à
son tour. Ici, le tapis est totalement détruit à partir du 8ème jour, d’où la baisse du titre
notée aux 9 et 10ème jours. Le décalage enregistré entre les deux tracés s’expliquerait
par la différence de sensibilité entre les deux types cellulaires et d’après le graphique,
les cellules de testicules sont plus sensibles au virus DNCB que les cellules de reins,
surtout lors des premiers jours d’infection. D’ailleurs ce degré de sensibilité a pu être
évalué grâce au test U de MANN ET WHITHNEY qui nous a montré que la différence
de sensibilité n’était pas significative entre les deux types de cellules.
45
Ces observations répondent à nos attentes car selon le Manuel de VOIE (1996),
les tissus testiculaires de mouton sont les plus sensibles à la DNCB, ensuite viennent
les reins, puis les muscles et bien d’autres tissus épithéliaux.
La DNCB peut conduire à une infertilité temporaire ou permanente chez le mâle
ce qui traduit donc une lésion des organes génitaux in vive. Ce tropisme pour cet
-
organe se retrouve même lorsqu’il s’agit de tissus testiculaires cultivés in vitro.
Pourtant, les cellules rénales deviennent sensibles au virus après explantation et
culture in vitro, tandis que l’organe ne semble pas affecté in situ. C’est une observation
classique en virologie que le spectre de sensibilité des cultures vis à vis des virus est
L
beaucoup plus large que celui des tissus ou organes dont elles dérivent. Le fait qu’une
cellule insensible dans l’organisme le devienne lorsqu’on la met en culture peut
s’expliquer soit par un remodélement des motifs antigéniques (démasquage de
récepteurs préexistants), soit par un processus de différenciation (acquisition de
récepteurs nouveaux). Cela nous amène tout naturellement à une question. Comment
des cellules d’un même individu, issues d’un même oeuf avec une hérédité identique
peuvent elles devenir aussi différentes les unes des autres ? C’est la différenciation
cellulaire. A la suite de cette dernière, les cellules acquièrent des protéines
particulières, avec une morphologie et des possibilités fonctionnelles caractéristiques.
Les récepteurs des cellules testiculaires seraient donc très tôt fonctionnels in vive alors
que ceux des cellules rénales le deviennent in vitro. II s’agirait donc pour les cellules
rénales d’un démasquage de récepteurs préexistants. La mise en contact d’un virus
avec une cellule sensible entraîne l’attachement des virions à la surface de la cellule
par le biais d’une attraction électrostatique. Cette attraction s’établit entre les charges
complémentaires de l’enveloppe virale et celles des récepteurs spécifiques de la
cellule.
Les cellules rénales comme les cellules testiculaires sont permissives au virus
de la DNCB mais avec une sensibilité différentielle. Cependant il serait plus avantageux
d’utiliser les cellules rénales pour une production massive de virus, puisque les cultures
de rein offrent plus de matériel biologique.
46
Souvent caractéristique d’un virus donné, I’ECP même s’il ne permet pas une
détermination complète du virus, oriente l’expérimentateur quant à la nature de
l’infection, en précisant le groupe de virus auquel on a à faire.
Pour une meilleure analyse des ECP il est important d’avoir des cultures témoins
car, souvent les cultures d’explants sont sujets à des dégradations non spécifiques qui
pourraient conduire à des interprétations erronées
Des lésions spécifiques sont observées et la coloration au Giemsa a pu révéler
la présence de particules virales dans le cytoplasme des cellules. Ces inclusions sont
semblables à celles qui sont décrites dans la littérature plus connues sous le nom de
corps de GUARNIERI et que l’on confert généralement à l’activité d’un poxvirus.
L’identité du virus est confirmée par la fixation élective d’anticorps anti-DNCB, couplés
à un fluochrome, sur les cellules infectées. Les observations faites après chaque
technique utilisée, ont conduit à des conclusions partielles mais encore incomplètes
lorsqu’elles sont exploitées individuellement.
Ainsi étape après étape, on est arrivé à identifier de façon assez précise le virus
de la DNCB. Néanmoins les méthodes utilisées dans ce travail ne permettent pas
toujours à elles seules la détermination complète du type de virus. Souvent des
épreuves sérologiques viennent corroborer ces résultats.
Mieux, avec la naissance de la microscopie électronique comme le montrait
NDIAYE (1986) “lorsqu’aucune donnée sérologique ne permet de rattacher un virus à
un groupe donné, seul l’examen en microscopie électronique s’avère d’un apport
considérable pour la classification des virus.”
c
L
C
I
RESUME ET
I
PERSPECTIVES
47
Des cultures de premières explantations de reins et de testicules de mouton sont
réalisées puis infectées par le virus de la Dermatose Nodulaire Contagieuse Bovine
(DNCB).
Différentes techniques de mise en évidence des effets cytopathogènes
consécutifs à l’activité du virus dans la cellule hôte ont pu être observées puis
analysées.
II ressort de cette étude que les cellules de testicules sont légèrement plus
sensibles au virus de la DNCB que les cellules de reins.
Mais à ce jour, le mode de pénétration du virus dans la cellule hôte est sujet à
-
controverses. Certains comme KIRN (1976), pensaient que seule l’attraction de charges
complémentaires suffisait. II est maintenant avancé la théorie des récepteurs
spécifiques (GIRARD et HIRTH, 1985). Aussi, une étude minutieuse des mécanismes
d’adsorption virale s’impose. Et cela ne peut se faire sans la microscopie électronique
associée à la biologie moléculaire. Ces deux techniques permettront l’étude
ultrastructurale, l’isolement et la purification des récepteurs membranaires. Des
inhibiteurs spécifiques et compétitifs de ce virus pourront être utilisés à des fins
thérapeutiques; aucun traitement spécifique de cette virose n’est encore disponible.
Avec l’avènement de la PCR (polymerase chain reaction), les nouvelles techniques de
Q
biologie moléculaire ont tendance à prendre le relais dans la préparation des vaccins.
En 1993, ROMERO et coll ont mis au point un vaccin recombinant peste bovine -
DNCB. Pourtant son utilisation reste encore balbutiante. Ce type de vaccin bivalent ne
risque - il pas de remettre en circulation le virus de la peste bovine dans les pays où
cette maladie est éradiquée?
Les avantages qu’offrent les biotechnologies sont nombreux : sensibilité exceptionnelle
de la PCR, précocité du diagnostic et sa grande fiabilité. Mais il n’en demeure pas
I
moins vrai que les principaux tests virologiques sont encore réalisés par sérologie. Les
vaccins produits à partir de cellules en culture offrent toujours des résultats
satisfaisants quant à la facilité d’exécution, de reproductibilité et surtout de coût.
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C
I
c
-
mn
-
I
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-
L
II.
J
ANNEXE
#9
C
-
-
-
m
L
Mm
-
TABLE DES VALEURS DE U
n1
nc
2
3
4
S 6 r7 8
9 10 11
1 2 1 3
1 4 1J
1 6 17 1: 1 9 20
2
<’ 0
0
0 0
1
1
1
1
1
2
2
2
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2
3 3
4
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s
6
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t 9 11 1 2 1 3 1 4 II 17 18
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8 10 11 13 14. 16
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34 37 39 42 45 U
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14 17 20 23 26 29 33 36 39 42 4S 48 S2 S S
II
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16 19 22 2 6 30 33 37 40 44 47 SI
S S 58
62
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7 l l 14 18 22 26 29 33 37 41 45 49 S3 51 61 6) 69
-
13
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12 16 20 24 28 33 37 41
4S S O S4 49 63 67 72 76
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1 4
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3 6 40 4J S O S S S P 64 67 74’ 78 13
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14 19 24 W 34 39 U 49 S4 SP 64 70 71 80 8S 90
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37 ,42 4 7 If 59 64 70 7S 81
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2
8 13 20 27 34 41 48 SS 62 69 76 83 90 91 SOS 112 Il9 127
Calculer U, et U2 (test de Mann-Whi tney, p. 30 >.
Prendre le “U” le plus faible et le comparer a la valeur lue dans
!a table à la croisée de n1 (effectif de l’échantillon 1) et de n2 (effectif de
I’~~:h~3nt.ili~y-i
2,)
‘3 ‘I W. C&.IS p e t i t qw? 1s valeur d e 1s t a b l e , l a diffh-enci e s t
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Titre : Contribution à l’étude du virus de la Dermatose Nodulaire
. Contagieuse Bovine sur culture de cellules primaires de moutoh.
Nom du candidat :
NDEYE FATOU TALL
Nature du Mémoire :
D.E.A. de Biologie Animale
Jury :
Président :
M. M ADY
NDIAYE
Membres :
MM. OMAR THIOM
TH IAW
YAYA
THIONGANE
MEïSSA
TOURE
111
- Soutenu le 28 Juin 1999 à 9h30 à I’Amphi 7
Résumé : Dans cette étude deux cultures de cellules de premières explantations
(reins et testicules de mouton) sont réalisées puis infectées par le virus de la
-
Dermatose Nodulaire Contagieuse Bovine (DNCB).
Les modifications cytologiques ou effets cytopathogènes (ECP)
consécutives à cette infection sont mises en évidence par des techniques de
111
colorations cytologique (Giemsa) et immunologique (immunofluorescence).
Le degré d’infection de ces cellules ou titre viral est déterminé grâce à la
méthode de SPEERMANN - KARBER. Les courbes d’évolution des titres en fonction
du temps d’infection, des deux espèces cellulaires ont montré une différence de
ol
sensibilité peu significative entre ces deux types de cellules. Ce qui a pu être
confirmé par le test U de MANN et WHITHNEY.
Mots-clefs : culture de cellules, première explantation, DNCB, ECP, titre
viral, sensibilité.
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--lrr.-“*.--.
Titre : Contribution à I”étude du virus de la Dermatose Nodulaire
Contagieuse Bovine sur culture de cellules primaires de rnoutorx
Non? du candidat :
NDEYE FATOU TALL
Nature du Mémoire :
D.E.A. de Biologie Animale
Jury
Président :
M. MADY
NDIAYE
Membres :
MM. OMAR THIOM
II-i IAW
YA~A
TI-iIONGANE
MEïSSA
TOURE
- Soutenu le 28 Juin 1999 à 9h30 à I’Amphi 7
Résumé : Dans cette étude deux cultures de cellules de premières explantations
(reins et testicules de mouton) sont réalisées puis infectées par le virus de la
Dermatose Nodulaire Contagieuse Bovine (DNCB),
Les modifications cytologiques
ou effets cytopathogènes (ECP)
consécutives à cette infection sont mises en évidence par des techniques de
colorations cytologique (Giemsa) et immunologique (immunoflbloresr~eaPr-)
Le degré d’infection de ces cellules ou titre viral est déterminé grâce à la
méthode de SPEERMANN L KARBER. Les courbes d’evolution des titres en fonction
du temps d’infection, des deux espèces cellulaires wnt montré une drfference de
sensibilité peu significative entre ces deux types de cellules Ce qur a pu etre
confirmé par le test U de MANN et WHITHNEY.
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Mots-clefs : culture de cellules, première explantatisn, DNCB, ECP, titre
viral, sensibilité,