INSTITUT D'l%EVAGE ET DE V'?TÉRTNATRE DES PAYS ...
INSTITUT D'l%EVAGE ET DE
V'?TÉRTNATRE DES PAYS
__
.
REVUE D’ÉLE’ STAGE
ET DE
MÉDECINE VÉT\\ !RINAIRE
DES PAYS
Essai d’entretien de cellules
de reins de bovins par
et modification du milieu
par Mme Josette MONNIER-C. AikBON
N* 1 - 19E5
-- VlGOT FRÈRES, ÉDIT~ URS
23. rue de l’École-de-Médecil e, PARIS-VI”
Rev. Elev. Méd. Vét. Pays trop,, 1965, 18, I (l-7)
Essai d’entretien de cellul 3s épithéliales
de reins de bovins par pc ssages répétés
et modification du mil ieu nutritif
Note préliminaire
Mme joseffe MONNIER-CAMC IN
RÉSUMÉ
II a été possible d’effectuer avec succès 27 passage
de cellules épithéliales
de rein de bovin durant une période de quatre mois.
La vitesse de croissance des cellules s’est amélioréf
du 1” passage au 5’ et
une modification du milieu de culture a permis de I
maintenir jusqu’au 20’.
Du 20e passage au 27e, la vitalité des cellules dans ce
iême milieu est allée en
diminuant. Au 28e passage, le tapis cellulaire n’a p u arriver à recouvrir que
5 pour cent de la boîte de Roux.
Cette lignée cellulaire au Ile passage et 1 3c passac
s’est montrée utilisable
pour la croissance et le titrage du virus bovipestique. .a souche Kabete « 0 »
aussi bien que /a souche « B » Dakar donnent des 18#ions identiques à celles
observées sur des cellules de Ire explantation et surtoL
un titre égal.
Une étude des chromosomes réalisée sur des cellule!
du IOC passage a permis
de constater que le nombre modal n’était pas modifié
t que la morphologie ne
paraissait pas altérée par rapport à celle des cellules d Ire explantation,
L’application de la technique de culture cellu-
TECHNIQUE
laire pour la croissance ou l’isolement d’un
virus tant dans le domaine de la recherche que
10 Préparc
ion des cellules de Ire explantation
dans celui du diagnostic, devient de plus en plus
Les rein d’un foetus bovin (7 mois environ)
fréquente et il est évident que le fait de pouvoir
sont préle\\
!s aseptiquement. La substance cor-
bénéficier d’un matériel à jour fixe, est un
ticale est t lchée finement à l’aide de scalpels,
avantage indiscutable. L’objet de cette étude a
lavée trois fois dans une solution tamponnée
donc été d’essayer d’obtenir une lignée cellu-
salée (PBS :* et mise au contact d’une solution
laire par passages répétés de cellules épithé-
de trypsine
Difco à 0,3 p. 100 en Hanks BSS***.
liales en notant les conditions particulières, s’il y
Après une Irétrypsination de 20 mn à la tempé-
a lieu, du développement.
i
rature du aboratoire, la trypsination propre-
e
ment dite
;t conduite à + 40 pendant 5 h. La
MATÉRIEL
trypsine es ensuite séparée par centrifugation.
La suspension cellulaire de reins de foetus*
bovin no 68 présentant une grande facilité de
* Les emi
yons n’étant utilisés qu’âgés d’au moins
culture, le tapis cellulaire atteint 95 p. 100 en
h-ois mois et IIUS, le terme « fœtus » est préféré. Conf.
BLIN et FOU NIER (1).
T
30 h sur une boîte de Roux, est retenue pour
** PBS ~=
hosphate buffer solution (Dulbecco).
être à l’origine de cet essai.
*** BSS -_ balanced
salt solution.
Le culot cellulaire est lavé et mis en culture a
En même temps, on note que les cellules devien-
raison de 1 volume pour 250 dans du Hanks
nent plus rondes et que leur croissance est amé-
LAYE* (pH 7,2) auquel on ajoute 10 p. 100
liorée en modifiant les conditions du milieu.
de sérum de veau (importé de France) ainsi
a) Adjonction de bicarbonate.
que des antibiotiques, pénicilline 150 U. l., strep-
tomycine 150 y et mycostatine 100 U. 1, par ml.
Au jour J, trypsination d’un flacon de 250 ml
Après répartition, les cultures sont incubées à 370.
(5e passage) et mise en culture dans 2 flacons.
Les renouvellements ultérieurs de milieu sont
L.e premier, dans les conditions habituelles, le
effectués tous les 2 ou 3 jours à l’aide du même
deuxième après adjonction de bicarbonate afin
milieu, mais ta proportion de sérum est ramenée
d’obtenir un pH aux environs de 7,4-7,5.
à 5 p. 100 de sérum de boeuf (importé de France)
Au jour J -1 1, le tapis est le suivant* :
au Ier changement et 2 p. 100 pour les suivants.
flacon sans bicarbonate . . .
30 pS 100
Le pH est porté de 72 à 7,4 par adjonction d’une
f l a c o n a v e c b i c a r b o n a t e
95 p. 100
solution de bicarbonate. Cette méthode a été
Au jour J -,- 2 :
exposée plus en détail dans un précédent
flacon sans bicarbonate
40 p. 100
article (2).
f l a c o n a v e c b i c a r b o n a t e
100 p. 100
b) Augmenfofion de la feneur du milieu en
20 Obtention de sub-culture
sérum.
Huit jours après la mise en culture, le tapis
Les cellules obtenues par trypsinatron d’un
d’un flacon de 250 ml est lavé trois fois avec une
autre flacon du 5” passage sont d’abord portées
solution de trypsine Difco à 0,3 p. 100 en solution
à la dilution habituelle de 1 volume pour 2 volu-
salée, sans calcium ni magnésium (CMFS). Au
mes. La moitié de la suspension obtenue est
dernier lavage, le flacon incliné est placé à
distribuée, l’autre moitié est encore diluée à
l’étuve à 370 pendant quelques mn de telle sorte
volume égal et mise en culture en quantité conve-
que la quantité infime de trypsine résiduelle
nable. La proportion de sérum dans ce dernier
imprègne le tapis cellulaire, et, pour éviter toute
milieu est augmentée à 12 p. 100 et 48 h après,
dessiccation, la trypsine est passée sur le tapis
les deux cultures ont atteint également 100 p. 100
cellulaire par inclinaisons répétées du flacon.
de développement.
Dès que les cellules sont décollées, elles sont
Au 7 passage, ‘quelques temps de croissance
remises en suspension dans une partie aliquote
sont relevés :
du milieu où elles seront cultivées (2 fois le
- A 13 h, trypsination du 6~ passage et mise
volume initial). Pour ce premier passage, la
en culture dans un flacon de 250 ml et de tubes
composition est la même que pour la mise en
Leighton.
culture de cellules de première explantation. II
- A 19 h 30, le tapis est le suivant :
est très important de pipetter et repipetter plu-
45 p. 100 dans les tubes,
sieurs fois afin de diviser le plus possible les amas
60 p. 100 dans le flacon.
cellulaires : leur croissance sera d’autant plus
- A7 h le lendemain :
rapide que les cellules auront été plus isolées.
80 p. 100 dans les tubes,
95 p. 100 dans le flacon.
RÉSULTATS
On peut donc constater une croissance extrê-
1. Croissance cellulaire.
mement rapide dans les premières heures, et,
contrairement à ce qui se passe habituellement à
Cinq jours après, la croissance a été telle qu’il
un tel niveau de passage, on n’observe pas une
est possible de refaire un passage et jusqu’au
majorité de fibroblastes. L’ensemble est bien
cinquième passage, ce délai de cinq jours sera
formé de cellules épithéliales (voir photos 1, 2
observé. A partir de celui-ci, trois jours seulement
et 3).
sont nécessaires pour obtenir un tapis complet.
* Le pourcentage est évalué de façon approximative
* LAYE r-7 hydrolysat de lactalbumine et extrait de
en effectuant une moyenne des résultats donnés par plu-
levure.
sieurs lectures au microscope.
2
Fig. 1. -- Culture de cellules épithéliales de rein de fcetus bovin au 6’jour, 7rpassage, X 160.
/
Fig. 2. - Culture de cellules épithéliales de rein de foetus bovin au 3” jour, 7’J passage, X 400.
f
3
I
Fig. 3. - Culture de cellules épithélinles de rein de foetus bovin (IOC’ passage) infectées
par le virus bovipestique Kabete « 0 » 4ejourà370 --Cellules multinucléées avec vacuole - X 400.
Malheureusement, les passages ne sont pas
sur la valeur qualitative de ces cellules. Elle
poursuivis au-delà du 28e. Avant le 20e passage,
porte sur :
la vitalité des cellules est telle qu’un flacon de
- la culture du virus bowpestique,
250 ml permeJ la mise en culture de 4 flacons
- le comportement génétique.
de même volume. Mais depuis le 23e passage,
la faculté de reproduction diminue et une compo-
II. C&ure ef fifrage du virus bovipesfique.
. .
sition convenable du milieu, peut-être encore à
modifier, n’a pu être étudiée par suite de circons-
Des titrages comparés de virus sont effectués
tances indépendantes de notre volonté, les
en utilisant la souche bovipestique « B » Dakar.
cellules fibroblastiques
deviennent très aoon-
- virus sur cellules de Ire explantation,
dantes.
- virus sur cellules du Ile passage titré 6 la
Au moment où la vitesse de croissance des
fois sur cellules de Ire explantation et sur cellules
cellules était maxima, une étude est entreprise
du 13” passage. (Tableau).
Cultivé sur cellules
Cultivé sur cellules
Ière aplantation
llbne passage
Titre (DISOR) sur
cellules lère
cellules 13ème
explentation
I
P = = % i -
,,+
I
10-5r3
i
La souche bovipestique Kabete « 0 » cultivée
montage a L/ baume du Canada sirupeux. Paral-
sur cellules de Ire explantation et sur cellules du
Ièlement, i
série de lamelles de.Ire explan-
I
13e passage, donne dans les deux cas un titre
tation est e
de 1 O--5,2.
Immédia
ent après séchage, les prépa-
w
La lignée cellulaire obtenue paraît avoir gardé
rations son
servées au microscope. On repère
vis-à-vis du virus bovipestique, son caractère
les plaques
uelles les chromosomes sont
réagissant, tout en ayant multiplié son facteur
nets et sépl
de croissance. S’agit-il d’une mutation ? II est
suffisamme
démonstratives. Après agrandisse-
difficile d’affirmer ou d’infirmer ce terme, tous
.
ment de tel
ci, les chromosomes sont découpés
les moyens d’étude ne pouvant être envisagés,
un à un, gr
pés par paire et par ordre décrois-
L’étude des chromosomes entreprise au IOe pas-
sant de tail
sage va cependant pouvoir nous donner une
Une con
raison de plaques de chromosomes
.
idée sur le matériel génétique de cette cellule.
résultant d
lules de Ire explantation et du
IOe passag
ntre que, malgré l’entretien en
III. Etude des chromosomes.
milieu arti
et 10 passages, ni le nombre,
La première expérience réalisée sur des
ni la morpl
e des chromosomes ne semblent
cellules ayant à peine 24 h s’avère nulle. Aucun
altérés. Les
es « 4 » et « 5 » montrent respec-
chromosome n’est sorti sauf sur les lames com-
tivement I
romosomes en métaphase de
portant des cellules normales et dont la crois-
cellules ép héliales de rein de foetus bovin de
sance se situait entre 48 h et 3 j.
Ire explant tion et du IOe passage.
La deuxième expérience est réalisée sur des
cellules de presque 3 j et cette fois avec succès.
CONCLUSION
A ce propos se pose le problème de la reproduc-
tion, pourtant si rapide dans les premières heures.
II a été p
‘ble d’effectuer avec succès 27 pas-
Au jour J, le 9e passage est trypsiné et mis en
sages de c
les épithéliales de rein de bovin
culture notamment dans 10 iubes Leighton. Au
durant une
riode de 4 mois.
jour J -L- 2 les milieux sont changés en diminuant
La vitess
e croissance des cellules s’est amé-
la quantité totale (1 ml au lieu de 2) et en augmen-
liorée du 1
passage au 5” et une modification
tant la teneur en sérum du milieu (20 p. 100).
du milieu
e culture a permis de la maintenir
6 h après, 6 tubes reçoivent 3 gouttes d’extrait
jusqu’au 21 , Du 20” passage au 27e, la vitalité
embryonnaire de poussin. Au jour J + 3, on
des cellule dans ce même milieu est allée en
introduit une goutte à 2 gouttes d’une solution
diminuant.
Le 28e passage n’a pu arriver qu’à
de colchicine à 0,4 mg p. 100 dans chaque
5 p. 100 de
tube (1). On laisse 4 h à l’étuve à 370 C. Ce pro-
Cette Ii!
cellulaire au Ile passage et
duit, ainsi qu’il est connu, a pour effet de bloquer
13e ipassa:
s’est montrée utilisable pour la
la mitose en métaphase. Au bout de ce temps,
croissance
titrage du virus bovipestique.
on vide le milieu et on ajoute par tube 1 ml d’un
La souche
e « 0 » aussi bien que la souche
mélange réchauffé à 37 OC d’eau distillée, d’eau
« B » Daki
nnent des lésions identiques à
physiologique et de hyaluronidase. Les tubes
tel les obse
es sur ces cellules de Ire explan-
sont agités légèrement, laissés 35 mn à la tempé-
tation et su
rature du laboratoire. II se produit alors un
Une étw
éclatement des cellules. C’est ensuite la ftxation
cellules dL
passage a permis de constater
i
au Carmoy (alcool absolu, chloroforme, acide
que le non
modal n’était pas modifié et que
acétique), puis l’hydrolyse dans un bain-marie
la morphc
te ne paraissait pas altérée par
à 600 en présence d’acide chlorhydrique normal.
rapport à
e des cellules de Ire explantation.
La coloration se fait au bleu de toluidine, le
Institu
Elevage et de Médecine Véténnalre
--~
des Pays fropicaux
Laboratoire National
(1) Technique pratiquée au laboratoire d’hygiène de
de I ,
rches Vétérinaires
la Faculté de Médecine (Prof. agrégé BAYLET et Mme
GRATTEPANCHE que nous remercions de leurs conseils).
Dakar-Hann
Fig. 4. - Chromosomes en métaphase de cellules éprthéllales de rein
de fœtus bovin de Ire’ explanlailon.
Fig. 5. - Chromosomes en métaphase de cellules éprthéliales
de rein de fcetus bovin de 1” explantation. 10” passage.
6
SUMMARY
Attempt to maintain bovine kidney cells by re eated passages and
modification of the nutritive medium. Prel i ninary note.
It was possible, to successfully carry out 27 succesIside passages of bovine
kidney epithelial cells over a period of four months.
The rate of growth of the cells was improved from th e 1 st to the 5 th passage
and a modification of the culture medium enabled one o maintain it up to the
20 th. From the 20 th to 27 th passage, the vitality of the c
Ils in this same medium
progressively decreased. The 20 th passage produced 45 p. 100 of the coverlng
growth only.
i
This strain, at the 11 th and 13 th passage, proved u’
!ful for the growth and
assay of the rinderpest virus. The Kabete « 0 » strain as 4 NeIl as the Dakar « B »
strain produced lesions identical to those observed on c: e 1s of primary culture :
they gave also a same TCID,, titer.
The study of the chromosomes carried out on cells
erived from the 10th
passage enabled one to ascertain that the modal numb e had not changed and
that the morphology did not appear to be modified a s c mpared to that of the
cells of the 1 st expiant.
i
RESUMEN
Ensayo de conservation de células epiteliales d
riiion de bovinos
mediante repetidos pasajes y modification
medio nutritivo.
Nota preliminar.
Se tuvo exito a1 efectuar 27 pasajes de células epitelial
de un ritîon bovino
durante cuatro meses.
La velocidad de crecimiento de las células est
al 50, y una modification del medio de cultiva
p e
enerla hasta el
200. Del 200 pasaje a1 270, la viabilidad de las c é
e m i s m o medto
fué disminuyendo. Con el 280 pasaje, la alfombra
que 5 por 100 de la superficie de la caja de Roux.
Esta iinea celular con el Il” y el 130 pasaje se en
ilizable para el cre-
cimiento y la dosificacion del virus bovipestico. La
bete « 0 » asi como
la cepa « B » Dakar dan lesiones identicas a las obs
en celulas de primer
cultiva y sobretodo un titulo semejante.
Un estudio de 10s cromosomas realizado en
comprobar que el numero modal no estaba
no parecia alterada con respecto a la de las ceiulas de pri
BIBLIOGRAPHIE
1. BLIN (P. C.) & FOURNIER (Cl,). - Diagnose
P.), - Traité de zoologie. T. XII.
de l’âge intra-maternel et périodisation
, MUNTONI (S.) et LODDO (B.). -
du développement dans l’espèce bovine.
de cellules rénales bovines
Economie ef Médecine animales no 1, 12-32,
lement in vitro (caratteristiche
1963.
Ii bovine
propagate serial-
2. GILBERT (Y.) et MONNIER (J.). -Adaptation
d’une souche de virus bovipestique à la
culture cellulaire. Premiers résultats. Rev.
UCK (T.). - Génétique des
Uev. Méd. Vét. Pays trop., 1962, 15 (4), 311-20.
ues de mammifères II. Cons-
3. FERGUSSON (1.) & WANSBROUGH (A.). -
osomique des cellules en culture
Isolement et culture à long terme d’une lignée
tics of somatic mammalian cells.
de cellules diploïdes de mammifères (Isolation
l
constitution of cells in tissue
and long term culture of diploid mammalian
cell lines). Cancer Res., 22, 556-562, 1962.
V'?TÉRTNATRE DES PAYS
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REVUE D’ÉLE’ STAGE
ET DE
MÉDECINE VÉT\\ !RINAIRE
DES PAYS
Essai d’entretien de cellules
de reins de bovins par
et modification du milieu
par Mme Josette MONNIER-C. AikBON
N* 1 - 19E5
-- VlGOT FRÈRES, ÉDIT~ URS
23. rue de l’École-de-Médecil e, PARIS-VI”
Rev. Elev. Méd. Vét. Pays trop,, 1965, 18, I (l-7)
Essai d’entretien de cellul 3s épithéliales
de reins de bovins par pc ssages répétés
et modification du mil ieu nutritif
Note préliminaire
Mme joseffe MONNIER-CAMC IN
RÉSUMÉ
II a été possible d’effectuer avec succès 27 passage
de cellules épithéliales
de rein de bovin durant une période de quatre mois.
La vitesse de croissance des cellules s’est amélioréf
du 1” passage au 5’ et
une modification du milieu de culture a permis de I
maintenir jusqu’au 20’.
Du 20e passage au 27e, la vitalité des cellules dans ce
iême milieu est allée en
diminuant. Au 28e passage, le tapis cellulaire n’a p u arriver à recouvrir que
5 pour cent de la boîte de Roux.
Cette lignée cellulaire au Ile passage et 1 3c passac
s’est montrée utilisable
pour la croissance et le titrage du virus bovipestique. .a souche Kabete « 0 »
aussi bien que /a souche « B » Dakar donnent des 18#ions identiques à celles
observées sur des cellules de Ire explantation et surtoL
un titre égal.
Une étude des chromosomes réalisée sur des cellule!
du IOC passage a permis
de constater que le nombre modal n’était pas modifié
t que la morphologie ne
paraissait pas altérée par rapport à celle des cellules d Ire explantation,
L’application de la technique de culture cellu-
TECHNIQUE
laire pour la croissance ou l’isolement d’un
virus tant dans le domaine de la recherche que
10 Préparc
ion des cellules de Ire explantation
dans celui du diagnostic, devient de plus en plus
Les rein d’un foetus bovin (7 mois environ)
fréquente et il est évident que le fait de pouvoir
sont préle\\
!s aseptiquement. La substance cor-
bénéficier d’un matériel à jour fixe, est un
ticale est t lchée finement à l’aide de scalpels,
avantage indiscutable. L’objet de cette étude a
lavée trois fois dans une solution tamponnée
donc été d’essayer d’obtenir une lignée cellu-
salée (PBS :* et mise au contact d’une solution
laire par passages répétés de cellules épithé-
de trypsine
Difco à 0,3 p. 100 en Hanks BSS***.
liales en notant les conditions particulières, s’il y
Après une Irétrypsination de 20 mn à la tempé-
a lieu, du développement.
i
rature du aboratoire, la trypsination propre-
e
ment dite
;t conduite à + 40 pendant 5 h. La
MATÉRIEL
trypsine es ensuite séparée par centrifugation.
La suspension cellulaire de reins de foetus*
bovin no 68 présentant une grande facilité de
* Les emi
yons n’étant utilisés qu’âgés d’au moins
culture, le tapis cellulaire atteint 95 p. 100 en
h-ois mois et IIUS, le terme « fœtus » est préféré. Conf.
BLIN et FOU NIER (1).
T
30 h sur une boîte de Roux, est retenue pour
** PBS ~=
hosphate buffer solution (Dulbecco).
être à l’origine de cet essai.
*** BSS -_ balanced
salt solution.
Le culot cellulaire est lavé et mis en culture a
En même temps, on note que les cellules devien-
raison de 1 volume pour 250 dans du Hanks
nent plus rondes et que leur croissance est amé-
LAYE* (pH 7,2) auquel on ajoute 10 p. 100
liorée en modifiant les conditions du milieu.
de sérum de veau (importé de France) ainsi
a) Adjonction de bicarbonate.
que des antibiotiques, pénicilline 150 U. l., strep-
tomycine 150 y et mycostatine 100 U. 1, par ml.
Au jour J, trypsination d’un flacon de 250 ml
Après répartition, les cultures sont incubées à 370.
(5e passage) et mise en culture dans 2 flacons.
Les renouvellements ultérieurs de milieu sont
L.e premier, dans les conditions habituelles, le
effectués tous les 2 ou 3 jours à l’aide du même
deuxième après adjonction de bicarbonate afin
milieu, mais ta proportion de sérum est ramenée
d’obtenir un pH aux environs de 7,4-7,5.
à 5 p. 100 de sérum de boeuf (importé de France)
Au jour J -1 1, le tapis est le suivant* :
au Ier changement et 2 p. 100 pour les suivants.
flacon sans bicarbonate . . .
30 pS 100
Le pH est porté de 72 à 7,4 par adjonction d’une
f l a c o n a v e c b i c a r b o n a t e
95 p. 100
solution de bicarbonate. Cette méthode a été
Au jour J -,- 2 :
exposée plus en détail dans un précédent
flacon sans bicarbonate
40 p. 100
article (2).
f l a c o n a v e c b i c a r b o n a t e
100 p. 100
b) Augmenfofion de la feneur du milieu en
20 Obtention de sub-culture
sérum.
Huit jours après la mise en culture, le tapis
Les cellules obtenues par trypsinatron d’un
d’un flacon de 250 ml est lavé trois fois avec une
autre flacon du 5” passage sont d’abord portées
solution de trypsine Difco à 0,3 p. 100 en solution
à la dilution habituelle de 1 volume pour 2 volu-
salée, sans calcium ni magnésium (CMFS). Au
mes. La moitié de la suspension obtenue est
dernier lavage, le flacon incliné est placé à
distribuée, l’autre moitié est encore diluée à
l’étuve à 370 pendant quelques mn de telle sorte
volume égal et mise en culture en quantité conve-
que la quantité infime de trypsine résiduelle
nable. La proportion de sérum dans ce dernier
imprègne le tapis cellulaire, et, pour éviter toute
milieu est augmentée à 12 p. 100 et 48 h après,
dessiccation, la trypsine est passée sur le tapis
les deux cultures ont atteint également 100 p. 100
cellulaire par inclinaisons répétées du flacon.
de développement.
Dès que les cellules sont décollées, elles sont
Au 7 passage, ‘quelques temps de croissance
remises en suspension dans une partie aliquote
sont relevés :
du milieu où elles seront cultivées (2 fois le
- A 13 h, trypsination du 6~ passage et mise
volume initial). Pour ce premier passage, la
en culture dans un flacon de 250 ml et de tubes
composition est la même que pour la mise en
Leighton.
culture de cellules de première explantation. II
- A 19 h 30, le tapis est le suivant :
est très important de pipetter et repipetter plu-
45 p. 100 dans les tubes,
sieurs fois afin de diviser le plus possible les amas
60 p. 100 dans le flacon.
cellulaires : leur croissance sera d’autant plus
- A7 h le lendemain :
rapide que les cellules auront été plus isolées.
80 p. 100 dans les tubes,
95 p. 100 dans le flacon.
RÉSULTATS
On peut donc constater une croissance extrê-
1. Croissance cellulaire.
mement rapide dans les premières heures, et,
contrairement à ce qui se passe habituellement à
Cinq jours après, la croissance a été telle qu’il
un tel niveau de passage, on n’observe pas une
est possible de refaire un passage et jusqu’au
majorité de fibroblastes. L’ensemble est bien
cinquième passage, ce délai de cinq jours sera
formé de cellules épithéliales (voir photos 1, 2
observé. A partir de celui-ci, trois jours seulement
et 3).
sont nécessaires pour obtenir un tapis complet.
* Le pourcentage est évalué de façon approximative
* LAYE r-7 hydrolysat de lactalbumine et extrait de
en effectuant une moyenne des résultats donnés par plu-
levure.
sieurs lectures au microscope.
2
Fig. 1. -- Culture de cellules épithéliales de rein de fcetus bovin au 6’jour, 7rpassage, X 160.
/
Fig. 2. - Culture de cellules épithéliales de rein de foetus bovin au 3” jour, 7’J passage, X 400.
f
3
I
Fig. 3. - Culture de cellules épithélinles de rein de foetus bovin (IOC’ passage) infectées
par le virus bovipestique Kabete « 0 » 4ejourà370 --Cellules multinucléées avec vacuole - X 400.
Malheureusement, les passages ne sont pas
sur la valeur qualitative de ces cellules. Elle
poursuivis au-delà du 28e. Avant le 20e passage,
porte sur :
la vitalité des cellules est telle qu’un flacon de
- la culture du virus bowpestique,
250 ml permeJ la mise en culture de 4 flacons
- le comportement génétique.
de même volume. Mais depuis le 23e passage,
la faculté de reproduction diminue et une compo-
II. C&ure ef fifrage du virus bovipesfique.
. .
sition convenable du milieu, peut-être encore à
modifier, n’a pu être étudiée par suite de circons-
Des titrages comparés de virus sont effectués
tances indépendantes de notre volonté, les
en utilisant la souche bovipestique « B » Dakar.
cellules fibroblastiques
deviennent très aoon-
- virus sur cellules de Ire explantation,
dantes.
- virus sur cellules du Ile passage titré 6 la
Au moment où la vitesse de croissance des
fois sur cellules de Ire explantation et sur cellules
cellules était maxima, une étude est entreprise
du 13” passage. (Tableau).
Cultivé sur cellules
Cultivé sur cellules
Ière aplantation
llbne passage
Titre (DISOR) sur
cellules lère
cellules 13ème
explentation
I
P = = % i -
,,+
I
10-5r3
i
La souche bovipestique Kabete « 0 » cultivée
montage a L/ baume du Canada sirupeux. Paral-
sur cellules de Ire explantation et sur cellules du
Ièlement, i
série de lamelles de.Ire explan-
I
13e passage, donne dans les deux cas un titre
tation est e
de 1 O--5,2.
Immédia
ent après séchage, les prépa-
w
La lignée cellulaire obtenue paraît avoir gardé
rations son
servées au microscope. On repère
vis-à-vis du virus bovipestique, son caractère
les plaques
uelles les chromosomes sont
réagissant, tout en ayant multiplié son facteur
nets et sépl
de croissance. S’agit-il d’une mutation ? II est
suffisamme
démonstratives. Après agrandisse-
difficile d’affirmer ou d’infirmer ce terme, tous
.
ment de tel
ci, les chromosomes sont découpés
les moyens d’étude ne pouvant être envisagés,
un à un, gr
pés par paire et par ordre décrois-
L’étude des chromosomes entreprise au IOe pas-
sant de tail
sage va cependant pouvoir nous donner une
Une con
raison de plaques de chromosomes
.
idée sur le matériel génétique de cette cellule.
résultant d
lules de Ire explantation et du
IOe passag
ntre que, malgré l’entretien en
III. Etude des chromosomes.
milieu arti
et 10 passages, ni le nombre,
La première expérience réalisée sur des
ni la morpl
e des chromosomes ne semblent
cellules ayant à peine 24 h s’avère nulle. Aucun
altérés. Les
es « 4 » et « 5 » montrent respec-
chromosome n’est sorti sauf sur les lames com-
tivement I
romosomes en métaphase de
portant des cellules normales et dont la crois-
cellules ép héliales de rein de foetus bovin de
sance se situait entre 48 h et 3 j.
Ire explant tion et du IOe passage.
La deuxième expérience est réalisée sur des
cellules de presque 3 j et cette fois avec succès.
CONCLUSION
A ce propos se pose le problème de la reproduc-
tion, pourtant si rapide dans les premières heures.
II a été p
‘ble d’effectuer avec succès 27 pas-
Au jour J, le 9e passage est trypsiné et mis en
sages de c
les épithéliales de rein de bovin
culture notamment dans 10 iubes Leighton. Au
durant une
riode de 4 mois.
jour J -L- 2 les milieux sont changés en diminuant
La vitess
e croissance des cellules s’est amé-
la quantité totale (1 ml au lieu de 2) et en augmen-
liorée du 1
passage au 5” et une modification
tant la teneur en sérum du milieu (20 p. 100).
du milieu
e culture a permis de la maintenir
6 h après, 6 tubes reçoivent 3 gouttes d’extrait
jusqu’au 21 , Du 20” passage au 27e, la vitalité
embryonnaire de poussin. Au jour J + 3, on
des cellule dans ce même milieu est allée en
introduit une goutte à 2 gouttes d’une solution
diminuant.
Le 28e passage n’a pu arriver qu’à
de colchicine à 0,4 mg p. 100 dans chaque
5 p. 100 de
tube (1). On laisse 4 h à l’étuve à 370 C. Ce pro-
Cette Ii!
cellulaire au Ile passage et
duit, ainsi qu’il est connu, a pour effet de bloquer
13e ipassa:
s’est montrée utilisable pour la
la mitose en métaphase. Au bout de ce temps,
croissance
titrage du virus bovipestique.
on vide le milieu et on ajoute par tube 1 ml d’un
La souche
e « 0 » aussi bien que la souche
mélange réchauffé à 37 OC d’eau distillée, d’eau
« B » Daki
nnent des lésions identiques à
physiologique et de hyaluronidase. Les tubes
tel les obse
es sur ces cellules de Ire explan-
sont agités légèrement, laissés 35 mn à la tempé-
tation et su
rature du laboratoire. II se produit alors un
Une étw
éclatement des cellules. C’est ensuite la ftxation
cellules dL
passage a permis de constater
i
au Carmoy (alcool absolu, chloroforme, acide
que le non
modal n’était pas modifié et que
acétique), puis l’hydrolyse dans un bain-marie
la morphc
te ne paraissait pas altérée par
à 600 en présence d’acide chlorhydrique normal.
rapport à
e des cellules de Ire explantation.
La coloration se fait au bleu de toluidine, le
Institu
Elevage et de Médecine Véténnalre
--~
des Pays fropicaux
Laboratoire National
(1) Technique pratiquée au laboratoire d’hygiène de
de I ,
rches Vétérinaires
la Faculté de Médecine (Prof. agrégé BAYLET et Mme
GRATTEPANCHE que nous remercions de leurs conseils).
Dakar-Hann
Fig. 4. - Chromosomes en métaphase de cellules éprthéllales de rein
de fœtus bovin de Ire’ explanlailon.
Fig. 5. - Chromosomes en métaphase de cellules éprthéliales
de rein de fcetus bovin de 1” explantation. 10” passage.
6
SUMMARY
Attempt to maintain bovine kidney cells by re eated passages and
modification of the nutritive medium. Prel i ninary note.
It was possible, to successfully carry out 27 succesIside passages of bovine
kidney epithelial cells over a period of four months.
The rate of growth of the cells was improved from th e 1 st to the 5 th passage
and a modification of the culture medium enabled one o maintain it up to the
20 th. From the 20 th to 27 th passage, the vitality of the c
Ils in this same medium
progressively decreased. The 20 th passage produced 45 p. 100 of the coverlng
growth only.
i
This strain, at the 11 th and 13 th passage, proved u’
!ful for the growth and
assay of the rinderpest virus. The Kabete « 0 » strain as 4 NeIl as the Dakar « B »
strain produced lesions identical to those observed on c: e 1s of primary culture :
they gave also a same TCID,, titer.
The study of the chromosomes carried out on cells
erived from the 10th
passage enabled one to ascertain that the modal numb e had not changed and
that the morphology did not appear to be modified a s c mpared to that of the
cells of the 1 st expiant.
i
RESUMEN
Ensayo de conservation de células epiteliales d
riiion de bovinos
mediante repetidos pasajes y modification
medio nutritivo.
Nota preliminar.
Se tuvo exito a1 efectuar 27 pasajes de células epitelial
de un ritîon bovino
durante cuatro meses.
La velocidad de crecimiento de las células est
al 50, y una modification del medio de cultiva
p e
enerla hasta el
200. Del 200 pasaje a1 270, la viabilidad de las c é
e m i s m o medto
fué disminuyendo. Con el 280 pasaje, la alfombra
que 5 por 100 de la superficie de la caja de Roux.
Esta iinea celular con el Il” y el 130 pasaje se en
ilizable para el cre-
cimiento y la dosificacion del virus bovipestico. La
bete « 0 » asi como
la cepa « B » Dakar dan lesiones identicas a las obs
en celulas de primer
cultiva y sobretodo un titulo semejante.
Un estudio de 10s cromosomas realizado en
comprobar que el numero modal no estaba
no parecia alterada con respecto a la de las ceiulas de pri
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