REPUBLIQUE DU SENEGAL ------m-s- MINISTERE DE...
REPUBLIQUE DU SENEGAL
------m-s-
MINISTERE DE L'AGRICULTURE
I
----w-m---
l
INSTITUT SENEGALAIS DE RECHERCHES
AGRICOLES (I.S.R.A.)
------m-m-
DEPARTEMENT DE RECHERCHES SUR LES
PRODUCTIONS ET LA SANTE ANIMALES
------w--w
LABORATOIRE NATIONAL DE L'ELEVAGE
ET DE RECHERCHES VETERINAIRES
BP 2057
DAKAR-HANN
RAPPORT DE
DU 1Er AU 31 DEC
A L'INSTITUT PASTE
LA TECHNIQUE ELISA APPLI
E AU DIAGNOSTIC
DES ARBOVIROSES, NOTM
LA FIEVRE DE LA
VALLEE DU
Par Modou Mousta ha LO
P
INTRODUCTION
Dans le cadre de ma participation à I’exé
ion du programme de la Fièvre de la
Vallée du Rift au Sénégal, le Chef du programme
jugé utile que je suivi un stage sur la
technique ELISA appliquée au diagnostic de cette ar
irose à l’institut Pasteur (CRORA).
La Fièvre de la Valle’e du Rift est en effe
e zoonose due à un arhovirus de la
famille des Bunyaviridae genre Phlébovirus, resp
e chez les ruminants d’hépatite
nécrosante, d’avortement, de mortalité périnatale e
ant chez l’homme une pathologie
allant du syndrome grippal à des formes graves : syn orne ictéro-hémorragique, encéphalite
et choriorétinite.
Le principe de la technique ELISA repose s
la formation d’un complexe antigène-
anticorps révélable par une atiglobuline marquée à
zyme PéroxYdase.
Cet ensemble se traduit par une réacti
colorée en présence d’une substrat
spécifique.
1. MATERIELS
La réalisation de la technique ELISA néce ite comme matériels :
A. Matériels biologiques
- Immune ascite de souris F.V.R.
r
-Immune ascite de la chaine “mu” ( ) des immunoglobulines (Rabbit anti
sheep IgM)
Catalogue n”0214.0202 volumme 5.0 ml
Maison distributeur CAPPEL
Adresse : Organon Teknika Corporatior
1230 Wilson Drive
West Chester PA 19380
- Antigène spécifique (Ag F.V. R.)
- Antigène témoin (Ag de foie normal)
- Anti IgG spécifique (mouton ou bovin) I arquée à la péroxydase
(= Péroxyddse conjugated) 3.214.0082 fl cons de 2 ml
Catalogue n 32 14.0082
Maison distributeur CAPPEL : même acIresse que l’anti “111~”
- Les sérums à tester.
B. Matériels chimiques
- L’orthotoludine (substrat)
Maison distributeur (Sigma nOT3501) :
Dissoudrp 5 mg d’0.T. dans 0,25 ml de
, N-Diméthyl formamide
’ (Sigma n D4254) puis ajouter 30 ml de ampon citratelacide chlorhydrique pH 4 et
12 ~1 de H202 3 10 %. La solution obtenue doit être parfaitement incolore
conservation à t4 C et a l’obscurité (v rre inactinique).
i
. . . /. . .
2
Répartir 100 ~1 par cupule ce qui donne u e coloration bleue ( 620 nm) après
10 mn, blocage avec 1OQ ~1 d’H2SO4 colorati )n jaune ( 450 nm).
Le tampon pH4 : utiliser le &risol MERC
n”9884/OO01 Tp pH4, ou préparer le
tampon suivant (conservation à +4aC).
+ Acide citrique 1 H20 (PROLABO no 027629 . . . . . Il,77 g
+ Hydroxyde de sodium (NaOH) PRO ABO n02825229...4,4 g
(soude en pastille)
:
+ Dissoudre la soude dans 204) ml d’e
bidistillée, puis l’acide citrique dans
cette solution. Ajouter encore 400
d’eau bidistillée. Ajuster le pH à 4
avec l’acide chlorhydrique IN ou 0,
goutte à goutte. Compléter à 1 litre
avec l’eau bidistillée.
+ Péroxydase d’hydrogène : H 02 à
% (MERCK ART 7210) à diluer
au 1/3 exemporanément dansz ‘eau
stillée (dilution de travail : H202 à
10 %).
=
- L’acide sulfurique H2SO4 2 N solution d’arrêt.
- Solution tampon de PBS pH 7,3 (phosphate Bu
red saline) Tween 20 0,05 %, lait
écrémé 1 %.
+ PBS.
. Dissoudre un comprimé dans 100 ml d’ea
illée stérile et autoclaver 10 mn à
11.5 C. Pour avoir la solution complete de
lbecco, ajouter 0,5 ml de Dulbecco B
(SR 39) à la solution autoclavée pH 7,3.
. Conserver dans un endroit frais et sec 10 à
à l’abri de la lumière.
Référence OXOID, code BR 14a boîte de 100 com
tampon PBS Dulbecco ‘A’ usage in vitro
Maison distributeur : BIOLYON BP 13, 6757
DILLY Cédex x 2180 OXOID
Limited, Basingstoke Hampshir England.
t Tween 20 : Polyoxyethylène Sorbitan monolaurate flacon de 500 ml
Distributeur : Maison SICMA
t Lait écrémé 1 % marque GLORIA e poudre
c
- Solution tampon citrate (acide citrique hydroxyde d sodium /eau distillée) pH 4.
C. Verreries et autres matériels
- Un spectrophotomètre couplé ou non à un ordinateur
- Des plaques polytyrènes ELISA de 96 cupules
- Un laveur de plaques (Microplate Washer 12
- Tubes de 10 ml en verre
. . . l...
- 3
- Erlenmeyers de SO à 200 m l
- Eprouvettes de 50, 100 et 2 5 0 m l
- Pipettes de 10 et 5 m l
- Micropipettes simples de 1 à 10 *1, de 20 à 1
pI,de 1OOà 1000~1
- Micropipette “Multicanaux” de 50 à 200 ~1
- Pipette Eppendorf distributeur avec un emb ut Eppendorf sous forme de seringue
-
i
Tube Eppendorf de 2 ml pour les sérums à di uer
- Propipette ou poire de 5 et 10 ml
- Kleenex en rouleau (format moyen et grand
- Papier absorbant.
II. METHODES OPERATOIRES
2.1 - Détection des IeG (immunoelobuline G)
- Sensibilisation des plaques :
Avant la sensibilisation proprement dite, on ( ivise trasversalement la plaque de 96
cupule en 6 rangées de 8 cupules à l’aide d’un marqueur indélibile.
Avec un anticorps de souris anti-virus à teste:- (immuno-ascite de souris) en milieu
tampon carbonate pH 9 dilution : (en général 1 / 1000 .
Pour une plaque : prévoir 10 ml de solutjon. Eien homogénéiser avant la répartition
(100 ~1 par puits). Couvrir et placer une nuit à t4 C.
- Lavage des plaques avec un tampon PBS -t Tween 20 à 0,05 % ; en série de 3 lavages
(compter 30 ml /lavage/plaque)
Secouer sur papier absorbant les plaques pour éliminer toute trace de liquide de
lavage.
- Préparer les solutions d’antigènes à la dilution préconisée par titrages antérieurs. Diluant
PBS Tween 20 à 0,5 %, lait écrémé 1 %
Pour une plaque, il faut 5 ml d’antigène à
ster et 5 ml d’antigène témoin. Bien
homogenéiser. Répartir les ant’gènes par colonnes a I-n& antigene test-antigène t6moin.
Couvrir, incuber une heure à 37 C.
L’antigène est est une suspension inactivée à a h propiolactone de cerveaux de foie
de souriceaux nouveau-nés infectés avec le virus.
/...
L’antigène temoin est constitué par une suspe sion
souriceaux nouveau-nés mais non infectés.
[I similaire de cerveaux ou foie de
Les antigènes sont conservés à -7QDC jusqu’à tilisation. L’antigène témoin permet
la détection de réaction non spécifique de cert&ns sénI s dont des anticorps “naturels” anti-
souris.
Préparer les dilutions des sérums à tester au 1 1OOè
de cupules des boîtes de dilution et ajouter ensuite 1 ml
écrémé 1 % de dilution. Les cupules sont arrangées dtil : répartir 10 ~1 de sérum au fond
I de tampon PBS Tween 20 O,OS % lait
: telle sorte qu’elles correspondent au
plan des plaques. Ajouter systématiquement des sérums e contrôle négatif et positif.
- Lavage des plaques (3 fois)
- Addition des sérums dilués en d?uble (une cupule tes1
une cupule témoin) 100 yl/cupule.
Couvrir. Incuber une heure à 37 C.
- Préparer la solution de conjugué anti-espèce (des sér
à tester) à la dilution déterminée
par titrage précédent. Soit 10 millilitres par plaque. Bi
- Lavage des plaques (3 fois)
- Addition du conjugué dilué : 100 ~1 par cupule. Couvri Incuber une heure à 37OC
- Préparer le substrat chromogène : orthotolidine (SIGh
Compter 10 ml par plaque
- lavage des plaques 3 fois. Séchage.
- Képartition du substrat chromogène 100 pl/cupule. Homogénéiser les plaques. Placer à
l’obscurité jusqu’à apparition d’une coloration b1et.u (cupule témoin positif) soit environ
5 minutes.
- Bloquer la réaction avec une solution d’acide sulfm
(H2SO4) 2N 100 ,~l par cupule.
Homogénéiser doucement. Vérifier l’absence des bu11 s pouvant fausser la lecture.
- les différences de densité optique ( DO) entre les c pules test et témoin sont mesurées à
450 nanomètres à l’aide d’un photomètre Titer Tek b ultiscan MCC /340, Flow laboratoires,
IRVINE, Scotland) couplé à un ordinateur F
avec programme LOTUS 123.
L’histogramme de distribution des D.O. et la tnoyen’ e de la population des négatives sont
déterminés. Les sérums sont considérés positifs qui nd la différence de densité optique
( DO) est supérieure à la moyenne des négatives t
2.2 - Détection des IIZG
- Sensilisation 0s plaques avec un anticorps anti ~1 esp èce à tester F (ab’) 2. Couvrir et placer
une nuit a t-4 .
i,avage en PBS Tween (3 fois). Séchage.
- Diluer les sérums au 1/ IOOème (voir pour les IgG).
100 ~1 de serum dilué par cupule
test et témoin. Sauf les témoins sérums positif et
- Couvrir et incuber une heure à 37OC.
. . . / . . .
-5
- Lavage en PBS Tween 20 3 fois. Séchage.
- Préparer la solution d’anticorps de souris spécifiqu
de l’antigène à tester (immune ascite) à
la dilution préalablement déterminée (10 ml pa plaque). Répartir 100 ~1 par cupule.
Couvrir et incuber une heure à 37 C.
/
- Lavage en PBS Tween (3 fois). Séchage.
- Préparer la solution de conjugué péroxydase anti-sc ris. Répartir 100 ,ul par cuple. Couvrir
et incuber une heure à 37 C.
- Lavage en PBS Tween (3 fois). Séchage.
- Préparer le.substrat chromogène. Répartir 100 ,ul
ar cupule. Placer à l’obscurité jusqu’à
apparition d’une coloration bleue (cupule témoin po: tif) soit environ 5 mn.
- Bloquer la réaction avec une solution d’acide SUI Jrique H2SO4 2N 100 11~1 par cupule.
Homogénéiser doucement. Lire à 450 nanomètres.
TECHNIOUE DE TITRAGE DE REACTIFS
1. Titraee d’un con&&
- Sensibiliser la plaque avec l’immune ascite de souris t incuber à +4O pendant une nuit.
- Lavage au PBS Tween (3 fois).
- Distribuer antigènes test et témoin (comme pour lr ; IgG et IgM), incuber à 37°C pendant
une heure.
- Lavage au PBS Tween (3 fois).
- Diluer un sérum connu positif et négatif, distribuer t incuber a 37OC pendant une heure.
- Lavage au PRS Tween (3 fois).
- Diluer le conjuué à titrer, la dilution peut varier du /SOOème au 1 /SO.OOOème, ce15 dépend
de la maison fabricant, distribuer à raison de 100 ~1 1 ir cupule, incuber 1 heure à 37 C.
- Lavage au PBS Tween.
- Mettre le substrat.
- Stopper la réaction au bout de 5 à 111 minutes avec l’a *de sulfurique.
1
- Lire au spectrophotometre couplé à l’ordinateur. A 1 dilution la plus faible où la différence
de densité optique ( DO) s’approche de 0,09 qu’on
le titre.
. . . i...
2. Titrarre d’un antitrène
- Sensibiliser la plaque avec l’immune-ascite de souris, i cuber à -1k4~C pendant une nuit.
- Lavage au PBS Tween 20 (3 fois).
- Diluer l’antigène à titrer du 1 /IOème, de mZme que 1’ Intigène témoin. Distribuer et incuber
à 37 C pendant une heure.
- Lavage au PBS Tween 20 (3 fois)
- Dilyer le sérum positif connu et le sérum témoin négz if connu, distribuer, incuber 1 heure à
37 c.
- Lavage au PBS Tween 20 (3 fois).
- Mettre le con-iugué, incuber une heure à 37OC.
- Lavage au PBS Tween (3 fois).
- Mettre le substrat.
- Arr&er avec l’acide sulfurique 2N.
- Lire au spectrophotomètre. A la plus faible dilutio où la différence de densité optique
s’approche de 0,05 (seuil de positivité) qu’on a le titre
3. Titrape d’un sérum
- Sensibiliser la plaque avec immun-ascite de souris et i cuber 2 -t4OC pendant une nuit.
- Lavage au PBS Tween 20 (3 fois).
- Diluer les antigènes test et témoin, distribuer et incub e à 37°C pendant une heure.
i
- Lavage au PBS Tween 20 (3 fois).
- Diluer le sérum à titrer du 1.2OOème au 1/2S.OOOkr e, puis distribuer et incuber à 37@~
pendant une heure.
- Lavage au PBS Tween 20.
- Mettre le con.iugué et incuber à 37O pendant une heure.
- Lavage au PBS Tween 20.
- Distribuer le substrat et au bout de 5 à 10 mn, arrêter 12 rkaction avec l’acide sulfurique.
- Lire au spectrophotomètre.
Inter&tation : & la plus faible dilution où la
de densit6 optique ( DO)
s’approche de 0.09 (seuil de positivité correspond le
. . . l...
-7
4, Techniaue de DréDaration d’un antieène
a) Matériel
- Souriceaux nouveau-nés d’un jour ou 2 à 3 jours (pou1 un virus inconnu).
- Souris de 2 mois pour la Fièvre de la Vallée du Rift (1 3ur avoir un bon titre).
- Seringue à insuline.
- Seringue à 10 cc avec une grosse aiguille de 18 C.
- Mortier broyeur avec son omnimixer.
- Pot à centrifuger.
b) Réactifs
- Tampon orate pH 9.0
. Nacl 1,5 M 80 ml
PM : 58,54
Nacl 1,5 M <==> 58,54x 1,5 <==> 87,81 g/litre d’eau
. Acide borique 0,5 M -----> 100 ml
H3BO
PM 61,81 g
Acide 2orique 0,5 M < = = > 61,81 x 0,5 ---> 10,9 g/litre
. Soude NaOH
PM:40g
NaOH 1 N < = = > 40 g/litre d’eau
. H20 distillée qsq ---> 1 000 ml
NB: Pour avoir l’acide borique H3B03 0,s M, il faudra. 30,9 g + 700 ml d’eau distillee chaude
+ 1 000 ml d’eau distillée.
- Tampon Tris pH 8,s 2 1 0 C
. Tris base ---> 12 1, 1 g
H 0 distillée ---> 800 ml
‘PI% 18g
. 2 M Hcl pour ajuster le pH a 8,5 à la
@rature de 2 1 o C.
PM23 +35,5à58,5g Hcl2N <==
17 g/litre d’eau
H20 distillée ---> 1 000 ml.
- f3 Propiolactone (BPPL) à -2OOC.
c) Maninulation
Remaraue : Pour les souriceaux, l’inoculation se fa t en intra-cérébral (IC) et les souris
adultes en intra-péritonéales (IP).
- Récolter les souriceaux nouveau-n& infectés quand il a 10 % de mortalité.
i
. . . l...
L
-8
- Congeler-les à -7OOC en emballage bien étiqueté pend a nt une nuit.
- Décongeler et conserver à +4OC pendant quelques he res.
- Désinfecter à l’alcool à 70°C.
- Faire sécher et aspirer les cerveaux à la seringue muni1 d’une aiguille 18 G.
- Ajouter le tampon borate pH 9 (0,9 ml de tampon bar; te pour un cerveau récolté).
- Homogénéiser à l’omnimixer.
- Ajouter le tampon Tris l/lO du volume total (VO~L ne de tampon borate + volume de
cerveau).
hJJJ: Le volume de chaque cerveau équivaut à 0,l ml.
- Ajouter le BPPL environ 2 gouttes, bien mélanger et p acer 72 heures à +4OC dans des pots à
centrifuger.
- Centrifuger à 10.000 tours/m, pendant 20 mn.
- récupérer le surnageant et alicoter dans des tubes Epi rndorf à raison de 1 à 2 ml (garder au
congélateur).
- Titrer l’antigène.
CONCLUSION
La surveillance sérologique de la Fièvre di la Vallée du Rift, avec la méthode
ELISA, peut se faire sur des animaux non individuellen
ent identifiés dans des sites sentinelles
choisis et fixes dans l’intervalle de temps défini pour la urveillance.
La circulation du virus se traduit par l’observ; ;ion de titre élevés de forte prévalence
en IgM au niveau du groupe d’animaux prélevés. La nl -activité virale se traduit par la mise
en évidence sur les sites sentinelles de prévalence en
G comparable en diminuant avec le
temps.
Cette méthode sérologique utilisée permet d’ btenir les résultats 48 heures après le
retour au Laboratoire, ce qui laisse toute liberté de r intervention sur le terrain si cela est
a
nécessaire, pour tenter l’isolement du virus dans un foye suspect d’infection en cours.
------m-s-
MINISTERE DE L'AGRICULTURE
I
----w-m---
l
INSTITUT SENEGALAIS DE RECHERCHES
AGRICOLES (I.S.R.A.)
------m-m-
DEPARTEMENT DE RECHERCHES SUR LES
PRODUCTIONS ET LA SANTE ANIMALES
------w--w
LABORATOIRE NATIONAL DE L'ELEVAGE
ET DE RECHERCHES VETERINAIRES
BP 2057
DAKAR-HANN
RAPPORT DE
DU 1Er AU 31 DEC
A L'INSTITUT PASTE
LA TECHNIQUE ELISA APPLI
E AU DIAGNOSTIC
DES ARBOVIROSES, NOTM
LA FIEVRE DE LA
VALLEE DU
Par Modou Mousta ha LO
P
INTRODUCTION
Dans le cadre de ma participation à I’exé
ion du programme de la Fièvre de la
Vallée du Rift au Sénégal, le Chef du programme
jugé utile que je suivi un stage sur la
technique ELISA appliquée au diagnostic de cette ar
irose à l’institut Pasteur (CRORA).
La Fièvre de la Valle’e du Rift est en effe
e zoonose due à un arhovirus de la
famille des Bunyaviridae genre Phlébovirus, resp
e chez les ruminants d’hépatite
nécrosante, d’avortement, de mortalité périnatale e
ant chez l’homme une pathologie
allant du syndrome grippal à des formes graves : syn orne ictéro-hémorragique, encéphalite
et choriorétinite.
Le principe de la technique ELISA repose s
la formation d’un complexe antigène-
anticorps révélable par une atiglobuline marquée à
zyme PéroxYdase.
Cet ensemble se traduit par une réacti
colorée en présence d’une substrat
spécifique.
1. MATERIELS
La réalisation de la technique ELISA néce ite comme matériels :
A. Matériels biologiques
- Immune ascite de souris F.V.R.
r
-Immune ascite de la chaine “mu” ( ) des immunoglobulines (Rabbit anti
sheep IgM)
Catalogue n”0214.0202 volumme 5.0 ml
Maison distributeur CAPPEL
Adresse : Organon Teknika Corporatior
1230 Wilson Drive
West Chester PA 19380
- Antigène spécifique (Ag F.V. R.)
- Antigène témoin (Ag de foie normal)
- Anti IgG spécifique (mouton ou bovin) I arquée à la péroxydase
(= Péroxyddse conjugated) 3.214.0082 fl cons de 2 ml
Catalogue n 32 14.0082
Maison distributeur CAPPEL : même acIresse que l’anti “111~”
- Les sérums à tester.
B. Matériels chimiques
- L’orthotoludine (substrat)
Maison distributeur (Sigma nOT3501) :
Dissoudrp 5 mg d’0.T. dans 0,25 ml de
, N-Diméthyl formamide
’ (Sigma n D4254) puis ajouter 30 ml de ampon citratelacide chlorhydrique pH 4 et
12 ~1 de H202 3 10 %. La solution obtenue doit être parfaitement incolore
conservation à t4 C et a l’obscurité (v rre inactinique).
i
. . . /. . .
2
Répartir 100 ~1 par cupule ce qui donne u e coloration bleue ( 620 nm) après
10 mn, blocage avec 1OQ ~1 d’H2SO4 colorati )n jaune ( 450 nm).
Le tampon pH4 : utiliser le &risol MERC
n”9884/OO01 Tp pH4, ou préparer le
tampon suivant (conservation à +4aC).
+ Acide citrique 1 H20 (PROLABO no 027629 . . . . . Il,77 g
+ Hydroxyde de sodium (NaOH) PRO ABO n02825229...4,4 g
(soude en pastille)
:
+ Dissoudre la soude dans 204) ml d’e
bidistillée, puis l’acide citrique dans
cette solution. Ajouter encore 400
d’eau bidistillée. Ajuster le pH à 4
avec l’acide chlorhydrique IN ou 0,
goutte à goutte. Compléter à 1 litre
avec l’eau bidistillée.
+ Péroxydase d’hydrogène : H 02 à
% (MERCK ART 7210) à diluer
au 1/3 exemporanément dansz ‘eau
stillée (dilution de travail : H202 à
10 %).
=
- L’acide sulfurique H2SO4 2 N solution d’arrêt.
- Solution tampon de PBS pH 7,3 (phosphate Bu
red saline) Tween 20 0,05 %, lait
écrémé 1 %.
+ PBS.
. Dissoudre un comprimé dans 100 ml d’ea
illée stérile et autoclaver 10 mn à
11.5 C. Pour avoir la solution complete de
lbecco, ajouter 0,5 ml de Dulbecco B
(SR 39) à la solution autoclavée pH 7,3.
. Conserver dans un endroit frais et sec 10 à
à l’abri de la lumière.
Référence OXOID, code BR 14a boîte de 100 com
tampon PBS Dulbecco ‘A’ usage in vitro
Maison distributeur : BIOLYON BP 13, 6757
DILLY Cédex x 2180 OXOID
Limited, Basingstoke Hampshir England.
t Tween 20 : Polyoxyethylène Sorbitan monolaurate flacon de 500 ml
Distributeur : Maison SICMA
t Lait écrémé 1 % marque GLORIA e poudre
c
- Solution tampon citrate (acide citrique hydroxyde d sodium /eau distillée) pH 4.
C. Verreries et autres matériels
- Un spectrophotomètre couplé ou non à un ordinateur
- Des plaques polytyrènes ELISA de 96 cupules
- Un laveur de plaques (Microplate Washer 12
- Tubes de 10 ml en verre
. . . l...
- 3
- Erlenmeyers de SO à 200 m l
- Eprouvettes de 50, 100 et 2 5 0 m l
- Pipettes de 10 et 5 m l
- Micropipettes simples de 1 à 10 *1, de 20 à 1
pI,de 1OOà 1000~1
- Micropipette “Multicanaux” de 50 à 200 ~1
- Pipette Eppendorf distributeur avec un emb ut Eppendorf sous forme de seringue
-
i
Tube Eppendorf de 2 ml pour les sérums à di uer
- Propipette ou poire de 5 et 10 ml
- Kleenex en rouleau (format moyen et grand
- Papier absorbant.
II. METHODES OPERATOIRES
2.1 - Détection des IeG (immunoelobuline G)
- Sensibilisation des plaques :
Avant la sensibilisation proprement dite, on ( ivise trasversalement la plaque de 96
cupule en 6 rangées de 8 cupules à l’aide d’un marqueur indélibile.
Avec un anticorps de souris anti-virus à teste:- (immuno-ascite de souris) en milieu
tampon carbonate pH 9 dilution : (en général 1 / 1000 .
Pour une plaque : prévoir 10 ml de solutjon. Eien homogénéiser avant la répartition
(100 ~1 par puits). Couvrir et placer une nuit à t4 C.
- Lavage des plaques avec un tampon PBS -t Tween 20 à 0,05 % ; en série de 3 lavages
(compter 30 ml /lavage/plaque)
Secouer sur papier absorbant les plaques pour éliminer toute trace de liquide de
lavage.
- Préparer les solutions d’antigènes à la dilution préconisée par titrages antérieurs. Diluant
PBS Tween 20 à 0,5 %, lait écrémé 1 %
Pour une plaque, il faut 5 ml d’antigène à
ster et 5 ml d’antigène témoin. Bien
homogenéiser. Répartir les ant’gènes par colonnes a I-n& antigene test-antigène t6moin.
Couvrir, incuber une heure à 37 C.
L’antigène est est une suspension inactivée à a h propiolactone de cerveaux de foie
de souriceaux nouveau-nés infectés avec le virus.
/...
L’antigène temoin est constitué par une suspe sion
souriceaux nouveau-nés mais non infectés.
[I similaire de cerveaux ou foie de
Les antigènes sont conservés à -7QDC jusqu’à tilisation. L’antigène témoin permet
la détection de réaction non spécifique de cert&ns sénI s dont des anticorps “naturels” anti-
souris.
Préparer les dilutions des sérums à tester au 1 1OOè
de cupules des boîtes de dilution et ajouter ensuite 1 ml
écrémé 1 % de dilution. Les cupules sont arrangées dtil : répartir 10 ~1 de sérum au fond
I de tampon PBS Tween 20 O,OS % lait
: telle sorte qu’elles correspondent au
plan des plaques. Ajouter systématiquement des sérums e contrôle négatif et positif.
- Lavage des plaques (3 fois)
- Addition des sérums dilués en d?uble (une cupule tes1
une cupule témoin) 100 yl/cupule.
Couvrir. Incuber une heure à 37 C.
- Préparer la solution de conjugué anti-espèce (des sér
à tester) à la dilution déterminée
par titrage précédent. Soit 10 millilitres par plaque. Bi
- Lavage des plaques (3 fois)
- Addition du conjugué dilué : 100 ~1 par cupule. Couvri Incuber une heure à 37OC
- Préparer le substrat chromogène : orthotolidine (SIGh
Compter 10 ml par plaque
- lavage des plaques 3 fois. Séchage.
- Képartition du substrat chromogène 100 pl/cupule. Homogénéiser les plaques. Placer à
l’obscurité jusqu’à apparition d’une coloration b1et.u (cupule témoin positif) soit environ
5 minutes.
- Bloquer la réaction avec une solution d’acide sulfm
(H2SO4) 2N 100 ,~l par cupule.
Homogénéiser doucement. Vérifier l’absence des bu11 s pouvant fausser la lecture.
- les différences de densité optique ( DO) entre les c pules test et témoin sont mesurées à
450 nanomètres à l’aide d’un photomètre Titer Tek b ultiscan MCC /340, Flow laboratoires,
IRVINE, Scotland) couplé à un ordinateur F
avec programme LOTUS 123.
L’histogramme de distribution des D.O. et la tnoyen’ e de la population des négatives sont
déterminés. Les sérums sont considérés positifs qui nd la différence de densité optique
( DO) est supérieure à la moyenne des négatives t
2.2 - Détection des IIZG
- Sensilisation 0s plaques avec un anticorps anti ~1 esp èce à tester F (ab’) 2. Couvrir et placer
une nuit a t-4 .
i,avage en PBS Tween (3 fois). Séchage.
- Diluer les sérums au 1/ IOOème (voir pour les IgG).
100 ~1 de serum dilué par cupule
test et témoin. Sauf les témoins sérums positif et
- Couvrir et incuber une heure à 37OC.
. . . / . . .
-5
- Lavage en PBS Tween 20 3 fois. Séchage.
- Préparer la solution d’anticorps de souris spécifiqu
de l’antigène à tester (immune ascite) à
la dilution préalablement déterminée (10 ml pa plaque). Répartir 100 ~1 par cupule.
Couvrir et incuber une heure à 37 C.
/
- Lavage en PBS Tween (3 fois). Séchage.
- Préparer la solution de conjugué péroxydase anti-sc ris. Répartir 100 ,ul par cuple. Couvrir
et incuber une heure à 37 C.
- Lavage en PBS Tween (3 fois). Séchage.
- Préparer le.substrat chromogène. Répartir 100 ,ul
ar cupule. Placer à l’obscurité jusqu’à
apparition d’une coloration bleue (cupule témoin po: tif) soit environ 5 mn.
- Bloquer la réaction avec une solution d’acide SUI Jrique H2SO4 2N 100 11~1 par cupule.
Homogénéiser doucement. Lire à 450 nanomètres.
TECHNIOUE DE TITRAGE DE REACTIFS
1. Titraee d’un con&&
- Sensibiliser la plaque avec l’immune ascite de souris t incuber à +4O pendant une nuit.
- Lavage au PBS Tween (3 fois).
- Distribuer antigènes test et témoin (comme pour lr ; IgG et IgM), incuber à 37°C pendant
une heure.
- Lavage au PBS Tween (3 fois).
- Diluer un sérum connu positif et négatif, distribuer t incuber a 37OC pendant une heure.
- Lavage au PRS Tween (3 fois).
- Diluer le conjuué à titrer, la dilution peut varier du /SOOème au 1 /SO.OOOème, ce15 dépend
de la maison fabricant, distribuer à raison de 100 ~1 1 ir cupule, incuber 1 heure à 37 C.
- Lavage au PBS Tween.
- Mettre le substrat.
- Stopper la réaction au bout de 5 à 111 minutes avec l’a *de sulfurique.
1
- Lire au spectrophotometre couplé à l’ordinateur. A 1 dilution la plus faible où la différence
de densité optique ( DO) s’approche de 0,09 qu’on
le titre.
. . . i...
2. Titrarre d’un antitrène
- Sensibiliser la plaque avec l’immune-ascite de souris, i cuber à -1k4~C pendant une nuit.
- Lavage au PBS Tween 20 (3 fois).
- Diluer l’antigène à titrer du 1 /IOème, de mZme que 1’ Intigène témoin. Distribuer et incuber
à 37 C pendant une heure.
- Lavage au PBS Tween 20 (3 fois)
- Dilyer le sérum positif connu et le sérum témoin négz if connu, distribuer, incuber 1 heure à
37 c.
- Lavage au PBS Tween 20 (3 fois).
- Mettre le con-iugué, incuber une heure à 37OC.
- Lavage au PBS Tween (3 fois).
- Mettre le substrat.
- Arr&er avec l’acide sulfurique 2N.
- Lire au spectrophotomètre. A la plus faible dilutio où la différence de densité optique
s’approche de 0,05 (seuil de positivité) qu’on a le titre
3. Titrape d’un sérum
- Sensibiliser la plaque avec immun-ascite de souris et i cuber 2 -t4OC pendant une nuit.
- Lavage au PBS Tween 20 (3 fois).
- Diluer les antigènes test et témoin, distribuer et incub e à 37°C pendant une heure.
i
- Lavage au PBS Tween 20 (3 fois).
- Diluer le sérum à titrer du 1.2OOème au 1/2S.OOOkr e, puis distribuer et incuber à 37@~
pendant une heure.
- Lavage au PBS Tween 20.
- Mettre le con.iugué et incuber à 37O pendant une heure.
- Lavage au PBS Tween 20.
- Distribuer le substrat et au bout de 5 à 10 mn, arrêter 12 rkaction avec l’acide sulfurique.
- Lire au spectrophotomètre.
Inter&tation : & la plus faible dilution où la
de densit6 optique ( DO)
s’approche de 0.09 (seuil de positivité correspond le
. . . l...
-7
4, Techniaue de DréDaration d’un antieène
a) Matériel
- Souriceaux nouveau-nés d’un jour ou 2 à 3 jours (pou1 un virus inconnu).
- Souris de 2 mois pour la Fièvre de la Vallée du Rift (1 3ur avoir un bon titre).
- Seringue à insuline.
- Seringue à 10 cc avec une grosse aiguille de 18 C.
- Mortier broyeur avec son omnimixer.
- Pot à centrifuger.
b) Réactifs
- Tampon orate pH 9.0
. Nacl 1,5 M 80 ml
PM : 58,54
Nacl 1,5 M <==> 58,54x 1,5 <==> 87,81 g/litre d’eau
. Acide borique 0,5 M -----> 100 ml
H3BO
PM 61,81 g
Acide 2orique 0,5 M < = = > 61,81 x 0,5 ---> 10,9 g/litre
. Soude NaOH
PM:40g
NaOH 1 N < = = > 40 g/litre d’eau
. H20 distillée qsq ---> 1 000 ml
NB: Pour avoir l’acide borique H3B03 0,s M, il faudra. 30,9 g + 700 ml d’eau distillee chaude
+ 1 000 ml d’eau distillée.
- Tampon Tris pH 8,s 2 1 0 C
. Tris base ---> 12 1, 1 g
H 0 distillée ---> 800 ml
‘PI% 18g
. 2 M Hcl pour ajuster le pH a 8,5 à la
@rature de 2 1 o C.
PM23 +35,5à58,5g Hcl2N <==
17 g/litre d’eau
H20 distillée ---> 1 000 ml.
- f3 Propiolactone (BPPL) à -2OOC.
c) Maninulation
Remaraue : Pour les souriceaux, l’inoculation se fa t en intra-cérébral (IC) et les souris
adultes en intra-péritonéales (IP).
- Récolter les souriceaux nouveau-n& infectés quand il a 10 % de mortalité.
i
. . . l...
L
-8
- Congeler-les à -7OOC en emballage bien étiqueté pend a nt une nuit.
- Décongeler et conserver à +4OC pendant quelques he res.
- Désinfecter à l’alcool à 70°C.
- Faire sécher et aspirer les cerveaux à la seringue muni1 d’une aiguille 18 G.
- Ajouter le tampon borate pH 9 (0,9 ml de tampon bar; te pour un cerveau récolté).
- Homogénéiser à l’omnimixer.
- Ajouter le tampon Tris l/lO du volume total (VO~L ne de tampon borate + volume de
cerveau).
hJJJ: Le volume de chaque cerveau équivaut à 0,l ml.
- Ajouter le BPPL environ 2 gouttes, bien mélanger et p acer 72 heures à +4OC dans des pots à
centrifuger.
- Centrifuger à 10.000 tours/m, pendant 20 mn.
- récupérer le surnageant et alicoter dans des tubes Epi rndorf à raison de 1 à 2 ml (garder au
congélateur).
- Titrer l’antigène.
CONCLUSION
La surveillance sérologique de la Fièvre di la Vallée du Rift, avec la méthode
ELISA, peut se faire sur des animaux non individuellen
ent identifiés dans des sites sentinelles
choisis et fixes dans l’intervalle de temps défini pour la urveillance.
La circulation du virus se traduit par l’observ; ;ion de titre élevés de forte prévalence
en IgM au niveau du groupe d’animaux prélevés. La nl -activité virale se traduit par la mise
en évidence sur les sites sentinelles de prévalence en
G comparable en diminuant avec le
temps.
Cette méthode sérologique utilisée permet d’ btenir les résultats 48 heures après le
retour au Laboratoire, ce qui laisse toute liberté de r intervention sur le terrain si cela est
a
nécessaire, pour tenter l’isolement du virus dans un foye suspect d’infection en cours.