REPUBLIQUE DU SENEGAL -.e----.w--mu MINISTERE DE...
REPUBLIQUE DU SENEGAL
-.e----.w--mu
MINISTERE DE LA RECHERCHE
SCIENTIFIQUE ET TECHNIQUE
- - - - m - - I - - - -
INSTITUT SENEGALAIS DE RECHERCHES
AGRICOLES (I.S.R,A.)
~~~cw.I--Iw.~.
LABORJTOIRE NATIONAL DE L’ELEVAGE
ET DE RECHERCHES VETERINAIRES
RAPPORT DE STAGE EFFECTUE A L’XLRAD DE NAXROB’L
3 KENYA I)U 2 SEPTEMBRE AU 29 NOVEMERE 198S
Par Dr A. DIAITE
REE No 124/PARASITO.
DECEMBRE 1985.
A
RAPPORT DE STAGE EFFECTUE A L'ILlWD DE NAIROBI
AU KENYA DU 2 SEPTE-HBRE AU 29 NOVEMBRE 1985
Par Dr A. DIAITW
I- INTRODUCTION
Ce stage a pu ëtre effectue grace & la collaboration de 1'ILRAD qui a pris
en charge tous les frais occasionnés par le d6placement. Pour cela, nous remer-
cions tout le personnel administratif de 1'XLRAD pour les efforts fournis daus
le souci de formation du personnel scientifique africain ainsi que tous les
chercheurs de cetteinstitution pour leur franche collaboration à l'effort de
formation.
Le stage a 6té axé sur le diagnostic sérologique des trypanosomiases ani-
males africaineset a comporté les principaux volets suivants :
=q purification de fractions d'immunoglobulines
- préparation d'antigènes pour ELISA et IF1
.- préparation de conjugu& ELISA et IFI.
I I - PURIFICATION D~IXMUNOGLOBULINES
- Technique
Du sang a c?té récolté à partir d'un bovin, puis centrifugé pour rXcolter
le sérum.
Les protéines du sérum ont été prkipitées avec du sulfate dsammonium à un
volume &a1 au volume initial de s4rum c'est-à-dire un taux de saturation de
(NH4j2S04 F,gal à 50 %. Après deux centrifugations et pr&ipitationso
ce taux
est ramené 2 45 h! avant de dialyser la suspension finale de protkres dans du
tampon phosphate pH 7975.
l . /
. .“.
* ISRA - Laboratoire national de l*Elcvage et de Recherches vétérinaires -
BP 2057 -DAIZAR-HANlif.
Le but de la dialyse est d'éliminer l'excbs de (NH4)2SO4 mais c'est un pro-
cédé excessivement lent. Pour éliminer rapidement le (NU4)2SO4, il faut passer
la suspension après une ou deux dialyses à travers une colonne de eéphadex G25
auparavant préparée.
La suspension est ensuite passée à travers une colonne de DEAE 52 en utili-
sant différents wupons phosphate (par la molsrit& et le pH) pour obtenir des
fractions plus ou moins purifi&s,
la séparation finale IGG1 et IgG2 se fait à
travers une colonne de sépharose 4 B + protéine A de Staphylococcus aureus.
Après la purification et la mesure de la concentration, ces immunoglobulines
sont utiliskes pour immuniser soit des moutons9
des chèvres ou des lapins% pour
obtenir des antibovins utilisés ultkkurement pour la préparation de conjugués.
III - PREPARATION D7ANTIGENES POUR ELISA OU IFI
-.
Après récolte de sang de rat parasité, 1"interphase riche en trypanosomes
est recueillie et passée à travers une colonne de DEAE 5 2 auparavant lavée avec
du PSG (ici PSG Rat). Les trypanosomes sent receuillis ainsi débarrassés des
cellules sanguines.
A partir de cette suspension, il y a possibilité de préparer z
a) Antigkne pour IFI
Un volume donni? de la suspension est melangé
avec le liquide fixateur au
ratio de 1 part: d2I. suspension de trypanosomes -+ 2 parts de liquide fixateur> le
to-ut garde à -5 4
au réfrigérateur jusqu'au lendemain. Le fixateur est ensuite
éliminé par centrifugation et lavage avec du sérum physiologique, la suspension
finale obtenue peut se conserver pendant un an à f 4'.
b) Antigène ELISA
LL’autrc. partie de la suspension est sonifiée jusqu'à disparition des trypa-
nosomes. Puis encore, centrifugation à 6 000 T/mn pendant 20 mn deux fois, puis
à 18 000 T/mn pendant 1 h à ce stade, filtrer avec un filtre nillipore avant de
recentrffugcr la solution obtenue B 36 008 T/mn pendant lh, receuillir le surna-
geant final et le garder comme Ag soluble pour ELISA.
. . . / . . . *
Des Ap, de Theileriaparvei
(Schizonte) ainsi que de Piroplesme ;t d"Anaplai;raa
-... --A
d'Anaplasma marQna1 e
-1.- ont 6t3 aussi prdp?r&s par la mëme technique, Mais pour
ces agi'nts patktogkkes, seuls les dg srr.lublas (ELISA) sont intkcssante ; en ef-,
fet les AR pour 1'IFI perdant tGS Vit2 icur 8CtiVité.
a) ELISA
Les protefnrs dkir*Zes (nntibovina ici) sont mis@ en dialyse dans le tampon
carbonate bicarbonstz pH 9,s (ce tampon peut se conserver une semaine mais tou-
jours v&ifîer si le pH est rr?stt5 5 9,ti).
Ramener aussi l'enzyme (Horseradish peroxydi3.w) au pH 9,O pour bien donner
une forme orydatiw car la forme commerciale :ist r&!uctrice,
La paxcxydase est d'abord solubilisée
P.v;tc du sodiw! pEciod<rt2, 12 sulution
agitee pandent 30 rzu puis pas& en s,iolysa dans un tampon acétique pB 494 toute
la nuit.
Apres la dialyse, ajouter un certain v.)lume de tampon bicarbonate $ la SO~U-=
tion de peroxgda ae et immédiatement mtlaager avec les protCines$ agiter pendant
2 heures, .ram~:ner le pH final à 7,% avec uw solution 0,2X IMH2FOcc~
Passer 13 solution finale à trwors une colonne de sjphadex G100 poua &pn-B
rer les protGinas conjuguées d5 ~";XC& dy.~,rnzyme à la oolution finelc obtenuep
ajouter un
égal volume de glycérol pour une bonne conservation à. de basses
temperaturan,
b) Pr¶tion$e
conjugu& IF1
Le colorant utilise est le FITC (isothiocyannte de Fluoros&ino). Le ratio
est 10 volumes Se colorant pour UT: volume de protéine. La &thode de coloration
consiste à :P,zire une dialyse des protkkres dans la solution adgquate do FITC.
On obtient trois types de protéines z
- sur conjugu6os
- ccnjugu&s normalement
- sous conJug&es.
Pour séparer ces fractions, utiliser uni! colonne (fino et longue) de sQphw
dex G 50, recueillir les solutions selon les pics obtenus. Les densités optiques
de ces solutions seront lues aux longueurs d'onde 495 ou 280.Trois types de
resultatc peuvent etrc obtenus :
< 0,5 sous conjuguées
> 1
sur C&jUgUéCS
entre 0,5 et 1 conjugaison normale
Les fractions obtenues selon les pics sont concentrées et additionnées avec
un agent conservateur.
IV - ANNEXE
La dernijre semaina du 22/11 au 29/11/!9S5p a bté passée au laboratoire des
tiques (ticks DnitF' où diffdrents aspects ds la rticherchc sur les tiques et les
maladies transmises ont 6té vus.
'= d&ermination de3 tiques par utilisation d'une cl&
- dissection des tiques, &tudu de lYanatomie interni: et prélèvement des glandes
salivaires pour fixation et coloration sur une lame en vue de déterminer le
taux d'infection
- recherche des gametocytes (micro at macro) à partir d'un étalement sur lame
du contenu du tube digestif de nymphe
- élevage de tiques.
En marge du stage, il nous a Gté propos& la tenue du cours de diagnostic
des hémoparasites au Sénégal. Une lettre de Mr. Jim LENAJ3AN a ét6 rappartée dans
ce sens au Directeur général de 1'ISRA.
-5
La tenue de cc cours nécensitersit ifr contact préalable de service comme :
- 13 Virologie pour le complément de matériel
.O 1'Univcrsité pour 12 mathA.el et éventuellement le personnel
enseignant.
L'ILRAD enwrrnit aussi. deux personnes pour aider à dispenser les cours0
A notra avis3 la tenue de ce cours à Dakar est tout 5 fait possible si le
mathiel suivant peut ëtre tenu disponible,
- plaques dz microtitration
- tubes à tz&olgsi: (en verre et en plastique)
- plasticine
- ampoule pour microscope à UV
- plaques dcz micrntitration pour ELLXSA
- lames Wellcomé pour IF1
= colonnes pour DEAFL~~
et oéphndex de diff&enta
diamètres et longueurs
- pHm4tre
- balance de prhcision (mg)
s-- spectrophoLomètriz
avec filtre 9 280 nm et 260 nm
- centrifugeuse
-* ultra-centrifugeuse
- servi~.ttes en papier
- klzenex
- micropipettes cdaptablrs et en s6rie de 12 adaptabhs
&galement,
Pour le ClT, une mission conduite par le Dr R, PALING se rendra au Sénégal
au courant du mois de fhricr pour discuter avec les autorit& de 1'ISRA des
modalités de collaboration entre le CLT et l*ISKA. Il est utile de savoir qw
le financement du projet fournit par la CEE est commun au &nég;:l et 2 la Gambie.
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MINISTERE DE LA RECHERCHE
SCIENTIFIQUE ET TECHNIQUE
- - - - m - - I - - - -
INSTITUT SENEGALAIS DE RECHERCHES
AGRICOLES (I.S.R,A.)
~~~cw.I--Iw.~.
LABORJTOIRE NATIONAL DE L’ELEVAGE
ET DE RECHERCHES VETERINAIRES
RAPPORT DE STAGE EFFECTUE A L’XLRAD DE NAXROB’L
3 KENYA I)U 2 SEPTEMBRE AU 29 NOVEMERE 198S
Par Dr A. DIAITE
REE No 124/PARASITO.
DECEMBRE 1985.
A
RAPPORT DE STAGE EFFECTUE A L'ILlWD DE NAIROBI
AU KENYA DU 2 SEPTE-HBRE AU 29 NOVEMBRE 1985
Par Dr A. DIAITW
I- INTRODUCTION
Ce stage a pu ëtre effectue grace & la collaboration de 1'ILRAD qui a pris
en charge tous les frais occasionnés par le d6placement. Pour cela, nous remer-
cions tout le personnel administratif de 1'XLRAD pour les efforts fournis daus
le souci de formation du personnel scientifique africain ainsi que tous les
chercheurs de cetteinstitution pour leur franche collaboration à l'effort de
formation.
Le stage a 6té axé sur le diagnostic sérologique des trypanosomiases ani-
males africaineset a comporté les principaux volets suivants :
=q purification de fractions d'immunoglobulines
- préparation d'antigènes pour ELISA et IF1
.- préparation de conjugu& ELISA et IFI.
I I - PURIFICATION D~IXMUNOGLOBULINES
- Technique
Du sang a c?té récolté à partir d'un bovin, puis centrifugé pour rXcolter
le sérum.
Les protéines du sérum ont été prkipitées avec du sulfate dsammonium à un
volume &a1 au volume initial de s4rum c'est-à-dire un taux de saturation de
(NH4j2S04 F,gal à 50 %. Après deux centrifugations et pr&ipitationso
ce taux
est ramené 2 45 h! avant de dialyser la suspension finale de protkres dans du
tampon phosphate pH 7975.
l . /
. .“.
* ISRA - Laboratoire national de l*Elcvage et de Recherches vétérinaires -
BP 2057 -DAIZAR-HANlif.
Le but de la dialyse est d'éliminer l'excbs de (NH4)2SO4 mais c'est un pro-
cédé excessivement lent. Pour éliminer rapidement le (NU4)2SO4, il faut passer
la suspension après une ou deux dialyses à travers une colonne de eéphadex G25
auparavant préparée.
La suspension est ensuite passée à travers une colonne de DEAE 52 en utili-
sant différents wupons phosphate (par la molsrit& et le pH) pour obtenir des
fractions plus ou moins purifi&s,
la séparation finale IGG1 et IgG2 se fait à
travers une colonne de sépharose 4 B + protéine A de Staphylococcus aureus.
Après la purification et la mesure de la concentration, ces immunoglobulines
sont utiliskes pour immuniser soit des moutons9
des chèvres ou des lapins% pour
obtenir des antibovins utilisés ultkkurement pour la préparation de conjugués.
III - PREPARATION D7ANTIGENES POUR ELISA OU IFI
-.
Après récolte de sang de rat parasité, 1"interphase riche en trypanosomes
est recueillie et passée à travers une colonne de DEAE 5 2 auparavant lavée avec
du PSG (ici PSG Rat). Les trypanosomes sent receuillis ainsi débarrassés des
cellules sanguines.
A partir de cette suspension, il y a possibilité de préparer z
a) Antigkne pour IFI
Un volume donni? de la suspension est melangé
avec le liquide fixateur au
ratio de 1 part: d2I. suspension de trypanosomes -+ 2 parts de liquide fixateur> le
to-ut garde à -5 4
au réfrigérateur jusqu'au lendemain. Le fixateur est ensuite
éliminé par centrifugation et lavage avec du sérum physiologique, la suspension
finale obtenue peut se conserver pendant un an à f 4'.
b) Antigène ELISA
LL’autrc. partie de la suspension est sonifiée jusqu'à disparition des trypa-
nosomes. Puis encore, centrifugation à 6 000 T/mn pendant 20 mn deux fois, puis
à 18 000 T/mn pendant 1 h à ce stade, filtrer avec un filtre nillipore avant de
recentrffugcr la solution obtenue B 36 008 T/mn pendant lh, receuillir le surna-
geant final et le garder comme Ag soluble pour ELISA.
. . . / . . . *
Des Ap, de Theileriaparvei
(Schizonte) ainsi que de Piroplesme ;t d"Anaplai;raa
-... --A
d'Anaplasma marQna1 e
-1.- ont 6t3 aussi prdp?r&s par la mëme technique, Mais pour
ces agi'nts patktogkkes, seuls les dg srr.lublas (ELISA) sont intkcssante ; en ef-,
fet les AR pour 1'IFI perdant tGS Vit2 icur 8CtiVité.
a) ELISA
Les protefnrs dkir*Zes (nntibovina ici) sont mis@ en dialyse dans le tampon
carbonate bicarbonstz pH 9,s (ce tampon peut se conserver une semaine mais tou-
jours v&ifîer si le pH est rr?stt5 5 9,ti).
Ramener aussi l'enzyme (Horseradish peroxydi3.w) au pH 9,O pour bien donner
une forme orydatiw car la forme commerciale :ist r&!uctrice,
La paxcxydase est d'abord solubilisée
P.v;tc du sodiw! pEciod<rt2, 12 sulution
agitee pandent 30 rzu puis pas& en s,iolysa dans un tampon acétique pB 494 toute
la nuit.
Apres la dialyse, ajouter un certain v.)lume de tampon bicarbonate $ la SO~U-=
tion de peroxgda ae et immédiatement mtlaager avec les protCines$ agiter pendant
2 heures, .ram~:ner le pH final à 7,% avec uw solution 0,2X IMH2FOcc~
Passer 13 solution finale à trwors une colonne de sjphadex G100 poua &pn-B
rer les protGinas conjuguées d5 ~";XC& dy.~,rnzyme à la oolution finelc obtenuep
ajouter un
égal volume de glycérol pour une bonne conservation à. de basses
temperaturan,
b) Pr¶tion$e
conjugu& IF1
Le colorant utilise est le FITC (isothiocyannte de Fluoros&ino). Le ratio
est 10 volumes Se colorant pour UT: volume de protéine. La &thode de coloration
consiste à :P,zire une dialyse des protkkres dans la solution adgquate do FITC.
On obtient trois types de protéines z
- sur conjugu6os
- ccnjugu&s normalement
- sous conJug&es.
Pour séparer ces fractions, utiliser uni! colonne (fino et longue) de sQphw
dex G 50, recueillir les solutions selon les pics obtenus. Les densités optiques
de ces solutions seront lues aux longueurs d'onde 495 ou 280.Trois types de
resultatc peuvent etrc obtenus :
< 0,5 sous conjuguées
> 1
sur C&jUgUéCS
entre 0,5 et 1 conjugaison normale
Les fractions obtenues selon les pics sont concentrées et additionnées avec
un agent conservateur.
IV - ANNEXE
La dernijre semaina du 22/11 au 29/11/!9S5p a bté passée au laboratoire des
tiques (ticks DnitF' où diffdrents aspects ds la rticherchc sur les tiques et les
maladies transmises ont 6té vus.
'= d&ermination de3 tiques par utilisation d'une cl&
- dissection des tiques, &tudu de lYanatomie interni: et prélèvement des glandes
salivaires pour fixation et coloration sur une lame en vue de déterminer le
taux d'infection
- recherche des gametocytes (micro at macro) à partir d'un étalement sur lame
du contenu du tube digestif de nymphe
- élevage de tiques.
En marge du stage, il nous a Gté propos& la tenue du cours de diagnostic
des hémoparasites au Sénégal. Une lettre de Mr. Jim LENAJ3AN a ét6 rappartée dans
ce sens au Directeur général de 1'ISRA.
-5
La tenue de cc cours nécensitersit ifr contact préalable de service comme :
- 13 Virologie pour le complément de matériel
.O 1'Univcrsité pour 12 mathA.el et éventuellement le personnel
enseignant.
L'ILRAD enwrrnit aussi. deux personnes pour aider à dispenser les cours0
A notra avis3 la tenue de ce cours à Dakar est tout 5 fait possible si le
mathiel suivant peut ëtre tenu disponible,
- plaques dz microtitration
- tubes à tz&olgsi: (en verre et en plastique)
- plasticine
- ampoule pour microscope à UV
- plaques dcz micrntitration pour ELLXSA
- lames Wellcomé pour IF1
= colonnes pour DEAFL~~
et oéphndex de diff&enta
diamètres et longueurs
- pHm4tre
- balance de prhcision (mg)
s-- spectrophoLomètriz
avec filtre 9 280 nm et 260 nm
- centrifugeuse
-* ultra-centrifugeuse
- servi~.ttes en papier
- klzenex
- micropipettes cdaptablrs et en s6rie de 12 adaptabhs
&galement,
Pour le ClT, une mission conduite par le Dr R, PALING se rendra au Sénégal
au courant du mois de fhricr pour discuter avec les autorit& de 1'ISRA des
modalités de collaboration entre le CLT et l*ISKA. Il est utile de savoir qw
le financement du projet fournit par la CEE est commun au &nég;:l et 2 la Gambie.