REUNION DU GROUPE FAO D'EXPERTS DES ASPECTS ...
REUNION DU GROUPE FAO D'EXPERTS DES ASPECTS
ECOLOGIQUES ET TECHNIQUES DU PROGRAMME DE
LUTTE CONTRE LA TRYPANOSOMIASE ANIMALE AFRICAINE
ET LA MISE EN VALEUR DES ZONES CONCERNEES
ROME, 1 - 5 JUIN 1981
-m---w
TECHNIQUES DE DIAGNOSTIC
Par Saydil M. TOURE
REF. No 066/PARASTTO
AVRIL 1982
.
EKOLKiIQUESFXTEX!HNIQUESWPROG~DE
LUITE cm LA TR!iRlNosoMIAsE l4NIMaE AFRICARJE
ETLAMISEENVALEURDESZONESCONCERNEES
-w-w--
RW,l- 5 JUIN 1981
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TECM[QuES DE DIAGNOSTPC
"m.-w.m-
PV Saydil M. ?DURE *
>
lIKt'RODUCl'ION
Les techniques de diagnostic des Trypanosomiases, tant humaines qu'a-
nim&s, ont fait l'objet de plusieurs notes au cours de ces dernières an-
&es (101 (27) (38) (39) (30). Ces notes, accmpag&es d'une bibliographie
abondante, sont des revues assez exhaustives des techniques de diagnostic
des Qypano somiases et,pmrcetteraison,
nous nous limitemns,dansle
prkent exposé, b des faits nouveaux ou à des ccmmntaires inédits. Nous
suivmns pour l'essentiel le W plan que celui adapté il y a quelque
deux ans (39).
1 -DETECTION DIREKZE CHEZ L'HMI:DE PAR?SITES FIGURES
1.1. Observation microscopique îm&diate
1.2. Observation apr+s rroncentration
1.2.1. Centrifugatim clagslqug
1.2.2. Centrifugation dans des tubes 2 m@~h&mtcmite
1.2.3. centrifugation d'éluat rçmeilli après filtration à travers
3
une colcmne de DEAE - cellulose
*\\
1.2.4, Centrifugation après lyse de globules rouges
..* / . . .
(*) Directeur du D$artement de Recherches zootechniques et vétérinaires de
l*ISRA et Chef du Service de Pamsitologie du Laboratoire national de
l*Elevage et de Recherches vétérintis - B.P. 2057 - DAK%
-2
1.3. Observation de lames colorées
Les lectu~s, au microscope, de fmttis classiqss et de gouttes
épaisses, ou de sang frais entre lam et lamelle, sont toujours comzn-
mnt pratiquées mis ces pmédés sont nettemnt inf6rieurs à ceux qui
pemttent de concentrer les TrypanoSOrneS.
.
J. (2ARRlX et D. TIMSIT (6) mpxrkent une m%hcde simplifiée de con-
centration des 'Rypanosms qui consiste à laisser &dinmtwle sang,re-
cueilli sur anticoagulant, et à centrifuger le plama : les résultats ob-
tenus sont, semble-t-il, supérieurs a la triple centrifugation.
Ceper&nt les techniques qui connaissent actuellemnt la plus large
utilisation sont celles de Woo et l'examen sur fond notid'une prépara-
tion d'interphase de centrif&ation micmh6mtomite.
Elles sont R&E as-
sez fr6quemmt appliquées sur le td. G. DUV- et al, 1979 (91,
cmtpmtiquélatechnique de Woo dans un%yerde Trypanosomiasehumaine a
Vavoua en C&e d'ivoire, en pmcédant à la lecture micmscopique à l'aide
d'un objectif à imnersion CG x 50). Ils ont pu dépister par cette r&hode
18 sujets pamsitkiques mis sans si@-m cliniques et qui n'auraient pu
être décelés que par la sérologie ou par des techniques de concentmtim
devaleurau&ns égale à celle dekbo.
La lecture sur fondnoirde prépamtionentm
lame etlamzlle d'inter-
phase de centrifugation micmhémtccrite a été largermnt décrite quant aux
pnxédés et aux avantages CM. MURR4Y et al, 1977 ; J. PARIS, M. MURRAY et
R. AGIIRE, 1980, mn publié (28) (30). Il n'est pas nécessaire de rwenir
sur cette technique, sinon pour relever des mues, celles de L. GRIFF'IN,
1978 (17) qui estime que cette rkthode est difficilement applicable sur le
temain et, pour cette mison, a une rr0uich-e valeur pratique. Nous ne sau-
rions partager cet avis, mur avoir pratiqué ce pmc&dé de diagjnostic, en
milieu éleveur, concumment avec d'autres n&hodes CBNRE, 1981) (401.'
Ses avantages r+&ent dans lafacilité, la précisiori et surtout la possi-
bilité d'évaluer l'hémrtocrite qui est le milleur indice de l'état de
santé vis h vis de la Trypan&miase, EWin, lorsqu'elle est assccik à
d'autres investigations, la r&thcde pz.rmzt de mieux ccsrrprendre les faits
pathologiqueS dans un cheptel. Ainsi, au cours de plusieurs tournées, des
prélèvemnts faits dans les diverses zones écologiques du Sénégal,en
. . /. . . .
-3
utilisant plusieurs techniques sur un r&me arC.mal (tittis et mut-tes
épaisses, centpifugation &moh&mtocrite
+ examen SUT fond nO* (mm),
des penseimnts pr&is sont obtenus sur T>lUSieurS p?TYiSitX?S : mm
scxna cmgolensc, T.vivax, Theileria m-tans, IkbeSia bigemina, hapkisns,
-,
SD.. les &rofilaires de J$tsria labiatopa~illosa.
L'idéal est de pratiquer plusieurs techniques et de faire une synthè-
se globale des données. I%ls si l'objectif visé est d'ap#.iquer des trai-
tements trypamcides adéquats, on peut se contenter des seuls exmns par
cM/EFN, car on juge d'apr&s l'hémtocrite et la pamsit&i.e. La m%hcde
microhématocrite peut donc valablement être ap@iq&e sur le t-au! (G?E?,
1979) (16). Les critiques avancées n'enlèvent rien 3 la valeur de la &-
thode C!M/EFN et c'est avec juste tison que MURRAY et al, 1979 (29) en re-
tracent les avantages. On lira avec profit les critères d%valuation qui
ressortent de plusieurs études comparatives faisant intervenir des métho-
des différentes dans divers types d'infections dues à T.vivax, T.congolen-
se ou T.brucei (311.
-
-m
La concentration de Trypanosoms mr filtration à travers une colonne
de DEAE - cellulose (selon Lanham) est rest~ek>ngtemps r&erv~e aux labo-
ratoires bien iiquipés.
Récenment, LUMSDEN et al (21) (22) (23) ont pmp-
sé une miniaturisation du matériel requis et une application sur le tem-ain
dans le dépistage de la Mladie du somil. Les r&mltats obtenus en 1980
indiquent que cette adaytation technologiq.ue Fut akliorer le diagnostic
de mutine de la msomiase humaine africaine. Sans doute s-ait-il
souhaitable d'appliquer aussi la technique dans les TryJ-nosdases ati-
miles à des fins de recherche.
II " DETECTION INDIRECTE DE PARASITES FIGURES
11.1. Inoculatim à des animzux d'e@rience-
11.2. Culture en vitro
11.3. Xénodiagnostic
- ^. .-
P~U de faits nouveaux sont à signaler dans cette mie, tout au
nGli3 en Ce qui conc-e les Gpreuves avant avoir une valeur riratique
de diagnostic des Trypanosomiases animales. 34mtion doit &pe faite ce-
. . /. .*.
-4
wdant de difficultés rencontrées pur caractériser avec certitude des
sercdènw de T.bmcei et Tzhodesiense. 11 a été démmtré r&emmt, au
cours de tests d'infectivité de sang incubé (TISI ou BIIT de Rickman et
Robson), des r@onses mdoxales chez des types antigéniques variables
de semdèna?s connus (ETat T.&odesiense et AnTat T.brucei). Un nouveau
protocole de RICKMAN et KOlAlA, 1980 (32) a permis d'étudier ces &pon-
ses paradoxales. Trois souches connues de T.brucei, ap&s avoir d'abord
entr&né des r&ultats négatifs au TISI,ont ensuite cons-tarment donné
des r&mltats positifs. D'autres épreuves ont confi.ys$ ces faits, à ver-
ser au dossier de l'identification des sous-espkes de Tbrucei, que nous
reprendmns d'ailleurs à la fin de cette revue de techniques. Il est à
noter que dans le TISI, il n'y a pas nécessairement corrélation entre la
utilité des Trypanosoms et l'infectivité pour des Rats ou des Souris
@OBSON et RICKMAN, 1977) (33).
Des mdifications du TISI ont permis à HAWiCN (18) d'étudier la
résistance au sérum hmin de diverses espèces de Trypanosoms.
III - METHODES SERO-~LOTI$S
111.1. Méthodes mn spécifiques
- Forml-leucogel ou &action de Gaté et PaFostas
- Test au &lorw?e mrcurique et ses variantes
- Evaluation des imnunoglobulines (IgM>
Dans cette rubrique, on wut citer les travaux de UJCKINS et al,
1979 (20) et ceux de ?MHMOUD et GRAY, 1980 (26) qui comparent entre elles
ces techniques non spécifiques et des techniques plus mdernes pur éva-
luer la Tkmanostise due à T.evansi.
111.2. Méthodes spécificpes-
111.2.1, Fixation du cmpl&nt ou test d'hémlyse
Elle est toujours utilisée (36) mis ses applications sont
devenues plus rares parce qu'il existe des moyens sémlogîques plus
faciles à appli&r et tout aussi fiables. Elle est passible d'am$-
lioration r des éprwves encore plus spécifiques (37).
.,. /
..,
-5
111.2.2. Héma@utination indirecte ou mssive
111.2.3, @reuve d'agglutination directe
BINZ et al, 1979 (4) ont pr&enté une évaluation du test d'hémg-
glutinaticm indirecte en tube capillaire. MAGNE et al,1979 (24) donnent
.
des précisions sur l'épreuve dgag.plutimtion directe sur carte en utili-
sant comre antigène des 'I!rypnosoms isolés SU?~ DEYE-cellulose et color&
par bleu Coomassie. Ces deux techniques, jusw'à m&stenant, n'ont été uti-
lisées que dans le dépistage de la Maladie du someil. Ltag#.rtination sur
carte a fait an-1 à un antigène T.brucei brucei WAT) AnTat 8 qui con-
duit à des r&ultats indiquant une forte @somtion de Txypanosomiase si
les titres sérologiques d'agglutination vont de 1:4 à 1:64.
111.2.4. Imunoe'lectro$xwèse et imnunodiffusion
111.2.5. Immnofluorescence indirecte
111.2.6. Immmpemxvdase indirecte
111.2.7. PCXCELISA
Nous insisterons SUT les trois dernières techniques qui sont ac-
tuellement les ylus utilisées dcans les laboratoires pour diagnosticper
les ~somiases humines et animales.
L'imnunofluorescence indirecte est désmmis classique. &,l,gré ses
teks rmrbreuses a@ications dans la rechemhe des maladies parasitaires,
ce ?mcédé de diagnostic n'est y?atiq& qu'assez raremnt dans les labo-
ratoires africains. Il a conduit à de bons rhultats dans le diagnostic
et l'étude &&ootiologique de la 'Ikpanosomiase bovine. Son utilisation
nraticue sur le terrain dans le dépistage de la Trypanosomiase humaine a
fait aIobjet d'une note de G. IXJVALEI' et P. SALIOW, 1978 (8). Les appli-
cations en épidémiologie citées dans la littérature scientifique sont yes-
que toujours -réalisées dans les l.aboratr?lres situés dans les ca~italesou
les grandes villes (11) (12) cl31 (14) (34). Les raisons de cette restric-
tion tiennent en nart.i.e 2 la nkessitg d'utiliser un micmsco~ à éclaira-
Fe ultraviolet qui c-& sensiblemnt @us cher tue les microscoms $
éclairage ordinaire et qu'on ne peut NS déplacer en brousse. Il est 'J-S-
sible de pallier cet inconvénient en praticpant la kthode imnunoenzymlo-
gique, tout en utilisant des antigènes figur&. Cette m&hode a été récem-
.., /
..,
-6
Jrrent exoérkntée, pxr ce cpi est de la Trypanosomiase huwtine. Elle a
une aussi Mnne sensibilité que l'irrrwnoflwrescence, tout en ne nécessi-
tant qpl'un éclairage courant. Nous l'avons exp%kntée dans le diapstic
de la Wypanosomiase bovine, en la corrparant ?i l'kxnunofluorescence indi-
recte (41).
La n&hcXe suivie est celle décrite FI? CAILLIEZ, que nous avions ci-
té dans une note antérieure (39). Elle comporte notmnt les étapes sui-
vantes :
- dilution des sérums en tampon de Coons C*l ,
- réaction anti$ne-anticorps pendant 60 minutes à la température ambiante,
- lavage 10 minutes par le tampon de Ccons,
- r?zaction avec un sérum de lapin anti-irsnuno~l&ulines bovines conjupué
àlapéroxydase (*+) et dilué à 1/50, pendant 60 minutes,
- lavape deux fois nar le taxrpon de Coons = 1 minute et dix tiutes,
- révélation na?? le &actif de Guaham-KarnowsQ pendant 15 minutes C***l >
- lavape à l'eau distillée,
- nrxxtage en milieu $?lyc&iné et exwen au microscope en lumière blanche.
Les r&.ctions positives se tiaduisent par une coloration brw&tre des
Trypanosames.
Des études visant 2 cxparer des bovins Zébus indemnes et des Ndam
suspzcts de Trypanosomiase ont donné les rkultats respectifs suivants,
exprinRs en myenne &or&rique des titres réciproques d'anticoqs MGI'R) :
- Ndc3.m suspects :
MGR en ixmxmoperoxydase indirecte
= 57,58
MGTR en immunofluorxscence indirecte = 54,96
-Zébus indenmes :
MTtRen werwydase indirecte
= 13,84
IGIR en inmwnoflmscence
indirecte.= 3,98
/
. . . ..*
(rw) Tamwn de Coons, pH 7,2 = Vbmnai! sadique 20,6 g : sod-hm chZome l SSg;
acide chtorlzp-hique 2 N : St?,6 mg ; eau distiZZ&e : &p 5 1. Au mn-t de
lkploi ce tagxn est diZuS à parties égaZes avec l’eau distiZZ9e et on
ajoute 0,3 p. 100 d ‘a&urtina bovins. (;Y*) Miles Ltd. (**+)Réactif de C&&ap
-ky d2wnSdim-3,3 - benzid2w (tétrachZorhy&rûtel : 100 mg ; tampon
!FA3 - Hcl dpA ?,6 : 200mZ ; eau oxygefnée d 10 voZwnes : 2 ml.
, .
-7
Les Ndam susnects ont ~&Sent6 des Aactions ~Jsiti.Ves 3 des dilu-
tions élevées (1/1280), aussi bien en irrmunsfluorescence cg'en i.num~~o$-
m,vdase indirectes ; nar con-WC, aucun zébu ne donne de r&ction positive
par les deux tithodes 7 entre les dilutions 1/320 et 1/1280.
Avec l'une CU l'autre kthcde, il y a des diffkences simificatives
entre les zébus et les Ndama.
t
Ltirmmmopémxydase indirecte se r&èle l&&rement sup&ieure à l'im-
munofluoresie,
tout en &tsnt Ci'aFplication et de lecture ylus rapides.
Dans ces conditions, il semble tout indiqué de poursuivre des re-
cherches sur lesapplications prMiwes de la &thkle d'tiopémxydasc
indirecte dans les ennuêtes sur les Trypanosomiases animales.
La technique par microELISA (Enzyme Linked Imwnospecific Assay) a
fait l'objet de nombreuses mises au point et applications pratiques. Des
prkisions techniques sont apport&es par AMBROISE-THOMAS et a1 (1) (2)
(31, par CARLIER, EKUT et a1 (5) ainsi que DESGEORGES et AMEROISE-THOMAS
(7). Le choix des substrats chrom&!nes a son importance. Parmi ceux qui
sont utilisCables (acide amino-5-salicyliques orthophénylène diamine, ortho-
dianisidine,
crtholidine dichlorhydrate) 4 l'wtholidine semble pr6f&
rable dans les laboratoires &uip& de lecteur automatique. La technique
microELISA est trks spécifiwe et très fi-able. Malheurcusem?nt elle ne
peut être appli&e qu'en laboratoinr! pour le moment. C'est un excellent
outil de recherche mais il ûst tout à fait vraisemblable q.u'une simplifi-
cation des procédss technioues en permette l'application sur le terrain,
dans les ann&s à venir. Son utilisation en laboratoire pour la détection
d'anti$nes titaboliques de pls.s&ium a ét6 &ussie et, très certaine-
ment, les exp&ienccs en cours sur les Trypanosomiases seront tout aussi
concluantes. Dans ces 6prcuves9 les plaques sont d'abord sensibilisées
avec des anticorps sp&ifiques de Trynanoson~. puis reçoivent le sérum
- -
suspect. L'adjonction des mêr~?s anticorps mar~.&s à la p&oxydase &Mi-
SC un pawfit sandwich quand le sérum est positif.
Toutes ces 6preuves sont praticables dans les diverses fnrmes de '&y-
panos~~-&ses animaks, comrrr- moyen de dia<wostic CU d'évaluation gpizco-
tiolwiaue (391, L'utilisation d'anti&nes de culture (35) pourrait per-
e.. / . . .
-8
rwttre de standardiser plus facilemnt les techniques pour ce qui est des
diverses espèces de Y3ypanosomes d'animaux. La conservation des antipènes
à très basse ter&rature est recommndée (25) : cela p-t de travailler
assez lon\\rtemps avec le r&nre rratériel standardisé. A titre d'exmle (VAT)
AnTat 8 de T.brucei brwei aui donne E?ncore de bons r&iltats dans les
épreuves ELISA (42).
IV - kNTIF'IcATION
Il nous semble important de compléter cette revue par lsidentification
des Teypanosoms. En plus du test d'infectivité de sanp incubé dont il a
été question plus haut, il faut pouvoir appliquer plus fréquement les
épreuves de camctérisation par isoenzymes. Elles sont utiles non seule-
mnt pour mieux connaître les rkervoirs de Trypanosomes pathogsnes pour
1'Hm (GIBSON et al, 1978 (15) mais aussi pur saisir les différences
entre souches de Trypanosomes de la n-êm espèce chez les animaux : selon
KILGOUR et al, 1980 (19) il y aurait trois sortes de T.vivax chez les bo-
vins d'Afrime. Ils d-dent à être mieux identifiés.
Telles sont les quelques réflexions qu'appelle la lecture de publica-
tions de ces deux dexmiks années sur les techniques de dia,mostic des
Ttp@IlOSomiase
s et d'identification des Trypanoscms.
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ET LA MISE EN VALEUR DES ZONES CONCERNEES
ROME, 1 - 5 JUIN 1981
-m---w
TECHNIQUES DE DIAGNOSTIC
Par Saydil M. TOURE
REF. No 066/PARASTTO
AVRIL 1982
.
EKOLKiIQUESFXTEX!HNIQUESWPROG~DE
LUITE cm LA TR!iRlNosoMIAsE l4NIMaE AFRICARJE
ETLAMISEENVALEURDESZONESCONCERNEES
-w-w--
RW,l- 5 JUIN 1981
mm---"
TECM[QuES DE DIAGNOSTPC
"m.-w.m-
PV Saydil M. ?DURE *
>
lIKt'RODUCl'ION
Les techniques de diagnostic des Trypanosomiases, tant humaines qu'a-
nim&s, ont fait l'objet de plusieurs notes au cours de ces dernières an-
&es (101 (27) (38) (39) (30). Ces notes, accmpag&es d'une bibliographie
abondante, sont des revues assez exhaustives des techniques de diagnostic
des Qypano somiases et,pmrcetteraison,
nous nous limitemns,dansle
prkent exposé, b des faits nouveaux ou à des ccmmntaires inédits. Nous
suivmns pour l'essentiel le W plan que celui adapté il y a quelque
deux ans (39).
1 -DETECTION DIREKZE CHEZ L'HMI:DE PAR?SITES FIGURES
1.1. Observation microscopique îm&diate
1.2. Observation apr+s rroncentration
1.2.1. Centrifugatim clagslqug
1.2.2. Centrifugation dans des tubes 2 m@~h&mtcmite
1.2.3. centrifugation d'éluat rçmeilli après filtration à travers
3
une colcmne de DEAE - cellulose
*\\
1.2.4, Centrifugation après lyse de globules rouges
..* / . . .
(*) Directeur du D$artement de Recherches zootechniques et vétérinaires de
l*ISRA et Chef du Service de Pamsitologie du Laboratoire national de
l*Elevage et de Recherches vétérintis - B.P. 2057 - DAK%
-2
1.3. Observation de lames colorées
Les lectu~s, au microscope, de fmttis classiqss et de gouttes
épaisses, ou de sang frais entre lam et lamelle, sont toujours comzn-
mnt pratiquées mis ces pmédés sont nettemnt inf6rieurs à ceux qui
pemttent de concentrer les TrypanoSOrneS.
.
J. (2ARRlX et D. TIMSIT (6) mpxrkent une m%hcde simplifiée de con-
centration des 'Rypanosms qui consiste à laisser &dinmtwle sang,re-
cueilli sur anticoagulant, et à centrifuger le plama : les résultats ob-
tenus sont, semble-t-il, supérieurs a la triple centrifugation.
Ceper&nt les techniques qui connaissent actuellemnt la plus large
utilisation sont celles de Woo et l'examen sur fond notid'une prépara-
tion d'interphase de centrif&ation micmh6mtomite.
Elles sont R&E as-
sez fr6quemmt appliquées sur le td. G. DUV- et al, 1979 (91,
cmtpmtiquélatechnique de Woo dans un%yerde Trypanosomiasehumaine a
Vavoua en C&e d'ivoire, en pmcédant à la lecture micmscopique à l'aide
d'un objectif à imnersion CG x 50). Ils ont pu dépister par cette r&hode
18 sujets pamsitkiques mis sans si@-m cliniques et qui n'auraient pu
être décelés que par la sérologie ou par des techniques de concentmtim
devaleurau&ns égale à celle dekbo.
La lecture sur fondnoirde prépamtionentm
lame etlamzlle d'inter-
phase de centrifugation micmhémtccrite a été largermnt décrite quant aux
pnxédés et aux avantages CM. MURR4Y et al, 1977 ; J. PARIS, M. MURRAY et
R. AGIIRE, 1980, mn publié (28) (30). Il n'est pas nécessaire de rwenir
sur cette technique, sinon pour relever des mues, celles de L. GRIFF'IN,
1978 (17) qui estime que cette rkthode est difficilement applicable sur le
temain et, pour cette mison, a une rr0uich-e valeur pratique. Nous ne sau-
rions partager cet avis, mur avoir pratiqué ce pmc&dé de diagjnostic, en
milieu éleveur, concumment avec d'autres n&hodes CBNRE, 1981) (401.'
Ses avantages r+&ent dans lafacilité, la précisiori et surtout la possi-
bilité d'évaluer l'hémrtocrite qui est le milleur indice de l'état de
santé vis h vis de la Trypan&miase, EWin, lorsqu'elle est assccik à
d'autres investigations, la r&thcde pz.rmzt de mieux ccsrrprendre les faits
pathologiqueS dans un cheptel. Ainsi, au cours de plusieurs tournées, des
prélèvemnts faits dans les diverses zones écologiques du Sénégal,en
. . /. . . .
-3
utilisant plusieurs techniques sur un r&me arC.mal (tittis et mut-tes
épaisses, centpifugation &moh&mtocrite
+ examen SUT fond nO* (mm),
des penseimnts pr&is sont obtenus sur T>lUSieurS p?TYiSitX?S : mm
scxna cmgolensc, T.vivax, Theileria m-tans, IkbeSia bigemina, hapkisns,
-,
SD.. les &rofilaires de J$tsria labiatopa~illosa.
L'idéal est de pratiquer plusieurs techniques et de faire une synthè-
se globale des données. I%ls si l'objectif visé est d'ap#.iquer des trai-
tements trypamcides adéquats, on peut se contenter des seuls exmns par
cM/EFN, car on juge d'apr&s l'hémtocrite et la pamsit&i.e. La m%hcde
microhématocrite peut donc valablement être ap@iq&e sur le t-au! (G?E?,
1979) (16). Les critiques avancées n'enlèvent rien 3 la valeur de la &-
thode C!M/EFN et c'est avec juste tison que MURRAY et al, 1979 (29) en re-
tracent les avantages. On lira avec profit les critères d%valuation qui
ressortent de plusieurs études comparatives faisant intervenir des métho-
des différentes dans divers types d'infections dues à T.vivax, T.congolen-
se ou T.brucei (311.
-
-m
La concentration de Trypanosoms mr filtration à travers une colonne
de DEAE - cellulose (selon Lanham) est rest~ek>ngtemps r&erv~e aux labo-
ratoires bien iiquipés.
Récenment, LUMSDEN et al (21) (22) (23) ont pmp-
sé une miniaturisation du matériel requis et une application sur le tem-ain
dans le dépistage de la Mladie du somil. Les r&mltats obtenus en 1980
indiquent que cette adaytation technologiq.ue Fut akliorer le diagnostic
de mutine de la msomiase humaine africaine. Sans doute s-ait-il
souhaitable d'appliquer aussi la technique dans les TryJ-nosdases ati-
miles à des fins de recherche.
II " DETECTION INDIRECTE DE PARASITES FIGURES
11.1. Inoculatim à des animzux d'e@rience-
11.2. Culture en vitro
11.3. Xénodiagnostic
- ^. .-
P~U de faits nouveaux sont à signaler dans cette mie, tout au
nGli3 en Ce qui conc-e les Gpreuves avant avoir une valeur riratique
de diagnostic des Trypanosomiases animales. 34mtion doit &pe faite ce-
. . /. .*.
-4
wdant de difficultés rencontrées pur caractériser avec certitude des
sercdènw de T.bmcei et Tzhodesiense. 11 a été démmtré r&emmt, au
cours de tests d'infectivité de sang incubé (TISI ou BIIT de Rickman et
Robson), des r@onses mdoxales chez des types antigéniques variables
de semdèna?s connus (ETat T.&odesiense et AnTat T.brucei). Un nouveau
protocole de RICKMAN et KOlAlA, 1980 (32) a permis d'étudier ces &pon-
ses paradoxales. Trois souches connues de T.brucei, ap&s avoir d'abord
entr&né des r&ultats négatifs au TISI,ont ensuite cons-tarment donné
des r&mltats positifs. D'autres épreuves ont confi.ys$ ces faits, à ver-
ser au dossier de l'identification des sous-espkes de Tbrucei, que nous
reprendmns d'ailleurs à la fin de cette revue de techniques. Il est à
noter que dans le TISI, il n'y a pas nécessairement corrélation entre la
utilité des Trypanosoms et l'infectivité pour des Rats ou des Souris
@OBSON et RICKMAN, 1977) (33).
Des mdifications du TISI ont permis à HAWiCN (18) d'étudier la
résistance au sérum hmin de diverses espèces de Trypanosoms.
III - METHODES SERO-~LOTI$S
111.1. Méthodes mn spécifiques
- Forml-leucogel ou &action de Gaté et PaFostas
- Test au &lorw?e mrcurique et ses variantes
- Evaluation des imnunoglobulines (IgM>
Dans cette rubrique, on wut citer les travaux de UJCKINS et al,
1979 (20) et ceux de ?MHMOUD et GRAY, 1980 (26) qui comparent entre elles
ces techniques non spécifiques et des techniques plus mdernes pur éva-
luer la Tkmanostise due à T.evansi.
111.2. Méthodes spécificpes-
111.2.1, Fixation du cmpl&nt ou test d'hémlyse
Elle est toujours utilisée (36) mis ses applications sont
devenues plus rares parce qu'il existe des moyens sémlogîques plus
faciles à appli&r et tout aussi fiables. Elle est passible d'am$-
lioration r des éprwves encore plus spécifiques (37).
.,. /
..,
-5
111.2.2. Héma@utination indirecte ou mssive
111.2.3, @reuve d'agglutination directe
BINZ et al, 1979 (4) ont pr&enté une évaluation du test d'hémg-
glutinaticm indirecte en tube capillaire. MAGNE et al,1979 (24) donnent
.
des précisions sur l'épreuve dgag.plutimtion directe sur carte en utili-
sant comre antigène des 'I!rypnosoms isolés SU?~ DEYE-cellulose et color&
par bleu Coomassie. Ces deux techniques, jusw'à m&stenant, n'ont été uti-
lisées que dans le dépistage de la Maladie du someil. Ltag#.rtination sur
carte a fait an-1 à un antigène T.brucei brucei WAT) AnTat 8 qui con-
duit à des r&ultats indiquant une forte @somtion de Txypanosomiase si
les titres sérologiques d'agglutination vont de 1:4 à 1:64.
111.2.4. Imunoe'lectro$xwèse et imnunodiffusion
111.2.5. Immnofluorescence indirecte
111.2.6. Immmpemxvdase indirecte
111.2.7. PCXCELISA
Nous insisterons SUT les trois dernières techniques qui sont ac-
tuellement les ylus utilisées dcans les laboratoires pour diagnosticper
les ~somiases humines et animales.
L'imnunofluorescence indirecte est désmmis classique. &,l,gré ses
teks rmrbreuses a@ications dans la rechemhe des maladies parasitaires,
ce ?mcédé de diagnostic n'est y?atiq& qu'assez raremnt dans les labo-
ratoires africains. Il a conduit à de bons rhultats dans le diagnostic
et l'étude &&ootiologique de la 'Ikpanosomiase bovine. Son utilisation
nraticue sur le terrain dans le dépistage de la Trypanosomiase humaine a
fait aIobjet d'une note de G. IXJVALEI' et P. SALIOW, 1978 (8). Les appli-
cations en épidémiologie citées dans la littérature scientifique sont yes-
que toujours -réalisées dans les l.aboratr?lres situés dans les ca~italesou
les grandes villes (11) (12) cl31 (14) (34). Les raisons de cette restric-
tion tiennent en nart.i.e 2 la nkessitg d'utiliser un micmsco~ à éclaira-
Fe ultraviolet qui c-& sensiblemnt @us cher tue les microscoms $
éclairage ordinaire et qu'on ne peut NS déplacer en brousse. Il est 'J-S-
sible de pallier cet inconvénient en praticpant la kthode imnunoenzymlo-
gique, tout en utilisant des antigènes figur&. Cette m&hode a été récem-
.., /
..,
-6
Jrrent exoérkntée, pxr ce cpi est de la Trypanosomiase huwtine. Elle a
une aussi Mnne sensibilité que l'irrrwnoflwrescence, tout en ne nécessi-
tant qpl'un éclairage courant. Nous l'avons exp%kntée dans le diapstic
de la Wypanosomiase bovine, en la corrparant ?i l'kxnunofluorescence indi-
recte (41).
La n&hcXe suivie est celle décrite FI? CAILLIEZ, que nous avions ci-
té dans une note antérieure (39). Elle comporte notmnt les étapes sui-
vantes :
- dilution des sérums en tampon de Coons C*l ,
- réaction anti$ne-anticorps pendant 60 minutes à la température ambiante,
- lavage 10 minutes par le tampon de Ccons,
- r?zaction avec un sérum de lapin anti-irsnuno~l&ulines bovines conjupué
àlapéroxydase (*+) et dilué à 1/50, pendant 60 minutes,
- lavape deux fois nar le taxrpon de Coons = 1 minute et dix tiutes,
- révélation na?? le &actif de Guaham-KarnowsQ pendant 15 minutes C***l >
- lavape à l'eau distillée,
- nrxxtage en milieu $?lyc&iné et exwen au microscope en lumière blanche.
Les r&.ctions positives se tiaduisent par une coloration brw&tre des
Trypanosames.
Des études visant 2 cxparer des bovins Zébus indemnes et des Ndam
suspzcts de Trypanosomiase ont donné les rkultats respectifs suivants,
exprinRs en myenne &or&rique des titres réciproques d'anticoqs MGI'R) :
- Ndc3.m suspects :
MGR en ixmxmoperoxydase indirecte
= 57,58
MGTR en immunofluorxscence indirecte = 54,96
-Zébus indenmes :
MTtRen werwydase indirecte
= 13,84
IGIR en inmwnoflmscence
indirecte.= 3,98
/
. . . ..*
(rw) Tamwn de Coons, pH 7,2 = Vbmnai! sadique 20,6 g : sod-hm chZome l SSg;
acide chtorlzp-hique 2 N : St?,6 mg ; eau distiZZ&e : &p 5 1. Au mn-t de
lkploi ce tagxn est diZuS à parties égaZes avec l’eau distiZZ9e et on
ajoute 0,3 p. 100 d ‘a&urtina bovins. (;Y*) Miles Ltd. (**+)Réactif de C&&ap
-ky d2wnSdim-3,3 - benzid2w (tétrachZorhy&rûtel : 100 mg ; tampon
!FA3 - Hcl dpA ?,6 : 200mZ ; eau oxygefnée d 10 voZwnes : 2 ml.
, .
-7
Les Ndam susnects ont ~&Sent6 des Aactions ~Jsiti.Ves 3 des dilu-
tions élevées (1/1280), aussi bien en irrmunsfluorescence cg'en i.num~~o$-
m,vdase indirectes ; nar con-WC, aucun zébu ne donne de r&ction positive
par les deux tithodes 7 entre les dilutions 1/320 et 1/1280.
Avec l'une CU l'autre kthcde, il y a des diffkences simificatives
entre les zébus et les Ndama.
t
Ltirmmmopémxydase indirecte se r&èle l&&rement sup&ieure à l'im-
munofluoresie,
tout en &tsnt Ci'aFplication et de lecture ylus rapides.
Dans ces conditions, il semble tout indiqué de poursuivre des re-
cherches sur lesapplications prMiwes de la &thkle d'tiopémxydasc
indirecte dans les ennuêtes sur les Trypanosomiases animales.
La technique par microELISA (Enzyme Linked Imwnospecific Assay) a
fait l'objet de nombreuses mises au point et applications pratiques. Des
prkisions techniques sont apport&es par AMBROISE-THOMAS et a1 (1) (2)
(31, par CARLIER, EKUT et a1 (5) ainsi que DESGEORGES et AMEROISE-THOMAS
(7). Le choix des substrats chrom&!nes a son importance. Parmi ceux qui
sont utilisCables (acide amino-5-salicyliques orthophénylène diamine, ortho-
dianisidine,
crtholidine dichlorhydrate) 4 l'wtholidine semble pr6f&
rable dans les laboratoires &uip& de lecteur automatique. La technique
microELISA est trks spécifiwe et très fi-able. Malheurcusem?nt elle ne
peut être appli&e qu'en laboratoinr! pour le moment. C'est un excellent
outil de recherche mais il ûst tout à fait vraisemblable q.u'une simplifi-
cation des procédss technioues en permette l'application sur le terrain,
dans les ann&s à venir. Son utilisation en laboratoire pour la détection
d'anti$nes titaboliques de pls.s&ium a ét6 &ussie et, très certaine-
ment, les exp&ienccs en cours sur les Trypanosomiases seront tout aussi
concluantes. Dans ces 6prcuves9 les plaques sont d'abord sensibilisées
avec des anticorps sp&ifiques de Trynanoson~. puis reçoivent le sérum
- -
suspect. L'adjonction des mêr~?s anticorps mar~.&s à la p&oxydase &Mi-
SC un pawfit sandwich quand le sérum est positif.
Toutes ces 6preuves sont praticables dans les diverses fnrmes de '&y-
panos~~-&ses animaks, comrrr- moyen de dia<wostic CU d'évaluation gpizco-
tiolwiaue (391, L'utilisation d'anti&nes de culture (35) pourrait per-
e.. / . . .
-8
rwttre de standardiser plus facilemnt les techniques pour ce qui est des
diverses espèces de Y3ypanosomes d'animaux. La conservation des antipènes
à très basse ter&rature est recommndée (25) : cela p-t de travailler
assez lon\\rtemps avec le r&nre rratériel standardisé. A titre d'exmle (VAT)
AnTat 8 de T.brucei brwei aui donne E?ncore de bons r&iltats dans les
épreuves ELISA (42).
IV - kNTIF'IcATION
Il nous semble important de compléter cette revue par lsidentification
des Teypanosoms. En plus du test d'infectivité de sanp incubé dont il a
été question plus haut, il faut pouvoir appliquer plus fréquement les
épreuves de camctérisation par isoenzymes. Elles sont utiles non seule-
mnt pour mieux connaître les rkervoirs de Trypanosomes pathogsnes pour
1'Hm (GIBSON et al, 1978 (15) mais aussi pur saisir les différences
entre souches de Trypanosomes de la n-êm espèce chez les animaux : selon
KILGOUR et al, 1980 (19) il y aurait trois sortes de T.vivax chez les bo-
vins d'Afrime. Ils d-dent à être mieux identifiés.
Telles sont les quelques réflexions qu'appelle la lecture de publica-
tions de ces deux dexmiks années sur les techniques de dia,mostic des
Ttp@IlOSomiase
s et d'identification des Trypanoscms.
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