REPUBLIQUE DU SENEGAL MINISTERE DE LA RECHERCHE ...
REPUBLIQUE DU SENEGAL
MINISTERE DE LA RECHERCHE
SCIENTIFIQUE ET TECHNIQUE
LABORATOIRE NATIONAL DE L’ELEVAGE
ET DE RECHERCHES VETERINAIRES
?’ *
f
R A P P O R T S U R U N S T A G E Ov 1 MMUNOLOGiE
P A R A S I T A I R E O R G A N I S E P A R L’ILRAD D E N A I R O B I
O U 4 O C T O B R E A U 1 2 NOVEMSRE 1 9 8 2
’
P a r M b a y e MfXNGUE
R E F . No 53iPARASITO.
J U I L L E T 1 9 8 3 .
RAPPORT SU'? UN STAGE D'IMMUNOLOGIE
PARASITAIRE ORGANfSE PAR L'ILRAD DE NAIROBI
DU 4 OCTOBRE AU 12 NOVEMBRE 1982
PRESENTATION BE L'ILRAD
Le tabcratoire InternatIonal pour la Recherche sur les Maladies animales
(tIR.AD) est si-l-u6 sur 70 hectares, 9 proxinite de NaI'robi, au Kenya. II fut
établi en 1973 au terme d9un accord avec le Gouvernement kenyan,
L'ILRAD est supporté par le Groupe consultatlf pour la Recherche agricole
internationale (C.G.I.A.R.1 qui est une assoclatton de fondatlons Priv&es, de
gouvernements nationaux et d'organismes nationaux et Internationaux.
Le C.G.I.A.R. est à son tour garanti par I'Organisatfon des Notions Untes
pour IsAlimentatlon et l'Agriculture (FAO), la Banque mondiale (Li.B.1 et le
Programme des Xations Unles pour le Développementr'
L'objectif du C.G. I.A.R. est d'omgl iorer la production agricole et animale
dans les pays tropicaux et subtropicaux,
Deux maladies, de vaste répartition geographlque et dont tes effets écono-
rnll$L'es s'avèrent graves sur le bbtail, furent choisies par le programme de
rrzherche de IPILPAO : il s'agit de la Trypanosomiase et de l'East Coast Fever
( .C,F. = flévre de la &-te de l'Est-1 qui est une forme d,e Thell&iose.
. . . / . . .
TABLE DES MATIERES
Pages
2
r,
I - INTRODUCTtCN
,*..*.....* O,......Y D c 0 0 5 1 i....‘..........,....G.C....,,
I I -. PARTIE THEORIQUE
. .."...~..,.....YI...~~.~~.,.*.,.,..~....~..~...,..
- GBnéralites sur I"immunologie
.r.o 00 SI) i...,.,...,,.,.....~~ aoa *..a
- Les Immunoglobulines
~...".~.I.....O~C.....~~~...*...,...~.~....~*
- La r8ponse immunitalre .*.*.*.,*00*. ..r..~........,,..,.,o~~.~,**..
- Le complément ,.~.,....~..~,.C~.~L~..~...~~~~.,....~~...~...,,.~~.
III - PARTIE PRATIQUE ..*....*...*..*0.~‘"~.~~...........*....,..,.~..‘...
10
Purification des proi-elnes ,.LC.O~~..,...........,..........~~.~..
11
Immunofluorescence indirecte (I.F.I.1 . . . . . ..o..*~..*..O~..e...o..
14
P
Test immunospecifique par couplage enzymatique (E.L.I.S.A.)..,....
17
Immunodiffusion et tmmunoélectrophorèse
.*.~*.~*O.....I*~1..~..~.~
19-21
Transformation lymphoblastiquo par la concanavaline A . ..e....**..
22
Test d'isolement des lymphocytes du sang . . . . . . . . . . . . . ..e.0*.0.***
24
Test d7aggluttnation sur lame ".~~f..~..~.~.....,.,,,.,~~.~..~~.~.
25
Test d'incubation et d'infectivité du sang (B.I.f.T.).......,..,..
26
Dosage radioimmunologique .*. Y...%- 0 P Q..a......e...,....o es..,,..,..
28
IV - CONCLUSIONS ET REMERCIEMENTS . .."~O..~C~......,.,..~~..,.~~.,~~"*~,.
30
- Conclusions ......................................................
31
- Remerciements
32
....................................................
b
Lîuire r!es tzches fondamentales de l'Institut sgnégalais de
Recherches
pyricoles (I.S.R.A.1 est la formation et lvamC51ic~ratTon
constante du niveau des chercheurs et dos techniciens,
4insi sur
l'initiative de son Directeur de dépariement de
recherches zootechniques et vGtC!rinaires, j'ai assista à un stage
organisé
par ilILRAO (le Laboratoire international pour la
Recherci;e SUC
les Malsdles animales) de NsTrobi 2u Kenya.
Le programme du stane a c,3rnp3t-l-6 :
- une partie théorique portant sur :
- g6n67sfit8s sur l'immun~olo~ie
- IGS i~m~noglobutines
- Ia reaction immunitaire
- 16 compldt7ent
- des travaux pratiques portant avec les mbthodes immunologiques
appliquaes dans
le diagnostic des maladies hémoparasitaires.
- 4
GENERALITES SUR L'IMMUNOLOGIE
;
<.
II existe plusieurs types d'ïmmuni-6 :
Irfmmunité dite naturelle : peut être inn6e ou constitutive.. Elle traduit
l'état de résistance naturelle vis-à-vis dvun agent pathogéne quvune espèce
anlmale doit à sa propre constitution.
Cette immunit& met en oeuvre :
- les cellules phagocytait-es
- tes facteurs humoraux non spkifiques (le complément, le système
properdfne)
*
.', "
I 1 immunité acqu,ise : peut être
.-.
- soit active à ta suite d’une infection ou d’yne, ImmunSsation
- soit passive SI el I e est conférée 5 un organisme sans que, ce, dernier
ne participe à Iv lnsta I lation de cette immunité,
.: . .
Les reactions antigène- anticorps sont reverslbles et-sont caractérlsées
. .
par des interaction? moléculaires non covalentes. ,.
.'
' ::
.
Lors de Ia rgponse primaIre,
les anticorps produits sont g6néralement de
nature IgI.1, Au cours de.cette réponser
Ivaffinitf3~ des,antiçorps est fai ble
mais I'avidi-6 est eievé+.
En roponse secondaire,
I 'affl ni té des antl cet-ps prend’ le pas sur I 9aviditB
cette réponse est le plus souvent de nature IgG.
Deux antigsnes ayant quelques déterminants antigénîques 'Identiques peuvent
donner des réactions crokées.
.*.
/ l *.
, . \\< . . .
LES I MMUNOGLOBUL
I NES
Les immunoglobulines ont une structure peFtidique formée de deux chatnes
lourdes et de deux chatnes I égères i dentiques .rel.i ées .entre...e 1. les.par.. .des ponts
dfssul fut-es.
L’hydrolyse de la mol6cule d’lmmunoglobuline par ,la papal’ne donne deux
,.<
. .
’
fragments f dent\\ iues (Fab 1 capab les de se l ier 5; #un %nti @ne iiiciri6vk1 ent et’ un
.s
.:
troisième fra9ment F c ( f r a g m e n t c r i s t a l Ilsable.) qui’ n e peut ,pas s e l i e r à
l’antigène. Ça dernier fragment Fc assure des fonctions btologiquss secondaires
(récepteur des cellules phagocytaires, fixation du’complément).
L’analyse des protéines de myclome a cfsntrjl que ies &gions ami no-acide
terminal des chaines iaurdes et des charries légèies’sont .variablcs.
Chez I vhomme, on trouve ci nq types de chafnes lourdes correspondant à
cinq c l a s s e s d’inwnunoglobulines q u i s o n t lglgG, lY19A, Iv:19M, I*,!g@ e t I’lgE.
.
Dans le s6rum normal, il existe au moins lO* molécules dvimmuno910bulInes
de spbcificit6 différente,
!
,“, .<
i&ggG
la mleux connue.de tous les lgj représente 86‘ p.lr)o des 19 du sérum
,,
‘_. humain ;
I’lgA : est surtout prhsente, dans les substances extravasculai res ;
l,‘lgM.: e s t i n t r a e t extravascufalre.
El I e est secrétée t&t dans la réponse
immunitaire, F cause de son de9re Olev8 de valence, el le est un trés
grand agglutinant bacterien et un mÉdiateut-, du facteur cytolythique
du camp l ément. L’I9M est le premier.8lémen-t de défense immunitaire,
humorale spécifique ; .
:
I’lgD : se rencontre $ la surface des lymphocytes B en cours de différenciation,
‘3.
..<,
où e’l le joue probablement le rôle dvanti9ène,récepteur ;
*
:I’l9E
se retrouve gén6ralement St la surface des mastocytes. Le contact d’un
al lergane avec I ’ l9E fixée 2 la surface des mastocytes entraine la$&
: 4
degranulation de celul-cl dont le r&sultat est la liberation de substan-
Ces vasoactives comme I’histamine. L’lgE intervient dans les phénomks
anaphylactiques liés aux Infections parasitai t-es,
Les i mmunog lobul 1 nes portent des marqueurs génét ,iques :
I . . . .
. . ./ . . .
-6
l e s allotypes $ sent l’expresslon 42 gànea all+les, O n l e s t r o u v e à l a fo 1s
sur 1 a partf e consfand-e ‘ei sur ‘I a parile UaFt ab ie des I Q*
l e s Idtotypes : sont sf 4~6s sur la r6gfon Var-table des Ig sotf b I r IntBrleur-
soft 9 proxlmfti! du site actif,
l’ldlotypte est h8r6ditnlce tmlr n’abel+ pas BU~ lolt de la
~hétfqU3 Sfmfde do #ENCECI
lymphacy-tes !3 sont tmpltqoés dans ta formation de; anticorps et sont responw-
bics de IPimmun~t6 humorale,
L’lmmudtb ceiiulafre qut est l a prlnçtpale s o u r c e d e dWewe cofltfe les
o~ga+alstws intracel lutatres, dépend d e s Inteactlons d e I’antl&e V!S-à-V~S
de@ r$ceptWs sficfflques pF&GJd’S à ia swf8ce d e s Iyinpbcytes T .
les lymphocytes T et B pocteht Ues marqueurs de surface S
- l e s Lyf@wcyt~~ T 3 an*t g&e 0, r6ceptews y e t V, nntt gZww3 L:I
- 10s t)‘rriphocyte 8 : 19 de sut-facta, tw-tw CSb du atJf@émed.
f l axfsta pluslews sous-populations de lymphocytes f parmi iesquelles :
- ieS 7 helper (Th) : 1 ntervfennent dans la production des anti coprs et la
g6nératfon des cd luies cytotoxlques
- 1 es T suppresseur (Ts) : leur action est de supprimer ioute rQponse Immun?-
tatre qu’elle soit humorale ou cellulaire
- les T cytotoxlques (T,) : ont pour r6le essentfel ta destruction des cellules
portant des antl @ries de surface d! ff6rentes de celles
d e I’hbte,
,Les tel I ul es productrfces d’antlcoFp5 peuvent &t-re m!ses en évidence par
I1lmmunofluorescence o u l a .teehnlque d e s piages dv lyse.
DPns la myclome, l e prot$tne monoclonaie
donne une seufe bande en
61 ectrophorese sur papier ou un seul Et-c de gr&A pf tatlon en i mrnuno-
0 I ectrophor&se . L’actf vit6 des lymphocytes peut &tre augnrent& par I ladminf stra-
tlon d’un adjuvant.
Les g8nes de ta r6ponse immunltalre sont an rapport avec les gènes du
complexe d9hiL;tac~&l 11-t-6,.
Les lymphocytes T peuvent non seulement augmenter 13 r+3onso i mfnunl tai re
par le tiats de le coop&atlon (Th): mals dans d’autres cas, peuveni exercer une
fonction suppressi ve (1s).
La toi érance lmnuno logique peut Eitre 1 ndut te avec des antigk?s solubtes :
. . . / l . *
,exemp le+ : des lapins ayant reçu a la naissance du sérum albumine bnvlne, ne pro-
duts8nt pas d anticorps lors d’une stimulation ultérieure avec cette protelne.
Cette i-0 érance peut aussi être Induite par I ‘exposltlon 3 l’antig&ne au
stade néonsta
et à I ‘état adulte,
exemple : I?i jsctlon de tel I ules de la moel le osseuse de souris CEIA à des sou-
ris nouveaux-n& de la !!gn&A, supprime leur capacité à re&?ter une greffe CBA
au cours de la vie adulte.
Les 1 ymphocytes T ont un d6gr9 de toIOrance p I us Bleti que 1~s lymphocytes
f3 comme Iv1 I lustre le tableau sutvent :
I
OOS6
5 tO~6FUtlC8
Indu1 t e
to I érogène
B n rnc
Lymphocyte T Lymphocyte B Rate du donneur
0, ’
96
9
6 2
03
9 9
56
9 7
2,5
9 9
70
9 9
Effet- de la dose dvantlgène sur IPinductlon de la tolérance au nlveau des
tymphoc/tes T et des lymphocytes B.
Les faibles doses dtantigbne rendent tolkanis les lymphocytes T alors
que I es 1 ymphocytes 8 ne devf ennent toi érants que pour des doses 6 IevGes
d’antlgene.
Lfactlvfté des lymphocytes T dicte dans une larçe mesure la r6ponse de la
rate entière, RQférence (CHiLLER J.M., HABICHT G.S. et WEIGLE W.O., Science,
1971, 171, 813).
LE COMPLEMENT
La r3act!c>n do t'anflgène' ~ortlculairo avec un anflcorps peut condutre à
une agglutination, une élev&f-ion de la phagocytose, une cytotoxlctte lorsque
1 'anti&c cst~constltué par des cellules, .
Le cornpI&wwt recouvre une caseode de réacttons enrymattquas dans !aquelie
le premier composant de l@açtfvatfan scinde un pettt peptlde en piusteufs mol61
cules du second composant dont chacun devient u~~enzyme acttve capable d'agfr
sur te troisiene composant.
Le comp!Qmont peut $tre actlv$ par deux voles :
- la vole classique
- ta VOIS alterne.
l.k plus Important composant le CJ est scindé par une converfase (vole
alterne).
Le produit de la scfssion C3a est chtmlotactlque pour les leucocytes
palynucl&3ires.
II augmente la pern&abllit~ vasculaire av3c l'histamine Ilhér6e
par loç,p~as~~yfos et les basaphilos.
Le second produit de la scission C,p actfve le Cs en CE.~ (ayant les pro-
'.
pristés simî laires au Cg'a), et conduit Csb & la s6quence des f?CteUrs $3 et Cg
entratnant la fyse de la cellule.
A travers fr,Üs ces effets, le compl6msnt joua un rble Important dans Ir
défense de lVorganlsme contre l'lnfectlon,
In vive, Il, Intervient dans les maladies auto-immunitaires kjanérulonéphrlte2
Le compt&ent est utfllsé fn vitro dans les s6rodiagnostics de msladies
parasitaires,
baci+rfennes, etc...
I PART I E PRpaT i QUE I
PURtFICATlON DES PROTEINES
DIff6renteslechniques
ont été utIlisées pour la purification des protéines, Ii
svagit de la chroma-tographie df6change d'ions, la chromatographle dsafflnlt6, la
flftratlon sur gel et la technique de IPélectrofocusîng.
Nous avlans manfpuI6 dans notre groupe 4 de travaux pratiques : chromatogra-
phle d'khange d'ions ot chromatographie d'afffnité.
l - CHROMATOGRAPHIE PAR ECHANGE D910NS
PrlncIpe :
Techn?que très senslbie permettant de séparer et même d'isoler les protefnes.
La ¶tfon est obtenue par le faft que certafnes substances (prot6ines) ont des
afflnlt6s dlfferentes du ma-tri% échangeur d'ions, qui sont dues aux dlffërences
de leur charge.
On procédera à la séparation des protbines sériquss et b IYisolement de
I'lgG B travers ta colonne de OE52. Les dlff6rences d'affinIt6 sont étroitement
Il&s au pH et 3 la force &nique des éléments en comp<ion,
Technfque :
Un volume détermin6 de s&um est aJouté lentement b un volume égal de solu-
tlon saturée de (NH4)2SOq.En agltant bien le sérum, on obttent 50 p.100 de concen-
tration ftnale de sérum saturé en (NH412SC4 ; le précfpit6 de prot6lnes obtenu est
centrifugé à frotd c1 3000 tours/mn x iO mn et Iav6 avec une solutton de (N!-14)2S04
3 40 p.100 de saturation., On centrifuge de nouveau : le préclpft6 est dlsscttt dans
du tampon PBS O.'l M pH 7,2 avec un volume Egal au vo fume Intttaf de s&um.
On ajoute le sulfate de(NH4)2S04 satur6 avec un volume Egal à la moi-i-l& du vo-
lume inttfa,l du sérum : la concentrai-ton finale des prot6lnes en (NH4)2SO4 satur8a
est de 33 p.100. Le pr&lpli-é est centrlfug6 et lavé avec une solution de (NH4)2SO4
B 40 p.100 de saturation et recentrifugé. Les proteines s6rlques obtenues sont mi-
ses en suspension dans du PRS 0.1 M pH 7,2 avec un volume dgal 3 la moltl~ du volu-
me Inlttal de sérum.
On mesure la densite optique (DO) des proteines B 280 nm et on calcule la quan-
ttté des prot6Ines selon la formule :
mg de protefnes
10
=T x DC x dilution x volume
(dilution effec-
(volume de prot6lnes* 1/2
tu60 au moment
volume Infttat de s&um).
de lire la DO)
.a. / . . .
.’
:, ~~Pr~i,neipa::,,
.!
I ::
.,,
.
.::. ,;
.,
* .
Tcxhntque
Me-t-l-t-~ fa prototne A sépharose dans la tolwme. Aj~u+er la solutfm citact&
' acétique O,t M pH 2,6, et vérlf!e?!?e pH dans la ctslonf~e de rw e&t Je
&me 2,6,
Proc&cr de la même façon avec une s9lu+lcm & BlaaW& (J,lM p#9,6 oosr*enern+
NaN3ka colonb de s6pharose est al~ns’t &qui Iib&b
Les frac-t-Ions protélniques sont 03t8cl48s daM; des ,fubar à b44wIy19 su,
fractl onnateur LKE
Qn procède avec deux soiuflsns +amp~rn da Na HzP6r, 8,# lai pH 5,9
P(aHp34 t3,l MpH5,O
‘
On obtient deux pics correspsndan~ ew frae~9wtr FgGt et Lgt$ du &%JM b
chilvre. La densitc cystique de chaque.pic est d&emrttie afin de Ca#culet les
taux de prot0fnes s&fqu& fractlonn&3s,
- 14
t - MARQUAGE DE C’lqG PAR LiISQTli!OCYANATE DE FLUORESWNE
_-1----.,
-.I----
-s.
Dans une membrane h dialyse, metire 1 ml de prot6lnss s6rlque a travers
la colonne de DE 52 (igG pure) + 1 mg d’lsothtocyanato de fluorsscelno.
Placer la mcmbrana dans un bkhw renfermant 10 ml cis tampon carborratçi
b I carbonate pH 9,5*
Dialyser les prot45 1 ries dans I’Isothlocyanate pendant 18 heures,
Purtfler les protbfnes Conjugu&es à la fluoresceinc à travers une colonne
ds DE5p
Des solutfons à. doses crolssantos de NaCi dans du tampon PC4 g,Ot M pH
7,s sont ~Joui-éer dgns la colonne.
Qn obi-lent diff6rsnts pics correspondant aux timpons NaCI. La denslfh op-
tique est lue à 280 et 495 nm pour chaque pic afin de détermtner la quanti%
de protéines conJugutSe par la formule sutvante
!DO 280 x dl lutton)
-_1-
- - - - C’ 0 35 (00
.-.-..L--
495 x dllutlonf
x vo,ume
1.4
La solutton dvlgG conjuguk 3 la fiuorescelne est concentrée au ftftre
amicon ou dans 1 e po l yéthy I èiw~ 1 yco 1 I’e .
L e conjuqué IqG 3 la fluorescelne e s t ainsi pr&t p o u r l e test d’lmmunofluo-
rente indirecte.
il - I FA~~r\\lOFLLlORESCENCE I ND l RECTE
-
-
-
-
-
- --e--w
Pi-i ncb” :
-.-
Détecfion lndlrecte des anticorps s&iques par un substrat chromogène qui
se flxc sur le complsxe ;!g - Ac Qvontuel form6, L’lsothtocyanate de fluoresceino
a été conjugué & une IgG obtenue apres purIf!cation
par chromatographle d’Cchan-
ge d’ions.
Le rkultat est obtenu par I’appt-&tatlon du degré de posttfvlte allant
d e + à ++++..
Prodd6 2 ;
------em
CMwnment utllls&e dam notre labwa4wlt-a; ta dlftharrcr, auee le pmmM4
1 est que lqBn travaIlle sur des tt-ypanownw tti,
^
BrocBdé 3 :
1c-...---l-l
On dispose de Schtzahfe de Thellerla parva
C_L
djkkange d'ions et de Thell,erla mUtah sur fro~tfs de sang.
-
-
-
ta souche de T. parva es+ dllwk au 1110 dons du sorum albumIn@ hutaslno
à 2 mg/mJ, Le ftwttls de sang de Teo mutans esi plong4 dans du *ampon PS pH 1,2
pendant 5 mn pour permettre la ch%emogfc&fn!satfon : Ialrsw &her et d811ml-
ter deux rar@.es de 5 cercles sur le lame b t'atda du wrnls à mgle.
Pour -paruo
: O h U+!tiSe t’!il ii3fW pf”#ite, dei!IRff&+ daW kjtKlb On fWt
25 \\II, de T.parva dans chaque cercte et on lalsss sécher.
-
-
T. mutans : a d4ja 8th fixé sur le frottis de sang.
Dans chaque cercle, dQoser 25 ~1 de dtlutlon de serum b tester. Les deux
lames son-i- lncub&s en chambre fetWk b la femp~ratut-e du Labora+olre pendant i
30 mn.
Jeter 1'0~~85 d'enflcorps et tsver dms du tampon PBS pH 72
2 x 15 mn.
AJouter 10 p-1L de cenJugu6 dllu4 au 1/18c'R) tilangé, b 1000 VI, de serum Albu-
mine humaln et 10 # de bieu evans dltub au 1/10.#U,
incuber 30 mn et laver 2 x 15 mn comme pr4cédemmen-t.
La!sser skher et fafre le montage dans une solution do glycerol P 50 p.lU@
a pki 0.0. Examiner les lames au mlcroscopo b f#u@rascence.
Les Thef Ierfa parva
MI-
: apparatssent très fluorescents dans fes lymphocytes on cas
de r8aciIan poslttve.
Les Thellerla mutans : devlennont fluorescents en cc7s de posltlvtt8,
Technfque trés sensible donnant de bons rbsu!tats,
L'Tnik@ du bleu evans est de supprimer tout ce qui nFest pas spklflque
à la fluorescence,
III .- TEST PR'ZPRENENT fI1T
.--
Les serums 3 tester sont dllt.Gs owc to mhlange sutvan+ t ~55 pH 7.2 +
0.5 p.100 iwe~n 20 dllutlons du 1/100 au lj31.250.
,
200 UL de dllutlon seriqus sont aJout&s dans ehsquo cupule. On fnccube
2 heures 4 la -température du Iabora-tof r-e et on lave 4 x 5 mn.
.
AJouter 290 I!!?, de paranf-trophenyt phosphate 1 mc,/ml dans du tampan carbotw
te 0.05 v P!i 3.6. Incuber à 37°C pendant 30 mn et arrêtor !a réactton par ad-
dition de 50 $?, de NaoH 3 1;1. iire la densltE! optique d 405 nM.
Nous qvtons obtenu de bons résultats dans Icensemble. Cependant, on peut
noter que ces dernfers sont susceptibles de varier d'un iaboratolre à un wtt-e
sous IPcffet de certains param&tres parmf lesquels ii ast n0cessalre de mentton-
t-ter la twpkature. A I'ILRAD, les rsactlons se sont d&wl&es à leoC alors
qu'elles devraient nornaalwhwt avoir tieu à 37'C.
Des w-t-ours pcuwnl- cgalgrnnnt provsnlr du fabrlquant de la plaque. Le
chronom6traye des lawqes doit se faire exactement sinon II peut aussi in-
duire des erreurs,
a,* / . . .
pour 8bs~t-b~k 1'euu dtstlIl4k9. Un fiacsn est
1/2 h~ufe~En\\eve~ le flacon, le k~eenex et
- 20
La lam est placéo dans la botte de coloration pendant 2 heures. On lave
6ion prc&de a la d6coloration par le décolorant suivant :
Le pressing et la coloration nous ont permis d'awlr des rhactlnns fdcl-
lement fnterpr6tables.
03.
/ . . .
TRANSFORMATI
IQUE PAR LA CONCANAVALINE A
I - *pRl clc 1 BE
La cixxteanaw3ttne A provoque te multlpltcatlon dos lymphocyias T du sang.
Sous l'action de Ia'mncartsvaline A, les lymphocytes subtssent des dfv1slonti
cellulelres oun3+ase, La transformaiton est mesur4e per I~lnçorpcwa+lon
d'um 1'2'5 ,
II -tE6HNlQUE
CI-
c Le sang obtenu par ponctlan wlnouse dans l'h6parlne est d!luB au 1/2 dans
une solu*lon saîtne st6rllo.
Dans un tube à centrlfugw confqoe, metfre : 5 ml de flcoile hypaque +
6 mi de sang h4parlnG dfiut5 BU 1/2, La!sser &zouter doucement le sang de ma-
nlere à ne pas m6fsngor le sang 8u ficotte. Centrtfuger 1.500 fout-s/tw pen-
dantlomn.
Prblever les cellules blanches à i'tnterphnse et les mettre dans un au-
tre tube dans lequel on ajoute du tampan Alsever pH 6,1 pour laver (bfen mé-
langer Aisever 4 Cellules blanches), Centrffuger 3 x 10 mn pour bien laver
les cellules blanches. Ajouter au culot 1 ml de milleu de culture L15 apr&s
la dernfere centrlfugatfon et bien m4Ianger.
Mettre dans untuke 0.9 ml de Bleu de ToluBno * O,l ml de cellules blan-
ches et compter le nombre de lymphocytes au microscope ordlnafre,
Nombre de lymphocytes/ml c!e sang = n (nombre compte) x dllutton ~10~~10~.
CeTto 6t8pf3 canstftue la purJurat?on des lymphocytes du sang.
- Préparation de la Concanavallne A
-MI.-. LII
La cancanavalfns A est extrafte d'une plante la Jackbean et a un poids tw-
l&ulalre de 71.000. Elle se fixe sur le groupe CH0 des prot4fnes et est blo-
qu6e par I"et methyl manos!ds.
La concanavalfne A ost obtenue en poudre lyophll?s& dlluQe 5 1 mg/m! en
solution saitne, flltrAe, sterllls6e et congel& 3 -8CW.
Ill - TEST PFWRD?ENT DIT
-
-
II est effectu& sur une plaque de microtttration. Chaque cercle renferme
un volume flnat de 0.2 ml, On utllisapfusleurs doses de concanavaline A et
.
plusleurs concentrations de lymphocytes.
On procède selon te sch0me suivant :
Concanavallne A : 500 Ug/mt dilue au 1/25 -re~ 2.0 ug/ml
Les dllutlons de concanavalfne .Y et de lymphocytes sont r6altsées dans
fe mf.lleu de culture C~C;. La plaqus est fncub6e à 37*C en atmwpHw humide avec
5 p.100 de CO2 pendant 3 jour-i.
Rljcolte et comptage
Ajouter dans chaque cupule 0.5 ~cl UDR + l12'. Les cellules sont rficolt&x
sur du papl.er tlltre spklal quf retient 1'A.D.N. cellulaire et permet Iy61iml-
naticn de la partte radioactive non fIxBe. Cela est suiv1 d'une multlpllcatton
automatique 8U HARVESTER.
ta rsdtoactlv? té est obtenue en une ml nute au compteur gamma,
-24
'
TEST D~.lSOLEb?ENT DES LYkV'HOCYTES DU SANG
-_"."....A*.. . _ ..-. _-~-.- .--. ~
-w.-w. -
-
-
I -- PRINCIPE
V_I-
Los lymphwyfss soni- 1~018s dans 10 sang par 1e ffçoile hypaque,
La vlialil-6 des lymphxyi-es G@J es-tfmée par le test d'excluslon du bieu
-h-y prl .
- COllulos mortes
: cc~1ork.x e-n bleu
- ml tentes vivantes : incolores et bien nettes,
1 I - TECHNIQUF
---.-_C.
!Jans un tube SI iicon5, mettre 3 ml de ficr‘llu hypaquo + 2 ml dc seng :
verser I&$Fement le sznfl.
Cen~rlfu~sr 30 mn* Prétover le surnageant et le me-l-tra dans un -tubo çilI-
con6 dans lequol on ct.jvk-(3 4 mi de FCS (serum Fo&us de KIT~!, Csntrifugor do
nouveau.
blanches dans la chxmbra au microscope.
Cs test trouve xx7 3yplic3tinn
en io?munitrl cgt!uiatre dans la diff&ron-
ciation des iympfxxytes.
TEST DPAGGLiJTINAT'fON SUR LAME
I - PRINCIPE
-
-
Les trypanosomes vivants sont aoolutlnés par les anticorps s6riques sp6-
cfffques. Ces derniers se fixent sur l~anf~gèno de surface du trypanosome,
Test slmp I e permettant dcappr6cler le dsnré dPagglutlnatton du trypanosome.
II - TECHNIQUE
LPantlgène est constttué par des trypanosomes bru&\\ vtvants purffl&
par la m6thode de Lanham dans du FCS 21 10 p.100,
Déllmftor des cercles sur une lame. Chaque cercle correspond 8 une dflu-
i-Ian do serwn.
I?éposar 10 PR de irypanosomes vivants dans chap~e corclo. Mettre 10 ~a
des dlff6rentes dtiutions skiques. Recouvrir la lame d'une fanelle et fatre
lPexamen au mfcrosccpo.
ST11 n'y a pas dPagglu-tinatlon Incuber la lame 10 mn dans une chambre.
Après I'incuba-klon, lire I'aogiutinatlon quF es? vlsiblu si le serum rsnferm~~
des nntfcorps sp6clfic;ues 2 i"antlg8ne.
. . /
. *,a
TEST CVINCU3ATION ET D'INFECTIVITE 0U SANG (B,l.l,T)
-
-
.WI "' "
I - PRINCIPE
Dlff~tontes formes de Trygancsoma hrucel
peuvont ê+re rencontrtces chez
l'homme, Les trypanosomes sont mis en P&ence du serum humatn dans un grsmtar
temps, !Ians lç? seconti -tt?mps~ Ils sont Inoculés 21 des soul'ls qui sont suivies
r6gull8rement par des frotifs de. sang pour voir la présence ou IYabsence de
parasltes.
S1ll y 8 prkmce de parasltos dans le sang de la sourts on nofe B.1 .t .T
(+) et l'homme peut &tre infect& par 10 paraslto (Trypanosoma brucel rhodeslon-
-
se). S'il nYy 8 pas de parasites dans le sang de la souris, oh a 8.1.1 ,T. I-1
-
et l'homme ne peut 6% infect8 par le paraslte.
11 - TECHNIQLIE
-
On r6allse 3 ossals et 3 t&nolns.
:TQmofn
1 ml PSG pH !IcO + 3.3 ml do trypanosomes dans le sang 107/ml
ESS8 l
: 1 ml serum humain + 0.2 ml de trypanosomes t07/mt dans le sang.
Nous avons manl pu10 las 3 souches sutvantes :
- 1.70% Tryponosoma hrucei brucsl
-.-..*.L" w..-- ..--
- 1.797 >panasoma brucei' rhodosiense
- I I . - - - -
.
433 Trypanosoma vlvax.
--
II...
Incuber les tubes 2 37'C pendant 5 heures.
Rkllser 3 frottis color& sugfemsaaprQs ffxation au methanol sur iOS tu-
bes
essals apres 30 mn 'r. 30 mn .m 180 m - 240 mn d51ncubatton,
A 240 mn d'fncubatlon, réaltser des frottts sur tous les tubes aussf bien
essals que t6mofns.
Observer les lamas 3u microscope pour apprkler Itétat des trypenosomes
S'fls sont lys& ou non.
Le contenu de chaque tube est Inoculd à 4 souris B ralson de 0.2 ml cha-
cune par vole lntrapert tcx$ûle,
Tous las Jours, prise de sane 3 la queue et obscrvatlon au microscope
ardtnafre pour apprécier le de& de parasltBale.
- T, brucel brucel Infecte ta sourts, mats ne peut Infecter iEhomne 5 cause
- -
d?un glycol?Dtde d e pofds moIêcuIa?re lOO.cx)O,
- T . brucei rhodeslense- est c a p a b l e d ’ i n f e c t e r I’home.
Ces deux formes de Tr~m~~~~ma brucel sont sensiblement Identiques, Par
prudence, 1s port de ph-ki en cours de ceite manlpuiation est Indispensable
pour Bvlter les risques dPinfectlon.
. . /. . . .
DOSAGE RADIOIMMUNOLOG~QUE
i - WRQUAGE DE L'ANTIGENE PAR L:IODE 125
w--c -..
.-sd.--
Rincer la colonne avec une so!ut?on fampon phosphate pH 7.4, La remplfr
.
de sephadex G 25 et r!ncor de nouveau avec le tampon. Le tampon est recuetlli
dans un béchei et la parfla inferleure de la colonne fermea.
Mettre dans un ficcon 25 JJ?, de serum aibumfne bovlna (Antfgène) * 10 VR
dliodlne 125 + 25 uR de Chforamlne T o-t attendre 2 mn.
La chloramlne 7 !ndiquo JF? dBbut du marquage.
Ajouter dans le mêrk5 flacon 25 J& de m6tabisutflte de sodfum. Le melange
est vers6 dans la colonne do sephadox G 25.
Le métablsulfate de bla orrôta le msrqu3ga.
25 v& dfan?-i$ne marque sont récoltés dans des tubes à hemolyse et les
fractfons sont compi-fies tcutes les 20 secondes.
F~jouter la solutfon tampon phosphate dans le méiar:zo dPantf$ne marqué
qui est ensuite préciplt& par la TCF\\ à 20 p.100.
Centrifuger le pt%cipitA 9-t r‘r:esurer sa radlaactlvttk au compteur gamma.
Ii - DETERMI NhT I ON D’3 Dl FFEREWES f: ‘AV I DITE ENTRE DEUX SERU% FAR FI$~? ASSAY
-/--e-w-s-..-.-. ..----".m. -I--I.-LI---~
u------
Deux antiscrums sont diiuOs dans du tampon P6S ? 25 p.100 de môme que
t*antlg&ne (s~wn Alhutnlne hovfne nmrqué ?I I'lode 125) : l/lO h- l/lOO - 1/1000
l/lO.OOO : les dilutions sont rfialTsEes dans des tubas à h&nTlyse.
Dans chaqus dflu-tlon d?antiswum, ajouter une dilution d'A9 marque corres-
pondant. incuber <'tO mn 3 la temp6ratura du Laboratoire.
Mesurer ia radfoactivit6 de la If?ison y,~".“';';?" - ?ntlcorps.
Mettre dans chaque tube (NH4!2 SO4 à SO p.100 pour pr6cTpiter le complexe
A:2 - Ac. Cen-trlfu~er le priicipfSE o-t dEterminer la rsdfooctivitk du complexe
anttgbne - anticorps. Ce taux de radioactivit6 est proportionnel aux taux ffx&
p3r lgantiserwn.
Repr&enter le pourcentage du complexe en fonction dvs dlff&wriws dflu-
tlons de l'antiserum.
.*e /
..D
- 29
DYaprGs notre expérience! I'anttserum A svest.r6v61é plus avfde que
I vantlserum B.
Exphrience trh sensibla et recente, ca qul fait qu'elle est bien plc-
cée pour être couramment utllls6e dans lvavenir,
- 30
x
CONCLUS IONS ET REMERC I EMENTS
l
- 31
CONCLllSIONS
.-,"-*.
Les c o u r s suivis $ I'1LRAD n o u s ont permis ciPacqubrlr uno s&le de con-
naissances th&oriques et pratiques :
- Pour la partie theorlque : les principes da base de Iqlmmunologio ont Qté
II --.....-.
Isrgenent pnss6s en revue : iPimmunitB humorale et 1 Yimmunit4 cellulaire.
La hiosynthese des protéines de môme yu2 les rAc.ctIons enzymatiques ont
été 6-tudlk.
- Pour le partle=i-ique
-.
u_.- : de nombreux tests de dfagnostic séro-immunologi-
ques ont été ~&II Is6s :
. pot- d6tectfon fndlrec-te d'anticorps dans le serum ;
* par dkteci-ion directe d'antfccrps s6rlques. ;
I par ag~iutinatlon d'antlgéne par dos ~nticarps sp6clfiques.
Cz plupart de CQS techn iques sont sensibles et nous ont donne de bons
r&sultats dans l'ensemble.
Le ma-t$riel mis 21 notre disposition pour nGS s6ances de i-revaux pratlqws
3 &té de haute qualité.
Dans la Ilmite de nos moyens, nous pourrcns afflnw ces techniques dans
nos dlagwstlcs immunol~qiqucs propres et accompll~r ainsi des,,proc)rEs.
L'fLRAD condllls?nt ces cours do pcrfec-I-lonnomont sur le diagnostic des
meladtes h&wparasit~fres~ apporte un grand concours dans te domaine de la
recherche v'&&-inairc dans .nos pe,ys,
.
.
.
:
REMERCIEMENTS
- A Monsieur le Dr A. GRAY : Directeur &&raJ de I'lLfWD pour Iqaccueil cha-,
ioureux qui!1 nous a réserv4 3 noire arrlvee &~Natbobt;~Profonde admiration
et hommage respectueux.
a accord6 I’admlssion à CBS cours avec toute sa sympathie. Nous lu 1. adres-
:.
sons l'expression de notre slwère gratltudo.
.
‘ :
- A Monslour le Dr Jack DOYLE : Chef du Servlce de Parasltoisgle, responsab,le
;:
de I~encadrement de cas~cours~~ te parfdlt d6roulomcnt'des cours..t&moigne de
:
:
tant dvefforts consentfs pour nous. Nous 11.11 adressons nos plus vlfs remer~+
ciements.
,i, .,.~ * .,N
- Ces remerciements s'adressent'~E)a'lement-au corps professorql~ de, I'ILRAD
qui nous a fourni"des &nnaissances de base en m&ibre dPimmunotogle +-
de bfochtmie .ds,par Isaxcolloi~tO~~quallté de I'enseigneinent.
..:
e.*
e- .A Xzsilames RAVI et NASEEM :dynamlques tochnlclennos du servlce de Parasltoio-
--"
-.-
prolo du Dr DOYLE qui n'ont J&ai'S'cessé de nous apporter 'le concours n6cessal.'
r-e au bon dérouiement do nos travaux pratiques. Nous teur qdressons notre
profonde gratf.tude et nos meilleurs souvenfrs.'
.",?F'
I
. .
> :'
MINISTERE DE LA RECHERCHE
SCIENTIFIQUE ET TECHNIQUE
LABORATOIRE NATIONAL DE L’ELEVAGE
ET DE RECHERCHES VETERINAIRES
?’ *
f
R A P P O R T S U R U N S T A G E Ov 1 MMUNOLOGiE
P A R A S I T A I R E O R G A N I S E P A R L’ILRAD D E N A I R O B I
O U 4 O C T O B R E A U 1 2 NOVEMSRE 1 9 8 2
’
P a r M b a y e MfXNGUE
R E F . No 53iPARASITO.
J U I L L E T 1 9 8 3 .
RAPPORT SU'? UN STAGE D'IMMUNOLOGIE
PARASITAIRE ORGANfSE PAR L'ILRAD DE NAIROBI
DU 4 OCTOBRE AU 12 NOVEMBRE 1982
PRESENTATION BE L'ILRAD
Le tabcratoire InternatIonal pour la Recherche sur les Maladies animales
(tIR.AD) est si-l-u6 sur 70 hectares, 9 proxinite de NaI'robi, au Kenya. II fut
établi en 1973 au terme d9un accord avec le Gouvernement kenyan,
L'ILRAD est supporté par le Groupe consultatlf pour la Recherche agricole
internationale (C.G.I.A.R.1 qui est une assoclatton de fondatlons Priv&es, de
gouvernements nationaux et d'organismes nationaux et Internationaux.
Le C.G.I.A.R. est à son tour garanti par I'Organisatfon des Notions Untes
pour IsAlimentatlon et l'Agriculture (FAO), la Banque mondiale (Li.B.1 et le
Programme des Xations Unles pour le Développementr'
L'objectif du C.G. I.A.R. est d'omgl iorer la production agricole et animale
dans les pays tropicaux et subtropicaux,
Deux maladies, de vaste répartition geographlque et dont tes effets écono-
rnll$L'es s'avèrent graves sur le bbtail, furent choisies par le programme de
rrzherche de IPILPAO : il s'agit de la Trypanosomiase et de l'East Coast Fever
( .C,F. = flévre de la &-te de l'Est-1 qui est une forme d,e Thell&iose.
. . . / . . .
TABLE DES MATIERES
Pages
2
r,
I - INTRODUCTtCN
,*..*.....* O,......Y D c 0 0 5 1 i....‘..........,....G.C....,,
I I -. PARTIE THEORIQUE
. .."...~..,.....YI...~~.~~.,.*.,.,..~....~..~...,..
- GBnéralites sur I"immunologie
.r.o 00 SI) i...,.,...,,.,.....~~ aoa *..a
- Les Immunoglobulines
~...".~.I.....O~C.....~~~...*...,...~.~....~*
- La r8ponse immunitalre .*.*.*.,*00*. ..r..~........,,..,.,o~~.~,**..
- Le complément ,.~.,....~..~,.C~.~L~..~...~~~~.,....~~...~...,,.~~.
III - PARTIE PRATIQUE ..*....*...*..*0.~‘"~.~~...........*....,..,.~..‘...
10
Purification des proi-elnes ,.LC.O~~..,...........,..........~~.~..
11
Immunofluorescence indirecte (I.F.I.1 . . . . . ..o..*~..*..O~..e...o..
14
P
Test immunospecifique par couplage enzymatique (E.L.I.S.A.)..,....
17
Immunodiffusion et tmmunoélectrophorèse
.*.~*.~*O.....I*~1..~..~.~
19-21
Transformation lymphoblastiquo par la concanavaline A . ..e....**..
22
Test d'isolement des lymphocytes du sang . . . . . . . . . . . . . ..e.0*.0.***
24
Test d7aggluttnation sur lame ".~~f..~..~.~.....,.,,,.,~~.~..~~.~.
25
Test d'incubation et d'infectivité du sang (B.I.f.T.).......,..,..
26
Dosage radioimmunologique .*. Y...%- 0 P Q..a......e...,....o es..,,..,..
28
IV - CONCLUSIONS ET REMERCIEMENTS . .."~O..~C~......,.,..~~..,.~~.,~~"*~,.
30
- Conclusions ......................................................
31
- Remerciements
32
....................................................
b
Lîuire r!es tzches fondamentales de l'Institut sgnégalais de
Recherches
pyricoles (I.S.R.A.1 est la formation et lvamC51ic~ratTon
constante du niveau des chercheurs et dos techniciens,
4insi sur
l'initiative de son Directeur de dépariement de
recherches zootechniques et vGtC!rinaires, j'ai assista à un stage
organisé
par ilILRAO (le Laboratoire international pour la
Recherci;e SUC
les Malsdles animales) de NsTrobi 2u Kenya.
Le programme du stane a c,3rnp3t-l-6 :
- une partie théorique portant sur :
- g6n67sfit8s sur l'immun~olo~ie
- IGS i~m~noglobutines
- Ia reaction immunitaire
- 16 compldt7ent
- des travaux pratiques portant avec les mbthodes immunologiques
appliquaes dans
le diagnostic des maladies hémoparasitaires.
- 4
GENERALITES SUR L'IMMUNOLOGIE
;
<.
II existe plusieurs types d'ïmmuni-6 :
Irfmmunité dite naturelle : peut être inn6e ou constitutive.. Elle traduit
l'état de résistance naturelle vis-à-vis dvun agent pathogéne quvune espèce
anlmale doit à sa propre constitution.
Cette immunit& met en oeuvre :
- les cellules phagocytait-es
- tes facteurs humoraux non spkifiques (le complément, le système
properdfne)
*
.', "
I 1 immunité acqu,ise : peut être
.-.
- soit active à ta suite d’une infection ou d’yne, ImmunSsation
- soit passive SI el I e est conférée 5 un organisme sans que, ce, dernier
ne participe à Iv lnsta I lation de cette immunité,
.: . .
Les reactions antigène- anticorps sont reverslbles et-sont caractérlsées
. .
par des interaction? moléculaires non covalentes. ,.
.'
' ::
.
Lors de Ia rgponse primaIre,
les anticorps produits sont g6néralement de
nature IgI.1, Au cours de.cette réponser
Ivaffinitf3~ des,antiçorps est fai ble
mais I'avidi-6 est eievé+.
En roponse secondaire,
I 'affl ni té des antl cet-ps prend’ le pas sur I 9aviditB
cette réponse est le plus souvent de nature IgG.
Deux antigsnes ayant quelques déterminants antigénîques 'Identiques peuvent
donner des réactions crokées.
.*.
/ l *.
, . \\< . . .
LES I MMUNOGLOBUL
I NES
Les immunoglobulines ont une structure peFtidique formée de deux chatnes
lourdes et de deux chatnes I égères i dentiques .rel.i ées .entre...e 1. les.par.. .des ponts
dfssul fut-es.
L’hydrolyse de la mol6cule d’lmmunoglobuline par ,la papal’ne donne deux
,.<
. .
’
fragments f dent\\ iues (Fab 1 capab les de se l ier 5; #un %nti @ne iiiciri6vk1 ent et’ un
.s
.:
troisième fra9ment F c ( f r a g m e n t c r i s t a l Ilsable.) qui’ n e peut ,pas s e l i e r à
l’antigène. Ça dernier fragment Fc assure des fonctions btologiquss secondaires
(récepteur des cellules phagocytaires, fixation du’complément).
L’analyse des protéines de myclome a cfsntrjl que ies &gions ami no-acide
terminal des chaines iaurdes et des charries légèies’sont .variablcs.
Chez I vhomme, on trouve ci nq types de chafnes lourdes correspondant à
cinq c l a s s e s d’inwnunoglobulines q u i s o n t lglgG, lY19A, Iv:19M, I*,!g@ e t I’lgE.
.
Dans le s6rum normal, il existe au moins lO* molécules dvimmuno910bulInes
de spbcificit6 différente,
!
,“, .<
i&ggG
la mleux connue.de tous les lgj représente 86‘ p.lr)o des 19 du sérum
,,
‘_. humain ;
I’lgA : est surtout prhsente, dans les substances extravasculai res ;
l,‘lgM.: e s t i n t r a e t extravascufalre.
El I e est secrétée t&t dans la réponse
immunitaire, F cause de son de9re Olev8 de valence, el le est un trés
grand agglutinant bacterien et un mÉdiateut-, du facteur cytolythique
du camp l ément. L’I9M est le premier.8lémen-t de défense immunitaire,
humorale spécifique ; .
:
I’lgD : se rencontre $ la surface des lymphocytes B en cours de différenciation,
‘3.
..<,
où e’l le joue probablement le rôle dvanti9ène,récepteur ;
*
:I’l9E
se retrouve gén6ralement St la surface des mastocytes. Le contact d’un
al lergane avec I ’ l9E fixée 2 la surface des mastocytes entraine la$&
: 4
degranulation de celul-cl dont le r&sultat est la liberation de substan-
Ces vasoactives comme I’histamine. L’lgE intervient dans les phénomks
anaphylactiques liés aux Infections parasitai t-es,
Les i mmunog lobul 1 nes portent des marqueurs génét ,iques :
I . . . .
. . ./ . . .
-6
l e s allotypes $ sent l’expresslon 42 gànea all+les, O n l e s t r o u v e à l a fo 1s
sur 1 a partf e consfand-e ‘ei sur ‘I a parile UaFt ab ie des I Q*
l e s Idtotypes : sont sf 4~6s sur la r6gfon Var-table des Ig sotf b I r IntBrleur-
soft 9 proxlmfti! du site actif,
l’ldlotypte est h8r6ditnlce tmlr n’abel+ pas BU~ lolt de la
~hétfqU3 Sfmfde do #ENCECI
lymphacy-tes !3 sont tmpltqoés dans ta formation de; anticorps et sont responw-
bics de IPimmun~t6 humorale,
L’lmmudtb ceiiulafre qut est l a prlnçtpale s o u r c e d e dWewe cofltfe les
o~ga+alstws intracel lutatres, dépend d e s Inteactlons d e I’antl&e V!S-à-V~S
de@ r$ceptWs sficfflques pF&GJd’S à ia swf8ce d e s Iyinpbcytes T .
les lymphocytes T et B pocteht Ues marqueurs de surface S
- l e s Lyf@wcyt~~ T 3 an*t g&e 0, r6ceptews y e t V, nntt gZww3 L:I
- 10s t)‘rriphocyte 8 : 19 de sut-facta, tw-tw CSb du atJf@émed.
f l axfsta pluslews sous-populations de lymphocytes f parmi iesquelles :
- ieS 7 helper (Th) : 1 ntervfennent dans la production des anti coprs et la
g6nératfon des cd luies cytotoxlques
- 1 es T suppresseur (Ts) : leur action est de supprimer ioute rQponse Immun?-
tatre qu’elle soit humorale ou cellulaire
- les T cytotoxlques (T,) : ont pour r6le essentfel ta destruction des cellules
portant des antl @ries de surface d! ff6rentes de celles
d e I’hbte,
,Les tel I ul es productrfces d’antlcoFp5 peuvent &t-re m!ses en évidence par
I1lmmunofluorescence o u l a .teehnlque d e s piages dv lyse.
DPns la myclome, l e prot$tne monoclonaie
donne une seufe bande en
61 ectrophorese sur papier ou un seul Et-c de gr&A pf tatlon en i mrnuno-
0 I ectrophor&se . L’actf vit6 des lymphocytes peut &tre augnrent& par I ladminf stra-
tlon d’un adjuvant.
Les g8nes de ta r6ponse immunltalre sont an rapport avec les gènes du
complexe d9hiL;tac~&l 11-t-6,.
Les lymphocytes T peuvent non seulement augmenter 13 r+3onso i mfnunl tai re
par le tiats de le coop&atlon (Th): mals dans d’autres cas, peuveni exercer une
fonction suppressi ve (1s).
La toi érance lmnuno logique peut Eitre 1 ndut te avec des antigk?s solubtes :
. . . / l . *
,exemp le+ : des lapins ayant reçu a la naissance du sérum albumine bnvlne, ne pro-
duts8nt pas d anticorps lors d’une stimulation ultérieure avec cette protelne.
Cette i-0 érance peut aussi être Induite par I ‘exposltlon 3 l’antig&ne au
stade néonsta
et à I ‘état adulte,
exemple : I?i jsctlon de tel I ules de la moel le osseuse de souris CEIA à des sou-
ris nouveaux-n& de la !!gn&A, supprime leur capacité à re&?ter une greffe CBA
au cours de la vie adulte.
Les 1 ymphocytes T ont un d6gr9 de toIOrance p I us Bleti que 1~s lymphocytes
f3 comme Iv1 I lustre le tableau sutvent :
I
OOS6
5 tO~6FUtlC8
Indu1 t e
to I érogène
B n rnc
Lymphocyte T Lymphocyte B Rate du donneur
0, ’
96
9
6 2
03
9 9
56
9 7
2,5
9 9
70
9 9
Effet- de la dose dvantlgène sur IPinductlon de la tolérance au nlveau des
tymphoc/tes T et des lymphocytes B.
Les faibles doses dtantigbne rendent tolkanis les lymphocytes T alors
que I es 1 ymphocytes 8 ne devf ennent toi érants que pour des doses 6 IevGes
d’antlgene.
Lfactlvfté des lymphocytes T dicte dans une larçe mesure la r6ponse de la
rate entière, RQférence (CHiLLER J.M., HABICHT G.S. et WEIGLE W.O., Science,
1971, 171, 813).
LE COMPLEMENT
La r3act!c>n do t'anflgène' ~ortlculairo avec un anflcorps peut condutre à
une agglutination, une élev&f-ion de la phagocytose, une cytotoxlctte lorsque
1 'anti&c cst~constltué par des cellules, .
Le cornpI&wwt recouvre une caseode de réacttons enrymattquas dans !aquelie
le premier composant de l@açtfvatfan scinde un pettt peptlde en piusteufs mol61
cules du second composant dont chacun devient u~~enzyme acttve capable d'agfr
sur te troisiene composant.
Le comp!Qmont peut $tre actlv$ par deux voles :
- la vole classique
- ta VOIS alterne.
l.k plus Important composant le CJ est scindé par une converfase (vole
alterne).
Le produit de la scfssion C3a est chtmlotactlque pour les leucocytes
palynucl&3ires.
II augmente la pern&abllit~ vasculaire av3c l'histamine Ilhér6e
par loç,p~as~~yfos et les basaphilos.
Le second produit de la scission C,p actfve le Cs en CE.~ (ayant les pro-
'.
pristés simî laires au Cg'a), et conduit Csb & la s6quence des f?CteUrs $3 et Cg
entratnant la fyse de la cellule.
A travers fr,Üs ces effets, le compl6msnt joua un rble Important dans Ir
défense de lVorganlsme contre l'lnfectlon,
In vive, Il, Intervient dans les maladies auto-immunitaires kjanérulonéphrlte2
Le compt&ent est utfllsé fn vitro dans les s6rodiagnostics de msladies
parasitaires,
baci+rfennes, etc...
I PART I E PRpaT i QUE I
PURtFICATlON DES PROTEINES
DIff6renteslechniques
ont été utIlisées pour la purification des protéines, Ii
svagit de la chroma-tographie df6change d'ions, la chromatographle dsafflnlt6, la
flftratlon sur gel et la technique de IPélectrofocusîng.
Nous avlans manfpuI6 dans notre groupe 4 de travaux pratiques : chromatogra-
phle d'khange d'ions ot chromatographie d'afffnité.
l - CHROMATOGRAPHIE PAR ECHANGE D910NS
PrlncIpe :
Techn?que très senslbie permettant de séparer et même d'isoler les protefnes.
La ¶tfon est obtenue par le faft que certafnes substances (prot6ines) ont des
afflnlt6s dlfferentes du ma-tri% échangeur d'ions, qui sont dues aux dlffërences
de leur charge.
On procédera à la séparation des protbines sériquss et b IYisolement de
I'lgG B travers ta colonne de OE52. Les dlff6rences d'affinIt6 sont étroitement
Il&s au pH et 3 la force &nique des éléments en comp<ion,
Technfque :
Un volume détermin6 de s&um est aJouté lentement b un volume égal de solu-
tlon saturée de (NH4)2SOq.En agltant bien le sérum, on obttent 50 p.100 de concen-
tration ftnale de sérum saturé en (NH412SC4 ; le précfpit6 de prot6lnes obtenu est
centrifugé à frotd c1 3000 tours/mn x iO mn et Iav6 avec une solutton de (N!-14)2S04
3 40 p.100 de saturation., On centrifuge de nouveau : le préclpft6 est dlsscttt dans
du tampon PBS O.'l M pH 7,2 avec un volume Egal au vo fume Intttaf de s&um.
On ajoute le sulfate de(NH4)2S04 satur6 avec un volume Egal à la moi-i-l& du vo-
lume inttfa,l du sérum : la concentrai-ton finale des prot6lnes en (NH4)2SO4 satur8a
est de 33 p.100. Le pr&lpli-é est centrlfug6 et lavé avec une solution de (NH4)2SO4
B 40 p.100 de saturation et recentrifugé. Les proteines s6rlques obtenues sont mi-
ses en suspension dans du PRS 0.1 M pH 7,2 avec un volume dgal 3 la moltl~ du volu-
me Inlttal de sérum.
On mesure la densite optique (DO) des proteines B 280 nm et on calcule la quan-
ttté des prot6Ines selon la formule :
mg de protefnes
10
=T x DC x dilution x volume
(dilution effec-
(volume de prot6lnes* 1/2
tu60 au moment
volume Infttat de s&um).
de lire la DO)
.a. / . . .
.’
:, ~~Pr~i,neipa::,,
.!
I ::
.,,
.
.::. ,;
.,
* .
Tcxhntque
Me-t-l-t-~ fa prototne A sépharose dans la tolwme. Aj~u+er la solutfm citact&
' acétique O,t M pH 2,6, et vérlf!e?!?e pH dans la ctslonf~e de rw e&t Je
&me 2,6,
Proc&cr de la même façon avec une s9lu+lcm & BlaaW& (J,lM p#9,6 oosr*enern+
NaN3ka colonb de s6pharose est al~ns’t &qui Iib&b
Les frac-t-Ions protélniques sont 03t8cl48s daM; des ,fubar à b44wIy19 su,
fractl onnateur LKE
Qn procède avec deux soiuflsns +amp~rn da Na HzP6r, 8,# lai pH 5,9
P(aHp34 t3,l MpH5,O
‘
On obtient deux pics correspsndan~ ew frae~9wtr FgGt et Lgt$ du &%JM b
chilvre. La densitc cystique de chaque.pic est d&emrttie afin de Ca#culet les
taux de prot0fnes s&fqu& fractlonn&3s,
- 14
t - MARQUAGE DE C’lqG PAR LiISQTli!OCYANATE DE FLUORESWNE
_-1----.,
-.I----
-s.
Dans une membrane h dialyse, metire 1 ml de prot6lnss s6rlque a travers
la colonne de DE 52 (igG pure) + 1 mg d’lsothtocyanato de fluorsscelno.
Placer la mcmbrana dans un bkhw renfermant 10 ml cis tampon carborratçi
b I carbonate pH 9,5*
Dialyser les prot45 1 ries dans I’Isothlocyanate pendant 18 heures,
Purtfler les protbfnes Conjugu&es à la fluoresceinc à travers une colonne
ds DE5p
Des solutfons à. doses crolssantos de NaCi dans du tampon PC4 g,Ot M pH
7,s sont ~Joui-éer dgns la colonne.
Qn obi-lent diff6rsnts pics correspondant aux timpons NaCI. La denslfh op-
tique est lue à 280 et 495 nm pour chaque pic afin de détermtner la quanti%
de protéines conJugutSe par la formule sutvante
!DO 280 x dl lutton)
-_1-
- - - - C’ 0 35 (00
.-.-..L--
495 x dllutlonf
x vo,ume
1.4
La solutton dvlgG conjuguk 3 la fiuorescelne est concentrée au ftftre
amicon ou dans 1 e po l yéthy I èiw~ 1 yco 1 I’e .
L e conjuqué IqG 3 la fluorescelne e s t ainsi pr&t p o u r l e test d’lmmunofluo-
rente indirecte.
il - I FA~~r\\lOFLLlORESCENCE I ND l RECTE
-
-
-
-
-
- --e--w
Pi-i ncb” :
-.-
Détecfion lndlrecte des anticorps s&iques par un substrat chromogène qui
se flxc sur le complsxe ;!g - Ac Qvontuel form6, L’lsothtocyanate de fluoresceino
a été conjugué & une IgG obtenue apres purIf!cation
par chromatographle d’Cchan-
ge d’ions.
Le rkultat est obtenu par I’appt-&tatlon du degré de posttfvlte allant
d e + à ++++..
Prodd6 2 ;
------em
CMwnment utllls&e dam notre labwa4wlt-a; ta dlftharrcr, auee le pmmM4
1 est que lqBn travaIlle sur des tt-ypanownw tti,
^
BrocBdé 3 :
1c-...---l-l
On dispose de Schtzahfe de Thellerla parva
C_L
djkkange d'ions et de Thell,erla mUtah sur fro~tfs de sang.
-
-
-
ta souche de T. parva es+ dllwk au 1110 dons du sorum albumIn@ hutaslno
à 2 mg/mJ, Le ftwttls de sang de Teo mutans esi plong4 dans du *ampon PS pH 1,2
pendant 5 mn pour permettre la ch%emogfc&fn!satfon : Ialrsw &her et d811ml-
ter deux rar@.es de 5 cercles sur le lame b t'atda du wrnls à mgle.
Pour -paruo
: O h U+!tiSe t’!il ii3fW pf”#ite, dei!IRff&+ daW kjtKlb On fWt
25 \\II, de T.parva dans chaque cercte et on lalsss sécher.
-
-
T. mutans : a d4ja 8th fixé sur le frottis de sang.
Dans chaque cercle, dQoser 25 ~1 de dtlutlon de serum b tester. Les deux
lames son-i- lncub&s en chambre fetWk b la femp~ratut-e du Labora+olre pendant i
30 mn.
Jeter 1'0~~85 d'enflcorps et tsver dms du tampon PBS pH 72
2 x 15 mn.
AJouter 10 p-1L de cenJugu6 dllu4 au 1/18c'R) tilangé, b 1000 VI, de serum Albu-
mine humaln et 10 # de bieu evans dltub au 1/10.#U,
incuber 30 mn et laver 2 x 15 mn comme pr4cédemmen-t.
La!sser skher et fafre le montage dans une solution do glycerol P 50 p.lU@
a pki 0.0. Examiner les lames au mlcroscopo b f#u@rascence.
Les Thef Ierfa parva
MI-
: apparatssent très fluorescents dans fes lymphocytes on cas
de r8aciIan poslttve.
Les Thellerla mutans : devlennont fluorescents en cc7s de posltlvtt8,
Technfque trés sensible donnant de bons rbsu!tats,
L'Tnik@ du bleu evans est de supprimer tout ce qui nFest pas spklflque
à la fluorescence,
III .- TEST PR'ZPRENENT fI1T
.--
Les serums 3 tester sont dllt.Gs owc to mhlange sutvan+ t ~55 pH 7.2 +
0.5 p.100 iwe~n 20 dllutlons du 1/100 au lj31.250.
,
200 UL de dllutlon seriqus sont aJout&s dans ehsquo cupule. On fnccube
2 heures 4 la -température du Iabora-tof r-e et on lave 4 x 5 mn.
.
AJouter 290 I!!?, de paranf-trophenyt phosphate 1 mc,/ml dans du tampan carbotw
te 0.05 v P!i 3.6. Incuber à 37°C pendant 30 mn et arrêtor !a réactton par ad-
dition de 50 $?, de NaoH 3 1;1. iire la densltE! optique d 405 nM.
Nous qvtons obtenu de bons résultats dans Icensemble. Cependant, on peut
noter que ces dernfers sont susceptibles de varier d'un iaboratolre à un wtt-e
sous IPcffet de certains param&tres parmf lesquels ii ast n0cessalre de mentton-
t-ter la twpkature. A I'ILRAD, les rsactlons se sont d&wl&es à leoC alors
qu'elles devraient nornaalwhwt avoir tieu à 37'C.
Des w-t-ours pcuwnl- cgalgrnnnt provsnlr du fabrlquant de la plaque. Le
chronom6traye des lawqes doit se faire exactement sinon II peut aussi in-
duire des erreurs,
a,* / . . .
pour 8bs~t-b~k 1'euu dtstlIl4k9. Un fiacsn est
1/2 h~ufe~En\\eve~ le flacon, le k~eenex et
- 20
La lam est placéo dans la botte de coloration pendant 2 heures. On lave
6ion prc&de a la d6coloration par le décolorant suivant :
Le pressing et la coloration nous ont permis d'awlr des rhactlnns fdcl-
lement fnterpr6tables.
03.
/ . . .
TRANSFORMATI
IQUE PAR LA CONCANAVALINE A
I - *pRl clc 1 BE
La cixxteanaw3ttne A provoque te multlpltcatlon dos lymphocyias T du sang.
Sous l'action de Ia'mncartsvaline A, les lymphocytes subtssent des dfv1slonti
cellulelres oun3+ase, La transformaiton est mesur4e per I~lnçorpcwa+lon
d'um 1'2'5 ,
II -tE6HNlQUE
CI-
c Le sang obtenu par ponctlan wlnouse dans l'h6parlne est d!luB au 1/2 dans
une solu*lon saîtne st6rllo.
Dans un tube à centrlfugw confqoe, metfre : 5 ml de flcoile hypaque +
6 mi de sang h4parlnG dfiut5 BU 1/2, La!sser &zouter doucement le sang de ma-
nlere à ne pas m6fsngor le sang 8u ficotte. Centrtfuger 1.500 fout-s/tw pen-
dantlomn.
Prblever les cellules blanches à i'tnterphnse et les mettre dans un au-
tre tube dans lequel on ajoute du tampan Alsever pH 6,1 pour laver (bfen mé-
langer Aisever 4 Cellules blanches), Centrffuger 3 x 10 mn pour bien laver
les cellules blanches. Ajouter au culot 1 ml de milleu de culture L15 apr&s
la dernfere centrlfugatfon et bien m4Ianger.
Mettre dans untuke 0.9 ml de Bleu de ToluBno * O,l ml de cellules blan-
ches et compter le nombre de lymphocytes au microscope ordlnafre,
Nombre de lymphocytes/ml c!e sang = n (nombre compte) x dllutton ~10~~10~.
CeTto 6t8pf3 canstftue la purJurat?on des lymphocytes du sang.
- Préparation de la Concanavallne A
-MI.-. LII
La cancanavalfns A est extrafte d'une plante la Jackbean et a un poids tw-
l&ulalre de 71.000. Elle se fixe sur le groupe CH0 des prot4fnes et est blo-
qu6e par I"et methyl manos!ds.
La concanavalfne A ost obtenue en poudre lyophll?s& dlluQe 5 1 mg/m! en
solution saitne, flltrAe, sterllls6e et congel& 3 -8CW.
Ill - TEST PFWRD?ENT DIT
-
-
II est effectu& sur une plaque de microtttration. Chaque cercle renferme
un volume flnat de 0.2 ml, On utllisapfusleurs doses de concanavaline A et
.
plusleurs concentrations de lymphocytes.
On procède selon te sch0me suivant :
Concanavallne A : 500 Ug/mt dilue au 1/25 -re~ 2.0 ug/ml
Les dllutlons de concanavalfne .Y et de lymphocytes sont r6altsées dans
fe mf.lleu de culture C~C;. La plaqus est fncub6e à 37*C en atmwpHw humide avec
5 p.100 de CO2 pendant 3 jour-i.
Rljcolte et comptage
Ajouter dans chaque cupule 0.5 ~cl UDR + l12'. Les cellules sont rficolt&x
sur du papl.er tlltre spklal quf retient 1'A.D.N. cellulaire et permet Iy61iml-
naticn de la partte radioactive non fIxBe. Cela est suiv1 d'une multlpllcatton
automatique 8U HARVESTER.
ta rsdtoactlv? té est obtenue en une ml nute au compteur gamma,
-24
'
TEST D~.lSOLEb?ENT DES LYkV'HOCYTES DU SANG
-_"."....A*.. . _ ..-. _-~-.- .--. ~
-w.-w. -
-
-
I -- PRINCIPE
V_I-
Los lymphwyfss soni- 1~018s dans 10 sang par 1e ffçoile hypaque,
La vlialil-6 des lymphxyi-es G@J es-tfmée par le test d'excluslon du bieu
-h-y prl .
- COllulos mortes
: cc~1ork.x e-n bleu
- ml tentes vivantes : incolores et bien nettes,
1 I - TECHNIQUF
---.-_C.
!Jans un tube SI iicon5, mettre 3 ml de ficr‘llu hypaquo + 2 ml dc seng :
verser I&$Fement le sznfl.
Cen~rlfu~sr 30 mn* Prétover le surnageant et le me-l-tra dans un -tubo çilI-
con6 dans lequol on ct.jvk-(3 4 mi de FCS (serum Fo&us de KIT~!, Csntrifugor do
nouveau.
blanches dans la chxmbra au microscope.
Cs test trouve xx7 3yplic3tinn
en io?munitrl cgt!uiatre dans la diff&ron-
ciation des iympfxxytes.
TEST DPAGGLiJTINAT'fON SUR LAME
I - PRINCIPE
-
-
Les trypanosomes vivants sont aoolutlnés par les anticorps s6riques sp6-
cfffques. Ces derniers se fixent sur l~anf~gèno de surface du trypanosome,
Test slmp I e permettant dcappr6cler le dsnré dPagglutlnatton du trypanosome.
II - TECHNIQUE
LPantlgène est constttué par des trypanosomes bru&\\ vtvants purffl&
par la m6thode de Lanham dans du FCS 21 10 p.100,
Déllmftor des cercles sur une lame. Chaque cercle correspond 8 une dflu-
i-Ian do serwn.
I?éposar 10 PR de irypanosomes vivants dans chap~e corclo. Mettre 10 ~a
des dlff6rentes dtiutions skiques. Recouvrir la lame d'une fanelle et fatre
lPexamen au mfcrosccpo.
ST11 n'y a pas dPagglu-tinatlon Incuber la lame 10 mn dans une chambre.
Après I'incuba-klon, lire I'aogiutinatlon quF es? vlsiblu si le serum rsnferm~~
des nntfcorps sp6clfic;ues 2 i"antlg8ne.
. . /
. *,a
TEST CVINCU3ATION ET D'INFECTIVITE 0U SANG (B,l.l,T)
-
-
.WI "' "
I - PRINCIPE
Dlff~tontes formes de Trygancsoma hrucel
peuvont ê+re rencontrtces chez
l'homme, Les trypanosomes sont mis en P&ence du serum humatn dans un grsmtar
temps, !Ians lç? seconti -tt?mps~ Ils sont Inoculés 21 des soul'ls qui sont suivies
r6gull8rement par des frotifs de. sang pour voir la présence ou IYabsence de
parasltes.
S1ll y 8 prkmce de parasltos dans le sang de la sourts on nofe B.1 .t .T
(+) et l'homme peut &tre infect& par 10 paraslto (Trypanosoma brucel rhodeslon-
-
se). S'il nYy 8 pas de parasites dans le sang de la souris, oh a 8.1.1 ,T. I-1
-
et l'homme ne peut 6% infect8 par le paraslte.
11 - TECHNIQLIE
-
On r6allse 3 ossals et 3 t&nolns.
:TQmofn
1 ml PSG pH !IcO + 3.3 ml do trypanosomes dans le sang 107/ml
ESS8 l
: 1 ml serum humain + 0.2 ml de trypanosomes t07/mt dans le sang.
Nous avons manl pu10 las 3 souches sutvantes :
- 1.70% Tryponosoma hrucei brucsl
-.-..*.L" w..-- ..--
- 1.797 >panasoma brucei' rhodosiense
- I I . - - - -
.
433 Trypanosoma vlvax.
--
II...
Incuber les tubes 2 37'C pendant 5 heures.
Rkllser 3 frottis color& sugfemsaaprQs ffxation au methanol sur iOS tu-
bes
essals apres 30 mn 'r. 30 mn .m 180 m - 240 mn d51ncubatton,
A 240 mn d'fncubatlon, réaltser des frottts sur tous les tubes aussf bien
essals que t6mofns.
Observer les lamas 3u microscope pour apprkler Itétat des trypenosomes
S'fls sont lys& ou non.
Le contenu de chaque tube est Inoculd à 4 souris B ralson de 0.2 ml cha-
cune par vole lntrapert tcx$ûle,
Tous las Jours, prise de sane 3 la queue et obscrvatlon au microscope
ardtnafre pour apprécier le de& de parasltBale.
- T, brucel brucel Infecte ta sourts, mats ne peut Infecter iEhomne 5 cause
- -
d?un glycol?Dtde d e pofds moIêcuIa?re lOO.cx)O,
- T . brucei rhodeslense- est c a p a b l e d ’ i n f e c t e r I’home.
Ces deux formes de Tr~m~~~~ma brucel sont sensiblement Identiques, Par
prudence, 1s port de ph-ki en cours de ceite manlpuiation est Indispensable
pour Bvlter les risques dPinfectlon.
. . /. . . .
DOSAGE RADIOIMMUNOLOG~QUE
i - WRQUAGE DE L'ANTIGENE PAR L:IODE 125
w--c -..
.-sd.--
Rincer la colonne avec une so!ut?on fampon phosphate pH 7.4, La remplfr
.
de sephadex G 25 et r!ncor de nouveau avec le tampon. Le tampon est recuetlli
dans un béchei et la parfla inferleure de la colonne fermea.
Mettre dans un ficcon 25 JJ?, de serum aibumfne bovlna (Antfgène) * 10 VR
dliodlne 125 + 25 uR de Chforamlne T o-t attendre 2 mn.
La chloramlne 7 !ndiquo JF? dBbut du marquage.
Ajouter dans le mêrk5 flacon 25 J& de m6tabisutflte de sodfum. Le melange
est vers6 dans la colonne do sephadox G 25.
Le métablsulfate de bla orrôta le msrqu3ga.
25 v& dfan?-i$ne marque sont récoltés dans des tubes à hemolyse et les
fractfons sont compi-fies tcutes les 20 secondes.
F~jouter la solutfon tampon phosphate dans le méiar:zo dPantf$ne marqué
qui est ensuite préciplt& par la TCF\\ à 20 p.100.
Centrifuger le pt%cipitA 9-t r‘r:esurer sa radlaactlvttk au compteur gamma.
Ii - DETERMI NhT I ON D’3 Dl FFEREWES f: ‘AV I DITE ENTRE DEUX SERU% FAR FI$~? ASSAY
-/--e-w-s-..-.-. ..----".m. -I--I.-LI---~
u------
Deux antiscrums sont diiuOs dans du tampon P6S ? 25 p.100 de môme que
t*antlg&ne (s~wn Alhutnlne hovfne nmrqué ?I I'lode 125) : l/lO h- l/lOO - 1/1000
l/lO.OOO : les dilutions sont rfialTsEes dans des tubas à h&nTlyse.
Dans chaqus dflu-tlon d?antiswum, ajouter une dilution d'A9 marque corres-
pondant. incuber <'tO mn 3 la temp6ratura du Laboratoire.
Mesurer ia radfoactivit6 de la If?ison y,~".“';';?" - ?ntlcorps.
Mettre dans chaque tube (NH4!2 SO4 à SO p.100 pour pr6cTpiter le complexe
A:2 - Ac. Cen-trlfu~er le priicipfSE o-t dEterminer la rsdfooctivitk du complexe
anttgbne - anticorps. Ce taux de radioactivit6 est proportionnel aux taux ffx&
p3r lgantiserwn.
Repr&enter le pourcentage du complexe en fonction dvs dlff&wriws dflu-
tlons de l'antiserum.
.*e /
..D
- 29
DYaprGs notre expérience! I'anttserum A svest.r6v61é plus avfde que
I vantlserum B.
Exphrience trh sensibla et recente, ca qul fait qu'elle est bien plc-
cée pour être couramment utllls6e dans lvavenir,
- 30
x
CONCLUS IONS ET REMERC I EMENTS
l
- 31
CONCLllSIONS
.-,"-*.
Les c o u r s suivis $ I'1LRAD n o u s ont permis ciPacqubrlr uno s&le de con-
naissances th&oriques et pratiques :
- Pour la partie theorlque : les principes da base de Iqlmmunologio ont Qté
II --.....-.
Isrgenent pnss6s en revue : iPimmunitB humorale et 1 Yimmunit4 cellulaire.
La hiosynthese des protéines de môme yu2 les rAc.ctIons enzymatiques ont
été 6-tudlk.
- Pour le partle=i-ique
-.
u_.- : de nombreux tests de dfagnostic séro-immunologi-
ques ont été ~&II Is6s :
. pot- d6tectfon fndlrec-te d'anticorps dans le serum ;
* par dkteci-ion directe d'antfccrps s6rlques. ;
I par ag~iutinatlon d'antlgéne par dos ~nticarps sp6clfiques.
Cz plupart de CQS techn iques sont sensibles et nous ont donne de bons
r&sultats dans l'ensemble.
Le ma-t$riel mis 21 notre disposition pour nGS s6ances de i-revaux pratlqws
3 &té de haute qualité.
Dans la Ilmite de nos moyens, nous pourrcns afflnw ces techniques dans
nos dlagwstlcs immunol~qiqucs propres et accompll~r ainsi des,,proc)rEs.
L'fLRAD condllls?nt ces cours do pcrfec-I-lonnomont sur le diagnostic des
meladtes h&wparasit~fres~ apporte un grand concours dans te domaine de la
recherche v'&&-inairc dans .nos pe,ys,
.
.
.
:
REMERCIEMENTS
- A Monsieur le Dr A. GRAY : Directeur &&raJ de I'lLfWD pour Iqaccueil cha-,
ioureux qui!1 nous a réserv4 3 noire arrlvee &~Natbobt;~Profonde admiration
et hommage respectueux.
a accord6 I’admlssion à CBS cours avec toute sa sympathie. Nous lu 1. adres-
:.
sons l'expression de notre slwère gratltudo.
.
‘ :
- A Monslour le Dr Jack DOYLE : Chef du Servlce de Parasltoisgle, responsab,le
;:
de I~encadrement de cas~cours~~ te parfdlt d6roulomcnt'des cours..t&moigne de
:
:
tant dvefforts consentfs pour nous. Nous 11.11 adressons nos plus vlfs remer~+
ciements.
,i, .,.~ * .,N
- Ces remerciements s'adressent'~E)a'lement-au corps professorql~ de, I'ILRAD
qui nous a fourni"des &nnaissances de base en m&ibre dPimmunotogle +-
de bfochtmie .ds,par Isaxcolloi~tO~~quallté de I'enseigneinent.
..:
e.*
e- .A Xzsilames RAVI et NASEEM :dynamlques tochnlclennos du servlce de Parasltoio-
--"
-.-
prolo du Dr DOYLE qui n'ont J&ai'S'cessé de nous apporter 'le concours n6cessal.'
r-e au bon dérouiement do nos travaux pratiques. Nous teur qdressons notre
profonde gratf.tude et nos meilleurs souvenfrs.'
.",?F'
I
. .
> :'