s f INSTITUT D'ELEVAGE ET DE MEDECINE 9 ...
s
f INSTITUT D'ELEVAGE ET DE MEDECINE
9
VETJXINAXE Dl3 PAYS TROPICAUX
..", ~ . ..- ..--..1 *-- __.._ __ ^I -,--. _ ...-es- ---....a
Ii-WORATOIRE NATIONAL DE L'ELEVAGE
Ei Dr RWKt'XC:-~S VE7ElWJAIRES
f
DAKAR-I%NN
FIXATION DU CO~PLEXFdT PESTE EQUINE
ffHXOTECH;JIQUE
Par G. REMARD
Fixation du Complément Peste c?quine
Microtechniaue
par C. RERNARD
Matdriel spdcial
f)-12 vicrodilueurs de 0,025 ml
2)- 3 compte-gouttes de 0,025 ml
3)- ?icro-plaaues en U
4)- Porte plaques pour centrifugation
SI- Papier Go-No-Go pour contrale des microdilueurs
Ce mat6riel fait partie du Microtiterkit produit par
COOKB INSTRUMENTS, AG. Rahnhofstrasse II ZURICH (Suisse)_.
Prhparation de Z'Antigène
La fixation du comp16ment Peste équine &tant une
Rpreuve de groupe et non de type, on pourra utiliser 2 tun
auelconaue des types- .NJanmoins,
Ze type 9-S2 convient part<cu-
iièrement- i Pantigt7‘ne est pr&par& sur cerveaux de souris âgées
de 3 semaines environ ,
On inocule y? chaque souris 0,025 à 0,03 ml par voie
i.-ç .dtune dilution au I/IOe dans du tampon phosphatE ?H 7,4 (1)
de -la souche n.eurotrowe conservBe 1yophilisBe R -25'C. Au bout
de 3 R 4 jours, les souris arriv&es au stade final! (paralysie
presque complète- sj.fmptômes nerveux très importants) sont anestk&-
siFes
AprBs ddcoupaqe de la boTte cranienne, Tes cerveaux sont
r&cot-t6is et on leur' fbit subir une cona&lation .On prgpare ensuite
une suswension au .T/2Oe : 10 cerveaux + 12 mt tampon Veronal (21
que 1 'on broie dans un mixer (type Virtis ou Sorvall). La suspen-
sion est alors centrifugbe I h ir 10.000 t/m 6 + 4'C. Le surnageant
rewr&sente lPantia&ne .Il peut être utilisé tel quel ( le eonser-
.
.
v e r 4 + 4OC) o u hken -inactivR 7 s? T./w-
-
M par 0,I mt solution de Retapropio-
'eau disti%Z&e pour 0,9 ml d'nntiqRne
(agitation de 3h A tem- . du labo puis 1831 b + 4°C).
-2-
~772 ;ktilise das hPmat?:es de m o u t o n ,
Le sang est prdZev8 d a n s une qunn-tith hgale d e Citrate
de soude (3.1 ou de Alsever (4) ,On le conservd 4 6. 5 jours 8 + 4’C
avant l’u*Tlisation .Les hhmat-71es son,t a l o r s 13v6es t r o i s f o i s p a r
centp7~fugat7Ton (5 A 2500 t/m). Décantntion aVe(3 .2 6 3 Volumes de
solution rie Veron.at-Celatine (5) 071 y, G, Le culot du dernier lavaqi?
.
e s t remis e n s u s p e n s i o n t7av.s u n î~dume égal d e VC, Il p e u t Etre aT,ns?,
conservR une s e m a i n e à + 4OC,
S&rum hem0 ly tique
On utilise le serum de Eapin anti hemnties de mouton de
2 vInstitut Pasteur- . II est conservé 3 4 4OC et peut servir pen2an.t
plusieurs mois .
Dans t o u t e s les &preuves, on utilise une solut<on dvhemo-
l y s i n e (SP) dilu6e a u I/IOOOe (une microqoutte de SI! dans 12 ml de
tampon VC) ,On. se trouve ainsi d’uns mankre c e r t a i n e e n exc$s d’he-
mo lysine, c o n d i t i o n n é c e s s a i r e 6 l ’ e x é c u t i o n des rBactions.
PrEparation du stock d’hÉi’maties sensibilisffes (SS ,- 5’r-J)
On prbvare une s u s p e n s i o n (appelée S S ) $ 37 d’hamaties
dans du tamvon VC 13 laquelle” on aJoute, en effectuant un. mouvement
r o t a t i f , un volume identique de SM(préaZablement ditu& au T/1030e) .
Apr$s une incubation de 15’ 8 temq .du Zabo, l e s ACImatias sensibi-
liSEeS
sont consorMes CF + 4OC e t neuvent $tre utilisdes p e n d a n t me
semaine.
Prgparation de la gamme d’ht5molyse
I I . e s t ndcessaire d e d i s p o s e r d ’ u n e clohelle Atalon dvhemo-
lyse ( d e 0 à 100%) a v e c ZaqueZZe des comparaisons pourront Btre
fuites lors des épreuves- ,
Pour cela, on prépare :
IOI- une solution d’hemoglobine (solution J) : T m2 de SS +
7 ml d’eau bidistillée .4pr8s agitation on ajoute 2 ml de solution
d e Varopal 5 ,fois conèentrbe o u V S (S)- .
2’)- une suspension d’himaties (suspension FI : on ajoute
9 m l d e VC A I m l d e SS- +On repartit d a n s TI tube.9 ~3 h&molyse :
SO2utiOn A : C?,O - O,r - /3,,? - 0,3 - 0,4 - O,S - 0,6 - @,7 - 0,8
0,9 - r,oo
Suspension B :
1, 00 - Cl,!? - 0,8 - 0,7 - 0,6 - 0,s - o,cl - o,a -
0,2 - 0,I - 0,o
-3-
Titranci! dea diÎr"$lTents convtitziants
I I - - - .--._ .._.... -* .:.-‘ a-... Ij.i .,.-<- -. ..,< --_l -.,..,.l.-l
."."-_.M
TO) -ri trage d
u
e31i713 -&&:Te”~l ‘-
m-. .r,. 4
-.-...” *--,,, _- *.“.-- ,.._* .k
Le compl&ment est Co~lSerV6 lZ/op?~ili,~h 2 -.55O{J (Compl$-
ment de Riolyon) .Au moment de l'empZo>,
utî. iiser le dissolvant
spacin1-, . nttendr-e la dissolution complBte sans agiter .~e pas
utiliser moins de IO' apï+s La reconstitution (temps -n&cessaire
ii: la sta3iZiaation) .Imm&diatement aprS.s utilisation le mettre
à -+ 4Oc
07.7 il pe24-f Ztre sonseruk ~pZ.us7~eurs jours au mieux !Fi
- 2s"c.
On utilise dnxs la rhactîon 5 unit,?s de ,:ompZ&meTit
hemoZyse 5 0 %
.On pr8pare de:!r: SOl.%:ti~-r1.s i.l4:Pe<? ds comp7,&IriTQi-2t dailr:
du VG : l'un-e ri I/25C (sozution AI) et 1. 'autre à I/l500 (solution 9)
Si le compZ&ment est trC3Cs act7Jf-, pr6parer Les solutions mgres Fj
X/400 et I/450,
Faire les dilutîons suivantes eîz tubes R k&molys~ :
Tube no
-7
2
3
,:
5
6
I
-.
8
VG
0: 6 0 0,55 0,50 0,40
0 , 60 C’, 5 5
0, 50
0, 40
Solution î: - - - ‘; o> 2 0 o3 25 0, 30 ‘TP Ch
0220 0,25
!1?30
0; 40 (solution 8) +-
d
On e~?f*ectue 16 t?ltiage ex. quadruple sur une plaque, i3n
reporte 4 gouttes de 0,025 ml de chacun des tubes I à 8 et on
a,ioute 0,025 n!Z de SS - SH dans chaque cxpule. Aprns agitation
on met 30' A ii’&tuve à 37O ~zvcc agîtatîon Z? la ISème minute .Puis
on centrifuae
5’ ct I 500 t/m h i- 4"'C.
O n l i t 2~s pource~~tages drhEmoZyse par comparaison avec
la gamme .Lee quatre titaagas doîven,t donner des rhsultats idez;z-
tiques, s i n o n p r e n d r e la nzoyexne, On. Rtahlît C~OLS la courbe de
tîtra,qe sur papier Zog . (vokr schéma: n"I) pour 1/250 et I/300
Les points ALB-C-D de -1~ courbe auront pour ordon79Ps le volume'
de compldment dans les tubas I ?T 4 et 5 A 8 (pour I/300) et pour
ahscîsses les valeurs qui correspondent aux pourcentages d'hemo-
Zysci suivants :
X dvh&moZyse
:
10
- 20
-
30
-
c!O
- 50
-
60
-
70 --
80 -
90
abscisses
0, III-O,,
,1,7-O,
25-0,
67-I,
00
00-I, SO-Z, 33-4,00-g,
n
i
_
1.
“_ i
_:
..__.
-. .<.“^
..-
..^
.
_
_..
,..
.<^
._
2 O)-litrnqc
- , - - - e - - de
- - - 2- -‘nrL
- - - tiaène
- i - - -
o n va rech!?rcher 1 POptimu!?? Cntig”nique c ‘est-F-dsrC
la di;Sution d’anti~~?ne d o n n a n t Ze t i t r e Ze F~US 67evC se WI
~Arum p o s i t i f c o n n u .Pour cela, o n v a prdparer d’we part u n e
serie de C tubes à %Jmolyse conten.ant les dij!utions ?u sn'rum
d6complPmentd r? 5F°C I du I/8e au 1/256el et d'autre part une
s&ric de R tubes contenant les dilutions de Z'nntiqèn.e ( du I/$
nu I/I2Rn)- ,Toutes les dilutions seront faites en VG.
On utiZise une microplaque (voir sch&mn no21 dwzs
l a q u e l l e on vn: d$stribuer d a n s 6 rangbes verticalas l e s diLu-
tiens du serum,
2 rnison de 0,025 ml par cupule et dans 7 cupules
p a r ran,cfPe ( la dernisre qui est 'J,e tbmoin scrum sert à contrô-
Zer un Aven tue 2 pouvoir :wticompl8mentnire dwxs chfxque ditution).
Puis dnns 6 ranqRes horizontales on distribue Zes dflutions de
t'nntiqdne 3 raksor. de 7 cuputes rnr dilution 9-t Q,O25 ml Par
cupule ( In dern<Sre c'tnnt le tdmoin antig&ne cour contr0Zer
un fiven.tust pouvoir anticomPZBmantaire dans chaque dilution).
Toutes les dilutions sont distrihudes e'n commençant
Par Ir! p114.8 élevde,
Dnns Zes 2 r:z?zqx6es T Aq et T Serum on ajoute 0,025 ml
de ta;mPon VI? par cupule- .
On distribue 0,06 ml, df? VG dans 3 cupuZ~s qui servz-
ront de contrôle complément et 0,I ~7. dans une cupule qui sera
Za t4moin hBmaties ,
On nqite et on l.cisss I5' 3 tempbrnture du labo .On
prbpnre alors Zes dElutions du complément :
-,
I)-n <5 unitbs : 6 ml selon La dilution d& terminPe -par le
titrnge .
?près Les I5’ on
distribue le compl&wnt CT)> 05 ml.
par c u p u l e ) ;
Il- (i. I,25 unitds : dans Lu cupuZe contrô%e _T,25
O n d o i t o b s e r v e r a l o r s
%es p02lrccn tnac s suivants
3
I, ‘hc”nin 7 ll5e
"<:
d a n s les t~?r?loins :
Contri"jle eompZi;ment 5 unit,Zs :
100 %
ff
2,5 unitbs:
90 - IOiJX
ff
I,25 unitr+s: 40 - 75%
Tamoins Antigène
0*
ICO%
Thmoins Sdrums
*.
130%
Temofn
Hemntie
..
0%
I
I
-
,--
f
- L ! . % -
Ii8
I/I6
I/32
I/f? A
_c_T--- -.
I/I28 Ii254
I/4
0
0
30 \\ 70
IOO
,100 Ii
I/R
0
0
ro
+y 50
90
100
1,
I/I6
I/32
l-/64
I/I28
_
-
-fi-
ExPcution de Za Rbaction de Fixnt<on du compliment
On distribuera pour chaque sbrum 0,025 ml de tampon
VG dans ,4 cupules d'une rannhe vertîeale (les trois premières
contiendront des I-i'lutions du serum uiilant du 1/9e au I/32e et
la 4c! servira de tFmoin sBrum a,fin de contrôler un Eventuel: l ,'
nnticom~l&mentoire). Dans In pratique, on pourr.~, j7ar plaqué,
frrZre deux séries de 12 s&rums.
On prend 4 microdilueurs que l'on tient entre le pouce
et l'index des deux mains et que l'on trempe (sazs mouiller la
tige) dans C! sfirums (dii!u&s au I
1 apr8.s une 16gère rotation
on porte les G microdilu.surs
T dans les premf8res curules
de 4 ranqécs verticales ( on a ainsi une dilution au I/8e3). AprSs
rotation, on passe aux sèmes cupules des CJ rong&es, puis aux
3èmes. On retrempe alors Zes Q diZueurs dans les % ditutions
initbales au I/d et on les Forte dans les i8mes cupules des 4
rnnflbes verticales(t~moine an~icompl~mentflire au I/Se). Le t&miTin
Anticompl&mentaire n'est rbalist! qu'au I/8è par commodit&, 2es
sbrums de chevaux nu contraire de ceux des unes btant très rare-
ment fwticompZEmentaires.
Les L? microdiZueu*rs sov,t alors rincAs
(71 l'eau distkZl6e et pcrss?s 6 la flamme. Pendant le refroidisse-
ment, on en utilise g'autres ( 3 series de 4 sont ainsi n&ces-
saires).
Lorsque tous les s6rums sont pass&s, on distribue dans
chaque cupule tAmoin ( ta fj8me de chaque ranade verticale.,
0,925 ml de tampon VC. Xstrihuer 0,05 ml de VG dans 3 cupules
oui serviront de t@moin comp/bment (5 - 2,5 zt 1,45 unitds) et
O,I ml dans une cupule tbmoin hgmaties.
Pr&parer %'nntig~ne R la dilution donnke par te ti-
trnge et en distribuer 0,025 ml dans chaque cupule reaction ( les
3 premiF3res de chaque rangde verticale )- .Apros nqitntion on
laisse 15' i temp- .du labo .
-7-
Apr&s agitation les plaques Sor!t mis2.s a3O7 iii 1, ir3;424ve
4 P7OC (aqitntion 3 la 15&me minuta), puis elles sont eentri-
~flqPZS 5 f 4 I.SOO$/m 2 + <OC,
LC! titre des s8ru.ms est indiqué par la dilution ln
Plus &leVf?e donnant de 0 4 30% d'h!smoZyse.
IvterprQtntion des Rbsultqts
On considi3re in mati8re de Peste Fquinn que le T/ee
en nicrn?ixntion du comvl$ment rst la Zimitn inf&rieurc! pour un
taux d'Gticorv.9 sipif*icnt7Tf.
n'outre part, ce taux est tr8s
rarement sz4p6rieur nu I/3Ze ou .T/il)'ge, ce qui expliqua la zone du
I/Ra au I/32e uti7is6e dnn.s l't?.preu.~e.
Bettouaae izu mntbriel
Les micrnc?ilueurs sont ~~ssds A 1 Ienu distiZlAe yz4is
s .r' c 374 .y I=: 7.1 f %nmme,
Les micropipettes sont rincdss plusieurs ,fo<s 2 l"eau
claire puis i- Z'anu disti716e. Or: ,oout les faire sPchar c!
1'4tuve ,? s7Oc.
Les microplaques sont mises ZmmBdiatement npr8s usage
dQns un r.4cipient c0nten.nn.t de l'eau claire. L'eau est ch.oxq&e
3 ou 3 .fois et on laisse tremper u'ne nuit nnr8s quoi les nlaoues
sont pa.ss.4~~ sous un fort jat d'eau que l'on fart nGnAtrer dnns
ch~:quC CU~Uh?.
r3n rince ?dne derni&re ,t'ois 4 ltn~:u distill.&e et
1 'on petit fnirc) shcher 5 1'Rtuve .? 37OC.
-R-
2-Tim~on Veronnl
-I comnrimk "comp1~msn.t Ffxntion test diluent tnb-Lets"(O.Yi7TD~
-Eau bidisti t Me . . . . . . . 8
I-00 vz
l . . . . ** . . . . . . . . . .
.,.
..1)..
.
Dissoudre R chaud.
.T-ritrate ;Zc soude
-Citrate trisodique (.2H20) ,..I.......................
3,8 q
-Em bidistiZl6e 0.S.P .*..*....*....*.*.....*.......*
IOO ml
(I.u,toc7lave 2 IIOOC pondant 20 mirutes.
4-Solution de ALSEVRR
-Glucose . . . . . . . . . . ..*a........ . ..*...*.* . . . . 0. u . . . . 20,5 $7
-titrate d? soude . ..*.i........** .**,.* ,..,........
8 $7
-
-/le. c<triquc?
0,55 9
. . . . . . . . . . . . . . . . . . l * . . . .
e..,. . . . . . l . . . .
-~h;Sorure de sodiuv
n
“‘1’1 9 r:
..*e
. . . . . . . . . . l * . . . .
*“..a . . . . . *..
-Eau ?ï?distilLée
0.S.P
1000 ml
. . . . . l . . . . . . . . l * . . . . l . . . . .
*.*..
jlutoc!7u~iJer ii IIOOC pendnnt 20 minutes.
S-SO lution de Veronnl. Gelatine fVG1
-IO comnrim4.c: 0XOI.v
-GeZatine .* . . . . . l *.* . . . . . *..
..,
..“,
.* .* . . . . . . . . . . .
2-q
.-.
-e-
-
-.lTmd hfdistilZée Q.:Y.P ..* . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . l . IOOCI ml.
DTssoudre gu bain-marie 4 chnud.
J
f INSTITUT D'ELEVAGE ET DE MEDECINE
9
VETJXINAXE Dl3 PAYS TROPICAUX
..", ~ . ..- ..--..1 *-- __.._ __ ^I -,--. _ ...-es- ---....a
Ii-WORATOIRE NATIONAL DE L'ELEVAGE
Ei Dr RWKt'XC:-~S VE7ElWJAIRES
f
DAKAR-I%NN
FIXATION DU CO~PLEXFdT PESTE EQUINE
ffHXOTECH;JIQUE
Par G. REMARD
Fixation du Complément Peste c?quine
Microtechniaue
par C. RERNARD
Matdriel spdcial
f)-12 vicrodilueurs de 0,025 ml
2)- 3 compte-gouttes de 0,025 ml
3)- ?icro-plaaues en U
4)- Porte plaques pour centrifugation
SI- Papier Go-No-Go pour contrale des microdilueurs
Ce mat6riel fait partie du Microtiterkit produit par
COOKB INSTRUMENTS, AG. Rahnhofstrasse II ZURICH (Suisse)_.
Prhparation de Z'Antigène
La fixation du comp16ment Peste équine &tant une
Rpreuve de groupe et non de type, on pourra utiliser 2 tun
auelconaue des types- .NJanmoins,
Ze type 9-S2 convient part<cu-
iièrement- i Pantigt7‘ne est pr&par& sur cerveaux de souris âgées
de 3 semaines environ ,
On inocule y? chaque souris 0,025 à 0,03 ml par voie
i.-ç .dtune dilution au I/IOe dans du tampon phosphatE ?H 7,4 (1)
de -la souche n.eurotrowe conservBe 1yophilisBe R -25'C. Au bout
de 3 R 4 jours, les souris arriv&es au stade final! (paralysie
presque complète- sj.fmptômes nerveux très importants) sont anestk&-
siFes
AprBs ddcoupaqe de la boTte cranienne, Tes cerveaux sont
r&cot-t6is et on leur' fbit subir une cona&lation .On prgpare ensuite
une suswension au .T/2Oe : 10 cerveaux + 12 mt tampon Veronal (21
que 1 'on broie dans un mixer (type Virtis ou Sorvall). La suspen-
sion est alors centrifugbe I h ir 10.000 t/m 6 + 4'C. Le surnageant
rewr&sente lPantia&ne .Il peut être utilisé tel quel ( le eonser-
.
.
v e r 4 + 4OC) o u hken -inactivR 7 s? T./w-
-
M par 0,I mt solution de Retapropio-
'eau disti%Z&e pour 0,9 ml d'nntiqRne
(agitation de 3h A tem- . du labo puis 1831 b + 4°C).
-2-
~772 ;ktilise das hPmat?:es de m o u t o n ,
Le sang est prdZev8 d a n s une qunn-tith hgale d e Citrate
de soude (3.1 ou de Alsever (4) ,On le conservd 4 6. 5 jours 8 + 4’C
avant l’u*Tlisation .Les hhmat-71es son,t a l o r s 13v6es t r o i s f o i s p a r
centp7~fugat7Ton (5 A 2500 t/m). Décantntion aVe(3 .2 6 3 Volumes de
solution rie Veron.at-Celatine (5) 071 y, G, Le culot du dernier lavaqi?
.
e s t remis e n s u s p e n s i o n t7av.s u n î~dume égal d e VC, Il p e u t Etre aT,ns?,
conservR une s e m a i n e à + 4OC,
S&rum hem0 ly tique
On utilise le serum de Eapin anti hemnties de mouton de
2 vInstitut Pasteur- . II est conservé 3 4 4OC et peut servir pen2an.t
plusieurs mois .
Dans t o u t e s les &preuves, on utilise une solut<on dvhemo-
l y s i n e (SP) dilu6e a u I/IOOOe (une microqoutte de SI! dans 12 ml de
tampon VC) ,On. se trouve ainsi d’uns mankre c e r t a i n e e n exc$s d’he-
mo lysine, c o n d i t i o n n é c e s s a i r e 6 l ’ e x é c u t i o n des rBactions.
PrEparation du stock d’hÉi’maties sensibilisffes (SS ,- 5’r-J)
On prbvare une s u s p e n s i o n (appelée S S ) $ 37 d’hamaties
dans du tamvon VC 13 laquelle” on aJoute, en effectuant un. mouvement
r o t a t i f , un volume identique de SM(préaZablement ditu& au T/1030e) .
Apr$s une incubation de 15’ 8 temq .du Zabo, l e s ACImatias sensibi-
liSEeS
sont consorMes CF + 4OC e t neuvent $tre utilisdes p e n d a n t me
semaine.
Prgparation de la gamme d’ht5molyse
I I . e s t ndcessaire d e d i s p o s e r d ’ u n e clohelle Atalon dvhemo-
lyse ( d e 0 à 100%) a v e c ZaqueZZe des comparaisons pourront Btre
fuites lors des épreuves- ,
Pour cela, on prépare :
IOI- une solution d’hemoglobine (solution J) : T m2 de SS +
7 ml d’eau bidistillée .4pr8s agitation on ajoute 2 ml de solution
d e Varopal 5 ,fois conèentrbe o u V S (S)- .
2’)- une suspension d’himaties (suspension FI : on ajoute
9 m l d e VC A I m l d e SS- +On repartit d a n s TI tube.9 ~3 h&molyse :
SO2utiOn A : C?,O - O,r - /3,,? - 0,3 - 0,4 - O,S - 0,6 - @,7 - 0,8
0,9 - r,oo
Suspension B :
1, 00 - Cl,!? - 0,8 - 0,7 - 0,6 - 0,s - o,cl - o,a -
0,2 - 0,I - 0,o
-3-
Titranci! dea diÎr"$lTents convtitziants
I I - - - .--._ .._.... -* .:.-‘ a-... Ij.i .,.-<- -. ..,< --_l -.,..,.l.-l
."."-_.M
TO) -ri trage d
u
e31i713 -&&:Te”~l ‘-
m-. .r,. 4
-.-...” *--,,, _- *.“.-- ,.._* .k
Le compl&ment est Co~lSerV6 lZ/op?~ili,~h 2 -.55O{J (Compl$-
ment de Riolyon) .Au moment de l'empZo>,
utî. iiser le dissolvant
spacin1-, . nttendr-e la dissolution complBte sans agiter .~e pas
utiliser moins de IO' apï+s La reconstitution (temps -n&cessaire
ii: la sta3iZiaation) .Imm&diatement aprS.s utilisation le mettre
à -+ 4Oc
07.7 il pe24-f Ztre sonseruk ~pZ.us7~eurs jours au mieux !Fi
- 2s"c.
On utilise dnxs la rhactîon 5 unit,?s de ,:ompZ&meTit
hemoZyse 5 0 %
.On pr8pare de:!r: SOl.%:ti~-r1.s i.l4:Pe<? ds comp7,&IriTQi-2t dailr:
du VG : l'un-e ri I/25C (sozution AI) et 1. 'autre à I/l500 (solution 9)
Si le compZ&ment est trC3Cs act7Jf-, pr6parer Les solutions mgres Fj
X/400 et I/450,
Faire les dilutîons suivantes eîz tubes R k&molys~ :
Tube no
-7
2
3
,:
5
6
I
-.
8
VG
0: 6 0 0,55 0,50 0,40
0 , 60 C’, 5 5
0, 50
0, 40
Solution î: - - - ‘; o> 2 0 o3 25 0, 30 ‘TP Ch
0220 0,25
!1?30
0; 40 (solution 8) +-
d
On e~?f*ectue 16 t?ltiage ex. quadruple sur une plaque, i3n
reporte 4 gouttes de 0,025 ml de chacun des tubes I à 8 et on
a,ioute 0,025 n!Z de SS - SH dans chaque cxpule. Aprns agitation
on met 30' A ii’&tuve à 37O ~zvcc agîtatîon Z? la ISème minute .Puis
on centrifuae
5’ ct I 500 t/m h i- 4"'C.
O n l i t 2~s pource~~tages drhEmoZyse par comparaison avec
la gamme .Lee quatre titaagas doîven,t donner des rhsultats idez;z-
tiques, s i n o n p r e n d r e la nzoyexne, On. Rtahlît C~OLS la courbe de
tîtra,qe sur papier Zog . (vokr schéma: n"I) pour 1/250 et I/300
Les points ALB-C-D de -1~ courbe auront pour ordon79Ps le volume'
de compldment dans les tubas I ?T 4 et 5 A 8 (pour I/300) et pour
ahscîsses les valeurs qui correspondent aux pourcentages d'hemo-
Zysci suivants :
X dvh&moZyse
:
10
- 20
-
30
-
c!O
- 50
-
60
-
70 --
80 -
90
abscisses
0, III-O,,
,1,7-O,
25-0,
67-I,
00
00-I, SO-Z, 33-4,00-g,
n
i
_
1.
“_ i
_:
..__.
-. .<.“^
..-
..^
.
_
_..
,..
.<^
._
2 O)-litrnqc
- , - - - e - - de
- - - 2- -‘nrL
- - - tiaène
- i - - -
o n va rech!?rcher 1 POptimu!?? Cntig”nique c ‘est-F-dsrC
la di;Sution d’anti~~?ne d o n n a n t Ze t i t r e Ze F~US 67evC se WI
~Arum p o s i t i f c o n n u .Pour cela, o n v a prdparer d’we part u n e
serie de C tubes à %Jmolyse conten.ant les dij!utions ?u sn'rum
d6complPmentd r? 5F°C I du I/8e au 1/256el et d'autre part une
s&ric de R tubes contenant les dilutions de Z'nntiqèn.e ( du I/$
nu I/I2Rn)- ,Toutes les dilutions seront faites en VG.
On utiZise une microplaque (voir sch&mn no21 dwzs
l a q u e l l e on vn: d$stribuer d a n s 6 rangbes verticalas l e s diLu-
tiens du serum,
2 rnison de 0,025 ml par cupule et dans 7 cupules
p a r ran,cfPe ( la dernisre qui est 'J,e tbmoin scrum sert à contrô-
Zer un Aven tue 2 pouvoir :wticompl8mentnire dwxs chfxque ditution).
Puis dnns 6 ranqRes horizontales on distribue Zes dflutions de
t'nntiqdne 3 raksor. de 7 cuputes rnr dilution 9-t Q,O25 ml Par
cupule ( In dern<Sre c'tnnt le tdmoin antig&ne cour contr0Zer
un fiven.tust pouvoir anticomPZBmantaire dans chaque dilution).
Toutes les dilutions sont distrihudes e'n commençant
Par Ir! p114.8 élevde,
Dnns Zes 2 r:z?zqx6es T Aq et T Serum on ajoute 0,025 ml
de ta;mPon VI? par cupule- .
On distribue 0,06 ml, df? VG dans 3 cupuZ~s qui servz-
ront de contrôle complément et 0,I ~7. dans une cupule qui sera
Za t4moin hBmaties ,
On nqite et on l.cisss I5' 3 tempbrnture du labo .On
prbpnre alors Zes dElutions du complément :
-,
I)-n <5 unitbs : 6 ml selon La dilution d& terminPe -par le
titrnge .
?près Les I5’ on
distribue le compl&wnt CT)> 05 ml.
par c u p u l e ) ;
Il- (i. I,25 unitds : dans Lu cupuZe contrô%e _T,25
O n d o i t o b s e r v e r a l o r s
%es p02lrccn tnac s suivants
3
I, ‘hc”nin 7 ll5e
"<:
d a n s les t~?r?loins :
Contri"jle eompZi;ment 5 unit,Zs :
100 %
ff
2,5 unitbs:
90 - IOiJX
ff
I,25 unitr+s: 40 - 75%
Tamoins Antigène
0*
ICO%
Thmoins Sdrums
*.
130%
Temofn
Hemntie
..
0%
I
I
-
,--
f
- L ! . % -
Ii8
I/I6
I/32
I/f? A
_c_T--- -.
I/I28 Ii254
I/4
0
0
30 \\ 70
IOO
,100 Ii
I/R
0
0
ro
+y 50
90
100
1,
I/I6
I/32
l-/64
I/I28
_
-
-fi-
ExPcution de Za Rbaction de Fixnt<on du compliment
On distribuera pour chaque sbrum 0,025 ml de tampon
VG dans ,4 cupules d'une rannhe vertîeale (les trois premières
contiendront des I-i'lutions du serum uiilant du 1/9e au I/32e et
la 4c! servira de tFmoin sBrum a,fin de contrôler un Eventuel: l ,'
nnticom~l&mentoire). Dans In pratique, on pourr.~, j7ar plaqué,
frrZre deux séries de 12 s&rums.
On prend 4 microdilueurs que l'on tient entre le pouce
et l'index des deux mains et que l'on trempe (sazs mouiller la
tige) dans C! sfirums (dii!u&s au I
1 apr8.s une 16gère rotation
on porte les G microdilu.surs
T dans les premf8res curules
de 4 ranqécs verticales ( on a ainsi une dilution au I/8e3). AprSs
rotation, on passe aux sèmes cupules des CJ rong&es, puis aux
3èmes. On retrempe alors Zes Q diZueurs dans les % ditutions
initbales au I/d et on les Forte dans les i8mes cupules des 4
rnnflbes verticales(t~moine an~icompl~mentflire au I/Se). Le t&miTin
Anticompl&mentaire n'est rbalist! qu'au I/8è par commodit&, 2es
sbrums de chevaux nu contraire de ceux des unes btant très rare-
ment fwticompZEmentaires.
Les L? microdiZueu*rs sov,t alors rincAs
(71 l'eau distkZl6e et pcrss?s 6 la flamme. Pendant le refroidisse-
ment, on en utilise g'autres ( 3 series de 4 sont ainsi n&ces-
saires).
Lorsque tous les s6rums sont pass&s, on distribue dans
chaque cupule tAmoin ( ta fj8me de chaque ranade verticale.,
0,925 ml de tampon VC. Xstrihuer 0,05 ml de VG dans 3 cupules
oui serviront de t@moin comp/bment (5 - 2,5 zt 1,45 unitds) et
O,I ml dans une cupule tbmoin hgmaties.
Pr&parer %'nntig~ne R la dilution donnke par te ti-
trnge et en distribuer 0,025 ml dans chaque cupule reaction ( les
3 premiF3res de chaque rangde verticale )- .Apros nqitntion on
laisse 15' i temp- .du labo .
-7-
Apr&s agitation les plaques Sor!t mis2.s a3O7 iii 1, ir3;424ve
4 P7OC (aqitntion 3 la 15&me minuta), puis elles sont eentri-
~flqPZS 5 f 4 I.SOO$/m 2 + <OC,
LC! titre des s8ru.ms est indiqué par la dilution ln
Plus &leVf?e donnant de 0 4 30% d'h!smoZyse.
IvterprQtntion des Rbsultqts
On considi3re in mati8re de Peste Fquinn que le T/ee
en nicrn?ixntion du comvl$ment rst la Zimitn inf&rieurc! pour un
taux d'Gticorv.9 sipif*icnt7Tf.
n'outre part, ce taux est tr8s
rarement sz4p6rieur nu I/3Ze ou .T/il)'ge, ce qui expliqua la zone du
I/Ra au I/32e uti7is6e dnn.s l't?.preu.~e.
Bettouaae izu mntbriel
Les micrnc?ilueurs sont ~~ssds A 1 Ienu distiZlAe yz4is
s .r' c 374 .y I=: 7.1 f %nmme,
Les micropipettes sont rincdss plusieurs ,fo<s 2 l"eau
claire puis i- Z'anu disti716e. Or: ,oout les faire sPchar c!
1'4tuve ,? s7Oc.
Les microplaques sont mises ZmmBdiatement npr8s usage
dQns un r.4cipient c0nten.nn.t de l'eau claire. L'eau est ch.oxq&e
3 ou 3 .fois et on laisse tremper u'ne nuit nnr8s quoi les nlaoues
sont pa.ss.4~~ sous un fort jat d'eau que l'on fart nGnAtrer dnns
ch~:quC CU~Uh?.
r3n rince ?dne derni&re ,t'ois 4 ltn~:u distill.&e et
1 'on petit fnirc) shcher 5 1'Rtuve .? 37OC.
-R-
2-Tim~on Veronnl
-I comnrimk "comp1~msn.t Ffxntion test diluent tnb-Lets"(O.Yi7TD~
-Eau bidisti t Me . . . . . . . 8
I-00 vz
l . . . . ** . . . . . . . . . .
.,.
..1)..
.
Dissoudre R chaud.
.T-ritrate ;Zc soude
-Citrate trisodique (.2H20) ,..I.......................
3,8 q
-Em bidistiZl6e 0.S.P .*..*....*....*.*.....*.......*
IOO ml
(I.u,toc7lave 2 IIOOC pondant 20 mirutes.
4-Solution de ALSEVRR
-Glucose . . . . . . . . . . ..*a........ . ..*...*.* . . . . 0. u . . . . 20,5 $7
-titrate d? soude . ..*.i........** .**,.* ,..,........
8 $7
-
-/le. c<triquc?
0,55 9
. . . . . . . . . . . . . . . . . . l * . . . .
e..,. . . . . . l . . . .
-~h;Sorure de sodiuv
n
“‘1’1 9 r:
..*e
. . . . . . . . . . l * . . . .
*“..a . . . . . *..
-Eau ?ï?distilLée
0.S.P
1000 ml
. . . . . l . . . . . . . . l * . . . . l . . . . .
*.*..
jlutoc!7u~iJer ii IIOOC pendnnt 20 minutes.
S-SO lution de Veronnl. Gelatine fVG1
-IO comnrim4.c: 0XOI.v
-GeZatine .* . . . . . l *.* . . . . . *..
..,
..“,
.* .* . . . . . . . . . . .
2-q
.-.
-e-
-
-.lTmd hfdistilZée Q.:Y.P ..* . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . l . IOOCI ml.
DTssoudre gu bain-marie 4 chnud.
J