REPUBLIQUE 3iJ SENEGAL -1-m-“--” MINISTERE DE...
REPUBLIQUE 3iJ SENEGAL
-1-m-“--”
MINISTERE DE LA RECHERCHE
SCIENTIFIQUE ET TECHNIQUE
---w--..-e
1 NSTI TUT SENEGALA t S DE RECHERCHES
AGRICOLES (1 .S.R.A.)
-wM.w..I-..w
LABORATO t RE NATIONAL DE L9 ELEVAGE
ET DE RECHERCHES VETER I NA I RES
iI DAKAR - HANN
i
T E C H N I Q U E D E P R O D U C T I O N D E V A C C I N A N T I - A P H T E U X
UTt LISEE A U L A B O R A T O I R E D E D E B R E - ZEIT - E T H I O P I E
S T A G E F A O S U R L A P R O D U C T I O N D E V A C C I N S
D A K A R , DU 1 7 O C T O B R E A U 5 N O V E M B R E 1 9 8 3
P a r Y . LEFORBAN
R E F . No 76/VIRO.
O C T O B R E 1 9 8 3 .
-3
Lorsque I 90~ fait la trypsination
des 10 ou 12 FR, chaque boutai I le
est traitue individuel lement et les tel lules recuei f+i~es à partir do:-1 fia-
.<
con sont reparti es dans 2 flacons de 1 t i tr& de mi I i eu complet (mi 1 ieu avec
les sels de HKS supplémenté + antibiotiques + 5 $ de s&um de veau). Gn
litre de cellules servira à faire 6 flacons roulants. (1 FR estdonc multi-
plie par 13.1.
Cn a donc dans chaque f lacon a-
170 ml de solution
cet lulaire.
Chaque FR,. est numéroté de mani &re à rep&er
I es boutei I I es de la
même origine en cas de contami nation.
B- PRODUCT l ON V I RALE
1 - Choix des ‘types et des souches
En 19absence dfisoiement des types SAT et ASIA, nous produisons le
vaccin uniquement contre les 3 types européens 13, A et C.
Les souches de production sont des souches éthiopiennes qui ont ét6
isolées dans ce Laboratoi t-c. (Le Laboratoi re ne détient d’ai I 1 eurs aucune
souche vivante provenant de I ‘étranger).
Le chci x des souches vacci nal cs tient compte de i ‘étude s&-ologique
des souches éthiopiennes qui a i-t
3, 6 effectuée. La souche chai si e pour un
type doit proteger contre I e maximum de soucha; local es de même type. Le
choix se portera donc sur les souches qui ont le plus de points communs
avec les autres souches sauvages pr6va I entes,
Le choix est également fonction de I eur p I us ou moins grande faci I i té
de multiplication sur le substrat tel Iulaire utilisé (1 PRSr).
Au cwrs de I ‘annee 1974 - 1980, I es souches uti I i sées ont &te :
0 149 (Debr&Zeit)
i.sol ée .en,..octob,re 1977
. . . .._
A 110 (Gafarsa)
isolée en novembre 1974
c
54 (Assella Godu) isolee en juillet 1972.
. . . / . . .
- 4
2 - Nombre dé'passaqes
De mani8re à avenir le moins possible dvalt&-ation anti$niquz des
souch@s, nous limitons le nombre des passages B 5 c'est-A-dire que le pas-
. sap de production correspond au maximum au 56 passage du virus.
.
,.
3 - Pr6parati0n de Ivlnoculum viral
Lc stock production'vlrus cîest-&-dire P3 ou P,+ doit être; conservé
à - 70°C. Ce stock devra &tre constitu4 en debut d'annee et contr6l6 du
point de vue :
Sabouraud
- stérilité
VF
l Tryotose s&rum
- puret
: Typage 9n fixation du complément
- titre
: en fixation du compl&~ent et.sur cellule*
Ces différents saramètres se mai ntiendront constants 3 la température
de - 7C"C pendznt 1 an et il ne sera donc pas nécessaire de les verifier
pour chaque lot. Un bon inoculum doit remplir les conditions suivantes :
- titre
en FC .) i
- titre sur cellule IBHS2 10' IXP 5Wml
- destruction comnl<:te du tapis en 15 à 17 h.
Dans lb cas OCI une conservation de stock virus ne serait pas possible
à - 70°C, il nous parait pref6rabla de préparer un nouvel inoculum pour
chaque lot c!e production. C?i- inoculum devra être prGpar% quelqucjs jours
2 l'avance ot st?cké à -3O'C de mani&-e 21 avoir le temps d'effectuer les
contrtjfes (st&riliiG, pureté, titre).
4 - Producticn de virus vaccinal Fropreiment dit
Chaque FR ayant Yn tapis cellulaire complet (cc qui corrcs;;ond 5 J18
ou J 19 c?est-,à-dire (1. 3 5 jwrs apr&s 1~7 trypsinatic?n) est inocul6 avec
60 ml de virus dilué au & dans du HKS virus (cf. annexa 11.
.
.
/
.
.I.
- 5
Le mi l i eu Hanks vi rus est preparé dans les mêmes candi ti ons que le
Hanks ce! I ules et réparti dans des flacons plasma de 1 I i tre remplis 6
900 ml,
!a st6ri Ii-té est contrôleo et les antibiotiques sont r a j o u t é s a u
moment de 1 ‘emploi, en même temps que l p i nocu l um vi t-a I g Comm e pour la
production ce1 I ulai re,
les antifongiques ne sont pas uti 1 isécs en routine.
Chaque flacon de 900 ml reçoit 9 ml dg inoculum viral et servira à
inoculer 15 FR (60 ml d’inoculum viral dilué au & par flacon).
On procÉ:dera au changement du bouchon de chaque FR juste apres avoir
vidé le vieux milieu de culture.
Aussi-B-t après leur inoculation,
les FR sont replac6s sur le rol Ier.
La r&zolts se fait entre la 14ème et 17ème h. après I1inoculation.
L’inoculation devra donc être faite le soir entre 16 h et 18 h et la
récolte le lendemain matin entre 8 et 10 heures.
La destruction cellulaire doit être complète et la récolte consiste
3. verser le contenu de chaque flacon (débris cellulaires + virus) dans un
recipient de 10 litres muni d’un barreau magnétique pr6alablement refroidi
.a - ZO*C,
Cette r&colte doit être faite rapidement et le récipient contenant
le virus vaccinal doit être plac& dans la glace fondante,
Noter le pH de la récolte
Faire une prise dqéchantillon 20 à 50 ml pour :
- contrôie du type
- contrôle de stjri 1 i té
- titra(7e + i n f e c t i e u x
+ f i x a t i o n d u camp lément.
. . /. *..
- 6
C - TRANSFORMATION EN VACCIN
a) Etude analytique
J19
Aussitôt apres la'récolte, chloroformer à 7 p.lflOn (7 ml de chloro-
+forme par I tre de virus brut soit 42 ml pour 6 litres correspondant à
100 flacons roulants).
Mettre on agitatio,n.:à
+L)'C pendant 24 heures.
Pratiquement, on peut laisser le ballon dans le bain de $l!ce fondante
jusqu9au soir sous agitation. Le ballon est pIa& nu r&fri$rsteur C?ale-
ment sous agitation, seulement le soir. Ceci permet de maintenir le virus
à une temperature plus basse que lorsqu9iI est mis directement au r[fric@-
rkteur le matin après la recolte.
J20
Centrifuger : 1 500, 2 QOO tlmm pendent 15 minutes.
Pour cette centrifugation, nous utilisons j usqu'r~ présent 13 centrifu-
geuse refrigerée Jouan K63F êquipée de 4 pots de 750 ml.
Les put-s doivent être parfaitement &quilibres avec une brlanw Poberval
en double pesée sous peine d'avoir des vibrations trtk importnntos qui
endommagent la centrifugeuse,
Les pots sont munis d'un couvercle que nous n'utilisons pas, car nous
trouvons plus pratique de recouvrir les pots dc papier d'aluminium ou de
papier ordinaire ligaturés par une ficelle. Chaque pot est rempli zu maxi-
mum ‘3 650 ml. La mesure est faite avec un flacon ~lssn~a. IJn portoir en bols
pour les pots serait tres utile,
Avant leur utilisation, les pets sont s-terilises ainsi quc3 1; partie
métallique qui les contient. On dispose une fine coucha do r:r:t~n zu fond
de cette partie metallique,ce qui favori%: la pr6honsion du pot.
Dans 19avenir et en particulier si l'on veut prcduire plus de vaccin,
il faudra envisager une centrifugation en continu.
Après centrifugation, refaire une prise d'khantillon poi~r CcntrCles
(les @mes qu9avant chloroforme).
. . /. ,.,
- 7
Le virus avant et après centrifugation est conservé dans la glace
.fondante. Après centrifugation,
le virus est mis dans un ballon muni d'un
siphon. Ajouter l'hydroxyde d'alumine = 119 ml d'hydroxyde d'alumine à
3 0.100 de matière sèche par litr4+Q de virus clarifi'é et centrifuge (714 ml
pour 6 litres).
Agiter pendant f/2 H à 1 H à + 4'C et laisser dkanter jusqu'au lende-
main matin.
. .
Le pH de lshydroxyde d'alumino après sa~‘st&iIisation est entre 5 et
6, Nous procédons à son alcalinisation (pH 7,5) avec une solution de bicar-
-.'-...,^.., ..-, ,,
bonate à 7,5 $ sterile, juste avant son méfange avec ie vi-rus,
Lvhydroxyde d'alumine que nous utilisons est fournie jusqu'8 prisent
par le Laboratoire ROGER BELLON, (cf. annexe IV - preparakion de IOhydro-
xyde dvalumine),
J21
Concentration du vaccin. Cette opération a essentlellement pour but
de diminuer le volume ,de la dose vaccinale.
Reprendre le ballon contenant virus et l'hydroxyde d'alumine en ayant
grand soin de ne pas l!agiter.
Brancher le stphon sur un by pass equipit de 2 bouteilles plasma de
1 litre (le même que celui utilisC pour la filtration de milieu).
e
Une partie du surnac,eant est soutirée de manière W r8duire le volume
total de rnoitig.
Cette opération est effectuee avec une pompe dlectrique aspirante.
Type AL 17
Fabricant : KURT NEUBEKGER, 42, Rue de MU!
483C3 - SAINT-LOUIS (France)
Lvintensite de l'aspiration ne doit pas être trop forte pour ne pas
créer de turbulences dans le ballon qui risqueraient de temélanger Ivalu-
mine sedimentse.
Pour une production de ID0 flacons roulants, le volume est ramené à
2 860 mi ; on soutire donc : 6 000 + 714 + 42 - 2 860 = 3 900 ml.
Ajouter la saponine au virus concentre : 70 ml d'une solution à
17 p.lOOO,pour la quantité ci-dessus (annexe XI).
. . ./ . . .
Formoler i 0,3 F.~TIO de fr,rmIdehYde Fur. Le formol du commerce
titre entre 35 et 44 ?r de formaloehyde (cf.
annxe V '- ti tr3cje dti formol).
II faut donc caltiuler la quanti-t5 tic forrnsl du commerce ? ajouter.
Exemple
: si le forwl du commerce titre 35 $ de fotimaldehyde pur X
représente le volume en ml à ajouter (ce velum.e etrint r!iIur dans 6C ml
dfeau dis-i-ill&).
0,3
3 5
X
3 5 x
-i?m-=
100 '
,2 869 + 60 + /:F =
2 990 x 190
X =
2 99c, x 3,3 x 100 = 2 5F J ml
1 000 x 35
9
II faut donc ajouter 2,56 ml 1-1-1
t. -fot-~Ql du commerce qu'on diiue au
préalable dans 60 ml d9eau distiiI;fe,
'In obtient ainsi une concentration finale en formîldehydz Fur de
r>,3 p,lOOr).
Mettre en inactivation sous qitation magn?~tique au hein-mariE 9 30'
pendant 36 heures exactement.
Pratiquement, le vaccin est mis en inactivstion dans la mutines (J21)
et celle-ci est arrêt& le lendemain soir (J22) par mise au rGfri$rateur.
J23
Ajuster le pH Z 8,2 - 8,3 avec du tampon -lycocolle (cf annexe VII.
Répartir en flacons de 1 litre. Etiqueter.
b) Schéma rkeoitulatif
J19
Virus vaccinal brut
5 OCi': ml
clarification
+ 42 ml de
l
chloroforme
J20
Virus clarifié
6 042 ml
4
71~1 d'Al (oti) 3'
J21
Virus aluminé '
6 756 ml'
concentration
1
soutirer 3 900 ml
J22
Virus concentré
2 860 mt
I
ajouter 6c) ml de
formol et 70 ml de
sapcnine
. .
/a..
. . .
.., .,.
- 9
IVi rus i nacti vé 2 990 ml
a j u s t e r l e pH
10 à 15 ml de
çilycocolle
J23
Vaccin fini
3 Xh’l ml soit 1 8OQ doses monovalentes.
CONTROLES
1 - Stdri I i te bactérioloqique
En plus des contrôles effectues sur la semence et le virus vaccinal,
un dernier contrôle est effectu6 sur la vaccin final.
Nous uti I isons en routine les mi I ieux suivants :
- gelose sérum ou tryptose sérum
- boui I Ion ou thioqlycolate
- mi I i eu de Sabouraud.
Tous i es contrôles sont faits à 37’ et 22’C (température du Labora-
toi rel. Tous les mi I ieux doivent rester stéri I es,
2 - Conirôles’serolooiques
En cours de fabrication, on procëde au typage et au titrage du virus
par fixation du complément (technique KOLMER 17 lr)n $ d’hémolyse à chaud
en tubes ou en mi cropl aque) sur la semence et sur I e vi rus vacc inal avant
et après clarification par le chloroforme),
Pratiquement,
les deux réactions typage et titrage sont fa ites en
m%ne temps. On procède comme pour le typage di rect d’un vi rus en uti I isant
des dilutions différentes P 4 , -& .&&,
(annexe VI 1 - Titrage du vi rus
en FC).
I f ne doit y avoi r aucune fixation avec les types di f ferents et le
virus doit fixer au moins jusqu’au 3 avec le sérum de même type.
3- Contrôle du titre infectieux
On prccède au titrage sur tubes de tel lules IBRSz (O,l ml par tube,
5 tubes par di lution).
Qn commence à la dilution lOe4 et on va jusqu’a
16
La lecture se fait après 48 heures et le calcul du titre est effectué
par la méthode de KARBEE.
/
. . . . . .
-
_L_
..-.
- 1')
Avec les souches utilisees,
i;c titre mfnimal doit Gtre entre 107 DCP
50 $ /ml (cf. annexe VIII - Titrage du virus sur cellule).
4- lnocuitd
Il est pr0f&ablo de n'effectuer ce con-trTjle qu'ayrès un stockase de
..I
. ,, ^
15 jours au moins du vaccin 2 * 4OC au refri~<rateur.
-1 ..? . . ..--..-. . . ..~..A.... a., 1 l.*C .-. . ., . ,, . <..
II se fait sur souriceaux de 3-4 jours. Les souriceaux na c!oivent
être manipulas qusavec des gants st&riles (ne 'lais les toucher avec les
mains nues>.
Inoculer 2 portees avec ie vaccin dilué au 1/2 dans du (?US, rat- voie
IP 9 raison de 0,l ml par souriceau.
Observer pendant 10 jours, En cas de mortalitfi,
rechercher le virus
dans le cerveau et le muscle.
PrSlever muscle et cerveau (1 31 broyer avec un mel7nqe de tampon
véronal et de chloroforme (dilution 1/'2). D+kompl6rIsnter -19 mn ?. 56' dans
un flacon hermctiquement bouch4. A,jcuter ! ml de tarnnon v5ronal. Centrifu-
ger 23 mn S 3 NC t/mn. Eecueillir le surnar;enht;"P^roC~~er'crslri~~
pour un
typage direct d'echantillon.
5" Efficacit6
Ce contrôle n‘est effectue qu9apr&s le contrôle d'inocuitG sur souri-
ceau, Ce ccntr~le est effeqtu6 sur bwin et il sert i?q~Iemen-i- d!t ountt-ôle
d'inocui-6 sur bovin.
a) Contrôle dos anticorps après vâccins-tion
Des bovins en bonne sant6 (5 5 1C)) et ayant 6-î-6 contr0li?s au préalable
comme nrayant pas d'anticorps cTntre la F.A. (indice de sGron2utralisstion
<:Q,3) sont vaccinés sous la peau do I 'encolure avec une dose normale de
vaccin trivalent, 21 jours après I:2 vzlccinat‘ion;
les 'anticorps-Sont titrés.
par la -khniqu e de s&oneut?alisation (cf. annexe 1x1;
.
.
/
.
.*.
<
- 11
Une va i ence de vacci n est consi d6r6e comme acceptab I e quand el le donne
un titre troyen de I ‘indice de SN ‘> g99.
Selon les normes europhennes, un tel vaccin devrait c o n f é r e r u n e pro-
tection de l’ordre de 80 $ des animaux.
Ces normes bien que non directement transposables aux conditions
africaines, dcnnent cependant unr3 idée assez precise de la valeur du
vacci n.
b) Epreuve vi ru 1 ente
Cette épreuve doit être faits dans des candi tiens dP isolement strict
des ani maux.
PRINCIPE
Les bcvi ns (animaux 1/2 sang tauri ns exempts d’anticorps neutral i sant
ISN <:9,3) sont vaccinés avec une dose normale de vacci n tri valent et con-
trôl6s 21 jours aprè,= avec une dose fixe de vi rus ( 10 Qc)0 DiB/50 $1 par
voie intradarmol in9uale (101).
On peut uti 1 i ser ces mêmes animaux pour I e contre 1 e des anti corps 3
condition de prélever le sérum avant 19épreuvo virulente.
Après un délai d’observation de 6 jours, les animaux sont abattus et
les Ibsions notées.
- Présence ou absence d’aphtes primaires ( 1 i nc,uaux)
- Présence ou absence doaphtes secondaires (buccaux - podaux).
REALI SATI ON
- On doit utiliser au minimum 3 animaux par valence (2 vaccin& et 1 con-
t r ô l e ) .
- 21 jours après la vaccination, tranqui 1 iser les animaux Rompun (BAYER)
1 ml de soiution à 2 p.lr>O par 100 kc; de poids vif.
. . /. .*.
- 1%
Inoculer en IDI_ 13 MO DIBI50 $ par bovin. Iqoculor en % points $e
0,l ml (5 %Y? @IB/CiC! d par point) (voir annexe X - Préparation ct titrage
'dti vit-k dP6pr&ve sur bovin).
II fzut toujours inoculer en même temps au wins un 3ovin tGmfzin non
vaccine et dépourvu d'Ac neUtralisani.
LECTURE DES RESULTATS
Elle se fait apr&s 6 jours.
-.
__._.. ._. . .._ _ _
L é s i o n s linyuales
- Cvimportance des lésions primaires de In lanque est zpprkiüe en
divisant arbitrairement sa surface en 4 parties Qqales.
Lésions podales
,..
- Laver les pieds au jet tous les jours.
- La lecture SC fait au doigt er; cherchant 3 rompre les qthtes fiven-
tuels entre les onglons et sur le bourrelet coronaire.
Lésions buccales
- Elles coexistknt le plus souvent avec les Ikions poc!nIes.
Le critère de protection retenu er;t I'absenco do i&sions secondaires
podales.
Les animaux prnté&s peuvent pr&enter des lkions prlïnsirer lin+aies.
ANNEXE I (F.A.1
MILIEUY DE HANKS
_...
. .-
.-..
Milieu de base
Hanks virus
51
'101
._. '20'1
-'-.' 10 1
51
NaCI
Chlorure de sodium.
SC!
83
160
80
40
,.
Kci
Chlorure de potassium
2
4
.8
4
2
".
MgSQ+
1
2
4
2
1
(7H20)
Sulfate de magniistum 8
Cacl2
Chlorure de calcium
$7
b4
23
v
0,7
Anhydre (+ 2h20)
(0,93)
(1,851
(3,701
(1,85)
IO,93)
Na 2t-l POc Phosphate disodique
0,75
I
v
3,O
V
0,75
12H20
w2
POlf
Phosphate monopotassique
0,3
%6
132
0,6
0,3
I
lGlucose anhydre
I 5 I .' 10
1
20
l
10
I
5
1
Extrait de levure (DIFCO)
5
10
20
10
5
Hydrolysat de Iactalbwin 1 25 / 50 / ,mo j 50 / 25
(DIFCO)
/
W+q
1Bicarbonate de sodium
I
5
I
1 0
l
29
I
30
I
15
de iiouge 4s
Phénol à 10 $ (on ml)
i
l
Eau distill&e
fen.mJ)
4 750
9 590
1 9 nm
1 0 000
5 000
Le milieu est prf$sr6 en rnjou-i-ant à l'eau distillée les produits dans
l'ordre indiqu6.
Avant filtration, le pH est ajuste à 7- 7,2 avec Hcl $"
N
et NaoH -.
I
Le milieu de base est filtré en flacons de 1 litre remplis 2 950 ml
de. milieu.
Le Hanks virus est réparti en flacons de 1 litre remplis à 900 ml.
A;>res contt$le de stérilite : 24 h à 37'
48 h à zoo
Les flacons sont stock& à + JOC, les antibiotiques sont- ajout&
au mment de Ivemploi.
.
.
.
..I..
.
.”
.
,
_
Ajcrutw les produits dans 190rdrec 'I"'Verser lentmei+ i&de jusqu'à .. -" -
dissoiution de la aoudre,
.
.
<,
.
.,
_,
.
-
:I. .
.
Com;lCfer à 109 ml avec l'eau distillBe.
.
_
^. .
.
_-.
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. .
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_
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1.
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* . ..____-..
. . ..-a
I\\NNEXE II (F,Ar!
_ .
ANTIBIOTIQUES ET ANTIF3NGIQUES
t- PRINCIPES DPUTILISATl~N EN VIRî)LOGIE
<'
- Travailler avec le moins d'antibiotiques et d'antifongfqües 'possible.
- Lors de la.con~élati.o.,~.,et,.,3
la d~conqélaiion des cellules, faire si
r<.z..--- . ..- _ f.-..-l-..-,.-...,,.r
__I
possible deux ou trois passages sans antibiotique. S'il n'y a pas de
contamination, on est alors sur de la st&illté des cellules,
- Les antibiotiques et antifongfques sont utilisés uniquement ?I titre
préventff,
Ne jamais essayer de recupérer quelque chose de contaminé
c'est l'échec certain,
2 - ANTIBIOTIQUES UTILISES EN RWTINE
Penici lline G
2 millions d'unités
4 million5 U
Streptomycine
sulfate
19
29
Eau distillée
20 ml
40 ml
- Après dissoluti on, f ili-rer sur membrane millipore de 0,22 p
- Répartir st&ril ement en:fla.con de 5, ml 5 raison de 2 ml par ffacon.
- Congeler a - 3O'C.
- Au moment de l'emploi, déconoeler et ajouter 2 ml par litre de mil ieu
dont la stCr1li-té a dejà été contr6lée.
.- La.concontration du..mil.ieu en antibioti,que est donc de 230 u/ml pour la
p&icilline, et 100 vg/mI pour la streptomycine. Cette concentration
est utilisable pour toutes les cellules et virus.
. . /. . . .
-
-
3- ANTI BICTIQUES .EÏ ANTI Fr)NGIQUES IJTI Lt S,WlES
.
.I.. -<. . . .
Antibiotiques
Concentrations
Concentr?ti:;ns
recomm,?ndGcs
extrêmes
f%nicilline '
1W
uJml
1Q --
1 y-i..')
Streptomycine
53 pg/rril
1n-
, ,j-. ? ('1
Naomycine
75 VnJml.
5n -
1 F,;?
Bacitracinc
5” p$/ml
1"
T
5:‘.
(lr! l-l/mI)
(5 -
L.\\..P
.i('\\ )
Col irnycine
23 ktJn/ml
m-
5:-j.'
~xacilline
23 pg/ml
1n -
2(\\(,
Gentamycine
5rl ~y/mI-
1 n - 2-.!1.
Pciyfi?yxi.ne fj
‘1..
*,-.
51.%pg/r;iI..
1 C-j
-
1
(;('y\\
Kanamycine
109 pg/ml
lr) - 1 ",r: :.:
Tétracyciine
19 Il$ml
5
-
rT .-,
*‘I,
Chloram phcnicol
5
l-
..I
';>r.
iky!:l
I
Eryf-hmmyci ne
_.
. .-. !jC).
.
._
1'2 -
1 '..!'
Oloandomycine
7 Iq/ml
Tylosine
13 j*c.,/ml
._, ‘
l-
y‘,
Antifongique5
Amphot&ici ne 0
(Forqizone)
Mycostatine
(Nysts-tine)
Tzblezu tir6 en pari-le du livre : "Ccntaminstion in tic-s:.;? Culture"
JI?RXN FWt? Academic Pr6:;s.
Penici I I ine : ne pas I ‘uti I isor dans le vaccin si des phénomènes de sensi-
”
bi lisat ,ion ,i cet antibiotique sont à craindre sur les animaux
2 vacci net-. Prciférer alors la Col imyci ne et la Néomycine,
@e tels phenomènes
n’ont jamais ét6 observés en Ethi.opi-e:- .
Ch loram Phénicol
: ne jamais ut-i liser avec les tel jutes BHK 21.
Nycostati ne : elle est insoluble dans l’eau, elle est soluble dans l’alcool
à 9o”.
Mettre la poudre en suspension dans 5 fois son poids d’alcool
3 9oo.
Laisser en contact 24 heures.
Après ce laps de temps, d i I uer cette suspension dans un
soluté physiologique (PBS) et fi I trer. L’adjonction d’alcool
n’a pas d’ i nci dence sur la croissance des ce! I ul es 6tant
donné son extrême dilution finale,
Pratiquement,
ta Myoostatine que nous uti lisons (flacon
de 500 900 ~1 est stérile ; fors de I ‘uti I isation, nous la
mélangeons avec 13 ml cIveau disti 1 iée stéri le et obtenons
ainsi une solution 3 59 OCG u/mi en concentration finale de
50 p/ml.
. . .
La Mycostatine n90st pas utilisée en routine. On iÏvuti lise
seu I @ment I orsqu’ i l exi ste une ri sque de contami nation
fongique, en particu I i er avec le Hanks vi rus dans la produc-
tion du vi rus vacci n:-il .
. . .
.-..
ANNEXE IV (F.,!. 1
EYWlES DU GEL D’AL!JMINE
a) !,H = entre 5,9 et 7,2
b) Paurcentqe de matibre sèche l,'I 3 3 % selon
c) Adsor?ti;;~ L rnrl adswhE par 1% m;; dsA13rlj
1‘0u(7e Conno
33
,_
f'rot6ine (F%A) 56
d) %dimentation pour un gel 5 2 $ de ma-tiérs skhe = phase C;~;I ~::n
pourcentage.
.
C heure
1 !:.\\ y
lq heures
7 5 - 8r>
20 heures
63 - 66
30 heures
5.5 - 50
4.0 heures
5.2 - 5 5
50 heures
52
60 heures
52
:
2 - NC!l?!4ES ‘r I c:LOG t QUES
Le qei dPeluminc doit adsorb6 FL' mc2ins 2 fois 13 quanti-k; !c virus
emp 1 oy & pGut- le vaccin.
pcur t.ester cet-te capaci-ts cl5 ~33sorption,
on rnélan<;c? un3 .:;u~r~tit*~ fixe
de virw-3 aphteux 5 des quantités varizbies d'hydroxyde d'nlwirt~ ot on
recherche I-. virus dans le surnagwnt pst- fixntic?n r!u comridm:,nt C:A sur
culture -Je ci=!lules (titrane du surnaye~~n-t).
3- INSTITUTS SUSCEFTIGLES DE F'YJRNIi-? L'HYDI?~%YDL CsALUMINE
- Br,lF
- Labnratoirc ROGER? RELLr>N (S.A.)
159, Avenue du Poule
92 NEUlLLY-SUR-SEINE (France)
- SIJPER FlS Expert Company
(!'a- I?ii el s Neeqaard)
15 ,WALl EGADE
A N N E X E ‘il (F.A.1
PREPARAT I QN Dl! TAMP3N GLYCOCCL~E
Soude (NaoH)
5Q cj
Nac l
104 $l
Glycocol I e
158 9
Eau distillee QSP
1 NO ml
Filtrer sur EKS Ii et repartir en petits flacons de 20 mi. Conserver
3 + 4OC.
Le tampon qlycocolle sert à ajuster le pH du vaccin fini ?I 8,2 - 8,3
(5 ml par litre environ).
II sert Gcalement 6 alcaliniser le gel d'alumine avant et après..%
- stérilisation (pH 9' - 9,4).
.
:,~: i: d?i
Vi?s dans
.
Llil
:
at4 7,6 : dknuper les aphtes aux ciseaux, puis 5rr,yer au wr-l-iet-.
Cet-+-
cjer 1,:1 mn 5 3 ?Or! tours/mn en centrifugeuse t-~~fri~&r6s.
Le surnageant constitue I'inoculum.
13 - LES :3C:'V I NS
Utiliser si possible -es animaux demi-sanq taurins. Tes ~i+‘im:~ur doivwrt
être ~r~a!:~~~lenent
tri% sQroIegiri+~r:men-:
: i 1s ne deivent ‘7s ;;ri:serter
d'anticct-ps entiaphteux (lq SNC i nfArie,Jr
,,
21 I) 9 Jfj),
C - l NOCULAT 1 W
1 - Tranquilliser au Rompun (N.D. iX!'Ei?f
Injecter par voie intra-musculaire: 1 ml de la s~/uti';i~ 2 2 ,? 7,ut-
1cy-l !<cj 5e poids vif.
A 53-t-k dem,
le Rompun est s&:izti f e-t ~mycr;tI~x~n-t.
Les animaux se couchent spontan5ment en Jr‘- 2”1 nltl çlt j j.:,yk?,rI:-,ri 53-t ion
de la lar-quv est très ais&.
2- Inoculatien intrsdermolin~uals en points rapnr%zhis sur tn~~-!'~~ Jr; sur-
face de la Isnnue jusquPa 2C,-25 ml dFinoculum.
ret-1 nque j 1~5.7' i: t.li7ir:uc>
type tuberculine ou insuline (1 ml) aiguille cour-te : 25 - '?i/'?"L "GI;.
rjiseau vers le haut.
D- PRISE GE TEWEF?ATU!?E (facultative) toutes les 6 heures:
(DZsinfecter le thermem&tre c::)ns In soude 3 li? MI"
E- RECOLTE DES APHTES
Entre 24 et 26 heures après Ifinoculaiion, par arrachage à ta main de
la muqueuse linguale (après avoir tranquiI.l.i.s6 ou abattu l'animal),
Les aphtes sont pIa& dans un pot stérile immergé dans la glace
fondante jusqu'au moment de leur congeiation (conserver si possible à
- 80°C).
Un prélèvement est effectué pour contrôle par fi xation du complément.
N.B. - Les manipulations des animaux doivent être fai tes st6ri lensni
Ivêiements de travail, gants de caoutchouc stériles), Les bottes
sent passées dans de la soude 3 10 g/lltre.
II est intéressant de noter le moment de la y&&rafisation podale
mais on abattra ensuite les animaux le plus tôt possible car ils
repr&sentent une source importante de virus très actif.
-'TITRAGE DU VIRUS APHTEUX'SUR BOVINS -
AI Les bovins
II faut au moins deux animaux, si possible demi-sang taurins, exempts
d'anticorps (log SNC inférieur .? 0,301.
8) Dilutions
On fai t en général des dilutions en pu ssance de 10 à Partir de fa
dilution in i tiale (il s'agi-t en r,-$néral de
'extrait d'aphte au l/lO).
On uti I ise une pipette par dilution : la pipette mélange et mesure
une seule d ilution,
Les dilutions sont placées dans la Ctace jusqu'au moment de !?inocu-
lai i on.
C> L'inoculstlcn
If Tranquilliser au RomPun : 1 ml de la +++Ton 5 2 % Par 100 kg de
Poids vif fw+a intramuscuIak&.
2) On peut'inoculer 3 dilutions (4 au maximum) par langue à raison de
5 points de r),l ml chacun par dilution par voie strictement intra-
dermique.
Exemple de -i-ijra!;e sur deux languas de bwins :
-7
..h
1 3
1'1 _
, .')- 6
y-f
"5
-4
13
1 3
D) La lecture est faite 24 3 26 heures apr&s 1' inoculation ûpr& injection
de Rompun ûu ahattc7-e des animalw.,
.
.
”
<.
"Si Iîon'attend plus lorytemps, la'pr&ziçion de Ii: Iecttire e,ct mcjins
bonne, czr il y a ccnfluenc6 des qhtes.
E) Calcul du titre
Par la mbthode des -totaux cumulntifs,
on calcule le ?ourcenta?e des
r6sultats i:,Ssitifs obtenus pour chque dilution.
A p.-:rti Ï de ces résul.f-ats,. ~~:-~@ig-rnine
l,?.,c!!~e infectieuse 5:: 9 par
- .." <.
la m&thodv grsphiyue sur p;~~~ier mi I Iitn;$tr6.
-1-m-“--”
MINISTERE DE LA RECHERCHE
SCIENTIFIQUE ET TECHNIQUE
---w--..-e
1 NSTI TUT SENEGALA t S DE RECHERCHES
AGRICOLES (1 .S.R.A.)
-wM.w..I-..w
LABORATO t RE NATIONAL DE L9 ELEVAGE
ET DE RECHERCHES VETER I NA I RES
iI DAKAR - HANN
i
T E C H N I Q U E D E P R O D U C T I O N D E V A C C I N A N T I - A P H T E U X
UTt LISEE A U L A B O R A T O I R E D E D E B R E - ZEIT - E T H I O P I E
S T A G E F A O S U R L A P R O D U C T I O N D E V A C C I N S
D A K A R , DU 1 7 O C T O B R E A U 5 N O V E M B R E 1 9 8 3
P a r Y . LEFORBAN
R E F . No 76/VIRO.
O C T O B R E 1 9 8 3 .
-3
Lorsque I 90~ fait la trypsination
des 10 ou 12 FR, chaque boutai I le
est traitue individuel lement et les tel lules recuei f+i~es à partir do:-1 fia-
.<
con sont reparti es dans 2 flacons de 1 t i tr& de mi I i eu complet (mi 1 ieu avec
les sels de HKS supplémenté + antibiotiques + 5 $ de s&um de veau). Gn
litre de cellules servira à faire 6 flacons roulants. (1 FR estdonc multi-
plie par 13.1.
Cn a donc dans chaque f lacon a-
170 ml de solution
cet lulaire.
Chaque FR,. est numéroté de mani &re à rep&er
I es boutei I I es de la
même origine en cas de contami nation.
B- PRODUCT l ON V I RALE
1 - Choix des ‘types et des souches
En 19absence dfisoiement des types SAT et ASIA, nous produisons le
vaccin uniquement contre les 3 types européens 13, A et C.
Les souches de production sont des souches éthiopiennes qui ont ét6
isolées dans ce Laboratoi t-c. (Le Laboratoi re ne détient d’ai I 1 eurs aucune
souche vivante provenant de I ‘étranger).
Le chci x des souches vacci nal cs tient compte de i ‘étude s&-ologique
des souches éthiopiennes qui a i-t
3, 6 effectuée. La souche chai si e pour un
type doit proteger contre I e maximum de soucha; local es de même type. Le
choix se portera donc sur les souches qui ont le plus de points communs
avec les autres souches sauvages pr6va I entes,
Le choix est également fonction de I eur p I us ou moins grande faci I i té
de multiplication sur le substrat tel Iulaire utilisé (1 PRSr).
Au cwrs de I ‘annee 1974 - 1980, I es souches uti I i sées ont &te :
0 149 (Debr&Zeit)
i.sol ée .en,..octob,re 1977
. . . .._
A 110 (Gafarsa)
isolée en novembre 1974
c
54 (Assella Godu) isolee en juillet 1972.
. . . / . . .
- 4
2 - Nombre dé'passaqes
De mani8re à avenir le moins possible dvalt&-ation anti$niquz des
souch@s, nous limitons le nombre des passages B 5 c'est-A-dire que le pas-
. sap de production correspond au maximum au 56 passage du virus.
.
,.
3 - Pr6parati0n de Ivlnoculum viral
Lc stock production'vlrus cîest-&-dire P3 ou P,+ doit être; conservé
à - 70°C. Ce stock devra &tre constitu4 en debut d'annee et contr6l6 du
point de vue :
Sabouraud
- stérilité
VF
l Tryotose s&rum
- puret
: Typage 9n fixation du complément
- titre
: en fixation du compl&~ent et.sur cellule*
Ces différents saramètres se mai ntiendront constants 3 la température
de - 7C"C pendznt 1 an et il ne sera donc pas nécessaire de les verifier
pour chaque lot. Un bon inoculum doit remplir les conditions suivantes :
- titre
en FC .) i
- titre sur cellule IBHS2 10' IXP 5Wml
- destruction comnl<:te du tapis en 15 à 17 h.
Dans lb cas OCI une conservation de stock virus ne serait pas possible
à - 70°C, il nous parait pref6rabla de préparer un nouvel inoculum pour
chaque lot c!e production. C?i- inoculum devra être prGpar% quelqucjs jours
2 l'avance ot st?cké à -3O'C de mani&-e 21 avoir le temps d'effectuer les
contrtjfes (st&riliiG, pureté, titre).
4 - Producticn de virus vaccinal Fropreiment dit
Chaque FR ayant Yn tapis cellulaire complet (cc qui corrcs;;ond 5 J18
ou J 19 c?est-,à-dire (1. 3 5 jwrs apr&s 1~7 trypsinatic?n) est inocul6 avec
60 ml de virus dilué au & dans du HKS virus (cf. annexa 11.
.
.
/
.
.I.
- 5
Le mi l i eu Hanks vi rus est preparé dans les mêmes candi ti ons que le
Hanks ce! I ules et réparti dans des flacons plasma de 1 I i tre remplis 6
900 ml,
!a st6ri Ii-té est contrôleo et les antibiotiques sont r a j o u t é s a u
moment de 1 ‘emploi, en même temps que l p i nocu l um vi t-a I g Comm e pour la
production ce1 I ulai re,
les antifongiques ne sont pas uti 1 isécs en routine.
Chaque flacon de 900 ml reçoit 9 ml dg inoculum viral et servira à
inoculer 15 FR (60 ml d’inoculum viral dilué au & par flacon).
On procÉ:dera au changement du bouchon de chaque FR juste apres avoir
vidé le vieux milieu de culture.
Aussi-B-t après leur inoculation,
les FR sont replac6s sur le rol Ier.
La r&zolts se fait entre la 14ème et 17ème h. après I1inoculation.
L’inoculation devra donc être faite le soir entre 16 h et 18 h et la
récolte le lendemain matin entre 8 et 10 heures.
La destruction cellulaire doit être complète et la récolte consiste
3. verser le contenu de chaque flacon (débris cellulaires + virus) dans un
recipient de 10 litres muni d’un barreau magnétique pr6alablement refroidi
.a - ZO*C,
Cette r&colte doit être faite rapidement et le récipient contenant
le virus vaccinal doit être plac& dans la glace fondante,
Noter le pH de la récolte
Faire une prise dqéchantillon 20 à 50 ml pour :
- contrôie du type
- contrôle de stjri 1 i té
- titra(7e + i n f e c t i e u x
+ f i x a t i o n d u camp lément.
. . /. *..
- 6
C - TRANSFORMATION EN VACCIN
a) Etude analytique
J19
Aussitôt apres la'récolte, chloroformer à 7 p.lflOn (7 ml de chloro-
+forme par I tre de virus brut soit 42 ml pour 6 litres correspondant à
100 flacons roulants).
Mettre on agitatio,n.:à
+L)'C pendant 24 heures.
Pratiquement, on peut laisser le ballon dans le bain de $l!ce fondante
jusqu9au soir sous agitation. Le ballon est pIa& nu r&fri$rsteur C?ale-
ment sous agitation, seulement le soir. Ceci permet de maintenir le virus
à une temperature plus basse que lorsqu9iI est mis directement au r[fric@-
rkteur le matin après la recolte.
J20
Centrifuger : 1 500, 2 QOO tlmm pendent 15 minutes.
Pour cette centrifugation, nous utilisons j usqu'r~ présent 13 centrifu-
geuse refrigerée Jouan K63F êquipée de 4 pots de 750 ml.
Les put-s doivent être parfaitement &quilibres avec une brlanw Poberval
en double pesée sous peine d'avoir des vibrations trtk importnntos qui
endommagent la centrifugeuse,
Les pots sont munis d'un couvercle que nous n'utilisons pas, car nous
trouvons plus pratique de recouvrir les pots dc papier d'aluminium ou de
papier ordinaire ligaturés par une ficelle. Chaque pot est rempli zu maxi-
mum ‘3 650 ml. La mesure est faite avec un flacon ~lssn~a. IJn portoir en bols
pour les pots serait tres utile,
Avant leur utilisation, les pets sont s-terilises ainsi quc3 1; partie
métallique qui les contient. On dispose une fine coucha do r:r:t~n zu fond
de cette partie metallique,ce qui favori%: la pr6honsion du pot.
Dans 19avenir et en particulier si l'on veut prcduire plus de vaccin,
il faudra envisager une centrifugation en continu.
Après centrifugation, refaire une prise d'khantillon poi~r CcntrCles
(les @mes qu9avant chloroforme).
. . /. ,.,
- 7
Le virus avant et après centrifugation est conservé dans la glace
.fondante. Après centrifugation,
le virus est mis dans un ballon muni d'un
siphon. Ajouter l'hydroxyde d'alumine = 119 ml d'hydroxyde d'alumine à
3 0.100 de matière sèche par litr4+Q de virus clarifi'é et centrifuge (714 ml
pour 6 litres).
Agiter pendant f/2 H à 1 H à + 4'C et laisser dkanter jusqu'au lende-
main matin.
. .
Le pH de lshydroxyde d'alumino après sa~‘st&iIisation est entre 5 et
6, Nous procédons à son alcalinisation (pH 7,5) avec une solution de bicar-
-.'-...,^.., ..-, ,,
bonate à 7,5 $ sterile, juste avant son méfange avec ie vi-rus,
Lvhydroxyde d'alumine que nous utilisons est fournie jusqu'8 prisent
par le Laboratoire ROGER BELLON, (cf. annexe IV - preparakion de IOhydro-
xyde dvalumine),
J21
Concentration du vaccin. Cette opération a essentlellement pour but
de diminuer le volume ,de la dose vaccinale.
Reprendre le ballon contenant virus et l'hydroxyde d'alumine en ayant
grand soin de ne pas l!agiter.
Brancher le stphon sur un by pass equipit de 2 bouteilles plasma de
1 litre (le même que celui utilisC pour la filtration de milieu).
e
Une partie du surnac,eant est soutirée de manière W r8duire le volume
total de rnoitig.
Cette opération est effectuee avec une pompe dlectrique aspirante.
Type AL 17
Fabricant : KURT NEUBEKGER, 42, Rue de MU!
483C3 - SAINT-LOUIS (France)
Lvintensite de l'aspiration ne doit pas être trop forte pour ne pas
créer de turbulences dans le ballon qui risqueraient de temélanger Ivalu-
mine sedimentse.
Pour une production de ID0 flacons roulants, le volume est ramené à
2 860 mi ; on soutire donc : 6 000 + 714 + 42 - 2 860 = 3 900 ml.
Ajouter la saponine au virus concentre : 70 ml d'une solution à
17 p.lOOO,pour la quantité ci-dessus (annexe XI).
. . ./ . . .
Formoler i 0,3 F.~TIO de fr,rmIdehYde Fur. Le formol du commerce
titre entre 35 et 44 ?r de formaloehyde (cf.
annxe V '- ti tr3cje dti formol).
II faut donc caltiuler la quanti-t5 tic forrnsl du commerce ? ajouter.
Exemple
: si le forwl du commerce titre 35 $ de fotimaldehyde pur X
représente le volume en ml à ajouter (ce velum.e etrint r!iIur dans 6C ml
dfeau dis-i-ill&).
0,3
3 5
X
3 5 x
-i?m-=
100 '
,2 869 + 60 + /:F =
2 990 x 190
X =
2 99c, x 3,3 x 100 = 2 5F J ml
1 000 x 35
9
II faut donc ajouter 2,56 ml 1-1-1
t. -fot-~Ql du commerce qu'on diiue au
préalable dans 60 ml d9eau distiiI;fe,
'In obtient ainsi une concentration finale en formîldehydz Fur de
r>,3 p,lOOr).
Mettre en inactivation sous qitation magn?~tique au hein-mariE 9 30'
pendant 36 heures exactement.
Pratiquement, le vaccin est mis en inactivstion dans la mutines (J21)
et celle-ci est arrêt& le lendemain soir (J22) par mise au rGfri$rateur.
J23
Ajuster le pH Z 8,2 - 8,3 avec du tampon -lycocolle (cf annexe VII.
Répartir en flacons de 1 litre. Etiqueter.
b) Schéma rkeoitulatif
J19
Virus vaccinal brut
5 OCi': ml
clarification
+ 42 ml de
l
chloroforme
J20
Virus clarifié
6 042 ml
4
71~1 d'Al (oti) 3'
J21
Virus aluminé '
6 756 ml'
concentration
1
soutirer 3 900 ml
J22
Virus concentré
2 860 mt
I
ajouter 6c) ml de
formol et 70 ml de
sapcnine
. .
/a..
. . .
.., .,.
- 9
IVi rus i nacti vé 2 990 ml
a j u s t e r l e pH
10 à 15 ml de
çilycocolle
J23
Vaccin fini
3 Xh’l ml soit 1 8OQ doses monovalentes.
CONTROLES
1 - Stdri I i te bactérioloqique
En plus des contrôles effectues sur la semence et le virus vaccinal,
un dernier contrôle est effectu6 sur la vaccin final.
Nous uti I isons en routine les mi I ieux suivants :
- gelose sérum ou tryptose sérum
- boui I Ion ou thioqlycolate
- mi I i eu de Sabouraud.
Tous i es contrôles sont faits à 37’ et 22’C (température du Labora-
toi rel. Tous les mi I ieux doivent rester stéri I es,
2 - Conirôles’serolooiques
En cours de fabrication, on procëde au typage et au titrage du virus
par fixation du complément (technique KOLMER 17 lr)n $ d’hémolyse à chaud
en tubes ou en mi cropl aque) sur la semence et sur I e vi rus vacc inal avant
et après clarification par le chloroforme),
Pratiquement,
les deux réactions typage et titrage sont fa ites en
m%ne temps. On procède comme pour le typage di rect d’un vi rus en uti I isant
des dilutions différentes P 4 , -& .&&,
(annexe VI 1 - Titrage du vi rus
en FC).
I f ne doit y avoi r aucune fixation avec les types di f ferents et le
virus doit fixer au moins jusqu’au 3 avec le sérum de même type.
3- Contrôle du titre infectieux
On prccède au titrage sur tubes de tel lules IBRSz (O,l ml par tube,
5 tubes par di lution).
Qn commence à la dilution lOe4 et on va jusqu’a
16
La lecture se fait après 48 heures et le calcul du titre est effectué
par la méthode de KARBEE.
/
. . . . . .
-
_L_
..-.
- 1')
Avec les souches utilisees,
i;c titre mfnimal doit Gtre entre 107 DCP
50 $ /ml (cf. annexe VIII - Titrage du virus sur cellule).
4- lnocuitd
Il est pr0f&ablo de n'effectuer ce con-trTjle qu'ayrès un stockase de
..I
. ,, ^
15 jours au moins du vaccin 2 * 4OC au refri~<rateur.
-1 ..? . . ..--..-. . . ..~..A.... a., 1 l.*C .-. . ., . ,, . <..
II se fait sur souriceaux de 3-4 jours. Les souriceaux na c!oivent
être manipulas qusavec des gants st&riles (ne 'lais les toucher avec les
mains nues>.
Inoculer 2 portees avec ie vaccin dilué au 1/2 dans du (?US, rat- voie
IP 9 raison de 0,l ml par souriceau.
Observer pendant 10 jours, En cas de mortalitfi,
rechercher le virus
dans le cerveau et le muscle.
PrSlever muscle et cerveau (1 31 broyer avec un mel7nqe de tampon
véronal et de chloroforme (dilution 1/'2). D+kompl6rIsnter -19 mn ?. 56' dans
un flacon hermctiquement bouch4. A,jcuter ! ml de tarnnon v5ronal. Centrifu-
ger 23 mn S 3 NC t/mn. Eecueillir le surnar;enht;"P^roC~~er'crslri~~
pour un
typage direct d'echantillon.
5" Efficacit6
Ce contrôle n‘est effectue qu9apr&s le contrôle d'inocuitG sur souri-
ceau, Ce ccntr~le est effeqtu6 sur bwin et il sert i?q~Iemen-i- d!t ountt-ôle
d'inocui-6 sur bovin.
a) Contrôle dos anticorps après vâccins-tion
Des bovins en bonne sant6 (5 5 1C)) et ayant 6-î-6 contr0li?s au préalable
comme nrayant pas d'anticorps cTntre la F.A. (indice de sGron2utralisstion
<:Q,3) sont vaccinés sous la peau do I 'encolure avec une dose normale de
vaccin trivalent, 21 jours après I:2 vzlccinat‘ion;
les 'anticorps-Sont titrés.
par la -khniqu e de s&oneut?alisation (cf. annexe 1x1;
.
.
/
.
.*.
<
- 11
Une va i ence de vacci n est consi d6r6e comme acceptab I e quand el le donne
un titre troyen de I ‘indice de SN ‘> g99.
Selon les normes europhennes, un tel vaccin devrait c o n f é r e r u n e pro-
tection de l’ordre de 80 $ des animaux.
Ces normes bien que non directement transposables aux conditions
africaines, dcnnent cependant unr3 idée assez precise de la valeur du
vacci n.
b) Epreuve vi ru 1 ente
Cette épreuve doit être faits dans des candi tiens dP isolement strict
des ani maux.
PRINCIPE
Les bcvi ns (animaux 1/2 sang tauri ns exempts d’anticorps neutral i sant
ISN <:9,3) sont vaccinés avec une dose normale de vacci n tri valent et con-
trôl6s 21 jours aprè,= avec une dose fixe de vi rus ( 10 Qc)0 DiB/50 $1 par
voie intradarmol in9uale (101).
On peut uti 1 i ser ces mêmes animaux pour I e contre 1 e des anti corps 3
condition de prélever le sérum avant 19épreuvo virulente.
Après un délai d’observation de 6 jours, les animaux sont abattus et
les Ibsions notées.
- Présence ou absence d’aphtes primaires ( 1 i nc,uaux)
- Présence ou absence doaphtes secondaires (buccaux - podaux).
REALI SATI ON
- On doit utiliser au minimum 3 animaux par valence (2 vaccin& et 1 con-
t r ô l e ) .
- 21 jours après la vaccination, tranqui 1 iser les animaux Rompun (BAYER)
1 ml de soiution à 2 p.lr>O par 100 kc; de poids vif.
. . /. .*.
- 1%
Inoculer en IDI_ 13 MO DIBI50 $ par bovin. Iqoculor en % points $e
0,l ml (5 %Y? @IB/CiC! d par point) (voir annexe X - Préparation ct titrage
'dti vit-k dP6pr&ve sur bovin).
II fzut toujours inoculer en même temps au wins un 3ovin tGmfzin non
vaccine et dépourvu d'Ac neUtralisani.
LECTURE DES RESULTATS
Elle se fait apr&s 6 jours.
-.
__._.. ._. . .._ _ _
L é s i o n s linyuales
- Cvimportance des lésions primaires de In lanque est zpprkiüe en
divisant arbitrairement sa surface en 4 parties Qqales.
Lésions podales
,..
- Laver les pieds au jet tous les jours.
- La lecture SC fait au doigt er; cherchant 3 rompre les qthtes fiven-
tuels entre les onglons et sur le bourrelet coronaire.
Lésions buccales
- Elles coexistknt le plus souvent avec les Ikions poc!nIes.
Le critère de protection retenu er;t I'absenco do i&sions secondaires
podales.
Les animaux prnté&s peuvent pr&enter des lkions prlïnsirer lin+aies.
ANNEXE I (F.A.1
MILIEUY DE HANKS
_...
. .-
.-..
Milieu de base
Hanks virus
51
'101
._. '20'1
-'-.' 10 1
51
NaCI
Chlorure de sodium.
SC!
83
160
80
40
,.
Kci
Chlorure de potassium
2
4
.8
4
2
".
MgSQ+
1
2
4
2
1
(7H20)
Sulfate de magniistum 8
Cacl2
Chlorure de calcium
$7
b4
23
v
0,7
Anhydre (+ 2h20)
(0,93)
(1,851
(3,701
(1,85)
IO,93)
Na 2t-l POc Phosphate disodique
0,75
I
v
3,O
V
0,75
12H20
w2
POlf
Phosphate monopotassique
0,3
%6
132
0,6
0,3
I
lGlucose anhydre
I 5 I .' 10
1
20
l
10
I
5
1
Extrait de levure (DIFCO)
5
10
20
10
5
Hydrolysat de Iactalbwin 1 25 / 50 / ,mo j 50 / 25
(DIFCO)
/
W+q
1Bicarbonate de sodium
I
5
I
1 0
l
29
I
30
I
15
de iiouge 4s
Phénol à 10 $ (on ml)
i
l
Eau distill&e
fen.mJ)
4 750
9 590
1 9 nm
1 0 000
5 000
Le milieu est prf$sr6 en rnjou-i-ant à l'eau distillée les produits dans
l'ordre indiqu6.
Avant filtration, le pH est ajuste à 7- 7,2 avec Hcl $"
N
et NaoH -.
I
Le milieu de base est filtré en flacons de 1 litre remplis 2 950 ml
de. milieu.
Le Hanks virus est réparti en flacons de 1 litre remplis à 900 ml.
A;>res contt$le de stérilite : 24 h à 37'
48 h à zoo
Les flacons sont stock& à + JOC, les antibiotiques sont- ajout&
au mment de Ivemploi.
.
.
.
..I..
.
.”
.
,
_
Ajcrutw les produits dans 190rdrec 'I"'Verser lentmei+ i&de jusqu'à .. -" -
dissoiution de la aoudre,
.
.
<,
.
.,
_,
.
-
:I. .
.
Com;lCfer à 109 ml avec l'eau distillBe.
.
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1.
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I\\NNEXE II (F,Ar!
_ .
ANTIBIOTIQUES ET ANTIF3NGIQUES
t- PRINCIPES DPUTILISATl~N EN VIRî)LOGIE
<'
- Travailler avec le moins d'antibiotiques et d'antifongfqües 'possible.
- Lors de la.con~élati.o.,~.,et,.,3
la d~conqélaiion des cellules, faire si
r<.z..--- . ..- _ f.-..-l-..-,.-...,,.r
__I
possible deux ou trois passages sans antibiotique. S'il n'y a pas de
contamination, on est alors sur de la st&illté des cellules,
- Les antibiotiques et antifongfques sont utilisés uniquement ?I titre
préventff,
Ne jamais essayer de recupérer quelque chose de contaminé
c'est l'échec certain,
2 - ANTIBIOTIQUES UTILISES EN RWTINE
Penici lline G
2 millions d'unités
4 million5 U
Streptomycine
sulfate
19
29
Eau distillée
20 ml
40 ml
- Après dissoluti on, f ili-rer sur membrane millipore de 0,22 p
- Répartir st&ril ement en:fla.con de 5, ml 5 raison de 2 ml par ffacon.
- Congeler a - 3O'C.
- Au moment de l'emploi, déconoeler et ajouter 2 ml par litre de mil ieu
dont la stCr1li-té a dejà été contr6lée.
.- La.concontration du..mil.ieu en antibioti,que est donc de 230 u/ml pour la
p&icilline, et 100 vg/mI pour la streptomycine. Cette concentration
est utilisable pour toutes les cellules et virus.
. . /. . . .
-
-
3- ANTI BICTIQUES .EÏ ANTI Fr)NGIQUES IJTI Lt S,WlES
.
.I.. -<. . . .
Antibiotiques
Concentrations
Concentr?ti:;ns
recomm,?ndGcs
extrêmes
f%nicilline '
1W
uJml
1Q --
1 y-i..')
Streptomycine
53 pg/rril
1n-
, ,j-. ? ('1
Naomycine
75 VnJml.
5n -
1 F,;?
Bacitracinc
5” p$/ml
1"
T
5:‘.
(lr! l-l/mI)
(5 -
L.\\..P
.i('\\ )
Col irnycine
23 ktJn/ml
m-
5:-j.'
~xacilline
23 pg/ml
1n -
2(\\(,
Gentamycine
5rl ~y/mI-
1 n - 2-.!1.
Pciyfi?yxi.ne fj
‘1..
*,-.
51.%pg/r;iI..
1 C-j
-
1
(;('y\\
Kanamycine
109 pg/ml
lr) - 1 ",r: :.:
Tétracyciine
19 Il$ml
5
-
rT .-,
*‘I,
Chloram phcnicol
5
l-
..I
';>r.
iky!:l
I
Eryf-hmmyci ne
_.
. .-. !jC).
.
._
1'2 -
1 '..!'
Oloandomycine
7 Iq/ml
Tylosine
13 j*c.,/ml
._, ‘
l-
y‘,
Antifongique5
Amphot&ici ne 0
(Forqizone)
Mycostatine
(Nysts-tine)
Tzblezu tir6 en pari-le du livre : "Ccntaminstion in tic-s:.;? Culture"
JI?RXN FWt? Academic Pr6:;s.
Penici I I ine : ne pas I ‘uti I isor dans le vaccin si des phénomènes de sensi-
”
bi lisat ,ion ,i cet antibiotique sont à craindre sur les animaux
2 vacci net-. Prciférer alors la Col imyci ne et la Néomycine,
@e tels phenomènes
n’ont jamais ét6 observés en Ethi.opi-e:- .
Ch loram Phénicol
: ne jamais ut-i liser avec les tel jutes BHK 21.
Nycostati ne : elle est insoluble dans l’eau, elle est soluble dans l’alcool
à 9o”.
Mettre la poudre en suspension dans 5 fois son poids d’alcool
3 9oo.
Laisser en contact 24 heures.
Après ce laps de temps, d i I uer cette suspension dans un
soluté physiologique (PBS) et fi I trer. L’adjonction d’alcool
n’a pas d’ i nci dence sur la croissance des ce! I ul es 6tant
donné son extrême dilution finale,
Pratiquement,
ta Myoostatine que nous uti lisons (flacon
de 500 900 ~1 est stérile ; fors de I ‘uti I isation, nous la
mélangeons avec 13 ml cIveau disti 1 iée stéri le et obtenons
ainsi une solution 3 59 OCG u/mi en concentration finale de
50 p/ml.
. . .
La Mycostatine n90st pas utilisée en routine. On iÏvuti lise
seu I @ment I orsqu’ i l exi ste une ri sque de contami nation
fongique, en particu I i er avec le Hanks vi rus dans la produc-
tion du vi rus vacci n:-il .
. . .
.-..
ANNEXE IV (F.,!. 1
EYWlES DU GEL D’AL!JMINE
a) !,H = entre 5,9 et 7,2
b) Paurcentqe de matibre sèche l,'I 3 3 % selon
c) Adsor?ti;;~ L rnrl adswhE par 1% m;; dsA13rlj
1‘0u(7e Conno
33
,_
f'rot6ine (F%A) 56
d) %dimentation pour un gel 5 2 $ de ma-tiérs skhe = phase C;~;I ~::n
pourcentage.
.
C heure
1 !:.\\ y
lq heures
7 5 - 8r>
20 heures
63 - 66
30 heures
5.5 - 50
4.0 heures
5.2 - 5 5
50 heures
52
60 heures
52
:
2 - NC!l?!4ES ‘r I c:LOG t QUES
Le qei dPeluminc doit adsorb6 FL' mc2ins 2 fois 13 quanti-k; !c virus
emp 1 oy & pGut- le vaccin.
pcur t.ester cet-te capaci-ts cl5 ~33sorption,
on rnélan<;c? un3 .:;u~r~tit*~ fixe
de virw-3 aphteux 5 des quantités varizbies d'hydroxyde d'nlwirt~ ot on
recherche I-. virus dans le surnagwnt pst- fixntic?n r!u comridm:,nt C:A sur
culture -Je ci=!lules (titrane du surnaye~~n-t).
3- INSTITUTS SUSCEFTIGLES DE F'YJRNIi-? L'HYDI?~%YDL CsALUMINE
- Br,lF
- Labnratoirc ROGER? RELLr>N (S.A.)
159, Avenue du Poule
92 NEUlLLY-SUR-SEINE (France)
- SIJPER FlS Expert Company
(!'a- I?ii el s Neeqaard)
15 ,WALl EGADE
A N N E X E ‘il (F.A.1
PREPARAT I QN Dl! TAMP3N GLYCOCCL~E
Soude (NaoH)
5Q cj
Nac l
104 $l
Glycocol I e
158 9
Eau distillee QSP
1 NO ml
Filtrer sur EKS Ii et repartir en petits flacons de 20 mi. Conserver
3 + 4OC.
Le tampon qlycocolle sert à ajuster le pH du vaccin fini ?I 8,2 - 8,3
(5 ml par litre environ).
II sert Gcalement 6 alcaliniser le gel d'alumine avant et après..%
- stérilisation (pH 9' - 9,4).
.
:,~: i: d?i
Vi?s dans
.
Llil
:
at4 7,6 : dknuper les aphtes aux ciseaux, puis 5rr,yer au wr-l-iet-.
Cet-+-
cjer 1,:1 mn 5 3 ?Or! tours/mn en centrifugeuse t-~~fri~&r6s.
Le surnageant constitue I'inoculum.
13 - LES :3C:'V I NS
Utiliser si possible -es animaux demi-sanq taurins. Tes ~i+‘im:~ur doivwrt
être ~r~a!:~~~lenent
tri% sQroIegiri+~r:men-:
: i 1s ne deivent ‘7s ;;ri:serter
d'anticct-ps entiaphteux (lq SNC i nfArie,Jr
,,
21 I) 9 Jfj),
C - l NOCULAT 1 W
1 - Tranquilliser au Rompun (N.D. iX!'Ei?f
Injecter par voie intra-musculaire: 1 ml de la s~/uti';i~ 2 2 ,? 7,ut-
1cy-l !<cj 5e poids vif.
A 53-t-k dem,
le Rompun est s&:izti f e-t ~mycr;tI~x~n-t.
Les animaux se couchent spontan5ment en Jr‘- 2”1 nltl çlt j j.:,yk?,rI:-,ri 53-t ion
de la lar-quv est très ais&.
2- Inoculatien intrsdermolin~uals en points rapnr%zhis sur tn~~-!'~~ Jr; sur-
face de la Isnnue jusquPa 2C,-25 ml dFinoculum.
ret-1 nque j 1~5.7' i: t.li7ir:uc>
type tuberculine ou insuline (1 ml) aiguille cour-te : 25 - '?i/'?"L "GI;.
rjiseau vers le haut.
D- PRISE GE TEWEF?ATU!?E (facultative) toutes les 6 heures:
(DZsinfecter le thermem&tre c::)ns In soude 3 li? MI"
E- RECOLTE DES APHTES
Entre 24 et 26 heures après Ifinoculaiion, par arrachage à ta main de
la muqueuse linguale (après avoir tranquiI.l.i.s6 ou abattu l'animal),
Les aphtes sont pIa& dans un pot stérile immergé dans la glace
fondante jusqu'au moment de leur congeiation (conserver si possible à
- 80°C).
Un prélèvement est effectué pour contrôle par fi xation du complément.
N.B. - Les manipulations des animaux doivent être fai tes st6ri lensni
Ivêiements de travail, gants de caoutchouc stériles), Les bottes
sent passées dans de la soude 3 10 g/lltre.
II est intéressant de noter le moment de la y&&rafisation podale
mais on abattra ensuite les animaux le plus tôt possible car ils
repr&sentent une source importante de virus très actif.
-'TITRAGE DU VIRUS APHTEUX'SUR BOVINS -
AI Les bovins
II faut au moins deux animaux, si possible demi-sang taurins, exempts
d'anticorps (log SNC inférieur .? 0,301.
8) Dilutions
On fai t en général des dilutions en pu ssance de 10 à Partir de fa
dilution in i tiale (il s'agi-t en r,-$néral de
'extrait d'aphte au l/lO).
On uti I ise une pipette par dilution : la pipette mélange et mesure
une seule d ilution,
Les dilutions sont placées dans la Ctace jusqu'au moment de !?inocu-
lai i on.
C> L'inoculstlcn
If Tranquilliser au RomPun : 1 ml de la +++Ton 5 2 % Par 100 kg de
Poids vif fw+a intramuscuIak&.
2) On peut'inoculer 3 dilutions (4 au maximum) par langue à raison de
5 points de r),l ml chacun par dilution par voie strictement intra-
dermique.
Exemple de -i-ijra!;e sur deux languas de bwins :
-7
..h
1 3
1'1 _
, .')- 6
y-f
"5
-4
13
1 3
D) La lecture est faite 24 3 26 heures apr&s 1' inoculation ûpr& injection
de Rompun ûu ahattc7-e des animalw.,
.
.
”
<.
"Si Iîon'attend plus lorytemps, la'pr&ziçion de Ii: Iecttire e,ct mcjins
bonne, czr il y a ccnfluenc6 des qhtes.
E) Calcul du titre
Par la mbthode des -totaux cumulntifs,
on calcule le ?ourcenta?e des
r6sultats i:,Ssitifs obtenus pour chque dilution.
A p.-:rti Ï de ces résul.f-ats,. ~~:-~@ig-rnine
l,?.,c!!~e infectieuse 5:: 9 par
- .." <.
la m&thodv grsphiyue sur p;~~~ier mi I Iitn;$tr6.