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-
“3
* ,sli INSTITUT SENEGALAIS DE
&
RECRRRCRES AGRICOLES
(1. S. R. A.)
-------e-m-
LABORATOIRE NATIONAL DE L'ELEVAGE
ET DE RECJIERCBES VETERINAIRES
-----------
B.P.
2057
DAKARfHANN
SEMINAIRE F.A.O.
SUR LA PRODUCTION DES VACCINS BACTERIENNES
GAROUA : 22-24 MAI 1989
PRODUCTION ET CONTROLE DE QUALITE
DU VACCIN CONTRE LE CEOLERA-AVIAIRE
Par
Dr. Mamady KONTE
L.N.E.R.V.
- DAKAR/HANN - SENEGAL
REF. No
024 JBACTERIO.
MAI 1989
1 - GENERALITE3.
Comme tous les autres vaccins contre les Pasteurelloses animales,
le "Cholavil" ou vaccin
contre le Choléra aviaire est fabriqué au LNERV
depuis 1965 à l'aide de l'appareil de Sterne (Structure, montage et fonc-
tionnement donnés en annexes). Il s'agit en fait d'un fermenteur dépourvu
de régulateur
thermique (37'C) que l'on place dans une chambre-étuve, et
qui permet d'obtenir, en milieu liquide, des cultures extrêmement denses,
cette richesse en germe étant due :
- à l'utilisation de digestat de pancréas dans le milieu (apport
d'acides nucléiques),
- à une aération constante,
- à l'apport régulier de milieu neuf au moment où la culture est en
phase de croissance logarithmique.
La densité de ce produit doit êtreramenéeaux normes requises pour
présenter un nombre minimum de germes c'est à dire à une densité optique
égale au tube no 10 de Brown avant adjonction d'aldéhyde formique et répar-
tition en ampoules.
Le vaccin inactivé contre le Choléra aviaire préparée en LNERV est
un vaccin liquide en ampoule constitué par une culture totaleetconcentrée
de Pasteurella multocida types A,
inactivé par addition de formol à 3
p.1000.
II - PRODUCTION DU VACCIN CONTRE LE CHOLERA AVIAIRE.
A - Milieu de culture et de production.
l") Composition.
a-- -------
Pour 10 litres d'eau portée à 60°C (meilleure dissolution des in-
grédients et filtration plus rapide).
- Extrait de viande Liebig ..........................
90 g
- Bacto-Peptone Difco (ou Peptone équivalente) .......
100 g
- Chlorure de sodium ................................
50 g
- Digestat papaïnique de pancréas ...................
1.250 ml
- Glucose ...........................................
20 g
- Lactate de soude ..................................
35 ml
- Phosphate monosodique ............................
30 g
Le PH est ajusté à 7,5 - 7.8.
- 2 -
2O) Préparation du digestat papaïnigue de pancréas.
-es -m-w---------
------ - ---- ------ ---____
400 g de pancréas de bœuf, recueilli à l'abattoir, dégraissé et ha-
ché, sont mélangés à 1.500 ml d'eau distillée portée à 50°C, en présence de
5 g de papaïne. En une heure, la température est élevée à 70 OC (bain-marie).
La digestion est alors arrêtée en augmentant la température à 86 OC en quel-
ques minutes. Le produit de la digestion est recueilli après filtration sur
papier. Ce digestat acide peut être conservé à -2O'C.
L'autodigestat originel de Sterne, nécessitant des opérations beau-
coup plus longues, a été abandonné.
3O) Filtration
----------
Elle s'effectue par filtration sur filtre SEITZ de 10 litres pourvu
d'une membrane EKS-1. Afin de faciliter cette opération, il y a intérêt à
procéder à une clarification préalable sur un autre filtre SEITZ de 10 li-
tres pourvu d'une membrane AS.
Le milieu filtré et réparti dans des facons de Woolf de 10 litres
sera éprouvé pendant 24 h.
B- Préparation de l'inoculum.
l") Choix et entretien des souches.
------------------------------
Le choix du sérotype de Pasteurella multocida à utiliser est imposé
par l'affection à combattre et l'espèce animale.. Ainsi, pour vacciner la
volaille contre le Choléra aviaire, le sérotype A (selon la classification
de Carter, voir annexe) sera utilisé ; le sérotype D, ubiquiste aussi mais
moins important, peut lui être combiné ou non.
Les souches sont conservées lyophilisées, en évitant rigoureusement
les passages inutiles sur milieux artificiels. On lyophilisera ainsi une
culture iridescente sur gélose tryptose sérum récoltée en eau peptoncé et
diluée au 113 dans du sérum de bœuf, ou du sang virulent.
La souche de P. multocida utilisée dans la préparation du vaccin,
doit tuer la souris.
-3 -
2O) L'inoculum :
La souche lyophilisée est remise en suspension pour en-
__---------
semencer une boîte de Pétri en vue d'un réisolement en
même temps qu'un contrôle de pureté. Les colonies typi-
ques serviront à l'ensemencement de 6 tubes de gelose-
sérum en pente, distinées à ensemencer l'inoculum..
Au LNERV, l'inoculum est contenu dans un Erlen-Meyer de 2 litres à
la base duquel a été soudée une tubulure d'environ 6 cm (en remplacement
des flacons de Kitasato plus contraignants,utilisés
auparavant).
Chaque Erlen-Meyer contient au moins 1 litre de milieu filtré.
L'inoculum est utilisé 6 à 8 heures après son ensemencement avec
environ 60 ml de culture en tubes (6 tubes).
C- Ensemencement et mise en route de la culture.
l") Introduction de l'inoculum et début de la culture.
-------------------------------------------------
L'appareil sorti de l'autoclave est placé dans la chambre-étuve et
préparé. L'inoculum est versé dans la colonne.
Puis 2 litres de milieu
sont alors introduits, deux titres de milieu et 1 litre d'inoculum sont
alors présents dans l'appareil.
Après 3 heures de culture non aérée, 2 à 3 ml d'antimousse sont
alors introduits
ou la flamme et l'aération est mise en route.
3 heures plus tard, ou
laisse les 8 litres de milieu restant dans
le flacon de Woolf s'.écoul;erdans l'appareil. Cette mise en route, par
étapes de la culture assure une
densité optique maximum.
2O) Première récolte et récoltes ultérieures.
----------------------------------------
Au bout de 6 heures, la culture a atteint son développement maxi-
mum. La récolte est alors effectuée sous la flamme, le produit étant reçu
dans un ballon de 10 litres stérile.. La récolte s'arrête lorsque l'appa-
reil ne contient plus qu'un litre de culture. Le volume restant permettra
l'ensemencement de l'apport nouveau de milieu neuf. Un test de pureté pour
coloration de Gram
permet de vérifier que la récolte n'est pas contami-
née.
-4-
La récolte est formolée immédiatement à 3 p.1000, en prenant la
précaution de ne pas dépasser ce taux au risque de tuer les sujets vac-
cinés.
Du milieu neuf est de nouveau introduit dans l'appareil. 10 ml
d'antimousse stérile sont amenés par l'allonge, et la série des opéra-
tions précédemment décrites est répétée dans le même ordre chronologi-
que.
D- Résultats de production et conditions d'utilisation.
10 litres de culture permettent de fabriquer 20 litres de vac-
cins.
Le conditionnement est effectué en ampoules de 10 ml correspon-
dant à 10 doses pour le jeune poulet de 6 semaines (soit 1 ml), 5 doses
pour poulet adulte et canard (2 ml>, 2 doses pour l'oie et le dindon
adulte (5 ml).
Pour obtenir une bonne immunité, il est conseillé de renouveler
la vaccination 10 jours après la première injection, par voie intra-
musculaire au bréchet.
Ne pas vacciner avant 6 semaines et faire un rappel tous les 6
mois en cas de menaces.
III - CONTROLE DE QUALITE DU VACCIN CONTRE LE CHOLERA AVIAIRE.
Les contrôles sont à effectuer sur la suspension vaccinale for-
molées.
A- Stérilité.
Ensemencer en bouillon ordinaire, en bouillon viande-foie anaé-
robie, sur gélose tryptose.
Observation pendant3 à4 jours. Aucuneculturenedoitêtreobservée.
-5 -
N.B. : Les principales causes de contamination de l'appareil de Sterne
sont : inoculum souillé, milieu neuf souillé, manque d'antimousse, culture
refoulée par les orifices supérieurs, contamination au niveau du branche-
ment tubes de jonction rodés mâle-femelle.
B- IIlnoculté.
Inoculer 2 ml sous la peau d'un lapin qui sera mis en observation
pendant une semaine. Aucun trouble ne doit être observé.
C- Immunité.
Des sujets de 6 semaines ayant reçu 2 injections du vaccin à 10
jours d'intervalle, sont mis en présence de sujets atteints de choléra
ème
aviaire expérimental 7 semaines après la 2
injection.
-6-
A N N E X E 1 .
L'APPAREIL DE STERNE.
1 - DESCRIPTION DE L'APPAREIL.
Il est essentiellement constitué par une colonne de verre Pyrex
(Verrerie générale : 39 rue des Clo~s, Paris) (longueur : 89 cm : diamètre
intérieur : 15 cm ; épaisseur du verre : 8 mm), obturée aux deux extrémi-
tés par 2 couronnes métalliques par l'intermédiaire d'un joint caoutchouté
épais (1 cm). L'ensemble est maintenu par 5 tiges filetées aux estrémités
munies d'écrous papillons (schéma A).
Dans l'espace libre de la couronne, le joint supérieur est percé de
3 orifices :
- l'un (a) par où est introduit l'inoculum et le milieu, primitif puis
renouvelé,
- un second (b) qui sert à la fois à l'admission d'antimousse et à
l'évacuation de l'air,
- un troisième (c) permet également la sortie de l'air et le remplace-
ment de (a) en cas de rupture de ce dernier.
Le joint inférieur com$rte également deux ouvertures :
- l'une servant à l'arrivée d'air stérile (d),
- l'autre (e) à la récolte de la culture.
a) - L'introduction de l'inoculum et du milieu s'effectue par l'intermé-
diaire d'un tube en rhodorsil (0 intérieur 8 mm, résistance à l'au-
toclavage) pénétrant dans la colonne grâce à un tybe de 8 mm (@ ex-
térieur),
l'extrémité distale du tube souple porte un tube de jonc-
tion rodé Quickfit femelle (87/16) qui permet tous les branchements
(inoculum et milieu),
b) - celle de l'antimousse (préalablement homogénéité et stérilisé à l'au-
toclave en tubes à essai de 18 mm à 11O'C pendant 15 mm ; volume par
--
- 7 -
,
nt. ”
/
.
- 8 -
-9-
tube à essai : 10 cc) est effectuée par une allonge à plasma (f) et
un tube en rhodorsil identique au précédent, pénétrant dans la co-
lonne de verre par l'intermédiaire d'un morceau de canne de verre
(longueur environ 12 cc, 0 extérieur : 8 mm),
cl - identique à (a), assure la sortie de l'air et le remplacement de (a)
en cas de rupture, la culture pouvant ainsi être prolongée.
Diffuseur d'air (d) et tube de récolte (e) sont montés suivant le
schéma A.
Aération : l'air est fourni par un compresseur (petit compresseur
Prolabo ou mieux compresseur fournissant l'air comprimé dans l'ensemble
du laboratoire). Il est stérilisé par filtration (membrane EKS 1) par pas-
sage à travers un filtre Seitz à 100 cm3 (g) (ce filtre est maintenu par
une pince à 4 doits solidaire d'une noix fixée sur une des 5 tiges qui as-
sure la cohésion colonne de verre, joints et couronnes) et pénètre dans le
milieu sous forme de fines bulles qui se dégagent du diffuseur d'air (h)
(schéma A). Une pince clamp (j), placée entre le diffuseur d'air et le fil-
tre de 100 cm3, permet à volonté de suspendre l'aération (évitant le re-
foulement de la culture au moment de la récolte et l'humidification de la
membrane EKS I), de même, une autre pince clamp (k) est placée sur le tube
de vidange pendant le cours de la culture, l'extrémité en verre plonge
dans le formol.
Fixation de l'appareil : la colonne est fixée sur un chassis-support
(schéma B) en cornières Dixon. Ce chassis amovible permet la disposition
verticale de l'appareil dans la chambre-étuve et assure une bonne protec-
tion de l'ensemble au cours des opérations de transport et de stérilisation
à l'autoclave.
II - STERILISATION DE L'APPAREIL.
Contenant environ 15 ml d'eau distillée, la colonne et ses acces-
soires sont stérilisés à l'autoclave (45 mn à 120°C) dans l'état où ils
sont représentés sur le schéma A, (f) est obturé par un bouchon coton-
gaze recouvert de papier et ficelé (après stérilisation de papier est rem-
placé par du papier d'aluminium dont l'épaisseur est quadruplée par pliare),
(a) et (c) chacun par un tube à essai de 22 mm et un coton. La pince (j)
est maintenue en position ouverte.
- 10 -
Les tubes de jonction rodés femelles (a) et (c), l'allonge à plasma
(f), le tube de vidange (e) sont rabattus et immobilisés à l'aide de fi-
celles sur la colonne. L'ensemble préalablement fixé sur le chassis-support
(schéma B) à l'aide de fil de fer est disposé horizontalement dans l'au-
toclave (autoclave horizontal).
III - PREPARATION DE L'APPAREIL AUTOCLAVE PAR D ENARRAGE DE LA CULTURE.
L'appareil,
sorti de l'autoclave, est placé en position verticale
dans la chambre-étuve et fixé. Une série d'opérations est alors effectuée :
- reserrage des écrous papillons,
- fixation de l'arrivée d'air comprimé sur le filtre de 100 cm3 (g),
- (a) est dégagé, (c), et (f) fixés supérieurement en position ver-
ticale,
- (e) est introduit dans un tube de formol fixé inférieurement en
position verticale.
- (j) et (k) sont fermés.
La chambre-étuve doit être pourvue d'un bec bunsen alimenté en gaz.
- 11 -
A N N E X E 2 .
LISTE DU MATERIEL UTILISE.
- Canne de verre de 8mm de y3,
- Tubes à essais de fl 18,
- Tubes à essais de @ 22,
- Erlen-Meyer de 2 litres (pourvu d'un tube soudé à la base, atelier spé-
cialisé dans travail du verre),
- Flacons de Woolf de 10 litres (dont l'ouverture inférieure est étirée,
atelier spécialisé dans travail du verre),
- Flacons de 10 litres,
- Filtres SEITZ de 10 litres, membranes EKS 1 et AS correspondantes,
- Pinces clap de 6 cm,
- Filtres SEITZ de 100 cn't3, membranes EKS 1 correspondantes,
- Diffuseur d'air (SOVIREL),
- Tubes de jonction rodés mâles et femelles QUICPIT (87/16),
- Tubes de jonction rodés mâles et femelles SOVIREL (14/23),
- Tubes souples rhodorsil résistant aux conditions de stérilisation (@ in-
térieur 8 mm>,
- Filtre papier,
- Antimousse (Silicone, rhodorsil) (PROLABO),
- Pinces à 4 doigts, noix de fixation,
- Cornières DIXON,
- Fil de fer, ficelle, coton cardé, gaze, papier Kraft, etc...
- 12 -
ANNEXE 3.
CLASSIFICATION SEROLOGIQUE ACTUELLE DE PASTEURELLA MULTOCIDA
(types "capsulaires")
Essentiellement
Septicémie hémorragique des bo-
vins et des buffles d'Asie, du
Type R ...........
Proche-Orient et de l'Afrique
Pas d'acide hyalu-
orientale, des bisons d'Amérique.
ronique dans la
Exclusivement
capsule...........
Septicémie hémorragique des bi-
Type E ...........
vins d'Afrique occidentale et
centrale.
Très ubiquiste.
Nombreux types (ou sous-groupes)
probables
- Pasteurellose de l'llomme
1. En quantité tou-
- Pasteurellose bovine
jours importante
Acide hyaluronique
- Pasteurellose des petits Ru-
capsulaire........
Type A . . . . . . . . .
minants
- Pasteurellose porcine
- Pasteurellose du lapin
- Pasteurellose des oiseaux.
Ubiquiste,
comme pour le groupe A
2. Enquantitévariable
Nombreux types (ou sous-groupes)
Type D . . . . . . . . .
probables.
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RECRRRCRES AGRICOLES
(1. S. R. A.)
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LABORATOIRE NATIONAL DE L'ELEVAGE
ET DE RECJIERCBES VETERINAIRES
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B.P.
2057
DAKARfHANN
SEMINAIRE F.A.O.
SUR LA PRODUCTION DES VACCINS BACTERIENNES
GAROUA : 22-24 MAI 1989
PRODUCTION ET CONTROLE DE QUALITE
DU VACCIN CONTRE LE CEOLERA-AVIAIRE
Par
Dr. Mamady KONTE
L.N.E.R.V.
- DAKAR/HANN - SENEGAL
REF. No
024 JBACTERIO.
MAI 1989
1 - GENERALITE3.
Comme tous les autres vaccins contre les Pasteurelloses animales,
le "Cholavil" ou vaccin
contre le Choléra aviaire est fabriqué au LNERV
depuis 1965 à l'aide de l'appareil de Sterne (Structure, montage et fonc-
tionnement donnés en annexes). Il s'agit en fait d'un fermenteur dépourvu
de régulateur
thermique (37'C) que l'on place dans une chambre-étuve, et
qui permet d'obtenir, en milieu liquide, des cultures extrêmement denses,
cette richesse en germe étant due :
- à l'utilisation de digestat de pancréas dans le milieu (apport
d'acides nucléiques),
- à une aération constante,
- à l'apport régulier de milieu neuf au moment où la culture est en
phase de croissance logarithmique.
La densité de ce produit doit êtreramenéeaux normes requises pour
présenter un nombre minimum de germes c'est à dire à une densité optique
égale au tube no 10 de Brown avant adjonction d'aldéhyde formique et répar-
tition en ampoules.
Le vaccin inactivé contre le Choléra aviaire préparée en LNERV est
un vaccin liquide en ampoule constitué par une culture totaleetconcentrée
de Pasteurella multocida types A,
inactivé par addition de formol à 3
p.1000.
II - PRODUCTION DU VACCIN CONTRE LE CHOLERA AVIAIRE.
A - Milieu de culture et de production.
l") Composition.
a-- -------
Pour 10 litres d'eau portée à 60°C (meilleure dissolution des in-
grédients et filtration plus rapide).
- Extrait de viande Liebig ..........................
90 g
- Bacto-Peptone Difco (ou Peptone équivalente) .......
100 g
- Chlorure de sodium ................................
50 g
- Digestat papaïnique de pancréas ...................
1.250 ml
- Glucose ...........................................
20 g
- Lactate de soude ..................................
35 ml
- Phosphate monosodique ............................
30 g
Le PH est ajusté à 7,5 - 7.8.
- 2 -
2O) Préparation du digestat papaïnigue de pancréas.
-es -m-w---------
------ - ---- ------ ---____
400 g de pancréas de bœuf, recueilli à l'abattoir, dégraissé et ha-
ché, sont mélangés à 1.500 ml d'eau distillée portée à 50°C, en présence de
5 g de papaïne. En une heure, la température est élevée à 70 OC (bain-marie).
La digestion est alors arrêtée en augmentant la température à 86 OC en quel-
ques minutes. Le produit de la digestion est recueilli après filtration sur
papier. Ce digestat acide peut être conservé à -2O'C.
L'autodigestat originel de Sterne, nécessitant des opérations beau-
coup plus longues, a été abandonné.
3O) Filtration
----------
Elle s'effectue par filtration sur filtre SEITZ de 10 litres pourvu
d'une membrane EKS-1. Afin de faciliter cette opération, il y a intérêt à
procéder à une clarification préalable sur un autre filtre SEITZ de 10 li-
tres pourvu d'une membrane AS.
Le milieu filtré et réparti dans des facons de Woolf de 10 litres
sera éprouvé pendant 24 h.
B- Préparation de l'inoculum.
l") Choix et entretien des souches.
------------------------------
Le choix du sérotype de Pasteurella multocida à utiliser est imposé
par l'affection à combattre et l'espèce animale.. Ainsi, pour vacciner la
volaille contre le Choléra aviaire, le sérotype A (selon la classification
de Carter, voir annexe) sera utilisé ; le sérotype D, ubiquiste aussi mais
moins important, peut lui être combiné ou non.
Les souches sont conservées lyophilisées, en évitant rigoureusement
les passages inutiles sur milieux artificiels. On lyophilisera ainsi une
culture iridescente sur gélose tryptose sérum récoltée en eau peptoncé et
diluée au 113 dans du sérum de bœuf, ou du sang virulent.
La souche de P. multocida utilisée dans la préparation du vaccin,
doit tuer la souris.
-3 -
2O) L'inoculum :
La souche lyophilisée est remise en suspension pour en-
__---------
semencer une boîte de Pétri en vue d'un réisolement en
même temps qu'un contrôle de pureté. Les colonies typi-
ques serviront à l'ensemencement de 6 tubes de gelose-
sérum en pente, distinées à ensemencer l'inoculum..
Au LNERV, l'inoculum est contenu dans un Erlen-Meyer de 2 litres à
la base duquel a été soudée une tubulure d'environ 6 cm (en remplacement
des flacons de Kitasato plus contraignants,utilisés
auparavant).
Chaque Erlen-Meyer contient au moins 1 litre de milieu filtré.
L'inoculum est utilisé 6 à 8 heures après son ensemencement avec
environ 60 ml de culture en tubes (6 tubes).
C- Ensemencement et mise en route de la culture.
l") Introduction de l'inoculum et début de la culture.
-------------------------------------------------
L'appareil sorti de l'autoclave est placé dans la chambre-étuve et
préparé. L'inoculum est versé dans la colonne.
Puis 2 litres de milieu
sont alors introduits, deux titres de milieu et 1 litre d'inoculum sont
alors présents dans l'appareil.
Après 3 heures de culture non aérée, 2 à 3 ml d'antimousse sont
alors introduits
ou la flamme et l'aération est mise en route.
3 heures plus tard, ou
laisse les 8 litres de milieu restant dans
le flacon de Woolf s'.écoul;erdans l'appareil. Cette mise en route, par
étapes de la culture assure une
densité optique maximum.
2O) Première récolte et récoltes ultérieures.
----------------------------------------
Au bout de 6 heures, la culture a atteint son développement maxi-
mum. La récolte est alors effectuée sous la flamme, le produit étant reçu
dans un ballon de 10 litres stérile.. La récolte s'arrête lorsque l'appa-
reil ne contient plus qu'un litre de culture. Le volume restant permettra
l'ensemencement de l'apport nouveau de milieu neuf. Un test de pureté pour
coloration de Gram
permet de vérifier que la récolte n'est pas contami-
née.
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La récolte est formolée immédiatement à 3 p.1000, en prenant la
précaution de ne pas dépasser ce taux au risque de tuer les sujets vac-
cinés.
Du milieu neuf est de nouveau introduit dans l'appareil. 10 ml
d'antimousse stérile sont amenés par l'allonge, et la série des opéra-
tions précédemment décrites est répétée dans le même ordre chronologi-
que.
D- Résultats de production et conditions d'utilisation.
10 litres de culture permettent de fabriquer 20 litres de vac-
cins.
Le conditionnement est effectué en ampoules de 10 ml correspon-
dant à 10 doses pour le jeune poulet de 6 semaines (soit 1 ml), 5 doses
pour poulet adulte et canard (2 ml>, 2 doses pour l'oie et le dindon
adulte (5 ml).
Pour obtenir une bonne immunité, il est conseillé de renouveler
la vaccination 10 jours après la première injection, par voie intra-
musculaire au bréchet.
Ne pas vacciner avant 6 semaines et faire un rappel tous les 6
mois en cas de menaces.
III - CONTROLE DE QUALITE DU VACCIN CONTRE LE CHOLERA AVIAIRE.
Les contrôles sont à effectuer sur la suspension vaccinale for-
molées.
A- Stérilité.
Ensemencer en bouillon ordinaire, en bouillon viande-foie anaé-
robie, sur gélose tryptose.
Observation pendant3 à4 jours. Aucuneculturenedoitêtreobservée.
-5 -
N.B. : Les principales causes de contamination de l'appareil de Sterne
sont : inoculum souillé, milieu neuf souillé, manque d'antimousse, culture
refoulée par les orifices supérieurs, contamination au niveau du branche-
ment tubes de jonction rodés mâle-femelle.
B- IIlnoculté.
Inoculer 2 ml sous la peau d'un lapin qui sera mis en observation
pendant une semaine. Aucun trouble ne doit être observé.
C- Immunité.
Des sujets de 6 semaines ayant reçu 2 injections du vaccin à 10
jours d'intervalle, sont mis en présence de sujets atteints de choléra
ème
aviaire expérimental 7 semaines après la 2
injection.
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L'APPAREIL DE STERNE.
1 - DESCRIPTION DE L'APPAREIL.
Il est essentiellement constitué par une colonne de verre Pyrex
(Verrerie générale : 39 rue des Clo~s, Paris) (longueur : 89 cm : diamètre
intérieur : 15 cm ; épaisseur du verre : 8 mm), obturée aux deux extrémi-
tés par 2 couronnes métalliques par l'intermédiaire d'un joint caoutchouté
épais (1 cm). L'ensemble est maintenu par 5 tiges filetées aux estrémités
munies d'écrous papillons (schéma A).
Dans l'espace libre de la couronne, le joint supérieur est percé de
3 orifices :
- l'un (a) par où est introduit l'inoculum et le milieu, primitif puis
renouvelé,
- un second (b) qui sert à la fois à l'admission d'antimousse et à
l'évacuation de l'air,
- un troisième (c) permet également la sortie de l'air et le remplace-
ment de (a) en cas de rupture de ce dernier.
Le joint inférieur com$rte également deux ouvertures :
- l'une servant à l'arrivée d'air stérile (d),
- l'autre (e) à la récolte de la culture.
a) - L'introduction de l'inoculum et du milieu s'effectue par l'intermé-
diaire d'un tube en rhodorsil (0 intérieur 8 mm, résistance à l'au-
toclavage) pénétrant dans la colonne grâce à un tybe de 8 mm (@ ex-
térieur),
l'extrémité distale du tube souple porte un tube de jonc-
tion rodé Quickfit femelle (87/16) qui permet tous les branchements
(inoculum et milieu),
b) - celle de l'antimousse (préalablement homogénéité et stérilisé à l'au-
toclave en tubes à essai de 18 mm à 11O'C pendant 15 mm ; volume par
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tube à essai : 10 cc) est effectuée par une allonge à plasma (f) et
un tube en rhodorsil identique au précédent, pénétrant dans la co-
lonne de verre par l'intermédiaire d'un morceau de canne de verre
(longueur environ 12 cc, 0 extérieur : 8 mm),
cl - identique à (a), assure la sortie de l'air et le remplacement de (a)
en cas de rupture, la culture pouvant ainsi être prolongée.
Diffuseur d'air (d) et tube de récolte (e) sont montés suivant le
schéma A.
Aération : l'air est fourni par un compresseur (petit compresseur
Prolabo ou mieux compresseur fournissant l'air comprimé dans l'ensemble
du laboratoire). Il est stérilisé par filtration (membrane EKS 1) par pas-
sage à travers un filtre Seitz à 100 cm3 (g) (ce filtre est maintenu par
une pince à 4 doits solidaire d'une noix fixée sur une des 5 tiges qui as-
sure la cohésion colonne de verre, joints et couronnes) et pénètre dans le
milieu sous forme de fines bulles qui se dégagent du diffuseur d'air (h)
(schéma A). Une pince clamp (j), placée entre le diffuseur d'air et le fil-
tre de 100 cm3, permet à volonté de suspendre l'aération (évitant le re-
foulement de la culture au moment de la récolte et l'humidification de la
membrane EKS I), de même, une autre pince clamp (k) est placée sur le tube
de vidange pendant le cours de la culture, l'extrémité en verre plonge
dans le formol.
Fixation de l'appareil : la colonne est fixée sur un chassis-support
(schéma B) en cornières Dixon. Ce chassis amovible permet la disposition
verticale de l'appareil dans la chambre-étuve et assure une bonne protec-
tion de l'ensemble au cours des opérations de transport et de stérilisation
à l'autoclave.
II - STERILISATION DE L'APPAREIL.
Contenant environ 15 ml d'eau distillée, la colonne et ses acces-
soires sont stérilisés à l'autoclave (45 mn à 120°C) dans l'état où ils
sont représentés sur le schéma A, (f) est obturé par un bouchon coton-
gaze recouvert de papier et ficelé (après stérilisation de papier est rem-
placé par du papier d'aluminium dont l'épaisseur est quadruplée par pliare),
(a) et (c) chacun par un tube à essai de 22 mm et un coton. La pince (j)
est maintenue en position ouverte.
- 10 -
Les tubes de jonction rodés femelles (a) et (c), l'allonge à plasma
(f), le tube de vidange (e) sont rabattus et immobilisés à l'aide de fi-
celles sur la colonne. L'ensemble préalablement fixé sur le chassis-support
(schéma B) à l'aide de fil de fer est disposé horizontalement dans l'au-
toclave (autoclave horizontal).
III - PREPARATION DE L'APPAREIL AUTOCLAVE PAR D ENARRAGE DE LA CULTURE.
L'appareil,
sorti de l'autoclave, est placé en position verticale
dans la chambre-étuve et fixé. Une série d'opérations est alors effectuée :
- reserrage des écrous papillons,
- fixation de l'arrivée d'air comprimé sur le filtre de 100 cm3 (g),
- (a) est dégagé, (c), et (f) fixés supérieurement en position ver-
ticale,
- (e) est introduit dans un tube de formol fixé inférieurement en
position verticale.
- (j) et (k) sont fermés.
La chambre-étuve doit être pourvue d'un bec bunsen alimenté en gaz.
- 11 -
A N N E X E 2 .
LISTE DU MATERIEL UTILISE.
- Canne de verre de 8mm de y3,
- Tubes à essais de fl 18,
- Tubes à essais de @ 22,
- Erlen-Meyer de 2 litres (pourvu d'un tube soudé à la base, atelier spé-
cialisé dans travail du verre),
- Flacons de Woolf de 10 litres (dont l'ouverture inférieure est étirée,
atelier spécialisé dans travail du verre),
- Flacons de 10 litres,
- Filtres SEITZ de 10 litres, membranes EKS 1 et AS correspondantes,
- Pinces clap de 6 cm,
- Filtres SEITZ de 100 cn't3, membranes EKS 1 correspondantes,
- Diffuseur d'air (SOVIREL),
- Tubes de jonction rodés mâles et femelles QUICPIT (87/16),
- Tubes de jonction rodés mâles et femelles SOVIREL (14/23),
- Tubes souples rhodorsil résistant aux conditions de stérilisation (@ in-
térieur 8 mm>,
- Filtre papier,
- Antimousse (Silicone, rhodorsil) (PROLABO),
- Pinces à 4 doigts, noix de fixation,
- Cornières DIXON,
- Fil de fer, ficelle, coton cardé, gaze, papier Kraft, etc...
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ANNEXE 3.
CLASSIFICATION SEROLOGIQUE ACTUELLE DE PASTEURELLA MULTOCIDA
(types "capsulaires")
Essentiellement
Septicémie hémorragique des bo-
vins et des buffles d'Asie, du
Type R ...........
Proche-Orient et de l'Afrique
Pas d'acide hyalu-
orientale, des bisons d'Amérique.
ronique dans la
Exclusivement
capsule...........
Septicémie hémorragique des bi-
Type E ...........
vins d'Afrique occidentale et
centrale.
Très ubiquiste.
Nombreux types (ou sous-groupes)
probables
- Pasteurellose de l'llomme
1. En quantité tou-
- Pasteurellose bovine
jours importante
Acide hyaluronique
- Pasteurellose des petits Ru-
capsulaire........
Type A . . . . . . . . .
minants
- Pasteurellose porcine
- Pasteurellose du lapin
- Pasteurellose des oiseaux.
Ubiquiste,
comme pour le groupe A
2. Enquantitévariable
Nombreux types (ou sous-groupes)
Type D . . . . . . . . .
probables.