REPU%IQuE DU SElNEGAL -m-v---- INSTITUT...
REPU%IQuE DU SElNEGAL
-m-v----
INSTITUT SENEGALAIS DE IUiX3iER~s
AGRICOLES (I.S.R.A.1
----e-m.-
L,ABORA!JXfIRENATIONALDE LiELEVAGE
ETDERECHERCHES VETEPJNAIRES
c
ETUDE DE LA PROTECTIOK DES CAPRINS
CONTRE LA PESTE DES PETITS RUMINANTS
,1
APPLICATION DE L'IMMUNODIFFUSION
RADIALE
A NIASS, S. CISSOKHO, P. BOURDIN
ETUDE DE LA PROTECTION DES CAPRINS
CONTRE LA PESTE DES PETITS RUMINANTS
APPLICATION DE L'IMMUNODIFFUSION RADIALE
A NIASS, S. CISSOKHO, P. BOURDIN
--Mm--....“--
I - INTRODUCTION
S'il est avantageux d'utiliser la micm&thode de neutralisation
cinétique (possibilité de tester plusieurs sérums en une manipulation& il
est évident par contre que cette technique présente des inconvénients.
Outre la série de préparations préalables (culture des cellules, titrage du
virus, etc,.. 1, l'inconvénient majeur réside dans la longue attente des
résultats (6 jours).
Le but de ce présent travail est d'appliquer l'imnunodiffusion
mdiale en covaison avec la sérmreutralisation cinétique dans la recherche
d'anticorps maternels contre la peste des petits mrxinants et l'accroisse-
rrent du taux d'anticorps ap&s vaccination.
Cette rr$m technique servira à la &v&lation de sérmeutralisation.
II - MATERIEL ET METHODE
Séroneu~îsation cinétique
La technique de sémneutmlisation cinétique est décrite en 1967
par P. BOURJXN et col. (2).
Brièvement, les cupules rec;oivent 0,15 ti de chacune des dilutions
suivantes du sérum 1/2, 1/8, 1/16, 1/32, 1/64 puis 0,15 ml de virus bovip@+
tique souche III B titrant 1 DIC!'ï' lOO/ml. Ce qui ramène les dilutions des
sérums à 1/4, 1/16, 1/32, 1/64, 1/128.
. . ./ . . .
2
Ces rklanges virus-semms so~it incubés à 37*C 2 l'étuve. Apr& une
heure de contact, il est ajoute 3 chaque complexe antigène-;;nticorps 0,15 ml
de cellules I!DB?S (3) dont la concentration est de 10G 000 cellules par
millili-tze. 4 % de s&um foetal de veau est mis dans toutes les cupules
où la dilution du s&um est supposee insuffisante pour la bonne croismxe
des cellules.
Des térroins cellules, virus et s&xms accompagnent chaque série de
mriipulations.
IMMUNODIFFUSION RADIALE UDR)
tipmation de la gélose - antigene ettitrage des anticorps cl,71
A 25 ml de tampon de composition suivante :
Veronal sodique CO,05 M) DOO.... 10,3G9
Vermal acide
CG,01 M) a.ao.0. 1,842
Acétate de sodium anhydre oa*...
4,102
Eau distillée q.s.p. 0,*000..* 1 000
Gn ajoute 75 ml dPeau distillae et 2 grarmes d'indubiose A37. Potié
à ébullitionJ ce rklange reçoit de L'a~ide de sodium à l/lO 000 puis mt
reparti dans des tubes à raison de 10 rUtube.
En temps opportun, la $OS~ est fondue au bain-mrie et est ramnée
à 5S"-6O*C, A 1Ornl de gelose on a-joute cj ,,2 ml de virus bovipestique III B
soit l?équivalent de 10 doses vaccinales.
Le rr&.ange gélose-anti&ne ainsi obtenu est coule .sw lame a:],m+
reçu p&alablement une rrince couche adhésive. Des sa solidification, des
cupules de 2 m de diamètre sont creusées et reçoivent les diff&ntes
dilutions des sémms à tester ou des complexes virus-sérmts 3011" 1~ "I::r;ge
des anticorps résiduels.
‘ ,
L'incubation se fait en chambre humide à + 4OC pendant 24-48 heums.
LECTURE DES RESULTATS DE L'IDR
Pour une bonne interprétation des résultats, 2 lectures sont faites.
Une première au bout de 24 heures et une deuxi&w après 48 heures d'incuba-
tion,suîvie de la coloration des lamus.
colorant : le colorant utilisé est Ile noir amido de composition suivante :
Noir amido 10 B ....oaOL.*O*o
091 E?T-.
Acide acétique glacial .,aOOU 10 ml
Métll~Ol
. . . . . . . . ..1.DOODDOG 70 ml
Eau distillée . ..*..ea...a0. 20 rI.il
Le différenciateur
Acide acétique glacial .2006 10 ml
P6thanol .,........*.oe.-,000 70 ml
Eau distillée ..,...*..e.eea
20 ml
Technique de coloration
Après 98 heures d'incubation, les lames sont imwgées dans une
solution à 8 % de ClNa pendant 4 heures.
Un séchage sous papier buvard à 37OC sgen suit. Les lamzs ainsi
séchées sont plongées dans le colorant pendant 10 minutes puis on fait agi-
le différenciateur très rapidemnt.
Un deux@E séchage à l'air libre rwt fin à la coloration.
Les coumnnes de pticipitation se colorent intensémnt alors que la
surface libre ces lames reste presque incolore.
. . /
. .a.
Les groupes H et B proviennent de nèxes vaccinées 3 mis avant
la rfiise-bas ;
III - RESIJLTATS
ks r&ultats obtenus fi,gurxit dans les t?&lcaux 1 et 11,
=- Persistance des anticorps rwternels
Cczparant le SO des gwupes A et E du tableau I:, il est constat? que
les anticorps rr;3ternrls anti-P?R aussi bien neutralisamts que pticipitants,
persistent chez les chwreaux jusqu'ji l'.Qe dz 3 mis et disparaissent
au-dela. Ausai, peut-on rerxxrquer quz les taux d&lés cn si$xxwxtr&isation
com en i..rrxUrxxliffusion radiale sont bien inférieurs 2 la ~uantitit; c~*irnale
prctectrizc~. Cette quantité se situe entre le 1/20 et le 1/40.
5
Tableau no1
Sérun
SO
Sl s2 s3
si
groupe
d'âge
Recherche d'anticorps mater-
A
1/4
1/16
1/64
1/128
0
nels et accmissemmt du
taux d'anticorps après vac-
B
0
1/8
1/32
1/64
0
cination en sémneutralisa-
tion cinétique
C
l/b
1/32
1/64
1/128
0
Anticorps maternels et
A
1/2
1/8
1/32
1/64
0
accroissement du taux
d'anticorps après vaccina-
B
0
1/4
l/16
1/32
0
tion en IDR.
c
1/4
1116
l/32
1/64
0
1
t ST = Sérum témin de chèvres adultes saines et jmis vaccir&es.
- Accmissemnt du taux d'anticorps après vaccination (voir tableau 1)
On notera que dans chaque groupe d'âge, l'augmxtation du taux
d'anticorps neutralisants ou prkipitants est r@ulière. Ainsi dès la
deuxième semaine après la vaccination, le taux minimum protecteur d'anticorps
est atteint ou m@me dépassé.
- Immnodiffusion radiale - Système révélateur de neutralisation
Habituellerrrent une sémneutralisation nécessite un substrat biolo@--
que vivant : animux de laboratoire, oeufs embryonnés, cellules vivantes de
lignée ou de premier explantation,
Dans ce travail, nous avons
utilisé l'immnodiffusion radial?
pour révéler l'action d'un virus sur le sérum spécifique. Ainsi les sémuns
S3 des groupes A, B et C dilués dans du PBS d'une part et d'autre part dans
une suspension virale titrant 1 Dict lOO/ml ont p&senté des titres prkipi-
tants diffk-ents de 2 à 3 dilutions COR-E l'indique le tableau II.
. . /. .*.
SI’ = S&um tbmoin de chkma non vaccinee, non malade.
IV -' DISCUSSION
l- Persistance des anticorps maternels
La fotie rrcrtalit6 des chexeaux au cours des épid&&s de P.P.R.
a pour ori.~,;ine 12 rapide disparition des Ganticox-p maternels.
Cette sensibilitc se retrouve 6galement chez les adultes vaccines
depuis plus d'u-h ran et n'.ayant ~>as E<U de ra?pl vaccinal.
2 - Xmt6e des axticoms maternels
11 ressort des fisultats 53txnus que l'augmentation des anticcrps
est r+uliè3x2 .apwirs ~w3$-i.ation -ïans tous les <mupes mis est plus rapide
apr& le rapTje n Ainsi, au bout & deux semines les arirmux c‘e tcus ,3yes
sont ixxiunis~5s.
La s6rcneutralisatim nous Jonne des titres plus &wes,
Ce qui encore ure fois confim s2 plus pinde sensibi1it.c mis la x$dité
des ~sultuts de 1'IDR et la simplicité de sa tialisation yx&3enterït bien
des wanta:r;-s
-. i
Y.0 / .
.
.
7
3 - Aptitude de 1'I.D.R. à &vèler une neutralisation
k test de pr&ipitaciOn peut &R Utilisé pour titD3? kS mticoqJs
rhiduels après contact sérum-virus. Eh effet la Icéaction entre virus et
sérum ou entre détetinants antigéniques et sites anticorps à 37O, est
reflétée par une absence de précipitation entre sites anticorps et détermi-
nants antigéniques inclus dans la gélose. La question posée est de savoir
si cette révèlation de la neutralisation par l'absence de prhipitation est
due par une non diffusion des complexes formh, de taille plus grosse que
les tilles de la glose ou par défaut de sftes anticorps libres diffusant
dans la gélose.
CONCLUSION
A l'issue de ce travail, nous reconurandons la vaccination systhati-
que du cheptel caprin dès le second mis de la vie et de procéder à des
rappels annuels afin de p&munir ces ~animawc contre la PPR.
Il ressort aussi des rhultats obtenus, que l'immuncdiffusion radiale
pourrait être appliquée dans bien des travaux d'enquêtes sérologiques et
par con&quent dcans le diagnostic rétrospectif des maladies où les anticorps
Cr?éés ontPpropriété de précipiter.
A dgfaut de substrat biologique vivant et dans le cas de la peste
des petits ruknants, une séroneutralisation est toujours réalisable grâce
à la technique de lvinmunodiffu%ion radiale.
P~I? ces deux tests..t il a étd rrm!-rG que la forte ,xx%&itG des
jeunes chevreaux au cours des épid&ies de peste des petits ~?wkmzts~
a. pur origine le taux très faible des anticorps maternels r3t leur rapide
disparitiori au bout dîun mis.
Cette absence de pm-tection contre la PPR se ~trouve t~h~~z les
caprins adultes, vaccinés depuis plus (~'uI an,? qui pas d6faut de vsxinatrian
de r.~ppG., ont U-E faible taux d'~!&iomps ci et rzhxxvmt leur
sensibilit& au virus.
9
B I B L I O G R A P H I E
l- CUNNINGHAM (M.P.), BAILEY (N,M,) et KIMBER (C.D.1 - Cosage des Imo-
globulines IgM sur sang desséché comme épreuve p&liminaire pour le
dépistage de la trypanosotiase hurmine. OMS Trop. Inf./66.10.
2- BOURDIN (P.) et BERNARD (G.) - Application de la &thode de séroneutra-
lisation cinétique à la recherche des anticorps neutralisant le virus
de la Peste bovine chez les bovins, les ovins et les caprins.
Rev. Elev. tid. vét. Pays tro~.~ 20 (41, 531-536, 1967.
-
3- MNXN (S.D.) et DARBY (N.B.) (2958 - Establishmnt kidney cellules of
normal adult bovin and ovine origine. Pmc. Soc. Exp. Bio. Méd. 98, 574,
4- MOR%T (P-1, GILBERT (Y.), 0RU.E (J.), THIERY CG.1 et SOW CM.1 - La
Peste des petits ruminants en Afrique occidentale française : ses rap--
ports avec la peste bovine. Rev.Elev.Méd.vét.Pays
trop,, 1956, 9 pp.
313-342.
5- SCHILD (G.C.1 ad al. - The use of transportable single, radial-diffusi.on
irfmnoplates in seroepidemiological studies of influenza in the Gambie.
J.Gen.Vir., 16 : 231-236 (19721,
6- F&%EY (J.L.1 et MCKELVEY (E.M,) (1965) - Quantitative determination of
serum immunoglobulins in antibody-agar plates. J. Imnunol. 4 94 (1) :
-.
84-90.
-m-v----
INSTITUT SENEGALAIS DE IUiX3iER~s
AGRICOLES (I.S.R.A.1
----e-m.-
L,ABORA!JXfIRENATIONALDE LiELEVAGE
ETDERECHERCHES VETEPJNAIRES
c
ETUDE DE LA PROTECTIOK DES CAPRINS
CONTRE LA PESTE DES PETITS RUMINANTS
,1
APPLICATION DE L'IMMUNODIFFUSION
RADIALE
A NIASS, S. CISSOKHO, P. BOURDIN
ETUDE DE LA PROTECTION DES CAPRINS
CONTRE LA PESTE DES PETITS RUMINANTS
APPLICATION DE L'IMMUNODIFFUSION RADIALE
A NIASS, S. CISSOKHO, P. BOURDIN
--Mm--....“--
I - INTRODUCTION
S'il est avantageux d'utiliser la micm&thode de neutralisation
cinétique (possibilité de tester plusieurs sérums en une manipulation& il
est évident par contre que cette technique présente des inconvénients.
Outre la série de préparations préalables (culture des cellules, titrage du
virus, etc,.. 1, l'inconvénient majeur réside dans la longue attente des
résultats (6 jours).
Le but de ce présent travail est d'appliquer l'imnunodiffusion
mdiale en covaison avec la sérmreutralisation cinétique dans la recherche
d'anticorps maternels contre la peste des petits mrxinants et l'accroisse-
rrent du taux d'anticorps ap&s vaccination.
Cette rr$m technique servira à la &v&lation de sérmeutralisation.
II - MATERIEL ET METHODE
Séroneu~îsation cinétique
La technique de sémneutmlisation cinétique est décrite en 1967
par P. BOURJXN et col. (2).
Brièvement, les cupules rec;oivent 0,15 ti de chacune des dilutions
suivantes du sérum 1/2, 1/8, 1/16, 1/32, 1/64 puis 0,15 ml de virus bovip@+
tique souche III B titrant 1 DIC!'ï' lOO/ml. Ce qui ramène les dilutions des
sérums à 1/4, 1/16, 1/32, 1/64, 1/128.
. . ./ . . .
2
Ces rklanges virus-semms so~it incubés à 37*C 2 l'étuve. Apr& une
heure de contact, il est ajoute 3 chaque complexe antigène-;;nticorps 0,15 ml
de cellules I!DB?S (3) dont la concentration est de 10G 000 cellules par
millili-tze. 4 % de s&um foetal de veau est mis dans toutes les cupules
où la dilution du s&um est supposee insuffisante pour la bonne croismxe
des cellules.
Des térroins cellules, virus et s&xms accompagnent chaque série de
mriipulations.
IMMUNODIFFUSION RADIALE UDR)
tipmation de la gélose - antigene ettitrage des anticorps cl,71
A 25 ml de tampon de composition suivante :
Veronal sodique CO,05 M) DOO.... 10,3G9
Vermal acide
CG,01 M) a.ao.0. 1,842
Acétate de sodium anhydre oa*...
4,102
Eau distillée q.s.p. 0,*000..* 1 000
Gn ajoute 75 ml dPeau distillae et 2 grarmes d'indubiose A37. Potié
à ébullitionJ ce rklange reçoit de L'a~ide de sodium à l/lO 000 puis mt
reparti dans des tubes à raison de 10 rUtube.
En temps opportun, la $OS~ est fondue au bain-mrie et est ramnée
à 5S"-6O*C, A 1Ornl de gelose on a-joute cj ,,2 ml de virus bovipestique III B
soit l?équivalent de 10 doses vaccinales.
Le rr&.ange gélose-anti&ne ainsi obtenu est coule .sw lame a:],m+
reçu p&alablement une rrince couche adhésive. Des sa solidification, des
cupules de 2 m de diamètre sont creusées et reçoivent les diff&ntes
dilutions des sémms à tester ou des complexes virus-sérmts 3011" 1~ "I::r;ge
des anticorps résiduels.
‘ ,
L'incubation se fait en chambre humide à + 4OC pendant 24-48 heums.
LECTURE DES RESULTATS DE L'IDR
Pour une bonne interprétation des résultats, 2 lectures sont faites.
Une première au bout de 24 heures et une deuxi&w après 48 heures d'incuba-
tion,suîvie de la coloration des lamus.
colorant : le colorant utilisé est Ile noir amido de composition suivante :
Noir amido 10 B ....oaOL.*O*o
091 E?T-.
Acide acétique glacial .,aOOU 10 ml
Métll~Ol
. . . . . . . . ..1.DOODDOG 70 ml
Eau distillée . ..*..ea...a0. 20 rI.il
Le différenciateur
Acide acétique glacial .2006 10 ml
P6thanol .,........*.oe.-,000 70 ml
Eau distillée ..,...*..e.eea
20 ml
Technique de coloration
Après 98 heures d'incubation, les lames sont imwgées dans une
solution à 8 % de ClNa pendant 4 heures.
Un séchage sous papier buvard à 37OC sgen suit. Les lamzs ainsi
séchées sont plongées dans le colorant pendant 10 minutes puis on fait agi-
le différenciateur très rapidemnt.
Un deux@E séchage à l'air libre rwt fin à la coloration.
Les coumnnes de pticipitation se colorent intensémnt alors que la
surface libre ces lames reste presque incolore.
. . /
. .a.
Les groupes H et B proviennent de nèxes vaccinées 3 mis avant
la rfiise-bas ;
III - RESIJLTATS
ks r&ultats obtenus fi,gurxit dans les t?&lcaux 1 et 11,
=- Persistance des anticorps rwternels
Cczparant le SO des gwupes A et E du tableau I:, il est constat? que
les anticorps rr;3ternrls anti-P?R aussi bien neutralisamts que pticipitants,
persistent chez les chwreaux jusqu'ji l'.Qe dz 3 mis et disparaissent
au-dela. Ausai, peut-on rerxxrquer quz les taux d&lés cn si$xxwxtr&isation
com en i..rrxUrxxliffusion radiale sont bien inférieurs 2 la ~uantitit; c~*irnale
prctectrizc~. Cette quantité se situe entre le 1/20 et le 1/40.
5
Tableau no1
Sérun
SO
Sl s2 s3
si
groupe
d'âge
Recherche d'anticorps mater-
A
1/4
1/16
1/64
1/128
0
nels et accmissemmt du
taux d'anticorps après vac-
B
0
1/8
1/32
1/64
0
cination en sémneutralisa-
tion cinétique
C
l/b
1/32
1/64
1/128
0
Anticorps maternels et
A
1/2
1/8
1/32
1/64
0
accroissement du taux
d'anticorps après vaccina-
B
0
1/4
l/16
1/32
0
tion en IDR.
c
1/4
1116
l/32
1/64
0
1
t ST = Sérum témin de chèvres adultes saines et jmis vaccir&es.
- Accmissemnt du taux d'anticorps après vaccination (voir tableau 1)
On notera que dans chaque groupe d'âge, l'augmxtation du taux
d'anticorps neutralisants ou prkipitants est r@ulière. Ainsi dès la
deuxième semaine après la vaccination, le taux minimum protecteur d'anticorps
est atteint ou m@me dépassé.
- Immnodiffusion radiale - Système révélateur de neutralisation
Habituellerrrent une sémneutralisation nécessite un substrat biolo@--
que vivant : animux de laboratoire, oeufs embryonnés, cellules vivantes de
lignée ou de premier explantation,
Dans ce travail, nous avons
utilisé l'immnodiffusion radial?
pour révéler l'action d'un virus sur le sérum spécifique. Ainsi les sémuns
S3 des groupes A, B et C dilués dans du PBS d'une part et d'autre part dans
une suspension virale titrant 1 Dict lOO/ml ont p&senté des titres prkipi-
tants diffk-ents de 2 à 3 dilutions COR-E l'indique le tableau II.
. . /. .*.
SI’ = S&um tbmoin de chkma non vaccinee, non malade.
IV -' DISCUSSION
l- Persistance des anticorps maternels
La fotie rrcrtalit6 des chexeaux au cours des épid&&s de P.P.R.
a pour ori.~,;ine 12 rapide disparition des Ganticox-p maternels.
Cette sensibilitc se retrouve 6galement chez les adultes vaccines
depuis plus d'u-h ran et n'.ayant ~>as E<U de ra?pl vaccinal.
2 - Xmt6e des axticoms maternels
11 ressort des fisultats 53txnus que l'augmentation des anticcrps
est r+uliè3x2 .apwirs ~w3$-i.ation -ïans tous les <mupes mis est plus rapide
apr& le rapTje n Ainsi, au bout & deux semines les arirmux c‘e tcus ,3yes
sont ixxiunis~5s.
La s6rcneutralisatim nous Jonne des titres plus &wes,
Ce qui encore ure fois confim s2 plus pinde sensibi1it.c mis la x$dité
des ~sultuts de 1'IDR et la simplicité de sa tialisation yx&3enterït bien
des wanta:r;-s
-. i
Y.0 / .
.
.
7
3 - Aptitude de 1'I.D.R. à &vèler une neutralisation
k test de pr&ipitaciOn peut &R Utilisé pour titD3? kS mticoqJs
rhiduels après contact sérum-virus. Eh effet la Icéaction entre virus et
sérum ou entre détetinants antigéniques et sites anticorps à 37O, est
reflétée par une absence de précipitation entre sites anticorps et détermi-
nants antigéniques inclus dans la gélose. La question posée est de savoir
si cette révèlation de la neutralisation par l'absence de prhipitation est
due par une non diffusion des complexes formh, de taille plus grosse que
les tilles de la glose ou par défaut de sftes anticorps libres diffusant
dans la gélose.
CONCLUSION
A l'issue de ce travail, nous reconurandons la vaccination systhati-
que du cheptel caprin dès le second mis de la vie et de procéder à des
rappels annuels afin de p&munir ces ~animawc contre la PPR.
Il ressort aussi des rhultats obtenus, que l'immuncdiffusion radiale
pourrait être appliquée dans bien des travaux d'enquêtes sérologiques et
par con&quent dcans le diagnostic rétrospectif des maladies où les anticorps
Cr?éés ontPpropriété de précipiter.
A dgfaut de substrat biologique vivant et dans le cas de la peste
des petits ruknants, une séroneutralisation est toujours réalisable grâce
à la technique de lvinmunodiffu%ion radiale.
P~I? ces deux tests..t il a étd rrm!-rG que la forte ,xx%&itG des
jeunes chevreaux au cours des épid&ies de peste des petits ~?wkmzts~
a. pur origine le taux très faible des anticorps maternels r3t leur rapide
disparitiori au bout dîun mis.
Cette absence de pm-tection contre la PPR se ~trouve t~h~~z les
caprins adultes, vaccinés depuis plus (~'uI an,? qui pas d6faut de vsxinatrian
de r.~ppG., ont U-E faible taux d'~!&iomps ci et rzhxxvmt leur
sensibilit& au virus.
9
B I B L I O G R A P H I E
l- CUNNINGHAM (M.P.), BAILEY (N,M,) et KIMBER (C.D.1 - Cosage des Imo-
globulines IgM sur sang desséché comme épreuve p&liminaire pour le
dépistage de la trypanosotiase hurmine. OMS Trop. Inf./66.10.
2- BOURDIN (P.) et BERNARD (G.) - Application de la &thode de séroneutra-
lisation cinétique à la recherche des anticorps neutralisant le virus
de la Peste bovine chez les bovins, les ovins et les caprins.
Rev. Elev. tid. vét. Pays tro~.~ 20 (41, 531-536, 1967.
-
3- MNXN (S.D.) et DARBY (N.B.) (2958 - Establishmnt kidney cellules of
normal adult bovin and ovine origine. Pmc. Soc. Exp. Bio. Méd. 98, 574,
4- MOR%T (P-1, GILBERT (Y.), 0RU.E (J.), THIERY CG.1 et SOW CM.1 - La
Peste des petits ruminants en Afrique occidentale française : ses rap--
ports avec la peste bovine. Rev.Elev.Méd.vét.Pays
trop,, 1956, 9 pp.
313-342.
5- SCHILD (G.C.1 ad al. - The use of transportable single, radial-diffusi.on
irfmnoplates in seroepidemiological studies of influenza in the Gambie.
J.Gen.Vir., 16 : 231-236 (19721,
6- F&%EY (J.L.1 et MCKELVEY (E.M,) (1965) - Quantitative determination of
serum immunoglobulins in antibody-agar plates. J. Imnunol. 4 94 (1) :
-.
84-90.