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REPUBLIQUE DU SENEGAL
**********
MINISTERE DU DEVELOPPEMENT RURAL
ET DE L’HYDRAULIQUE
*t********
‘*
INSTITUT SENEGALAIS DE RECHERCHES
AGRICOLES (I.S.R.A.)
**********
DEPARTEMENT DE RECHERCHES SUR LES
PRODUCTIONS ET LA SANTE ANIMALES
**********
LABORATOIRE NATIONAL DE L’ELEVAGE
ET DE RECHERCHES VETERINAIRES
B.P. 2057
,Y
yy-
*
7 4 ,,,. 2
:.:
: 3
DAKAR - HANN
/,.J
w.--
\\
ETUDE DE LA PESTE PORCINE
AFRICAINE AU SENEGAL
Rapport final
Programme de recherche financé par la
Commission des Communautés européennes
Direction générale de la science, de la
recherche et du développement
*
,
, t
Contrat n”TSDA 21 S/CEE
REF. NOSO/PATH. INF
Juin 1987 - Décembre 1989
AOUT 1990.
RAPPORT FINAL
JUIN 1987 - DECEMBRE 1989
CONTRACTANT : Institut sénégalais de Recherches
Agricoles (ISRA)
C O N T R A T no T S D - A 219/CEE
CHEF DU PROJET : Joseph SARR
TITRE DU PROJET: Etude de la peste porcine africaine :
cartographie des variétés antigéniques
LIEU D’IMPLANTATION DU PROJET : Laboratoire national
d’Elevage et de Recherches vétérinaires
BP 2057 - DAKAR-HANN
(Sén&gal)
T A B L E D E S M A T I E R E S
1. INTRODUCTION . . . * . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
1
II. PLAN DE TRAVAIL . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
2
Ill. ELEVAGE PORCIN AU SENEGAL . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
3
A- Les races porcines . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
3
B - Le mode d’élevage . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
3
C- Conclusion 0s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
4
IV. EPIDEMIOLOGIE DE LA PESTE PORCINE AFRICAINE
AU SENEGAL . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
5
A - Historique . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
5
B - Origine de la maladie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
5
C- Situation actuelle de la Peste porcine africaine au Sénégal..
6
D- Le mode d’infection . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ...*.*...
8
E- Conclusion . . . ..e...........................“..............
8
V. ENQUETE SERO-EPIDEMIOLOCIQUE . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
9
A - Matériel et méthode . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
9
1. Echantillonnage . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
9
2. Les prélèvements . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
9
3. L’antigène . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
9
4. Test Elisa
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
1 0
B- Résultats . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..*...................
1 4
C- Discussion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
14
D - Conclusion . . . . . . . * . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . * . . . . . . . . . . . .
15
IV. ISOLEMENT ET IDENTIFICATION DE VIRUS DE LA
PESTE PORCINE AFRICAINE . . . . . . . . . . . . . . . . . ..*............
16
A- Matériel et méthode . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
16
1. Prélèvements . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
16
2. Isolement de virus . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
16
a) Inoculation au porcelet . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
17
b) Inoculation cultures cellulaires
17
. . . . . . . . . . . . . . . . . .
3. Identification du virus de PPA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
17
B- Résultats . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
18
C- Discussion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
19
D - Conclusion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
19
VII. ETUDE COMPARATIVE DE SOUCHES ISOLEES PAR LES
ANTICORPS MONOCLONAUX . . . . . . * . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . * . .
20
VIII. ETUDE DES CONDITIONS D’APPARITION D’ANTICORPS
NEUTRALISANTS
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
20
IX. CONCLUSION GENERALE . . . . . . . * . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
2 1
X. DEPLACEMENTS A L’ETRANGER . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
22
ANNEXES
1 - Préparation d’antigènes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
23
4
2 - T e s t Elisa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
25
3 - Epreuve d’hémadsorption . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
26
4- Préparation cultures leucocytes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
29
5 - Culture leucocytes à partir du sang . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
30
6 - Culture leucocytes (moelle osseuse) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
3 1
7 - Préparation conjugué fluorescent . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
32
1. INTRODUCTION
La Peste porcine africaine (PPA) est une maladie infectieuse hautement conta-
gieuse qui frappe avec une mortalité de presque 100 p. 100, tous les Porcs du
genre Sus.
Cliniquement,
il s’agit en règle générale, d’une maladie à évolution aiguë, mais
qui a pu revêtir parfois des formes suraiguës, chroniques ou même atypiques.
Malgré de grandes similitudes cliniques et anatomo-pathologiques avec la Peste
porcine classique (PPC), cette affection décrite pour la première fois par
MONTGOMERY (1921) sous le nom d’East african Swine Fever a pour origine
un virus qui ne présente pas de relations morphologiques ni même immunolo-
giques avec le virus de la Peste porcine classique.
Ce virus dont les analogies structurales avec
des virus affectant des
espèces très éloignées des Suidés (Grenouilles, Reptiles) et singulièrement de
certains insectes
(Tipula et Sericesthis) est classé dans le groupe de
Iridoviridae.
Un seul sérotype du virus de la Peste porcine africaine est connu.
Pourtant, il n’existe pas de protection hétérospécifique entre les différents
isolats.
Cette absence de protection croisée ne peut s’expliquer que par de larges
variations antigéniques du virus.
L’étude de ces variations par les anticorps monocolonaux présente l’avantage
de mettre en évidence les différentes structures antigéniques qui sont certes
le meilleur reflet des mutations génomiques entre les souches virales.
Aussi, dans la forme aiguë et chronique de la maladie, l’absence d’anticorps
neutralisants n’est pas expliquée.
La recherche de conditions d’induction d’anticorps neutralisants (modification
d’antigènes à partir de souches locales, mutagenèse, etc.. .) pour la mise au
point d’un vaccin, constitue l’objectif principal du programme.
I
. . . . . .
- 2
I I . PIAN D E T R A V A I L
1, Etablissement de la carte épidémiologique de la Peste porcine africaine
au Sénégal.
2. Isolement et identification de souches de peste porcine africaine à
partir de foyers ; constitution d’une banque de souches virales.
3. Production d’anticorps monoclonaux anti-PPA et étude comparative
des souches isolées avec d’autres souches africaines, européennes et
asiatiques, etc.. .
4. Etude des conditions d’apparition d’anticorps neutralisants à partir
de la banque de souches (mutagenèse, modifications d’antigènes, etc.. . ).
__ ___._ --.-. -
- 3
III. L’ELEVAGE PORCIN AU SENEGAL
La zone d’élevage porcin correspond à toute la façade Ouest du pays face a
l’Océan Atlantique où la population est en majorité chrétienne ou animiste.
C’est une bande longue de 500 kms et large de 100 kms environ (carte).
L’élevage porcin y est presqu’essentiejlement paysan en dehors de quelques
exploitations de type coopératif autour des grandes villes (Dakar, Thiès,
Mbour, Ziguinchor, Bignona.. . 1.
Les effectifs dépassent rarement 15 animaux par exploitation familiale,
Les porcheries des centres urbains s’approvisionnent à partir des villages.
La population porcine totale du pays est estimée à 400 000 têtes.
A. Les races porcines
Elles ont été très peu étudiées au Sénégal.
L’existence d’une forte pression de races importées comme la “Large White”
fait que les races locales généralement naines et très rustiques cèdent progres-
sivement la place à des métissages non contrôlés.
Cependant, dans le Sud du Pays, toutes les tentatives d’introduction de races
améliorëes ont échoué.
B. Le mode d’élevage
c
Le mode d’élevage est conditionné par l’alimentation. II est de trois types :
- élevage en liberté,
- élevage en hutte
- élevage de type moderne.
. . . / . . .
- 4
_ Les deux premiers types sont pratiqués en milieu rural.
Pendant la saison sèche (octobre - juin), les animaux sont laissés en totale
liberté : ils sont chargés de trouver p’endant la journée leur propre nourriture,
L’élevage en hutte prend le relais en saison des pluies. Les animaux sont
enfermés dans des enclos de fortune à cause des cultures. Ils sont nourris
avec les restes de cuisine et du son de riz, mil, sorgho, maïs, etc...
l’élevage de type moderne concerne généralement les centres urbains.
Néanmoins, une partie des aliments est constituée par les déchets de cuisine
des restaurants.
C. Conclusion
Les races porcines existantes et le mode d’élevage constituent les principaux
facteurs déterminants de I’épidémiologie de la Peste porcine africaine au Sénégal.
. . /. .,.
- 5
IV. EPIDEMIOLOGIE DE LA PESTE PORCINE AFRICAINE AU SENEGAL
A. Historique
En septembre 1959, est observée une mortalité importante dans l’effectif porcin
du km 17 de la Route de Rufiçque (Région de Dakar),
A cet endroit, sont installés un certain nombre de porcheries exploitées par des
ressortissants des Iles du cap-Vert.
Les animaux vivent dans des conditions d’hygiène très sommaires. La maladie
sévit depuis plusieurs semaines entraînant une forte mortalité.
Le diagnostic de peste porcine africaine fut confirmé au mois d’octobre de la
même année.
A la suite de cette épizootie, d’autres foyers furent observés :
- Elevage de la Charcuterie Moderne,
- Base aérienne de Ouakam,
- Km 23, Route de Rufisque,
- Caserne des troupes aéroportées,
- Km 7, Route de Rufisque.
L’allure de la maladie diffère sensiblement de celle observée dans le premier
foyer. A la forme épizootique, succède une forme sporadique.
Seuls quelques animaux dans chaque porcherie sont atteint et succombent.
B. Origine de la maladie
L’origine peut être située en Guinée-Bissau (ex. Guinée Portugaise).
En 1958, une mortalité importante dans l’effectif porcin avait été constatée.
L’examen des prélèvements expédiés au Laboratoire de Dakar avait permis de
reconnaître des lésions histopathologiques caractéristiques de la maladie.
. . . I . . .
- 6
La peste porcine africaine a dû donc s’étendre de la Guinée-Bissau, au Sud
du Sénégal (Casamance) où des éleveurs de la Région de Dakar effectuent
des achats pour approvisionner leurs porcheries.
Un animal porteur de virus a pu, dans ces conditions, amener la maladie dans
dans la Région de Dakar.
C. Situation actuelle de la PPA au Sénégal
Selon une étude FAOIBanque Mondiale, en 1982, pour le compte des services
vétérinaires du Sénégal, du fait de la peste porcine, l’effectif des porcins est
passé de 332 000 têtes en 1977 à 141 000 seulement en 1981.
C!est ainsi, qu’au cours de l’année 1987, de nombreux foyers ont été enregis-
trés à travers le pays (tableau no1 ).
Tableau no1 : Foyers enregistrés entre 1986 et 1989
Loca I i tés
Année
Nombre de morts
Malades
Ziguinchor
. Séminaire Saint-Louis 1986
1986
40
. tindiane
1987
?
. Tilène
1987
7
Oussouye
. Oussouye
1987
plusieurs centaines
1988
à chaque foyer)
1989
. Diaken Diola
1987
1
. Emaye
1989
120
Brin
. Brin
1987
3
. . . / . . .
- 7
Niaguls
. Niaguis
1986
Non précisé
1987
Bignona
. Manguilly
1987
9
1988
Plus de 100
, Bassène
1988
Plus de 100
. Tandiem
1987
12
Fatick
. Diouroup
1987
50
Dakar
. Grand-Yoff
1987
20
1987
2
Thiès
. Thiès
1989
30
Les taux de mortalité enregistrés ainsi que la taille des foyers sont générale-
ment sous-estimés compte tenu :
- l’état de liberté totale des animaux entre octobre et juin,
- des échanges entre villages et/ou villes sans contrôle.
II reste de nombreux foyers qui ne sont pas toujours déclarés par les services
vétérinaires ; le laboratoire les ayant pour la plupart découvert lors de ses
enquêtes sur le terrain.
. . . / . . .
- 8
D. Le mode d’infection
La Peste porcine africaine est enzootique chez les races locales mais revêt
parfois des allures épizootiques lors d’introduction de souches virales haute-
ment pathogènes.
L’infection procède souvent de la contagion directe. Les grandes périodes de
mortalité dans les zones dlenzootie correspondent :
- à la mise en liberté des porcs (fin de la saison des Pl:uies),
- à la mise en enclos (début de la saison des pluies).
Le rôle des vecteurs (tiques, insectes hématophages) dans la transmission de
la maladie n’a pas fait l’objet d’études au Sénégal.
- La faune sauvage peut également jouer un rôle comme réservoir à virus en
particulier dans les régions de Fatick et de Ziguinchor où le phacochère peut
entrer en contact direct avec le porc domestique.
Cependant, il est plus probable que le réservoir à virus soit aujourd’hui le
porc lui-même.
E. Conclusion
Le mode d’élevage favorise la dissémination des souches de virus.
Dans une même porcherie, plusieurs souches peuvent être impliquées.
L’absence de protection hétérospécifique entre les différents isolats fait qu’il
n’y a presque jamais de rescapés.
De plus, les formes aiguës et chroniques de l’affection sont les plus fréquem-
ment rencontrées, entraînant une délimitation quasi-impossible des foyers.
. . . / . . .
- 9
IV. ENQUETE SERO-EPIDEMIOLOGIQUE
Les formes aiguës et chroniques de la Peste porcine africaine sont marquées
Par une hypergammaglobulinémie (anticorps précipitants et fixants le complément).
Mais compte tenu du caractère progressif de la maladie, les guérisons sont rares ;
les animaux porteurs d’anticorps sont généralement excréteurs de virus.
A. Matériel et méthode
1. Echantillonnage
L’échantillonnage a été effectué selon un tirage au hasard au niveau des diffé-
rents villages de la zone d’élevage.
70 à 80 p.100 des porcheries des villages retenus ont été visités et le groupe
de porcs saignés pour chaque exploitation peut être considéré comme représen-
tatif (environ 30 p. 100 également pris au hasard).
2. Les prélèvements
1 062 prélèvements de sang ont été effectués par la veine jugulaire au
vacutainer.
Après coagulation, les sérums sont décantés par centrifugation à 2 000 trs/mn
pendant 15 mn, puis aliqoutés et congelés à -20°C en attendant d’être testés.
3. L’antigène
L’antigène est produit à partir de cellules de lignée MS infectées par la souche
Espagne 70 de Peste porcine africaine.
L’antigène est obtenu par solubilisation des membranes des cellules infectées.
. . . / . . .
- 10
II s’agit de la protéine VP 73 de membrane du virus, purifiée par centrifuga-
tion au gradient de saccharose (voir annexe 1).
4. Test Elisa
L’antigène est absorbé sur microplaque Elisa (Nunc Intermed).
Les sérums a tester sont dilués au 1/30è pour réduire le bruit de fond.
Le complexe antigène-anticorps est révélé par la protéine A marquée à la
péroxydase (voir annexe 2).
. . . / . . .
“..
- 11
Tableau 2 : Résultats de l'enquête séro-épidémiologique
Nombre de
Département
Localité
Nombre de
prélèvement
Observa-
chef lieu
lrélèvement
tions
positifs
Oussouye
Oussouye
43
7
Diaken Diola
26
9
Oukout
39
19
Hlump
50
6
Boukitingo
15
1
Niassia
Niassia
20
0
brin
28
7
Seleki
24
5
Niaguis
Kaniaka (Adean)
6
1
Niaguis
20
4
Bignona
Tobor
30
2
Manguilly
79
34
Bassène
35
9
Tandième
19
9
Soutou
29
16
Koutinghor
29
4
Niassaran
26
1
Bindago
13
3
Piran
25
1
Diourou
19
3
Diaboudior
19
4
Kaodioul
21
3
Kassila
19
0
Affiniam
Affiniam
31
7
Elana
41
2
Ziguinchor
Lindiane
27
2
Camp Saouli
24
3
Lindiane Manjak
12
6
Lindiane
12
2
Sinediane
12
2
Boudodi
06
2
Séminaire St-Lou.i.s
4
1
Santiaba
10
0
Petit Kandé
26
8
Grand Kandé
06
0
Djefaye
28
6
Tilène
67
29
'stick
Fatick
Fatick
20
Diouroup
59
Sokone
Sokone
41
Keur Ndiouga
2
Phacochurc
- 12
ZONE D’ELEVAGE PORCIN
Tableau 3 : prévalence de la Peste porcine africaine dans
les départements / chef lieux
Nombre de
% d’animaux
Départements/
Nombre de
prélèvements
porteurs de
chef-lieux
prélèvements
positifs
virus
Ziguinchor
234
61
26,l + 7,4 %
Oussouye
173
42
24,3 t 8,4 8
N iassia
72
12
17
t 11,s %
Niaguis
26
5
19,2
Bignona
363
89
24,s k 5,8 90
Affiniam
72
9
12,s rt: 10 %
Sokone”
43
0
0,oo
Fatick
79
0
0,oo
Total
1 062
/
N.B : L’intervalle de confiance est calculé pour un coefficient de
sécurité de 95 %.
* Département où porcs sauvages et domestiques peuvent entrer en
contact direct.
Tous les phacochères testés sont également négatifs.
- 14
9. Résultats
En Casamance, on trouve des porteurs de virus dans presque toutes les loca-
lités visitées (tableaux 2 et 3).
A Bignona, Oussouye et Ziguinchor, les taux respectifs sont de 24,5 1 5,8 p.100
24,3 1: 8,4 p.100 et 26,l ? 7,4 p.100, soit environ un quart de la population
porcine de ces départements.
Niassia, Niaguiss et Affiniam sont encore moins infectés mais les taux restent
encore relativement élevés.
Dans le nord de la zone d’élevage, Fatick et Sokone, tous les animaux testés
sont négatifs.
C. Discussion
La région d’élevage comprend deux graindes régions :
- le Sud, la Casamance,
- le Nord, de Sokone à Dakar.
II s’agit de deux zones écologiques différentes, séparées par le territoire de
la Gambie où il n’y a presque pas de porcins sauf à Banjul la capitale où vit
un petit noyau de population chrétienne.
Toute la région Sud est une zone de forêts.
Le portage de virus y est extrêmement important et l’on rencontre surtout
la forme chronique de la Peste porcine africaine.
Cette situation s’explique par le fait que l’on y trouve que des races locales
très rustiques qui se sont, avec le temps, adaptées à la maladie et manifes-
tent une certaine résistance.
. . . / . . .
- 15
La circulation quasi-permanente de souches atténuées pourrait également
augmenter cette résistance naturelle.
C’est pourqoui, toutes les tentatives d’amélioration génétique de ces races,
par l’introduction de porcs de race Large White, ont échoue.
La région nord est une zone de savane où les races locales ont presque
disparu.
Les produits de croisement (Large White x races locales) sont extrêmement
sensibles à la Peste porcine africaine.
Les formes aiguës et chroniques de la maladie sont exceptionnelles.
On rencontre surtout la forme suraigüe avec une mortalité avoisinant 100 p.100.
Les prévalences nulles rencontrées dans ces localités visitées s’expliquent par
l’absence de porteurs chroniques de virus chez les races améliorées.
Cependant, de nombreux foyers ont été signalés ces dernières années, notam-
ment à Dakar, Thiès et Fatick où des souches virales ont été isolées.
Les problèmes liés au (x) réservoir (s) et au (x) vecteur (s) dans la trans-
mission restent malheureusement entiers.
Mais, il est probable que l’apparition de foyers, en particulier, dans la région
nord soit davantage liée à l’introduction d’animaux porteurs de virus à partir
du sud du pays.
D. Conclusion
L’interdiction des échanges d’animaux dans le sens Sud -> Nord demeure aujour-
d’hui une condition indispensable pour le contrôle de la maladie dans la
région Nord.
. . . / . . .
- 16
VI. ISOLEMENT ET IDENTIFICATION DE VIRUS DE LA
PESTE PORCINE AFRICAINE
Les formes aigües et suraigües de la IPeste porcine africaine sont généralement
rencontrées chez les produits de croisement (Large White x races locales) dans
la zone d’élevage au nord du pays.
Les mortalités enregistrées lors de ces foyers sont voisines de 100 p.100.
Au sud du pays, la forme chronique est de loin la plus fréquente.
Pendant la phase finale de la maladie, on rencontre de la pleuropneumonie,
une gastrite, des adénites nécrosantes parfois accompagnées d’une péricardite
et des arthrites.
Les mortalités. sont très variables. Le virus peut alors être isolé à partir de la
plupart des organes.
A. Matériel et méthode
1. Prélèvements
Les prélèvements sont constitués de sang prélevés sous anticoagulant à partir
de la veine jugulaire au vacutainer de porcs malades ou d’organes (rate, gan-
glions) d’animaux morts suspects de Peste porcine africaine.
Tous les prélèvements sont conservés à -2OOC dans l’obscurité en attendant
d’être testés.
2. Isolement de virus
L’isolement de virus comprend toujours deux phases :
- inoculation du prélèvement au porc (enrichissement),
- passage sur culture de leucocytes circulants de porc.
. . . / . . .
- 17
a) Inoculation au porcelet
Les prélèvements d’organes sont broyés, centrifugés à +4OC à 4 000 trs/mn
pendant 30 mn. Le surnageant est aliquoté avant d’être inoculé au porcelet
âgé de 2 à 3 mois à raison de 1 ml, par voie intramusculaire.
Le sang décongelé est inoculé également dans les mêmes conditions.
Pour éviter le mélange des souches, un seul prélèvement est inoculé à la fois
et le porcelet est isolé pendant toute la phase d’observation (3 semaines).
Les malades sont sacrifiés in extrémis, puis la rate et les ganglions mésenté-
riques sont prélevés pour l’inoculation aux leucocytes de porc.
b) Inoculation aux cultures cellulaires
Des cultures de leucocytes circulants âgés de 72 heures, à raison de 0,2 ml/
tube du surnageant de broyat de rate etlou de ganglion préparé comme
précédemment et filtré sur millipore 0,2 u (technique de culture de leucocytes
voir en annexes 3, 4, 5, 6).
5 tubes sont utilisés par prélèvement.
Ensuite les tubes sont placés à 37OC sur “roller” et observés tous les jours
pour Ilhémadsorption puis pour l’effet cytopathogène (8 jours environ).
Les tubes positifs sont congelés à -2OOC en attendant l’identification.
3. Identification du virus de la Peste porcine africaine
L’identification est réalisée par immunofluorescence directe sur culture de
leucocytes de porc en tubes de Leighton avec lamelle.
L’immunofluorescence (technique en annexe 7) est réalisée à 24, 48 et 72
heures après inoculation. Pour cela, des séries de 6 tubes avec lamelles sont
préparés à cet effet.
/
. . . . . .
.-___.
.--
- 18
B. Résultats
Au total, 13 souches de virus de la Peste porcine africaine ont été ainsi isolées
et identifiées.
Dix proviennent des différentes régions du Senégal, deux du Zai’re et une
des Iles du Cap-Vert (tableaux 4 et 5).
Tableau 4 : Isolements de virus PPA
Nombre de
l solement dl
Foyers
Année
Ma lades
morts
virus
Tandiem
1987
12
1
T”l
(Bignona)
Diouroup
1987
50
4
DPl
(Fatick)
DP2
Grand-Yoff
1987
20
3
GdY,
(Dakar)
1987
5
2
W2
Brin
1988
?
1
Brl
(Ziguinchor)
Tilène
1988
?
1
(Ziguinchor)
TZl
Lindiane
1988
50
1
(Ziguinchor)
Lzl
Oussouye
1989
100
2
O y1
Oukout
1989
50
1
Okl
Thiès
1989
30
3
En cours
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.
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1 9
-
Tableau 5 : Autres souches de virus isolées
Souche
Origine
Année
I
isolée
Kinshasa
1988
Kin,
(Zaïre)
Kin 2
Iles du Cap-Vert
i 987
Pra,
(Praia)
C. Discussion
La plupart des souches virales ont éte isolées en Casamance où la Peste
porcine africaine sévit à l’état enzootique.
La résistance relative des races locales fait que les mortal ités sont très varia-
bles d’une année à une autre.
Cependant, ces souches passées sur des porcs Large Whit e au Laboratoire,
se sont toutes révélées extrêmement pathogènes.
Tous les animaux inoculés ont tous developpé
la forme suraiguë de la maladie,
la mort survenant 4 à 6 jours après inoculation.
Les produits de croisement (Large White x races locales) de la région nord
servent de révélateurs de ces souches à chaque fois qu’elles y sont introduite
lors des échanges etlou cérémonies familiales.
D. Conclusion
Ces souches isolées au niveau de toute la zone d’élevage constituent la banque
à partir de laquelle seront menées les études de variabilité et d’induction
d’anticorps neutralisants par modification d’antigènes.
. . . / . . .
- 20
- VII. ETUDE COMPARATIVE DES SOUCHES ISOLEES PAR
LES ANTICORPS MONOCLONAUX
Cette étude va commencer dès le remboursement des derniers mémoires.
Un agent du programme a effectué un ,stage de formation en France (IEMVT)
de 6 (six) mois sur la technologie des anticorps monoclonaux.
V I I I . ETUDE DES CONDITIONS D’APPARITION D’ANTICORPS
NEUTRALISANTS
Tou, tes les souches ont été passées sur porc Large White et se sont toutes
révélées extrêmement pathogènes.
On assiste toujours à la forme suraigue de la Peste porcine africaine. Les
mortalités surviennent entre le 4ème et le 6ème jour après inoculation.
En fonction des impératifs, l’exécution de cette phase du programme peut
couvrir une longue période d’activité.
1.. I . . .
- 21
IX. CONCLUSION GENERALE
la peste porcine africaine est une maladie particulièrement grave pour les
Suidés.
Sur le terrain ou au Laboratoire, l’infection aiguë ou suraiguë est le plus sou-
vent liée à une multiplication intense du virus dans les organes nobles.
L’animal meurt avant la mise en place des mécanismes de défense immunitaire.
Les formes chroniques généralement rencontrées dans le Sud du pays ne sont
pas nécessairement liées à la présence de souches peu pathogènes mais plus à
une résistance naturelle des races locales.
La recherche de souches atténuées ne peut donc se faire qu’avec des races
porcines très sensibles à la maladie comme la Large White ou ses produits de
croisement.
Les études du etlou des vecteurs dans le maintien et la transmission du virus
devront permettre une meilleure connaissance de I’épizootiologie de la Peste
porcine africaine.
Une seconde phase de financement pourrait donc couvrir ce volet et appuyer
les études sur la variabilité du virus et l’induction d’anticorps neutralisants
par modification d’antigènes (mutagenèse).
. . . / . . .
- 22
X. DEPLACEMENTS A L’ETRANGER
J. SARR : Voyage d’études et d’échanges sur la Peste Porcine africaine à
IlInstitut national dlnvestigaciones Agrarias.
Madrid : 6 - 23 juin 1988.
J. SARR : Voyage d’études et d’échanges au Laboratoire national de Investi-
gaçao Veterinaria Lisboa Portugal.
M. DIOP
: Stage de formation sur les anticorps monoclonaux.
IEMVT - Maisons-Alfort, France : 29 septembre 1988 - 4 avril 1989.
- 23
ANNEXE 1
PREPARATION DE L’ANTIGENE POUR ELISA
La protéine de structure majoritaire chez le virus de la Peste porcine africaine
est la VP 73.
Elle induit, lors d’infection naturelle des anticorps précipitants et fixant
complément. Elle peut être extraite à partir du cytoplasme des cellules infectée.
Purifiée, elle est utilisée dans le diagnostic de la Peste porcine africaine
(Elisa, précipitation en gélose, etc.. . ) .
Pour cela :
1. Infecter des boîtes de Roux dont le tapis cellulaire arrive à confluence
(cellules Vero ou MS) 5 ml de suspension virale / boîte de Roux de 100 ml.
2. Décoller les cellules (polisman), 24 heures après infection (début de I’appari-
tion de l’effet cytopathogène).
3. Laver les cellules avec du PBS par centrifugation, 10 mn à 1 500 trs/mn ;
deux fois.
4. Laver les cellules en tampon saccharose 0,34 M en Tris Hcl 5 mM ph = 8,
2 ml par boi’te de Roux puis centrifuger à 1 500 trslmn pendant 5 mn.
5. Placer le culot dans la glace fondante.
6. Suspendre les cellules en tampon hypotonique de saccharose 0,067 M en Tris-
Hcl 5 mM pH = 8 (2 ml/boîte de Roux).
7. Laisser reposer 10 mn à OoC en agitant de temps en temps pour lyser
les cellules.
. . ./ .*.
- 24
8. Solubiliser les membranes cellulaires en ajoutant l/Sème du volume de
NP 40 (Nonidet P40 à la concentration finale de 1 p. 100).
Laisser agir 10 mn en agitant de temps en temps.
Le tout est toujours placé à OOC.
9. Ajouter 1/7ème de volume total de tampon hypertonique de saccharose
64 p.100 en Tris-Hcl 0,4 M pH = 8.
10. Centrifuger à 2 000 trs pendant 10 mn à +4OC pour la sédimentation des
noyaux cellulaires.
11. Recueillir le surnageant qui contient la fraction cytoplasmique.
Ajouter 1/19ème de tampon TEN (EDTA 40 mM B-mercapto-ethanol 1 M
en Tris-Hcl 5 mM pH = 8) pour solubiliser la protéine VP12 (envolope).
12. Laisser agir 15 mn à température ambiante en agitant toutes les 5 mn.
13. Séparer les protéines en gradient discontinu
A - Saccharose
60 p. 100 (V/V) en Tris-Hcl
50 mM pH = 8
B - Saccharose
20 p.100 (V/V) en Tris-Hcl 50 mM
pH = 8
Placer dans le tube : A = 2 ml, B = 4 ml
Puis remplir le tube de la solution contenant les protéines virales en
évitant le mélange entre A et B.
14. Centrifuger à 25 000 trslmn en rotor SW40
pendant 1 heure 15 mn à +4OC.
La protéine VP 73 semi-purifiée se trouve à l’interface du gradient juxta-
posée à la fraction de saccharose à 60 p. 100.
- 25
ANNEXE 2
LE TEST ELISA
M a t é r i e l
- Plaque Nunc (Intermed)
- Cônes
- Tampon PBS + Tween 20 pH = ï,2
- Protéine VP 73
- Tampon carbotane pH 9,6
- Protéine A - péroxydase
- Eau oxygénée 30 p. 100
- Orthophényléne diarninc OPD
-- %rum nIbumitIe bovine
- Acide chlorhydrique 2 N
_
Wthode
.__-- --.
Lecture 2 492 nm en absorption.
R e m a r q u e : VP 73, protéine A-péroxydase et OPD sont utilisées aux dilutions
~--- - - -
o p t i m a l e s
Le sérum est dilué au 1/30è pour réduire au maximum le bruit
de fond.
Cette dilution n’affecte pas la sensibilité de la réaction.
- 26
ANNEXE 3
EPREUVE DE L’HEMADSORPTION
A. CULTURES DE LEUCOCYTES
Les cultures sont obtenues par l’une des techniques indiquées dans les fiches
correspondantes.
B . I N O C U L U M
Utiliser :
- soit le sang d’un porc hyper-imrnunisé contre la peste porcine classique ino-
culée dans un but de diagnostic. Ce sang est recueilli au mornerit de I’Clev;i-
tion thermique,
- soit la rate et si possible un mélange de plusieurs rates prélevitcs dans Id
même exploitation sur des animaux qui viennent de mourir ou qui ont 616
abattus pendant la période fébrile de la maladie.
A partir de ce matériel, faire une suspension de 20 ;? en solution phosph;1tCc
a pH 7,2 (Hanks, Earle, etc. . . ) additl,onnée de 5 000 U de pénicillirie et de
2,s - 3 mg de streptomycine/ml.
Broyer et centrifuger à 6 000 trs/mn pendant 30 mn. Le surnageant est IaissC
1 à 2 heures à la ternpérature ambiante (laisser agir les antibiotiques)
C. INOCULATION DES CULTURES
- Un minimum de 3 tubes est utilisé par diagnostic.
- L’inoculum est dilué au 1 /lOè dans le milieu de culture.
. . . / . . .
- 27
D. HEMADSORPTION
Les hématies nécessaires à la lecture de la réaction sont ajoutées directement
sur la culture 2 heures après l’inoculation.
E. LECTURE
- La première lecture est réalisée de 11 à 16 heures après l’inoculation.
- Les hématies sédimentixs sur la culture sont enlevkes par une légère rot;l-
tien du tube s u r 5011 a x e iongitudinal, avant son observation au microscope.
- On continue l’observation pendant 7 ou 10 jours. Une lecture est effectuée
toutes les 24 heures ~usyu’à la constatation de I’hémadsorptiori ou d’un effet
cytopathogkne sur 50 % des cellules.
- Faire des tubes contrôlks :
- ncgatifs
- p o s i t i f s .
F. INTERPRETATION
-
-
- Les tubes qui présentent le phénomène d’hémadsorption suivi d’effets cyto-
pathogènes entrainent le diagnostic de peste porcine africaine.
- L e s t u b e s q u i n e ~Jr&Seriterlt p a s cf’hémadsorption, a v e c o u s a n s e f f e t cyto-
pathogènes, font l’objet d’une inoculation à des nouvelles cultures. Pour
cela, un mélange de surnageani d e c:es tubes est inoculé à une nr)uvelI(:
série de culture Iclucocytaire ;1 raison de 0,2 ml par tube.
0 n peu t donc o bser vc r
:
- ia présence d’hémadsorption suivie d’effets cytopathogènes, ce qui entrsî-
Iiera le diagnostic de peste pot-cine africaine,
I
. . . . . .
- 28
- l’absence d’hémadsorption et d’effets cytopathogènes qui entrainera un
diagnostic d’absence du virus africain,
- l’absence d’hémadsorption et la presence d’un effet cytopathogène. Dans
ce cas, procéder à un nouvel ensemencement à partir de la culture et à
d’autres épreuves complémentaires, tel les que :
* immunofluorescence au porc
* immunofluorescence
* précipitation en gélose.. .
en vue de déterminer si l’on est en présence d’une souche non hémadsor-
bante du virus africain.
- 29
ANNEXE 4
PREPARATION DE CULTURES DE LEUCOCYTES
SEDIMENTATION SPONTANEE
1 - Le sang est recueilli en tubes sous héparine.
2 - Laisser sédimenter à 37OC en tubes inclinés.
3 - Recueillir le surnageant au moment où la vitesse de sédimentation
commence à diminuer.
4 - Ce surnageant est mélangé à un volume de Hanks ou de Earle puis
distribué en tubes à raison de 2 ml/tube.
5 - Variante : utiliser un Erlen-Meyer à 37OC pendant 1 ou 2 heures.
- 30
ANNEXE 5
CULTURE DE LEUCOCYTES A PARTIR DU
SANG DEFRIBINE
-
-
1 - Donneurs : porcs de 40 - 100 kgs
Ils sont saignes tous les 20 jours.
2 -. Ponction de la veine cave
Le sang est placé dans un défribinateur mécanique de 1 000 ml.
3 - Centrifuger dans des pots de 500 ml a 2 500 trslmn pendant 20 ~III~.
4 - Le sérum est recueilli, puis distribué en petits volumes.
5 - Recueillir à l’aide d’une pipette la couche superficielle du sédiment qui
contient les leucocytes mélangés à une couche d’hématies. Eviter de
prendre trop d’hématies (rapport 4 - 5 ml pour 250 ml de sang).
6- Les leucocytes recueillis sont additionnés de sérum prélevé après la
centrifugation puis ajusté à 6. 106 Ilml.
7 - Distribuer à raison de 1,5 ml en tubes de cultures de tissus.
8 - La suspension est utilisée à 50 00 de sérum pur et 50 “0 de Earle.
9 -. Incuber à 37OC et observer après 48 heures.
10 - Les cultures peuvent être utilisées après 48 heures - 8 jours.
II est important d’utiliser le sérum du même animal donneur des leucocytes
pour la culture.
- 31
ANNEXE 6
CULTURE DES LEUCOCYTES
(MOELLE OSSEUSE)
- Utiliser un porcelet (10 - 20 kgs).
- Laisser à jeun pendant 24 heures.
- Le saigner à blanc pour l’utilisation totale du sérum.
- La moelle est obtenue des épiphyses des os longs et placée dans un milieu
de culture, après être découpée en petits morceaux.
- La dispersion des éléments cellulairece .> est obtenue au moyen d’un agitateur
magnétique et la filtration se fait à travers une gaze stérile.
- Compter les cellules et ajuster à 3.106 I/ml.
- Utiliser du milieu 199 pH 7,2-7,4 avec 10 à 50 Y,
de sérum du mCrnc ;ll>irri;ll.
- Culture sur flacons tubes à essais ou de Leighton pendant 3 jours.
- 32
ANNEXE 7
PREPARATION DE CONJUGUE. FLUORESCENT
-
-
-
Préparation des globulines de I’anti-sérum peste porcine africaine par
le (NH ),SO,à +4*C sous agitation (saturation 50 %).
Dialyse contre du tampon phosphate 0,0175 M pH 6,3 jusqu’à disparition
du sulfate d’ammonium.
Séparation des immunoglobulines sur colonne de DEAE cellulose préalable-
ment équilibrée avec du tampon phosphate 0,0175 M (pH 6,3).
4- Lyophiliser.
5 - Contrôle de pureté par immuno-électrophorèse.
6 - Conjugaison des immunoglobulines (Ig) avec I’isothiocyanate de fluoresceine
(ITCF) selon le rapport de poids 1/50.
La conjugaison se fait à pH 9,5 pendant 30 mn soit à + 4OC, soit à la
température du Labo.
7 - Passer le conjugué sur colonne de séphadex G 25 ou G 50, équilibrée
avec du tampon phosphate pH 7,2 (0,0175 M ) .
8 - Adsorber le conjugé sur poudre de foie de porc pendant 1 heure à + 4OC
en agitation continue suivie de centrifugation a 10 000 trslmn pendant
30 mn.
9 - prendre le surnageant (globuline marquée) et répartir en petits volumes,
puis ajouter du merthiolate de Na à 1110 000.
10 - Conserver à - 2O*C.
11 - Avant son utilisation, déterminer la dilution optimale de son emploi.
_
..-.
,-““I
REPUBLIQUE DU SENEGAL
**********
MINISTERE DU DEVELOPPEMENT RURAL
ET DE L’HYDRAULIQUE
*t********
‘*
INSTITUT SENEGALAIS DE RECHERCHES
AGRICOLES (I.S.R.A.)
**********
DEPARTEMENT DE RECHERCHES SUR LES
PRODUCTIONS ET LA SANTE ANIMALES
**********
LABORATOIRE NATIONAL DE L’ELEVAGE
ET DE RECHERCHES VETERINAIRES
B.P. 2057
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yy-
*
7 4 ,,,. 2
:.:
: 3
DAKAR - HANN
/,.J
w.--
\\
ETUDE DE LA PESTE PORCINE
AFRICAINE AU SENEGAL
Rapport final
Programme de recherche financé par la
Commission des Communautés européennes
Direction générale de la science, de la
recherche et du développement
*
,
, t
Contrat n”TSDA 21 S/CEE
REF. NOSO/PATH. INF
Juin 1987 - Décembre 1989
AOUT 1990.
RAPPORT FINAL
JUIN 1987 - DECEMBRE 1989
CONTRACTANT : Institut sénégalais de Recherches
Agricoles (ISRA)
C O N T R A T no T S D - A 219/CEE
CHEF DU PROJET : Joseph SARR
TITRE DU PROJET: Etude de la peste porcine africaine :
cartographie des variétés antigéniques
LIEU D’IMPLANTATION DU PROJET : Laboratoire national
d’Elevage et de Recherches vétérinaires
BP 2057 - DAKAR-HANN
(Sén&gal)
T A B L E D E S M A T I E R E S
1. INTRODUCTION . . . * . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
1
II. PLAN DE TRAVAIL . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
2
Ill. ELEVAGE PORCIN AU SENEGAL . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
3
A- Les races porcines . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
3
B - Le mode d’élevage . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
3
C- Conclusion 0s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
4
IV. EPIDEMIOLOGIE DE LA PESTE PORCINE AFRICAINE
AU SENEGAL . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
5
A - Historique . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
5
B - Origine de la maladie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
5
C- Situation actuelle de la Peste porcine africaine au Sénégal..
6
D- Le mode d’infection . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ...*.*...
8
E- Conclusion . . . ..e...........................“..............
8
V. ENQUETE SERO-EPIDEMIOLOCIQUE . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
9
A - Matériel et méthode . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
9
1. Echantillonnage . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
9
2. Les prélèvements . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
9
3. L’antigène . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
9
4. Test Elisa
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
1 0
B- Résultats . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..*...................
1 4
C- Discussion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
14
D - Conclusion . . . . . . . * . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . * . . . . . . . . . . . .
15
IV. ISOLEMENT ET IDENTIFICATION DE VIRUS DE LA
PESTE PORCINE AFRICAINE . . . . . . . . . . . . . . . . . ..*............
16
A- Matériel et méthode . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
16
1. Prélèvements . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
16
2. Isolement de virus . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
16
a) Inoculation au porcelet . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
17
b) Inoculation cultures cellulaires
17
. . . . . . . . . . . . . . . . . .
3. Identification du virus de PPA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
17
B- Résultats . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
18
C- Discussion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
19
D - Conclusion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
19
VII. ETUDE COMPARATIVE DE SOUCHES ISOLEES PAR LES
ANTICORPS MONOCLONAUX . . . . . . * . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . * . .
20
VIII. ETUDE DES CONDITIONS D’APPARITION D’ANTICORPS
NEUTRALISANTS
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
20
IX. CONCLUSION GENERALE . . . . . . . * . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
2 1
X. DEPLACEMENTS A L’ETRANGER . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
22
ANNEXES
1 - Préparation d’antigènes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
23
4
2 - T e s t Elisa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
25
3 - Epreuve d’hémadsorption . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
26
4- Préparation cultures leucocytes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
29
5 - Culture leucocytes à partir du sang . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
30
6 - Culture leucocytes (moelle osseuse) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
3 1
7 - Préparation conjugué fluorescent . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
32
1. INTRODUCTION
La Peste porcine africaine (PPA) est une maladie infectieuse hautement conta-
gieuse qui frappe avec une mortalité de presque 100 p. 100, tous les Porcs du
genre Sus.
Cliniquement,
il s’agit en règle générale, d’une maladie à évolution aiguë, mais
qui a pu revêtir parfois des formes suraiguës, chroniques ou même atypiques.
Malgré de grandes similitudes cliniques et anatomo-pathologiques avec la Peste
porcine classique (PPC), cette affection décrite pour la première fois par
MONTGOMERY (1921) sous le nom d’East african Swine Fever a pour origine
un virus qui ne présente pas de relations morphologiques ni même immunolo-
giques avec le virus de la Peste porcine classique.
Ce virus dont les analogies structurales avec
des virus affectant des
espèces très éloignées des Suidés (Grenouilles, Reptiles) et singulièrement de
certains insectes
(Tipula et Sericesthis) est classé dans le groupe de
Iridoviridae.
Un seul sérotype du virus de la Peste porcine africaine est connu.
Pourtant, il n’existe pas de protection hétérospécifique entre les différents
isolats.
Cette absence de protection croisée ne peut s’expliquer que par de larges
variations antigéniques du virus.
L’étude de ces variations par les anticorps monocolonaux présente l’avantage
de mettre en évidence les différentes structures antigéniques qui sont certes
le meilleur reflet des mutations génomiques entre les souches virales.
Aussi, dans la forme aiguë et chronique de la maladie, l’absence d’anticorps
neutralisants n’est pas expliquée.
La recherche de conditions d’induction d’anticorps neutralisants (modification
d’antigènes à partir de souches locales, mutagenèse, etc.. .) pour la mise au
point d’un vaccin, constitue l’objectif principal du programme.
I
. . . . . .
- 2
I I . PIAN D E T R A V A I L
1, Etablissement de la carte épidémiologique de la Peste porcine africaine
au Sénégal.
2. Isolement et identification de souches de peste porcine africaine à
partir de foyers ; constitution d’une banque de souches virales.
3. Production d’anticorps monoclonaux anti-PPA et étude comparative
des souches isolées avec d’autres souches africaines, européennes et
asiatiques, etc.. .
4. Etude des conditions d’apparition d’anticorps neutralisants à partir
de la banque de souches (mutagenèse, modifications d’antigènes, etc.. . ).
__ ___._ --.-. -
- 3
III. L’ELEVAGE PORCIN AU SENEGAL
La zone d’élevage porcin correspond à toute la façade Ouest du pays face a
l’Océan Atlantique où la population est en majorité chrétienne ou animiste.
C’est une bande longue de 500 kms et large de 100 kms environ (carte).
L’élevage porcin y est presqu’essentiejlement paysan en dehors de quelques
exploitations de type coopératif autour des grandes villes (Dakar, Thiès,
Mbour, Ziguinchor, Bignona.. . 1.
Les effectifs dépassent rarement 15 animaux par exploitation familiale,
Les porcheries des centres urbains s’approvisionnent à partir des villages.
La population porcine totale du pays est estimée à 400 000 têtes.
A. Les races porcines
Elles ont été très peu étudiées au Sénégal.
L’existence d’une forte pression de races importées comme la “Large White”
fait que les races locales généralement naines et très rustiques cèdent progres-
sivement la place à des métissages non contrôlés.
Cependant, dans le Sud du Pays, toutes les tentatives d’introduction de races
améliorëes ont échoué.
B. Le mode d’élevage
c
Le mode d’élevage est conditionné par l’alimentation. II est de trois types :
- élevage en liberté,
- élevage en hutte
- élevage de type moderne.
. . . / . . .
- 4
_ Les deux premiers types sont pratiqués en milieu rural.
Pendant la saison sèche (octobre - juin), les animaux sont laissés en totale
liberté : ils sont chargés de trouver p’endant la journée leur propre nourriture,
L’élevage en hutte prend le relais en saison des pluies. Les animaux sont
enfermés dans des enclos de fortune à cause des cultures. Ils sont nourris
avec les restes de cuisine et du son de riz, mil, sorgho, maïs, etc...
l’élevage de type moderne concerne généralement les centres urbains.
Néanmoins, une partie des aliments est constituée par les déchets de cuisine
des restaurants.
C. Conclusion
Les races porcines existantes et le mode d’élevage constituent les principaux
facteurs déterminants de I’épidémiologie de la Peste porcine africaine au Sénégal.
. . /. .,.
- 5
IV. EPIDEMIOLOGIE DE LA PESTE PORCINE AFRICAINE AU SENEGAL
A. Historique
En septembre 1959, est observée une mortalité importante dans l’effectif porcin
du km 17 de la Route de Rufiçque (Région de Dakar),
A cet endroit, sont installés un certain nombre de porcheries exploitées par des
ressortissants des Iles du cap-Vert.
Les animaux vivent dans des conditions d’hygiène très sommaires. La maladie
sévit depuis plusieurs semaines entraînant une forte mortalité.
Le diagnostic de peste porcine africaine fut confirmé au mois d’octobre de la
même année.
A la suite de cette épizootie, d’autres foyers furent observés :
- Elevage de la Charcuterie Moderne,
- Base aérienne de Ouakam,
- Km 23, Route de Rufisque,
- Caserne des troupes aéroportées,
- Km 7, Route de Rufisque.
L’allure de la maladie diffère sensiblement de celle observée dans le premier
foyer. A la forme épizootique, succède une forme sporadique.
Seuls quelques animaux dans chaque porcherie sont atteint et succombent.
B. Origine de la maladie
L’origine peut être située en Guinée-Bissau (ex. Guinée Portugaise).
En 1958, une mortalité importante dans l’effectif porcin avait été constatée.
L’examen des prélèvements expédiés au Laboratoire de Dakar avait permis de
reconnaître des lésions histopathologiques caractéristiques de la maladie.
. . . I . . .
- 6
La peste porcine africaine a dû donc s’étendre de la Guinée-Bissau, au Sud
du Sénégal (Casamance) où des éleveurs de la Région de Dakar effectuent
des achats pour approvisionner leurs porcheries.
Un animal porteur de virus a pu, dans ces conditions, amener la maladie dans
dans la Région de Dakar.
C. Situation actuelle de la PPA au Sénégal
Selon une étude FAOIBanque Mondiale, en 1982, pour le compte des services
vétérinaires du Sénégal, du fait de la peste porcine, l’effectif des porcins est
passé de 332 000 têtes en 1977 à 141 000 seulement en 1981.
C!est ainsi, qu’au cours de l’année 1987, de nombreux foyers ont été enregis-
trés à travers le pays (tableau no1 ).
Tableau no1 : Foyers enregistrés entre 1986 et 1989
Loca I i tés
Année
Nombre de morts
Malades
Ziguinchor
. Séminaire Saint-Louis 1986
1986
40
. tindiane
1987
?
. Tilène
1987
7
Oussouye
. Oussouye
1987
plusieurs centaines
1988
à chaque foyer)
1989
. Diaken Diola
1987
1
. Emaye
1989
120
Brin
. Brin
1987
3
. . . / . . .
- 7
Niaguls
. Niaguis
1986
Non précisé
1987
Bignona
. Manguilly
1987
9
1988
Plus de 100
, Bassène
1988
Plus de 100
. Tandiem
1987
12
Fatick
. Diouroup
1987
50
Dakar
. Grand-Yoff
1987
20
1987
2
Thiès
. Thiès
1989
30
Les taux de mortalité enregistrés ainsi que la taille des foyers sont générale-
ment sous-estimés compte tenu :
- l’état de liberté totale des animaux entre octobre et juin,
- des échanges entre villages et/ou villes sans contrôle.
II reste de nombreux foyers qui ne sont pas toujours déclarés par les services
vétérinaires ; le laboratoire les ayant pour la plupart découvert lors de ses
enquêtes sur le terrain.
. . . / . . .
- 8
D. Le mode d’infection
La Peste porcine africaine est enzootique chez les races locales mais revêt
parfois des allures épizootiques lors d’introduction de souches virales haute-
ment pathogènes.
L’infection procède souvent de la contagion directe. Les grandes périodes de
mortalité dans les zones dlenzootie correspondent :
- à la mise en liberté des porcs (fin de la saison des Pl:uies),
- à la mise en enclos (début de la saison des pluies).
Le rôle des vecteurs (tiques, insectes hématophages) dans la transmission de
la maladie n’a pas fait l’objet d’études au Sénégal.
- La faune sauvage peut également jouer un rôle comme réservoir à virus en
particulier dans les régions de Fatick et de Ziguinchor où le phacochère peut
entrer en contact direct avec le porc domestique.
Cependant, il est plus probable que le réservoir à virus soit aujourd’hui le
porc lui-même.
E. Conclusion
Le mode d’élevage favorise la dissémination des souches de virus.
Dans une même porcherie, plusieurs souches peuvent être impliquées.
L’absence de protection hétérospécifique entre les différents isolats fait qu’il
n’y a presque jamais de rescapés.
De plus, les formes aiguës et chroniques de l’affection sont les plus fréquem-
ment rencontrées, entraînant une délimitation quasi-impossible des foyers.
. . . / . . .
- 9
IV. ENQUETE SERO-EPIDEMIOLOGIQUE
Les formes aiguës et chroniques de la Peste porcine africaine sont marquées
Par une hypergammaglobulinémie (anticorps précipitants et fixants le complément).
Mais compte tenu du caractère progressif de la maladie, les guérisons sont rares ;
les animaux porteurs d’anticorps sont généralement excréteurs de virus.
A. Matériel et méthode
1. Echantillonnage
L’échantillonnage a été effectué selon un tirage au hasard au niveau des diffé-
rents villages de la zone d’élevage.
70 à 80 p.100 des porcheries des villages retenus ont été visités et le groupe
de porcs saignés pour chaque exploitation peut être considéré comme représen-
tatif (environ 30 p. 100 également pris au hasard).
2. Les prélèvements
1 062 prélèvements de sang ont été effectués par la veine jugulaire au
vacutainer.
Après coagulation, les sérums sont décantés par centrifugation à 2 000 trs/mn
pendant 15 mn, puis aliqoutés et congelés à -20°C en attendant d’être testés.
3. L’antigène
L’antigène est produit à partir de cellules de lignée MS infectées par la souche
Espagne 70 de Peste porcine africaine.
L’antigène est obtenu par solubilisation des membranes des cellules infectées.
. . . / . . .
- 10
II s’agit de la protéine VP 73 de membrane du virus, purifiée par centrifuga-
tion au gradient de saccharose (voir annexe 1).
4. Test Elisa
L’antigène est absorbé sur microplaque Elisa (Nunc Intermed).
Les sérums a tester sont dilués au 1/30è pour réduire le bruit de fond.
Le complexe antigène-anticorps est révélé par la protéine A marquée à la
péroxydase (voir annexe 2).
. . . / . . .
“..
- 11
Tableau 2 : Résultats de l'enquête séro-épidémiologique
Nombre de
Département
Localité
Nombre de
prélèvement
Observa-
chef lieu
lrélèvement
tions
positifs
Oussouye
Oussouye
43
7
Diaken Diola
26
9
Oukout
39
19
Hlump
50
6
Boukitingo
15
1
Niassia
Niassia
20
0
brin
28
7
Seleki
24
5
Niaguis
Kaniaka (Adean)
6
1
Niaguis
20
4
Bignona
Tobor
30
2
Manguilly
79
34
Bassène
35
9
Tandième
19
9
Soutou
29
16
Koutinghor
29
4
Niassaran
26
1
Bindago
13
3
Piran
25
1
Diourou
19
3
Diaboudior
19
4
Kaodioul
21
3
Kassila
19
0
Affiniam
Affiniam
31
7
Elana
41
2
Ziguinchor
Lindiane
27
2
Camp Saouli
24
3
Lindiane Manjak
12
6
Lindiane
12
2
Sinediane
12
2
Boudodi
06
2
Séminaire St-Lou.i.s
4
1
Santiaba
10
0
Petit Kandé
26
8
Grand Kandé
06
0
Djefaye
28
6
Tilène
67
29
'stick
Fatick
Fatick
20
Diouroup
59
Sokone
Sokone
41
Keur Ndiouga
2
Phacochurc
- 12
ZONE D’ELEVAGE PORCIN
Tableau 3 : prévalence de la Peste porcine africaine dans
les départements / chef lieux
Nombre de
% d’animaux
Départements/
Nombre de
prélèvements
porteurs de
chef-lieux
prélèvements
positifs
virus
Ziguinchor
234
61
26,l + 7,4 %
Oussouye
173
42
24,3 t 8,4 8
N iassia
72
12
17
t 11,s %
Niaguis
26
5
19,2
Bignona
363
89
24,s k 5,8 90
Affiniam
72
9
12,s rt: 10 %
Sokone”
43
0
0,oo
Fatick
79
0
0,oo
Total
1 062
/
N.B : L’intervalle de confiance est calculé pour un coefficient de
sécurité de 95 %.
* Département où porcs sauvages et domestiques peuvent entrer en
contact direct.
Tous les phacochères testés sont également négatifs.
- 14
9. Résultats
En Casamance, on trouve des porteurs de virus dans presque toutes les loca-
lités visitées (tableaux 2 et 3).
A Bignona, Oussouye et Ziguinchor, les taux respectifs sont de 24,5 1 5,8 p.100
24,3 1: 8,4 p.100 et 26,l ? 7,4 p.100, soit environ un quart de la population
porcine de ces départements.
Niassia, Niaguiss et Affiniam sont encore moins infectés mais les taux restent
encore relativement élevés.
Dans le nord de la zone d’élevage, Fatick et Sokone, tous les animaux testés
sont négatifs.
C. Discussion
La région d’élevage comprend deux graindes régions :
- le Sud, la Casamance,
- le Nord, de Sokone à Dakar.
II s’agit de deux zones écologiques différentes, séparées par le territoire de
la Gambie où il n’y a presque pas de porcins sauf à Banjul la capitale où vit
un petit noyau de population chrétienne.
Toute la région Sud est une zone de forêts.
Le portage de virus y est extrêmement important et l’on rencontre surtout
la forme chronique de la Peste porcine africaine.
Cette situation s’explique par le fait que l’on y trouve que des races locales
très rustiques qui se sont, avec le temps, adaptées à la maladie et manifes-
tent une certaine résistance.
. . . / . . .
- 15
La circulation quasi-permanente de souches atténuées pourrait également
augmenter cette résistance naturelle.
C’est pourqoui, toutes les tentatives d’amélioration génétique de ces races,
par l’introduction de porcs de race Large White, ont échoue.
La région nord est une zone de savane où les races locales ont presque
disparu.
Les produits de croisement (Large White x races locales) sont extrêmement
sensibles à la Peste porcine africaine.
Les formes aiguës et chroniques de la maladie sont exceptionnelles.
On rencontre surtout la forme suraigüe avec une mortalité avoisinant 100 p.100.
Les prévalences nulles rencontrées dans ces localités visitées s’expliquent par
l’absence de porteurs chroniques de virus chez les races améliorées.
Cependant, de nombreux foyers ont été signalés ces dernières années, notam-
ment à Dakar, Thiès et Fatick où des souches virales ont été isolées.
Les problèmes liés au (x) réservoir (s) et au (x) vecteur (s) dans la trans-
mission restent malheureusement entiers.
Mais, il est probable que l’apparition de foyers, en particulier, dans la région
nord soit davantage liée à l’introduction d’animaux porteurs de virus à partir
du sud du pays.
D. Conclusion
L’interdiction des échanges d’animaux dans le sens Sud -> Nord demeure aujour-
d’hui une condition indispensable pour le contrôle de la maladie dans la
région Nord.
. . . / . . .
- 16
VI. ISOLEMENT ET IDENTIFICATION DE VIRUS DE LA
PESTE PORCINE AFRICAINE
Les formes aigües et suraigües de la IPeste porcine africaine sont généralement
rencontrées chez les produits de croisement (Large White x races locales) dans
la zone d’élevage au nord du pays.
Les mortalités enregistrées lors de ces foyers sont voisines de 100 p.100.
Au sud du pays, la forme chronique est de loin la plus fréquente.
Pendant la phase finale de la maladie, on rencontre de la pleuropneumonie,
une gastrite, des adénites nécrosantes parfois accompagnées d’une péricardite
et des arthrites.
Les mortalités. sont très variables. Le virus peut alors être isolé à partir de la
plupart des organes.
A. Matériel et méthode
1. Prélèvements
Les prélèvements sont constitués de sang prélevés sous anticoagulant à partir
de la veine jugulaire au vacutainer de porcs malades ou d’organes (rate, gan-
glions) d’animaux morts suspects de Peste porcine africaine.
Tous les prélèvements sont conservés à -2OOC dans l’obscurité en attendant
d’être testés.
2. Isolement de virus
L’isolement de virus comprend toujours deux phases :
- inoculation du prélèvement au porc (enrichissement),
- passage sur culture de leucocytes circulants de porc.
. . . / . . .
- 17
a) Inoculation au porcelet
Les prélèvements d’organes sont broyés, centrifugés à +4OC à 4 000 trs/mn
pendant 30 mn. Le surnageant est aliquoté avant d’être inoculé au porcelet
âgé de 2 à 3 mois à raison de 1 ml, par voie intramusculaire.
Le sang décongelé est inoculé également dans les mêmes conditions.
Pour éviter le mélange des souches, un seul prélèvement est inoculé à la fois
et le porcelet est isolé pendant toute la phase d’observation (3 semaines).
Les malades sont sacrifiés in extrémis, puis la rate et les ganglions mésenté-
riques sont prélevés pour l’inoculation aux leucocytes de porc.
b) Inoculation aux cultures cellulaires
Des cultures de leucocytes circulants âgés de 72 heures, à raison de 0,2 ml/
tube du surnageant de broyat de rate etlou de ganglion préparé comme
précédemment et filtré sur millipore 0,2 u (technique de culture de leucocytes
voir en annexes 3, 4, 5, 6).
5 tubes sont utilisés par prélèvement.
Ensuite les tubes sont placés à 37OC sur “roller” et observés tous les jours
pour Ilhémadsorption puis pour l’effet cytopathogène (8 jours environ).
Les tubes positifs sont congelés à -2OOC en attendant l’identification.
3. Identification du virus de la Peste porcine africaine
L’identification est réalisée par immunofluorescence directe sur culture de
leucocytes de porc en tubes de Leighton avec lamelle.
L’immunofluorescence (technique en annexe 7) est réalisée à 24, 48 et 72
heures après inoculation. Pour cela, des séries de 6 tubes avec lamelles sont
préparés à cet effet.
/
. . . . . .
.-___.
.--
- 18
B. Résultats
Au total, 13 souches de virus de la Peste porcine africaine ont été ainsi isolées
et identifiées.
Dix proviennent des différentes régions du Senégal, deux du Zai’re et une
des Iles du Cap-Vert (tableaux 4 et 5).
Tableau 4 : Isolements de virus PPA
Nombre de
l solement dl
Foyers
Année
Ma lades
morts
virus
Tandiem
1987
12
1
T”l
(Bignona)
Diouroup
1987
50
4
DPl
(Fatick)
DP2
Grand-Yoff
1987
20
3
GdY,
(Dakar)
1987
5
2
W2
Brin
1988
?
1
Brl
(Ziguinchor)
Tilène
1988
?
1
(Ziguinchor)
TZl
Lindiane
1988
50
1
(Ziguinchor)
Lzl
Oussouye
1989
100
2
O y1
Oukout
1989
50
1
Okl
Thiès
1989
30
3
En cours
. . ./ .,.
_.-__-
I_
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-
~,_
__
.__
.
.
.
.._”
---
-
,
.-
1 9
-
Tableau 5 : Autres souches de virus isolées
Souche
Origine
Année
I
isolée
Kinshasa
1988
Kin,
(Zaïre)
Kin 2
Iles du Cap-Vert
i 987
Pra,
(Praia)
C. Discussion
La plupart des souches virales ont éte isolées en Casamance où la Peste
porcine africaine sévit à l’état enzootique.
La résistance relative des races locales fait que les mortal ités sont très varia-
bles d’une année à une autre.
Cependant, ces souches passées sur des porcs Large Whit e au Laboratoire,
se sont toutes révélées extrêmement pathogènes.
Tous les animaux inoculés ont tous developpé
la forme suraiguë de la maladie,
la mort survenant 4 à 6 jours après inoculation.
Les produits de croisement (Large White x races locales) de la région nord
servent de révélateurs de ces souches à chaque fois qu’elles y sont introduite
lors des échanges etlou cérémonies familiales.
D. Conclusion
Ces souches isolées au niveau de toute la zone d’élevage constituent la banque
à partir de laquelle seront menées les études de variabilité et d’induction
d’anticorps neutralisants par modification d’antigènes.
. . . / . . .
- 20
- VII. ETUDE COMPARATIVE DES SOUCHES ISOLEES PAR
LES ANTICORPS MONOCLONAUX
Cette étude va commencer dès le remboursement des derniers mémoires.
Un agent du programme a effectué un ,stage de formation en France (IEMVT)
de 6 (six) mois sur la technologie des anticorps monoclonaux.
V I I I . ETUDE DES CONDITIONS D’APPARITION D’ANTICORPS
NEUTRALISANTS
Tou, tes les souches ont été passées sur porc Large White et se sont toutes
révélées extrêmement pathogènes.
On assiste toujours à la forme suraigue de la Peste porcine africaine. Les
mortalités surviennent entre le 4ème et le 6ème jour après inoculation.
En fonction des impératifs, l’exécution de cette phase du programme peut
couvrir une longue période d’activité.
1.. I . . .
- 21
IX. CONCLUSION GENERALE
la peste porcine africaine est une maladie particulièrement grave pour les
Suidés.
Sur le terrain ou au Laboratoire, l’infection aiguë ou suraiguë est le plus sou-
vent liée à une multiplication intense du virus dans les organes nobles.
L’animal meurt avant la mise en place des mécanismes de défense immunitaire.
Les formes chroniques généralement rencontrées dans le Sud du pays ne sont
pas nécessairement liées à la présence de souches peu pathogènes mais plus à
une résistance naturelle des races locales.
La recherche de souches atténuées ne peut donc se faire qu’avec des races
porcines très sensibles à la maladie comme la Large White ou ses produits de
croisement.
Les études du etlou des vecteurs dans le maintien et la transmission du virus
devront permettre une meilleure connaissance de I’épizootiologie de la Peste
porcine africaine.
Une seconde phase de financement pourrait donc couvrir ce volet et appuyer
les études sur la variabilité du virus et l’induction d’anticorps neutralisants
par modification d’antigènes (mutagenèse).
. . . / . . .
- 22
X. DEPLACEMENTS A L’ETRANGER
J. SARR : Voyage d’études et d’échanges sur la Peste Porcine africaine à
IlInstitut national dlnvestigaciones Agrarias.
Madrid : 6 - 23 juin 1988.
J. SARR : Voyage d’études et d’échanges au Laboratoire national de Investi-
gaçao Veterinaria Lisboa Portugal.
M. DIOP
: Stage de formation sur les anticorps monoclonaux.
IEMVT - Maisons-Alfort, France : 29 septembre 1988 - 4 avril 1989.
- 23
ANNEXE 1
PREPARATION DE L’ANTIGENE POUR ELISA
La protéine de structure majoritaire chez le virus de la Peste porcine africaine
est la VP 73.
Elle induit, lors d’infection naturelle des anticorps précipitants et fixant
complément. Elle peut être extraite à partir du cytoplasme des cellules infectée.
Purifiée, elle est utilisée dans le diagnostic de la Peste porcine africaine
(Elisa, précipitation en gélose, etc.. . ) .
Pour cela :
1. Infecter des boîtes de Roux dont le tapis cellulaire arrive à confluence
(cellules Vero ou MS) 5 ml de suspension virale / boîte de Roux de 100 ml.
2. Décoller les cellules (polisman), 24 heures après infection (début de I’appari-
tion de l’effet cytopathogène).
3. Laver les cellules avec du PBS par centrifugation, 10 mn à 1 500 trs/mn ;
deux fois.
4. Laver les cellules en tampon saccharose 0,34 M en Tris Hcl 5 mM ph = 8,
2 ml par boi’te de Roux puis centrifuger à 1 500 trslmn pendant 5 mn.
5. Placer le culot dans la glace fondante.
6. Suspendre les cellules en tampon hypotonique de saccharose 0,067 M en Tris-
Hcl 5 mM pH = 8 (2 ml/boîte de Roux).
7. Laisser reposer 10 mn à OoC en agitant de temps en temps pour lyser
les cellules.
. . ./ .*.
- 24
8. Solubiliser les membranes cellulaires en ajoutant l/Sème du volume de
NP 40 (Nonidet P40 à la concentration finale de 1 p. 100).
Laisser agir 10 mn en agitant de temps en temps.
Le tout est toujours placé à OOC.
9. Ajouter 1/7ème de volume total de tampon hypertonique de saccharose
64 p.100 en Tris-Hcl 0,4 M pH = 8.
10. Centrifuger à 2 000 trs pendant 10 mn à +4OC pour la sédimentation des
noyaux cellulaires.
11. Recueillir le surnageant qui contient la fraction cytoplasmique.
Ajouter 1/19ème de tampon TEN (EDTA 40 mM B-mercapto-ethanol 1 M
en Tris-Hcl 5 mM pH = 8) pour solubiliser la protéine VP12 (envolope).
12. Laisser agir 15 mn à température ambiante en agitant toutes les 5 mn.
13. Séparer les protéines en gradient discontinu
A - Saccharose
60 p. 100 (V/V) en Tris-Hcl
50 mM pH = 8
B - Saccharose
20 p.100 (V/V) en Tris-Hcl 50 mM
pH = 8
Placer dans le tube : A = 2 ml, B = 4 ml
Puis remplir le tube de la solution contenant les protéines virales en
évitant le mélange entre A et B.
14. Centrifuger à 25 000 trslmn en rotor SW40
pendant 1 heure 15 mn à +4OC.
La protéine VP 73 semi-purifiée se trouve à l’interface du gradient juxta-
posée à la fraction de saccharose à 60 p. 100.
- 25
ANNEXE 2
LE TEST ELISA
M a t é r i e l
- Plaque Nunc (Intermed)
- Cônes
- Tampon PBS + Tween 20 pH = ï,2
- Protéine VP 73
- Tampon carbotane pH 9,6
- Protéine A - péroxydase
- Eau oxygénée 30 p. 100
- Orthophényléne diarninc OPD
-- %rum nIbumitIe bovine
- Acide chlorhydrique 2 N
_
Wthode
.__-- --.
Lecture 2 492 nm en absorption.
R e m a r q u e : VP 73, protéine A-péroxydase et OPD sont utilisées aux dilutions
~--- - - -
o p t i m a l e s
Le sérum est dilué au 1/30è pour réduire au maximum le bruit
de fond.
Cette dilution n’affecte pas la sensibilité de la réaction.
- 26
ANNEXE 3
EPREUVE DE L’HEMADSORPTION
A. CULTURES DE LEUCOCYTES
Les cultures sont obtenues par l’une des techniques indiquées dans les fiches
correspondantes.
B . I N O C U L U M
Utiliser :
- soit le sang d’un porc hyper-imrnunisé contre la peste porcine classique ino-
culée dans un but de diagnostic. Ce sang est recueilli au mornerit de I’Clev;i-
tion thermique,
- soit la rate et si possible un mélange de plusieurs rates prélevitcs dans Id
même exploitation sur des animaux qui viennent de mourir ou qui ont 616
abattus pendant la période fébrile de la maladie.
A partir de ce matériel, faire une suspension de 20 ;? en solution phosph;1tCc
a pH 7,2 (Hanks, Earle, etc. . . ) additl,onnée de 5 000 U de pénicillirie et de
2,s - 3 mg de streptomycine/ml.
Broyer et centrifuger à 6 000 trs/mn pendant 30 mn. Le surnageant est IaissC
1 à 2 heures à la ternpérature ambiante (laisser agir les antibiotiques)
C. INOCULATION DES CULTURES
- Un minimum de 3 tubes est utilisé par diagnostic.
- L’inoculum est dilué au 1 /lOè dans le milieu de culture.
. . . / . . .
- 27
D. HEMADSORPTION
Les hématies nécessaires à la lecture de la réaction sont ajoutées directement
sur la culture 2 heures après l’inoculation.
E. LECTURE
- La première lecture est réalisée de 11 à 16 heures après l’inoculation.
- Les hématies sédimentixs sur la culture sont enlevkes par une légère rot;l-
tien du tube s u r 5011 a x e iongitudinal, avant son observation au microscope.
- On continue l’observation pendant 7 ou 10 jours. Une lecture est effectuée
toutes les 24 heures ~usyu’à la constatation de I’hémadsorptiori ou d’un effet
cytopathogkne sur 50 % des cellules.
- Faire des tubes contrôlks :
- ncgatifs
- p o s i t i f s .
F. INTERPRETATION
-
-
- Les tubes qui présentent le phénomène d’hémadsorption suivi d’effets cyto-
pathogènes entrainent le diagnostic de peste porcine africaine.
- L e s t u b e s q u i n e ~Jr&Seriterlt p a s cf’hémadsorption, a v e c o u s a n s e f f e t cyto-
pathogènes, font l’objet d’une inoculation à des nouvelles cultures. Pour
cela, un mélange de surnageani d e c:es tubes est inoculé à une nr)uvelI(:
série de culture Iclucocytaire ;1 raison de 0,2 ml par tube.
0 n peu t donc o bser vc r
:
- ia présence d’hémadsorption suivie d’effets cytopathogènes, ce qui entrsî-
Iiera le diagnostic de peste pot-cine africaine,
I
. . . . . .
- 28
- l’absence d’hémadsorption et d’effets cytopathogènes qui entrainera un
diagnostic d’absence du virus africain,
- l’absence d’hémadsorption et la presence d’un effet cytopathogène. Dans
ce cas, procéder à un nouvel ensemencement à partir de la culture et à
d’autres épreuves complémentaires, tel les que :
* immunofluorescence au porc
* immunofluorescence
* précipitation en gélose.. .
en vue de déterminer si l’on est en présence d’une souche non hémadsor-
bante du virus africain.
- 29
ANNEXE 4
PREPARATION DE CULTURES DE LEUCOCYTES
SEDIMENTATION SPONTANEE
1 - Le sang est recueilli en tubes sous héparine.
2 - Laisser sédimenter à 37OC en tubes inclinés.
3 - Recueillir le surnageant au moment où la vitesse de sédimentation
commence à diminuer.
4 - Ce surnageant est mélangé à un volume de Hanks ou de Earle puis
distribué en tubes à raison de 2 ml/tube.
5 - Variante : utiliser un Erlen-Meyer à 37OC pendant 1 ou 2 heures.
- 30
ANNEXE 5
CULTURE DE LEUCOCYTES A PARTIR DU
SANG DEFRIBINE
-
-
1 - Donneurs : porcs de 40 - 100 kgs
Ils sont saignes tous les 20 jours.
2 -. Ponction de la veine cave
Le sang est placé dans un défribinateur mécanique de 1 000 ml.
3 - Centrifuger dans des pots de 500 ml a 2 500 trslmn pendant 20 ~III~.
4 - Le sérum est recueilli, puis distribué en petits volumes.
5 - Recueillir à l’aide d’une pipette la couche superficielle du sédiment qui
contient les leucocytes mélangés à une couche d’hématies. Eviter de
prendre trop d’hématies (rapport 4 - 5 ml pour 250 ml de sang).
6- Les leucocytes recueillis sont additionnés de sérum prélevé après la
centrifugation puis ajusté à 6. 106 Ilml.
7 - Distribuer à raison de 1,5 ml en tubes de cultures de tissus.
8 - La suspension est utilisée à 50 00 de sérum pur et 50 “0 de Earle.
9 -. Incuber à 37OC et observer après 48 heures.
10 - Les cultures peuvent être utilisées après 48 heures - 8 jours.
II est important d’utiliser le sérum du même animal donneur des leucocytes
pour la culture.
- 31
ANNEXE 6
CULTURE DES LEUCOCYTES
(MOELLE OSSEUSE)
- Utiliser un porcelet (10 - 20 kgs).
- Laisser à jeun pendant 24 heures.
- Le saigner à blanc pour l’utilisation totale du sérum.
- La moelle est obtenue des épiphyses des os longs et placée dans un milieu
de culture, après être découpée en petits morceaux.
- La dispersion des éléments cellulairece .> est obtenue au moyen d’un agitateur
magnétique et la filtration se fait à travers une gaze stérile.
- Compter les cellules et ajuster à 3.106 I/ml.
- Utiliser du milieu 199 pH 7,2-7,4 avec 10 à 50 Y,
de sérum du mCrnc ;ll>irri;ll.
- Culture sur flacons tubes à essais ou de Leighton pendant 3 jours.
- 32
ANNEXE 7
PREPARATION DE CONJUGUE. FLUORESCENT
-
-
-
Préparation des globulines de I’anti-sérum peste porcine africaine par
le (NH ),SO,à +4*C sous agitation (saturation 50 %).
Dialyse contre du tampon phosphate 0,0175 M pH 6,3 jusqu’à disparition
du sulfate d’ammonium.
Séparation des immunoglobulines sur colonne de DEAE cellulose préalable-
ment équilibrée avec du tampon phosphate 0,0175 M (pH 6,3).
4- Lyophiliser.
5 - Contrôle de pureté par immuno-électrophorèse.
6 - Conjugaison des immunoglobulines (Ig) avec I’isothiocyanate de fluoresceine
(ITCF) selon le rapport de poids 1/50.
La conjugaison se fait à pH 9,5 pendant 30 mn soit à + 4OC, soit à la
température du Labo.
7 - Passer le conjugué sur colonne de séphadex G 25 ou G 50, équilibrée
avec du tampon phosphate pH 7,2 (0,0175 M ) .
8 - Adsorber le conjugé sur poudre de foie de porc pendant 1 heure à + 4OC
en agitation continue suivie de centrifugation a 10 000 trslmn pendant
30 mn.
9 - prendre le surnageant (globuline marquée) et répartir en petits volumes,
puis ajouter du merthiolate de Na à 1110 000.
10 - Conserver à - 2O*C.
11 - Avant son utilisation, déterminer la dilution optimale de son emploi.