i INSTITUT SENEGALAIS DE RECHERCHES AGRICOLES ...
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INSTITUT SENEGALAIS DE RECHERCHES
AGRICOLES (I.S.R.A.)
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---..----..m-.---m.-----
1
LABORATOIRE NATIONAL DE L’ELEVAGE
ET DE RECHERCHES VETERINAIRES
DAKAR-HANN
,.
__
RAPPORT DE MISSION - COUkS REGIONAL DE FORMAT I ON
_
SUR LA PRODUCTION ET LE CONTROLE DE QUALITE DES VACCINS
ANTIBOVIPESTIQUE, ANTIPERIPNEUMONIQUE ET ASSOCIE PB/PFCB
P a r M . S . DIALLO
R E F . No 115/VIROLCGIE
NOVEMBRE 1985
RAPPCRT DE MISSION
COURS REGIONAL DE FORMATION SUR LA PRODUCTION
ET LE CONTROLE DE QUALITE DES VACCINS ANTIBOVIPESTIQUE,
ANTIPERIFNEUMONIQUE
ET ASSOCIE PB/PPCB
:.
INTRODUCTION
:
Un cours r6gional do formation sur la i‘:roduction ot le contrôle dc
quai ii-G des vaccins antibovip&stique,
antiplripneumonique
et essocic
PB/PPCB s'est tenu à Bamako,'1?6publique du Mali, du 23 au 27 septembre 1985.
Dans son allocution de bienvenue, le repr&sentant j:at- intcrim du
repr@sentant résidant de la F.A.0 au Mali a insiste sur le rôle primordial
que les Laboratoires producteurs de vaccins doivent jouer dans ia campagne
d'immunisation du cheptel contre la peste et la pgripneumonie contagieuse
bovine. L'immunisation du cheytel ne peut être obtenue qupavec des vaccins
de bonne qualit&.
Les laboratoires producteurs que vous yeFr6scntez ici sont
char& de fournir ces vaccins.
Le Directeur de Cabinet du Minist&re chat-96 des Ressources naturelles
et de IfElevage, après avoir romercii la F.A.O. pour I$oryanisation de ces
cours et le choix du Mali pour les arbriter s'est exprim6 on ces termes.
L'existence de la pes-ts bovine et la pbripneumonie contagieuse bovine
est un hand’icap certain pour les Qtats africains. Ces deux maladies trans-
'
missibles limitent nos cchan9es commerciaux avec dvautres pays et provoquent
des pertes consid0rables danS notre cheptel.
Les laboratoires que vous repr6sentez ici et vous memes techniciens,
devez contribuer.2 I'6radication de ces deux maladies en produisant des
vaccins de qua.1 i-te,' car seule la vaccination peut nous pwmettre de liquider
ce flfau. Les vaccins que vous êtes appel4 à produire doivent avoir un pou-
voir immunogi?ne
certain, êtrti purs, et engendrer des rcactions vaccinales
acceptables.
. . ./ . . .
e
II clôture son discours en souhaitant plein SU~C~S pour les cours et un bon
?
sbjour au Mal i .
Le Doctuer PPOVOST a fait enfin I’historique de la peste bovine et de i
la phripneumonie contagieuse bovine. Ces deux maladies, diffCrentes dans leurs
symptomatologie et dans leur 6vclution,
prgsentent des aspects sembfables
au point de vue contamination :
(contamination lymphatique, respiratoire, etc).
Les chercheurs ont pens0 qu’i I serait peut-être possi,bie de @parer
un vaccin mixte contre ces deux maladies. Les premiers essais n’ont pas
donne des rksultats satisfaisants,, Et pourtant,i l c-tait c e r t a i n qu!on pouva t
arriver à l’éradication de ces maladies par les vaccinations.
Les difficult6s de production d’un v,accin mixte sont :
a)
- Peste bovine --. Le virus capinisi? est d’une certaine manicre,
-
immuno-dcpressif.
Le virus vaccin PB cultiv6 sur cellules contient des antibiotiques
inhibiteurs des mycoplasmes (streptomycine).
b)
- PGripneumonie contagieuse - Les ovocu I turcs. de mycop l asma
mycoldes occasionnent parfois des lkions pulmonaires.
Le lyophilisation des mycoplasmes (appareils 6 tambour dit centrifuge)
ocçasionne des pestes de titre important.
Néanmoins,
il 6tait possible de trouver une solution.
C’est ainsi que PGOVOST et PERROT rsussiront à isoler une souche de
mycop I asines strepto r6s i stante (TI/SE -. KH3J/SF:). A partir de ces souches,
il etait possible de méalanger le vaccin antipbripneumonique au vaccin anti-
pestique prbpar6 sur cet lules. Restait 2 trouver I e support de I yoph i I isa-
tion et la m&thdde de dessication.
Le I a i t oct-emé en poudre, présente des qualit& requises d’un support
respectant la vie des mycoplasmes,$
e t i I est d’un prix abordable.
En effectuant une cor@ I ation rap ide (tout en G/itant la surfusion q~ i
:e
se produit entre -7OC’ et’-:IO’%) ,. et en KW chauffant quo lorsque la dessica-
.
tion primaire est termi&e,
on obtient une dessication respectant la vie des
;
mycoplasmes.
/
. . . . . .
_
A nos jours, par les résul tats de ces recherches , nous produisons des
vaccins associés PB/PpCB de bonne qualité pour l’immun isation du cheptel
contre la peste bovine et la pkripneumonie contacieusa bovine (vaccin Bisec)
i...’
_*..
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,,
.
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- 4 -
;
SOUCHES VACCINALES CONTRE LA PESTE BOVINE ET LA PERIPNEUMONIE CONTAGIEUSE
BOVINE
Nous ne traiterons dans ce cours que des souches vaccinales antipes-
tiques préparees sur cellules et des souches
antip&ripneumoniques
T1/44 e t
KH3J et de leur variante.
SOUCHE VACCINALE PE3
C’est du vi rus KabetevvOvv (F.BOK) de virus bovipestique après 93 passages
sur couche monocellulaire de cellulesreinales
de bovins. Le virus est lyo-
philise 5 c e t t e o r i g i n e . Un passage supplémentaire a 6-t& effectu& sur des
ceiiulesrsina{e$
de bovin. Le liquide de ce passage a 6-i-c melang& ?I un
molange d’hydrolysot de loctalltimine et de saccharose. Cette suspension est
f ractionnee et conservk ?I -70°C:. Cette rbcol te et le r6sul ta-t de deux pas--
sages ultdrieurs
se sont r6v6lk sans danger pour les bovins et exempts de
contamination bactariennc ou virale decelable.
Les lots de vaccins pr&parés à partir de cette semence doivent être
immunogènes,
exempts de contaminants bactSriens ou viraux decefables et sans
danger.
Le vaccin prbpare sur culture cellulaire prbsente de nombreux avanta-
ges.
1°) - II est efficace pour toutes les races bovines, ovines et caprinas
2”) - II ne provoque aucune réaction clinique notable chez les animaux
vaccines.
3O) - II confere u n e immuniti s o l i d e e t d u r a b l e .
4O)
- I I ne se propage pas par contact.
. . ./ . . .
. . 5 . .
SOUCHES VACC l NALES PPCB
a) - T1/44
La souche Tl/44 est adaptEe par passages sur oeufs de poule em-
bryonni;, d’abord par inoculation sur la membrane chorioal IantoTdienne, et
ensuite par inoculation intrsviteiline. Le 44? pass&6 I yoph i I is6 constitue
la’,b&que qui sert àftiifc un vaccin sur boui I Ion.
b) - KH3J
Et I e est obtenue aprE:s 08 passages. Elle est moins immunogene que
la souche T1/44, mais occasionne des Gactions vaccinales moins fortes. C’est
pour cela qu’et le est Utilis&e pour la vaccination des taurins, pluswnsi-
btes que l e s z&bus.
cl - Tl-SF; e t KH3J-,Sf?
-
-
Des mutants rssistants à la streptomycine furent cr6és
(SP( = Strepto R6sistan-t).
L+ clones strepto r%sistants sont obtenus assez
v i t e (4 passages).
Les souches Tl - Si< e t KH:3J - SR entrent dans la fabrication du
vacc i n m i x t e PB - PPCB (Bi sec).
VACC IN BOV I PEST’IQUE DE CULTUKE CELLULA I FE
:
Pr&aration des cellules de rein de bovin
Les meilleurs &sul+ats sont obtenus avec des veaux tr&s jeunes
(1 à 3 semaines) ou des foetus dsenviron 5 Mois.
Matcriel
: Ciseaux, bistouris, pinces, cuill$re, boites de p6tri flacon à
trypsiner,‘barreau aimant6 recouvert de tef ion, pots 2 centrifuger, enton-
noir avec gaze de coton.
Mi I ieux : Solution tampon phosphate, trypsine, mi I ieu de croissance (Eagi e)
s6rums de veau ou de bovin, antibiotiques.
. . ./ . . .
Procedure
a) - Rein de veau
Assomer et saigner un veau. Prélever aseptiquement les reins qu’on
:Pet dans une boite de potri.
.<
b) - Foetus de veau
Suspendre le foetus par les pattes arrières, le saigner par égor-
gement ; prélever aseptiquement les reins et les mettre dans une boite de
petri.
1°) - Dégraisser, decouper la capsule reinale en deux ; mettre ;G
nu une moitié.;
.:
2O) - Couper des tranches du cortex mis à nu avec un bistouris
ou des ciseaux. Tailler ?I vif le reste de la capsule ; enlever le cortex de
l'autre moitié et proceder comme précédemment. Placer les morceaux dens une
boite de pétri.
3O) - Répéter I1opérationpour l'autre rein.
4O)
- Hacher menu le cortex (morceaux de 3 mm31 avec le bistouris
ou les ciseaux. Mettre le hacht dans le flacon à trysiner.
5O)
d Laver le tissu haché plusieurs fois avec la solution (STP)
froide + 4OC jusqu'à ce que le liquide de lavage soit exempte de sang.
Jeter ie surnageant.
6“) - Ajouter la solution de trypsine froi.de;- Agiter sur agita-
teur magnetique pendant 20 minutes à
+20°C (température ambiante).
7O) - Jeter le surnageant et remettre une sclution de trypsine
‘
froide. Placer le flacon sur agitateur magnetique et laisser tourner à +4'C
pendant 16 heures (une nuit).
T'
/
8') - Retirer le flacon du réfrigerateur et .:
" -
a) - si la trypsination est complete, ajouter 20 ml de
sérum de boeuf normal pour acherver I*action de la trypsine.
-
,.. /
. . .
A
I
b.1 - -si 1.a tryps +nation -est încomplcte, d&canter le surna-
geant qu'on garde et remettre une solution de trypsine neuve à 37OC ; mettre
sur agitation magn&tique a
+37OC jusqu'à ce que tous les fragments soient
/
1. dispercés. Arrêter Ifaction de la trypsine avec du sorum de boeuf normal.
go 1 - Filtrer la suspension sur un entonnoir moite de gaze de
"coton. Mettre le filtra-l- dans les pots à centrifuger.
lo"l
- Centri.fuger à 200 g (environ 800 i-m) sur une centrifugeuse
.I
rbfrigérée pendant 7 m nutes. Jeter le surnageant ; remettre le culot en
"suspension dans du STP contenant 5 $ de sérum de boeuf normal. Recentrifuger
2 200 g pendant 7 minu es.
11°)
- Jeter le surnageant. Remettre le culot en suspension dans
du STP, et recentrifuger dans des pots gradues (200 g - 7 mn?.
i
12O) - Décanter le surnageant, mesurer le volume du culot ceilu-
laire et y ajouter un votume @gai de STP + 5 5 de sérum de boeuf normal.
13O)
- A partir de cette suspension met-e, preparer la suspension
finale dans le milieu de croissance à raison,de 1 partie de suspension mère
pour 200 parties de milieu de croissance. RÉ&rtir dans"des bouteilles ou
dans des boites de Roux.
]4O)
- Mettre $ IPCtuve à
+37'C pendant 4 jours (ne pas bouger
les boites pendant ce temps). Remplacer le milieu de culture par un milieu
d?entretien. Maintenir ivincubation jusqu'a obtenir un tapis cellulaire
complet.
Les couches monocellulaires ainsi obtenues sont prêtes pour :
a) - les cultures secondaires
b! -le stockage à +20°C :'
.-'c) - à l'inoculation du virus bovipestique.
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.
.
i
:
:
', REPIQUAGE DES CELLULES REINALES POUR L'OBTENTION DES CELLULES DE 2e GENERA-
Les cellules semi-dormantes (à +20°C) sont reactivees à +37'C pendant
,24 5 48 heures.
1°) - Vider le liquide de culture,mettre de la solution tampon phos-
phate (STP> chauffée à +37OC. Rincer doucement le tapis, vider.
2O) - Mettre une solution de trypsine-verscne Chauff&e à +37OC ; lais-
,,' 'ser agir pendant 10 minutes. Secouer de temps en temps pour de-tacher les
cellules.
3O) -CG;~rendreIes cellules dans du milieu de croissance ; centrigqer
à 200 9 pendant 10 minutes. Jeter ie surnageant.
4O) - Reprendre le culot cellulaire dans du milieu de culture, faire
une mumi:ration et la dilution finale, puis repartir dans.les bouteilles ou
:
dans les boîtes de Roux.
:,
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STO(J(.DE SEMENCE DU VIRUS BOVIPESTIQUE
La souche Kabete YF est passee deux fois sur cellules reinales de
bovin. A partir du 2". passage, on prepat-e des lots de semence lyophilisés.
-Tous les tests seront effectués sur ces lots (purete efficscit6, stérillt&,
,innocuite, non toxicite, identi-te).
L'inoculum doit être une semence fraîche prdpeke dur cellules reinsles
de bovin et conservee 2 ‘7Q°C, et qui aura sa-ti sfait B tous IGs tests.
INCCULATION DES CELLULES L;EINAtES
La semence est dilu6e à 10-2 dans du bouillon tryptose ; 5 ml de cette
dilution sont ajout& 3 100 ml de suspension cellulaire. liepartir les cel-
lules infectées dans les boites de Roux ou les bouteilles. Mettre à incuber
à l'étuve 2; +37OC.
Le reste de I'inoculum est mis à +37°Cpourcontrôle*de stBrili te.
INOCULATION D'UN TAPIS CELLULAIRE
La semence est diluee à
-2
10
dans du bouillon tryptose. Vider le m i-
lieu des boites à inoculer. Mettre 5 ml de semence par boîte dti rlqcux'de 100
;
ml. Incuber 30 minutes 3 +37OC. Mettre le milieu de maintien et mettre à
I*Etuve à +37OC.
PREM I ER CHANGEMENT DE MI L I EU DES BOITES INOCULEES
l”) Examiner chaque bouteiije-et
n o t e r (PH, exc&s d e turbidit6 e t
contamination fungique.
2O 1 - Examiner au mi c roscope et noter I’&tat des cellules, le pour-
centage de couverture, la prkence , d I ECP,
I a prkence dé .shangemeni%
atyp i -
,ques, changements qui indi quera i en t une contamination virale possible.
3OI - Prélever 0,l ml de milieu et l’ensemencer sur de bouillon de
thioglycolate pour contrôle de st6ri I it6.
4*> - Vider le yi I ieu de culture dans un rkig,ient contenant un anti-
:
-
septique. Eviter i es Ccl aboussures en retour en ut i I i sant un entonnoi r pour
vider.
5’) Remplacer le liquide par du milieu de maintien. et remettre à
I ‘ktuve à +37*C,
Par laj suite, examiner chaque jour les cultures jusqu’à ce que les
ECP a-ient suffisamment progressk pour la rkol te.
t:ECOLTE DU ViRUS BOVIPESTIQUE
1°) - Récolter le surnageant de chaque boite 3 part, pa.r asp+ration,
après avoir examiner les boîtes individuellement. Si une autre rkolte est
prkue,
remettre du milieu de maintien et remettre à If incubateur.
ZO) - Chaque ri;col te est mise 2 part dans un pot. à centrifuger ; puis
on centrifuge à 1 000 g’;endant 20 minutes.
3O 1 - Rkol ter soigneusement le surnageant, auquc I on ajoute une quan-
tiC &gale de lactalbumine hydrolys6 et de saccharose t-e f r o i d i à +4’C.
4O)
- Bien mélanger et prélever 0,4 ml du mélange pour chaque fraction
de 100 ml. Ensemencer du milieu de Sabourand et du boui I Ion de thioglycolate
pour contrôle de stgri I i-t&. Pr6lever aussi des khantillons du mélange pour
.l,es t i t r a g e s .
.a. /.
.
.
5O) - Conserver les recoltes à -7OOC jusqu9à la fin des tests de
stét-ilite
et dejstitrages.
6') - Si une seconde recolte est pt-evue, pr6cQder comme pour la recel-
te 1.
CONTROLE DE STERILITE
.
i
Inocuier 10 tubes de bouillon de thioglycolate et 10 tubes de milieu
de Sabaurand avec 0,2 ml de suspension virale. Incuber la moitié de chaque
serie à
+37OC et l'autre moiti6 à +20°C pendant 10 jours0
Ecarter toute recolte montrant un développement bacterien ou fungique
dans les cultures.
TITPAGE DES RECOLTES
Preparer :
1°1 - une suspension de cellules secondaires de rein de bovin dans du m
milieu de croissance (concentration 2 x 1 0-5 cellules par ml).
ZO) - 35 tubes bouches dans lesquels on met 2 ml de suspension ce1 lu.-
laife dans chaque tube.
3Oj - 6 tubes de dilution contenant chacun 9 ml de BTP.
4O) - Dilution du virus : Mettre 1 ml dPkhantillon viral dans le
-1. Transférer 1 ml
premier tube de dilution. Mélanger ; cll;st la dilution 1 0
de cettegdilution au tube suivant = 10
Ccntlnuor la s:ric de.diIution~jus-
C$I. 10 . Mettra 0,2 ml de chaque dilution par tube, 5 tubes par dilu*lon.
5") Mettre à l'étuve à +37"C. Lire les ECP des tubes pendant 10 à 12
jours, et calculer le titre, selon la methode de REED et NUNCH.
, :
'... . . .
/
LYOPHILISATION
a)
- Mélange des récoltes
Décongeler lentement les rbcoltes conservees à -70°C, Agiter fré-
quemment pour empêcher le developpement des couches salines concentrées.
Mesurer le volume des rkoltes et ajuster de façon 2 remplir l’appareil à
lyophiliser (cet ajustement n’est possible que si l’on a un tibro elev6 de
v i r u s ) .
b)
- Distribuer dans chaque flacon le volume de vaccin nécessaire selon
le nombre de doses par f iacon. Charger I ‘apparei 1.
cl -’ Congeler le vaccin dans I’apparei I et lyophi I iser.
Lorsque le vaccin est sec, soit faire un bouchage sous vide, soit
casser le vide avec de IPazote neutre. Ouvrir l’appareil, sortir les flacons
et les capsuler. Etique?ter les flacons et les conserver à .-20°C jusqu’à la
fin des tests.
t
.
-?3-
4O)
- INcuber à 19étuve 8 +37OC, 5 tubes de bouillon de thioglycolate
+ 1 temoin ; 5 tubes de milieu de Sabourand + 1 témoin et les tvbes de
bouil len mycoplasme + les t&oins.
5O)
- Incuber les autres tubes et les témoins 2 +20°C. Examiner tous
les tubes quotidiennement pendant 7 jours. Noter les resultats.
Titrage du vaccin ..* Reconstituer un echant i I Ion repr6senta-t if du lot
dans ‘de .f’eau dis-t] I lé&. * ‘ i
”
.:. I,
: ..I.’ ,._
*
.,“l
b
,o4j
:
t”l
- Faire des dilutions de 10
dans’: d u BTP” ’
2O)
- tnocirl’er 0,2 ml de chaqee dilution ‘à 5 tubes de’suspension
.I
cellulaires (cel’l’Ulk$s cl52 rein de::bovin ,de 2” generaticn:)~. Gardér 5 tubes
temoins c e l l u l e s ; Rkpéter l e tit’ragé‘ troisfois avec trai’s lots dlfftronts de
tel lules de rein de ‘bovin’.
“~.
”
,’
a
;
;.
.., :
3O) - Incuber l e s t u b e s inocule‘s’à i ’
‘
‘étuve à ’+37”C. Faire un change-
. i “. “i. ..‘:>y <. -Y .
‘*,>,.? j 6 y;,. !P ;s ‘Pi+ > . : Y”
6, 1c *^n ,w, ), .h i.
<
*.:
:r.,i,
-ment de mi I’i’eu “le ‘4” jour. Lire I es ECP pondant ‘16 jours.
Si un des titrages
. a;\\. i :‘;. ; *3b ,;f
est i-t-es diffsrent des autres, faire un 4e titrage avec un au+rei’i8t“‘de
cellules. Calculer le titre selon la mkthode de REED et MUNCH.
i
. . ./ . . .
;
t
.-14*-
. _ .
Test d’ innocuite r’ U t i l i s e r d e u x t a u r i l l o n s d o n t l a s e n s i b i l i t é a éti
.
contrôlée par le test de neutralisation.
1°) - Saigner I es! tauri I Ions pour. avoir un &rum avant inoculation.
,’
z” 1 - Reconsti t uer le vaccin avec de l’eau distill3e ou du BTP.
3O) - I nocu Ier à chaque animal 5 ml de vaccin reconstitue.
4O) - Prendre I a temperature .pendant 14 jours.
5O 1 - Saigner les an imaux 21 jours aprbs inoculation
BO)
* RecheEfFe~ lels: ant icorprs neufrat isants dans I es sGtwrrrs avant et
apres inoculation.
Test de non toxicite m-’ Reconstituer du vaccin dans 5 ml eau distillée.
Peser 4 cobayes et 6 souris.
,1°) - Inoculer 0,5 ml 2 2 cobayes par la voie intramusculaire dans une
pa$te poster i cure.
2’) Inoculer 0,5 ml 2 2 cobayes par la voie intrapériton6ale
3a”)- Inoculer 0,l ml a 6 souris par !a voie intraperitonéale.
Observer les animaux inoculés pendant 3 semaines en notant toutes
les anomal les.
Test d’efficacite
=a UtiIiser,des veaux de plus de 12 mois, ne possédant
-
pas d’anticorps neutralisant le virus PB.
1°) - Inoculer 1 veau avec 100 doses vaccinales
ZO) =- Inoculer 1 veau awc l/lOOe de la dose vaccinale p garder un
veau temoin. Prendre leur temperature pendant 3 semaines.
3O)
- Inoculer les 3 veaux avec le virus d’épreuve, et continuer à
prendre la température pendant 15 jours apr&s 1’ inoculation d’épreuve. Noter
les r5sul tats.
N.B. *- On peut uti I iser le virus copripestique comme virus d’épreuve
ii
I
. . /
. . . .
Contrôle d'identitk -3 Faire une séroneutralisstion du virus vaccin
avec du sérum de lapin hyparimmun contre la peste bovine, et une autre sera-
neutralisation avec du s8rum normal de lapin. Lire les résultats au bout de
14 jours.
Contrô.le du vide '- Ce contrôle est fait si le vaccin est bouc!% sous
vide. Un appareil, le Spark Tester permet de faire ce contrôle.
Contrôle de I'humiditQ résiduelle - La teneur en eau du vaccin ne doit
pas être supérieure à 0,5 $ du produit lyophilis&, Le dosage de I'humiditk
r&siduelle peut être effectue par la méthode de Karl Fischer.
VACCIN CONÏ-RE LA PERIPNEUMONIE CONTAGIEUSE BOVINE
MILIEU DE CULTUffE
Le milieu de culture de mycoplasmes est celui utilisé au Labora-
tore de Farcha (mii'k& F 66). Quelques modifications dans la composition du
F 66 ont &té apportées afin de diminuer son prix et faciliter sa préparation.
Une Modification de M. DOUTEE consiste à préparer une digestion papalnique
de coeur au lieu de la mac&ration.
PREPARATION DU MILIEU
Coeur hachg ...............................
5 kg
Eau distillé ..............................
10 k$L i-h%
Chauffer à 50°C pendant 1 heure, puis porter à ébullution et filtrer à chaud
Ajouter pour 10 litres de mac6ration :
Bacto tryptose .............................
100 g
Glucose ....................................
20 9
Phosphate disodique ........................
25 9
Glycérol ....................................
39
Acide oléique ..............................
50 g/gttes
Extrait de levure ..........................
50 g
Sérum de cheval dep ........................
1 000 ml
PénicilSine
1000000 UI
...............................
Fi-l 8/81
Clarifier et stériliser par filtration.
(..
/.
.
.
i
-F7-
Ce milcieu convient aussi bien pour la culture des souches Tl et KH3J.
Pour le développement de leurs variantes SR, on ajoute 1 g de streptomycine ,
pour 10 litres de milieu. R%partir dans les ballons.
Préparation de I-vinoculur~ :
1°) -- Préparer 1 litre de milieu de culture qu'on met dans un
erlen meyer de 2 litres : cet erlen-meyer doit avoir 3 sa base une tubulure
montée d'un tube en rhodorcil. Le tube est obturé par une canne de verre
soudee à l'extrémité.
ZO) -' Préparer une gamme de 8 tubes contenant chacun 9 mi de
milieu. A partir d'une ampoule de la banque, 1 ml. de suspension mycoplasmique
est porte dans le ler tube (dilution 10-l). Apres homog&tGisation,
1 ml de
cette dilution est port6 dans le 2e tube (dilution lO=") et ainsi de suite,
jusquQà 10-8 . Boucher les tubes avec du coton carde et les mettre a I'&uve
à +37"C pendant 4 jours. Les deux derniers tubes presentant une culture
serviront à ensemencer 17erlen-meyer.
3O) - L'erlen-meyer est mis en incubation à I'&l-uve à +37OC pen-
dant 3 jours. Faire un contrôle.de pureté de la.culture (coioration de gram.)
Inoculation du ballon : Avec 1 litre d'inoculum (erlen), ensemencer le
ballon. Mettre à t'étuve à +37OC pendant-70 & 72 heures (les premiGres 24
heures sans agitation, p uis sur agitation magne-tique le reste du temps).
Faire un contrôle de puret du bal ton (coloration au gram.).
Distribution et lyophilisation - Pour chaque litre dc culture de myco-
plasmes, on ajoute 45 g de lait écrémé sec. Après dissolution complite du
lait, le vaccin est réparti dans des flacons types pénicilline de 20 ml à
raison de 5 ml par flacon.
Le vaccin est ensuite charge dans l'appareil congele et lyophilisé.
L'appareil à lyophiliser doit être un appareil à etagkt-es et non du type
,centrifuge. A. la fin de la' lyophilisation, les flacons sont bouchés soit
,.. /
. . .
-lO-
sous vide, soit sous azote neutre ; ils sont ensuite etiquettés et conservés
ZJZO*C jusqu'à la fin des tests.
CONTROLE DU PRODUIT FINI
Test de stérilite +m Le contrôle de stérilité est classique. II se fait
-par ensemencement sur mit i-eu a8robie et anaérobie.
Reconstituer 2 flacons avec 10 ml ,eau disfïII&stériIe. Faire un
étalement sur lame et une coloration de Giemsa et de gram. pour contrôler
l'absence de contamination.r
Ensemencer : 10 tubes de bouillon tryptose sérum
2 boîtes de petri de tryptose agar sorum
10'tÙbes de bouillon de thioglycolate'
Garder des témoins pour chaque milieu. Mettre ?I 1 fétuve à +37'C.
Tous les milieux doivent rester stériles après 14 jours d'incubation.
Test d'identité c:l Faire une précipitation sur gélose. Une ligne de
<
~precipitation est observ6e avec l'immun sérum précipitant.
:_
Contrôle de streptomycine rbsistant
- Ce contrôle est fait pour les
souches SR, Ce caractere differencie les souches vaccinales Tl-SR/KH3J-SR
des autres souches de,mycoplasmes pouvant être manipul&s du laboratoire.
Test d'inhibition de croissance -1 C'est un test indispensable pour
l'identification des especes de mycoplasmes. En présence dFun immun sérum
puissant, ies mycoplasmes ont une croissance et une multipl'tcation bloquées
par les anticorps spécifiqees correspondants.
Test d'innocuité -.I Le vaccin est reconstitué dans de l'eau distillée
sterile.
1 6
1°)
- Inoculet 4 cobayes avec 1 ml, par la voie sous cutanée.
. . /. ..*
-1%
ZO) - Inoculer 4 souris avec 0,5 ml par la voie intrap6ritoneale
. .
Mettre les animaux ‘inocules en observation pendant 3 semaines au bout
desquelies ils ne doivent présenter aucun signe de maladie.
Il est conseille de vacciner 10 veaux avec 50 doses vaccinalee et les
observer au laboratoire pendant 4 semaines.
La souche T1/44 provoque parfois des r6akiions post-,vaccinales impor-
tantes (oedeme à tendance envahissante) surtout chez le taurin,
Titrage du vaccin ‘- Reconstituer le vaccin et, prendre 1 ml (1 dose
vaccinale)
F a i r e d e s d i l u t i o n s & ‘r”‘. 3 ‘0-10
Mettre les tubes 3 I*Gtuva à *37’C et lire lac résultats aprbs 1 se-
-7
maine. La dose vaccinale doit titrer au moins 10
organ i smes v iab I es. Toute-,
fois, on s’efforcera de ne pas I ivrer un vaccin dont le titre est inférieur
-8
à 10
par dose vaccinale.
Contrôle de IshumiditB rési.dueIIe - La teneur en .eau ne doit pas être
su@G?ri-eure à 0,5 $ du produit lyophil isé. Ce dosage peut être effectue par
. .
la mkthode de Karl Fischer.
Con-l-rôl e du v i de -- Ce contrôle est essentiel si Ilon a chojsi, le
bouchage des flacons sous vide au lieu d!azote.
Contrôle d1 immunitc -- La méthode de contact mise au point par les
chercheurs austral icns, a permis de savoir que’3 et 7 mois et demi aprk la
vakination, I 1 immu’nit6 est totale (T1/44) ;“ quatorze mois apres la vaccina-
tion, elle est encore de 90 $.
:
Ii est Evident quoi1 nOes-i- pas possible de faire une expét- ience de
contact pour chaque I ot dc vaccin produ ii-.
La valeur de l’immunité de la souche T1/44 étant’ prouvée une fois pour
toute,
ce contrôle se ram?.nc 6 un titrage du nombre de microorgan ismcs via-
bles par dose vaccinale.
. . /. .*.
-2o-
-.
VACCIN MIXTE CONTRE LA PESTE BOVINE ET LA PERIPNEUMONIE
CONTAGIEUSE BOVINE
(BISECI
Le vaccin mixte antibovipestique-antipGripneumonique
est un mélange
en proportionsdéterminées dvune culture atténu6e du virus de la peste
bovine sur culture cellulaire et dqune culture vivante d’une souche atténuoe
de mycoplasma myco?des. (Tl re SR ou KH3J
- SRI, additionné dqun stabil isa-
t e u r , p u i s lyophilise~
I I e s t e s s e n t i e l d ’ u t i l i s e r u n e culture de virus vaccin bovipestique
ayant un titre maximum en unités viru lentes, et une cultut-c de mycoplasmes
Si7 ayant atteint un developpement opt imum.
.-3
L’animal à vacciner doit recevo ir au moins 10
DCF/50 dose peste
bovine, et IO-’ unités viables de mycoplasma myco’idcs, dose peripneumonie.
II est préférable de preparer le.composant bovipestique 3 I ‘avance
:,
et de le conserver a -.70°C jusqu’au moment du melange.
.:.
Mél ange des deux composants - Le composant pesti que est t i tri! d’avan-
ce. Basé sur son titre, on calcule le volume du composant pCt-ipneumonique.
Ajouter au mélange 45 13 de lait écrémé sec par I itre. Distribuer en flacons
et lyophi I iser.
Contrôles du vaccin b isec - Des contrôles sont dk,js. effectubs sur
- - -
chacun des composants avanf le mélange. Neanmoins, un test de stéril ité et
un titrage de chacun dos
composants sont faits apres lyophilisation.
Sur les flacons bouches, on effectue le contrôle de lPhumidité
ksiduelle et un con-l-t-ô-e du vide si les flacons sont bouchés sous vide.
Les flacons sont enfin’ etiquettés et conservés à . 20°C jusqu’au
moment de l’expédition.
--
--
L
L
PB = PESTE BOV INE
F
STP = SOLUTION TAMPON PHOSPHATE
BTP = BOUILLON TRYPTOSE PHOSPHATE
ECP = EFFET CYTOPATHOGENE
S R -. STREPTO T:ES l STANT
INSTITUT SENEGALAIS DE RECHERCHES
AGRICOLES (I.S.R.A.)
i
---..----..m-.---m.-----
1
LABORATOIRE NATIONAL DE L’ELEVAGE
ET DE RECHERCHES VETERINAIRES
DAKAR-HANN
,.
__
RAPPORT DE MISSION - COUkS REGIONAL DE FORMAT I ON
_
SUR LA PRODUCTION ET LE CONTROLE DE QUALITE DES VACCINS
ANTIBOVIPESTIQUE, ANTIPERIPNEUMONIQUE ET ASSOCIE PB/PFCB
P a r M . S . DIALLO
R E F . No 115/VIROLCGIE
NOVEMBRE 1985
RAPPCRT DE MISSION
COURS REGIONAL DE FORMATION SUR LA PRODUCTION
ET LE CONTROLE DE QUALITE DES VACCINS ANTIBOVIPESTIQUE,
ANTIPERIFNEUMONIQUE
ET ASSOCIE PB/PPCB
:.
INTRODUCTION
:
Un cours r6gional do formation sur la i‘:roduction ot le contrôle dc
quai ii-G des vaccins antibovip&stique,
antiplripneumonique
et essocic
PB/PPCB s'est tenu à Bamako,'1?6publique du Mali, du 23 au 27 septembre 1985.
Dans son allocution de bienvenue, le repr&sentant j:at- intcrim du
repr@sentant résidant de la F.A.0 au Mali a insiste sur le rôle primordial
que les Laboratoires producteurs de vaccins doivent jouer dans ia campagne
d'immunisation du cheptel contre la peste et la pgripneumonie contagieuse
bovine. L'immunisation du cheytel ne peut être obtenue qupavec des vaccins
de bonne qualit&.
Les laboratoires producteurs que vous yeFr6scntez ici sont
char& de fournir ces vaccins.
Le Directeur de Cabinet du Minist&re chat-96 des Ressources naturelles
et de IfElevage, après avoir romercii la F.A.O. pour I$oryanisation de ces
cours et le choix du Mali pour les arbriter s'est exprim6 on ces termes.
L'existence de la pes-ts bovine et la pbripneumonie contagieuse bovine
est un hand’icap certain pour les Qtats africains. Ces deux maladies trans-
'
missibles limitent nos cchan9es commerciaux avec dvautres pays et provoquent
des pertes consid0rables danS notre cheptel.
Les laboratoires que vous repr6sentez ici et vous memes techniciens,
devez contribuer.2 I'6radication de ces deux maladies en produisant des
vaccins de qua.1 i-te,' car seule la vaccination peut nous pwmettre de liquider
ce flfau. Les vaccins que vous êtes appel4 à produire doivent avoir un pou-
voir immunogi?ne
certain, êtrti purs, et engendrer des rcactions vaccinales
acceptables.
. . ./ . . .
e
II clôture son discours en souhaitant plein SU~C~S pour les cours et un bon
?
sbjour au Mal i .
Le Doctuer PPOVOST a fait enfin I’historique de la peste bovine et de i
la phripneumonie contagieuse bovine. Ces deux maladies, diffCrentes dans leurs
symptomatologie et dans leur 6vclution,
prgsentent des aspects sembfables
au point de vue contamination :
(contamination lymphatique, respiratoire, etc).
Les chercheurs ont pens0 qu’i I serait peut-être possi,bie de @parer
un vaccin mixte contre ces deux maladies. Les premiers essais n’ont pas
donne des rksultats satisfaisants,, Et pourtant,i l c-tait c e r t a i n qu!on pouva t
arriver à l’éradication de ces maladies par les vaccinations.
Les difficult6s de production d’un v,accin mixte sont :
a)
- Peste bovine --. Le virus capinisi? est d’une certaine manicre,
-
immuno-dcpressif.
Le virus vaccin PB cultiv6 sur cellules contient des antibiotiques
inhibiteurs des mycoplasmes (streptomycine).
b)
- PGripneumonie contagieuse - Les ovocu I turcs. de mycop l asma
mycoldes occasionnent parfois des lkions pulmonaires.
Le lyophilisation des mycoplasmes (appareils 6 tambour dit centrifuge)
ocçasionne des pestes de titre important.
Néanmoins,
il 6tait possible de trouver une solution.
C’est ainsi que PGOVOST et PERROT rsussiront à isoler une souche de
mycop I asines strepto r6s i stante (TI/SE -. KH3J/SF:). A partir de ces souches,
il etait possible de méalanger le vaccin antipbripneumonique au vaccin anti-
pestique prbpar6 sur cet lules. Restait 2 trouver I e support de I yoph i I isa-
tion et la m&thdde de dessication.
Le I a i t oct-emé en poudre, présente des qualit& requises d’un support
respectant la vie des mycoplasmes,$
e t i I est d’un prix abordable.
En effectuant une cor@ I ation rap ide (tout en G/itant la surfusion q~ i
:e
se produit entre -7OC’ et’-:IO’%) ,. et en KW chauffant quo lorsque la dessica-
.
tion primaire est termi&e,
on obtient une dessication respectant la vie des
;
mycoplasmes.
/
. . . . . .
_
A nos jours, par les résul tats de ces recherches , nous produisons des
vaccins associés PB/PpCB de bonne qualité pour l’immun isation du cheptel
contre la peste bovine et la pkripneumonie contacieusa bovine (vaccin Bisec)
i...’
_*..
,.
.:
,,
.
,
- 4 -
;
SOUCHES VACCINALES CONTRE LA PESTE BOVINE ET LA PERIPNEUMONIE CONTAGIEUSE
BOVINE
Nous ne traiterons dans ce cours que des souches vaccinales antipes-
tiques préparees sur cellules et des souches
antip&ripneumoniques
T1/44 e t
KH3J et de leur variante.
SOUCHE VACCINALE PE3
C’est du vi rus KabetevvOvv (F.BOK) de virus bovipestique après 93 passages
sur couche monocellulaire de cellulesreinales
de bovins. Le virus est lyo-
philise 5 c e t t e o r i g i n e . Un passage supplémentaire a 6-t& effectu& sur des
ceiiulesrsina{e$
de bovin. Le liquide de ce passage a 6-i-c melang& ?I un
molange d’hydrolysot de loctalltimine et de saccharose. Cette suspension est
f ractionnee et conservk ?I -70°C:. Cette rbcol te et le r6sul ta-t de deux pas--
sages ultdrieurs
se sont r6v6lk sans danger pour les bovins et exempts de
contamination bactariennc ou virale decelable.
Les lots de vaccins pr&parés à partir de cette semence doivent être
immunogènes,
exempts de contaminants bactSriens ou viraux decefables et sans
danger.
Le vaccin prbpare sur culture cellulaire prbsente de nombreux avanta-
ges.
1°) - II est efficace pour toutes les races bovines, ovines et caprinas
2”) - II ne provoque aucune réaction clinique notable chez les animaux
vaccines.
3O) - II confere u n e immuniti s o l i d e e t d u r a b l e .
4O)
- I I ne se propage pas par contact.
. . ./ . . .
. . 5 . .
SOUCHES VACC l NALES PPCB
a) - T1/44
La souche Tl/44 est adaptEe par passages sur oeufs de poule em-
bryonni;, d’abord par inoculation sur la membrane chorioal IantoTdienne, et
ensuite par inoculation intrsviteiline. Le 44? pass&6 I yoph i I is6 constitue
la’,b&que qui sert àftiifc un vaccin sur boui I Ion.
b) - KH3J
Et I e est obtenue aprE:s 08 passages. Elle est moins immunogene que
la souche T1/44, mais occasionne des Gactions vaccinales moins fortes. C’est
pour cela qu’et le est Utilis&e pour la vaccination des taurins, pluswnsi-
btes que l e s z&bus.
cl - Tl-SF; e t KH3J-,Sf?
-
-
Des mutants rssistants à la streptomycine furent cr6és
(SP( = Strepto R6sistan-t).
L+ clones strepto r%sistants sont obtenus assez
v i t e (4 passages).
Les souches Tl - Si< e t KH:3J - SR entrent dans la fabrication du
vacc i n m i x t e PB - PPCB (Bi sec).
VACC IN BOV I PEST’IQUE DE CULTUKE CELLULA I FE
:
Pr&aration des cellules de rein de bovin
Les meilleurs &sul+ats sont obtenus avec des veaux tr&s jeunes
(1 à 3 semaines) ou des foetus dsenviron 5 Mois.
Matcriel
: Ciseaux, bistouris, pinces, cuill$re, boites de p6tri flacon à
trypsiner,‘barreau aimant6 recouvert de tef ion, pots 2 centrifuger, enton-
noir avec gaze de coton.
Mi I ieux : Solution tampon phosphate, trypsine, mi I ieu de croissance (Eagi e)
s6rums de veau ou de bovin, antibiotiques.
. . ./ . . .
Procedure
a) - Rein de veau
Assomer et saigner un veau. Prélever aseptiquement les reins qu’on
:Pet dans une boite de potri.
.<
b) - Foetus de veau
Suspendre le foetus par les pattes arrières, le saigner par égor-
gement ; prélever aseptiquement les reins et les mettre dans une boite de
petri.
1°) - Dégraisser, decouper la capsule reinale en deux ; mettre ;G
nu une moitié.;
.:
2O) - Couper des tranches du cortex mis à nu avec un bistouris
ou des ciseaux. Tailler ?I vif le reste de la capsule ; enlever le cortex de
l'autre moitié et proceder comme précédemment. Placer les morceaux dens une
boite de pétri.
3O) - Répéter I1opérationpour l'autre rein.
4O)
- Hacher menu le cortex (morceaux de 3 mm31 avec le bistouris
ou les ciseaux. Mettre le hacht dans le flacon à trysiner.
5O)
d Laver le tissu haché plusieurs fois avec la solution (STP)
froide + 4OC jusqu'à ce que le liquide de lavage soit exempte de sang.
Jeter ie surnageant.
6“) - Ajouter la solution de trypsine froi.de;- Agiter sur agita-
teur magnetique pendant 20 minutes à
+20°C (température ambiante).
7O) - Jeter le surnageant et remettre une sclution de trypsine
‘
froide. Placer le flacon sur agitateur magnetique et laisser tourner à +4'C
pendant 16 heures (une nuit).
T'
/
8') - Retirer le flacon du réfrigerateur et .:
" -
a) - si la trypsination est complete, ajouter 20 ml de
sérum de boeuf normal pour acherver I*action de la trypsine.
-
,.. /
. . .
A
I
b.1 - -si 1.a tryps +nation -est încomplcte, d&canter le surna-
geant qu'on garde et remettre une solution de trypsine neuve à 37OC ; mettre
sur agitation magn&tique a
+37OC jusqu'à ce que tous les fragments soient
/
1. dispercés. Arrêter Ifaction de la trypsine avec du sorum de boeuf normal.
go 1 - Filtrer la suspension sur un entonnoir moite de gaze de
"coton. Mettre le filtra-l- dans les pots à centrifuger.
lo"l
- Centri.fuger à 200 g (environ 800 i-m) sur une centrifugeuse
.I
rbfrigérée pendant 7 m nutes. Jeter le surnageant ; remettre le culot en
"suspension dans du STP contenant 5 $ de sérum de boeuf normal. Recentrifuger
2 200 g pendant 7 minu es.
11°)
- Jeter le surnageant. Remettre le culot en suspension dans
du STP, et recentrifuger dans des pots gradues (200 g - 7 mn?.
i
12O) - Décanter le surnageant, mesurer le volume du culot ceilu-
laire et y ajouter un votume @gai de STP + 5 5 de sérum de boeuf normal.
13O)
- A partir de cette suspension met-e, preparer la suspension
finale dans le milieu de croissance à raison,de 1 partie de suspension mère
pour 200 parties de milieu de croissance. RÉ&rtir dans"des bouteilles ou
dans des boites de Roux.
]4O)
- Mettre $ IPCtuve à
+37'C pendant 4 jours (ne pas bouger
les boites pendant ce temps). Remplacer le milieu de culture par un milieu
d?entretien. Maintenir ivincubation jusqu'a obtenir un tapis cellulaire
complet.
Les couches monocellulaires ainsi obtenues sont prêtes pour :
a) - les cultures secondaires
b! -le stockage à +20°C :'
.-'c) - à l'inoculation du virus bovipestique.
’
i’.. / .
.
.
i
:
:
', REPIQUAGE DES CELLULES REINALES POUR L'OBTENTION DES CELLULES DE 2e GENERA-
Les cellules semi-dormantes (à +20°C) sont reactivees à +37'C pendant
,24 5 48 heures.
1°) - Vider le liquide de culture,mettre de la solution tampon phos-
phate (STP> chauffée à +37OC. Rincer doucement le tapis, vider.
2O) - Mettre une solution de trypsine-verscne Chauff&e à +37OC ; lais-
,,' 'ser agir pendant 10 minutes. Secouer de temps en temps pour de-tacher les
cellules.
3O) -CG;~rendreIes cellules dans du milieu de croissance ; centrigqer
à 200 9 pendant 10 minutes. Jeter ie surnageant.
4O) - Reprendre le culot cellulaire dans du milieu de culture, faire
une mumi:ration et la dilution finale, puis repartir dans.les bouteilles ou
:
dans les boîtes de Roux.
:,
: .,
STO(J(.DE SEMENCE DU VIRUS BOVIPESTIQUE
La souche Kabete YF est passee deux fois sur cellules reinales de
bovin. A partir du 2". passage, on prepat-e des lots de semence lyophilisés.
-Tous les tests seront effectués sur ces lots (purete efficscit6, stérillt&,
,innocuite, non toxicite, identi-te).
L'inoculum doit être une semence fraîche prdpeke dur cellules reinsles
de bovin et conservee 2 ‘7Q°C, et qui aura sa-ti sfait B tous IGs tests.
INCCULATION DES CELLULES L;EINAtES
La semence est dilu6e à 10-2 dans du bouillon tryptose ; 5 ml de cette
dilution sont ajout& 3 100 ml de suspension cellulaire. liepartir les cel-
lules infectées dans les boites de Roux ou les bouteilles. Mettre à incuber
à l'étuve 2; +37OC.
Le reste de I'inoculum est mis à +37°Cpourcontrôle*de stBrili te.
INOCULATION D'UN TAPIS CELLULAIRE
La semence est diluee à
-2
10
dans du bouillon tryptose. Vider le m i-
lieu des boites à inoculer. Mettre 5 ml de semence par boîte dti rlqcux'de 100
;
ml. Incuber 30 minutes 3 +37OC. Mettre le milieu de maintien et mettre à
I*Etuve à +37OC.
PREM I ER CHANGEMENT DE MI L I EU DES BOITES INOCULEES
l”) Examiner chaque bouteiije-et
n o t e r (PH, exc&s d e turbidit6 e t
contamination fungique.
2O 1 - Examiner au mi c roscope et noter I’&tat des cellules, le pour-
centage de couverture, la prkence , d I ECP,
I a prkence dé .shangemeni%
atyp i -
,ques, changements qui indi quera i en t une contamination virale possible.
3OI - Prélever 0,l ml de milieu et l’ensemencer sur de bouillon de
thioglycolate pour contrôle de st6ri I it6.
4*> - Vider le yi I ieu de culture dans un rkig,ient contenant un anti-
:
-
septique. Eviter i es Ccl aboussures en retour en ut i I i sant un entonnoi r pour
vider.
5’) Remplacer le liquide par du milieu de maintien. et remettre à
I ‘ktuve à +37*C,
Par laj suite, examiner chaque jour les cultures jusqu’à ce que les
ECP a-ient suffisamment progressk pour la rkol te.
t:ECOLTE DU ViRUS BOVIPESTIQUE
1°) - Récolter le surnageant de chaque boite 3 part, pa.r asp+ration,
après avoir examiner les boîtes individuellement. Si une autre rkolte est
prkue,
remettre du milieu de maintien et remettre à If incubateur.
ZO) - Chaque ri;col te est mise 2 part dans un pot. à centrifuger ; puis
on centrifuge à 1 000 g’;endant 20 minutes.
3O 1 - Rkol ter soigneusement le surnageant, auquc I on ajoute une quan-
tiC &gale de lactalbumine hydrolys6 et de saccharose t-e f r o i d i à +4’C.
4O)
- Bien mélanger et prélever 0,4 ml du mélange pour chaque fraction
de 100 ml. Ensemencer du milieu de Sabourand et du boui I Ion de thioglycolate
pour contrôle de stgri I i-t&. Pr6lever aussi des khantillons du mélange pour
.l,es t i t r a g e s .
.a. /.
.
.
5O) - Conserver les recoltes à -7OOC jusqu9à la fin des tests de
stét-ilite
et dejstitrages.
6') - Si une seconde recolte est pt-evue, pr6cQder comme pour la recel-
te 1.
CONTROLE DE STERILITE
.
i
Inocuier 10 tubes de bouillon de thioglycolate et 10 tubes de milieu
de Sabaurand avec 0,2 ml de suspension virale. Incuber la moitié de chaque
serie à
+37OC et l'autre moiti6 à +20°C pendant 10 jours0
Ecarter toute recolte montrant un développement bacterien ou fungique
dans les cultures.
TITPAGE DES RECOLTES
Preparer :
1°1 - une suspension de cellules secondaires de rein de bovin dans du m
milieu de croissance (concentration 2 x 1 0-5 cellules par ml).
ZO) - 35 tubes bouches dans lesquels on met 2 ml de suspension ce1 lu.-
laife dans chaque tube.
3Oj - 6 tubes de dilution contenant chacun 9 ml de BTP.
4O) - Dilution du virus : Mettre 1 ml dPkhantillon viral dans le
-1. Transférer 1 ml
premier tube de dilution. Mélanger ; cll;st la dilution 1 0
de cettegdilution au tube suivant = 10
Ccntlnuor la s:ric de.diIution~jus-
C$I. 10 . Mettra 0,2 ml de chaque dilution par tube, 5 tubes par dilu*lon.
5") Mettre à l'étuve à +37"C. Lire les ECP des tubes pendant 10 à 12
jours, et calculer le titre, selon la methode de REED et NUNCH.
, :
'... . . .
/
LYOPHILISATION
a)
- Mélange des récoltes
Décongeler lentement les rbcoltes conservees à -70°C, Agiter fré-
quemment pour empêcher le developpement des couches salines concentrées.
Mesurer le volume des rkoltes et ajuster de façon 2 remplir l’appareil à
lyophiliser (cet ajustement n’est possible que si l’on a un tibro elev6 de
v i r u s ) .
b)
- Distribuer dans chaque flacon le volume de vaccin nécessaire selon
le nombre de doses par f iacon. Charger I ‘apparei 1.
cl -’ Congeler le vaccin dans I’apparei I et lyophi I iser.
Lorsque le vaccin est sec, soit faire un bouchage sous vide, soit
casser le vide avec de IPazote neutre. Ouvrir l’appareil, sortir les flacons
et les capsuler. Etique?ter les flacons et les conserver à .-20°C jusqu’à la
fin des tests.
t
.
-?3-
4O)
- INcuber à 19étuve 8 +37OC, 5 tubes de bouillon de thioglycolate
+ 1 temoin ; 5 tubes de milieu de Sabourand + 1 témoin et les tvbes de
bouil len mycoplasme + les t&oins.
5O)
- Incuber les autres tubes et les témoins 2 +20°C. Examiner tous
les tubes quotidiennement pendant 7 jours. Noter les resultats.
Titrage du vaccin ..* Reconstituer un echant i I Ion repr6senta-t if du lot
dans ‘de .f’eau dis-t] I lé&. * ‘ i
”
.:. I,
: ..I.’ ,._
*
.,“l
b
,o4j
:
t”l
- Faire des dilutions de 10
dans’: d u BTP” ’
2O)
- tnocirl’er 0,2 ml de chaqee dilution ‘à 5 tubes de’suspension
.I
cellulaires (cel’l’Ulk$s cl52 rein de::bovin ,de 2” generaticn:)~. Gardér 5 tubes
temoins c e l l u l e s ; Rkpéter l e tit’ragé‘ troisfois avec trai’s lots dlfftronts de
tel lules de rein de ‘bovin’.
“~.
”
,’
a
;
;.
.., :
3O) - Incuber l e s t u b e s inocule‘s’à i ’
‘
‘étuve à ’+37”C. Faire un change-
. i “. “i. ..‘:>y <. -Y .
‘*,>,.? j 6 y;,. !P ;s ‘Pi+ > . : Y”
6, 1c *^n ,w, ), .h i.
<
*.:
:r.,i,
-ment de mi I’i’eu “le ‘4” jour. Lire I es ECP pondant ‘16 jours.
Si un des titrages
. a;\\. i :‘;. ; *3b ,;f
est i-t-es diffsrent des autres, faire un 4e titrage avec un au+rei’i8t“‘de
cellules. Calculer le titre selon la mkthode de REED et MUNCH.
i
. . ./ . . .
;
t
.-14*-
. _ .
Test d’ innocuite r’ U t i l i s e r d e u x t a u r i l l o n s d o n t l a s e n s i b i l i t é a éti
.
contrôlée par le test de neutralisation.
1°) - Saigner I es! tauri I Ions pour. avoir un &rum avant inoculation.
,’
z” 1 - Reconsti t uer le vaccin avec de l’eau distill3e ou du BTP.
3O) - I nocu Ier à chaque animal 5 ml de vaccin reconstitue.
4O) - Prendre I a temperature .pendant 14 jours.
5O 1 - Saigner les an imaux 21 jours aprbs inoculation
BO)
* RecheEfFe~ lels: ant icorprs neufrat isants dans I es sGtwrrrs avant et
apres inoculation.
Test de non toxicite m-’ Reconstituer du vaccin dans 5 ml eau distillée.
Peser 4 cobayes et 6 souris.
,1°) - Inoculer 0,5 ml 2 2 cobayes par la voie intramusculaire dans une
pa$te poster i cure.
2’) Inoculer 0,5 ml 2 2 cobayes par la voie intrapériton6ale
3a”)- Inoculer 0,l ml a 6 souris par !a voie intraperitonéale.
Observer les animaux inoculés pendant 3 semaines en notant toutes
les anomal les.
Test d’efficacite
=a UtiIiser,des veaux de plus de 12 mois, ne possédant
-
pas d’anticorps neutralisant le virus PB.
1°) - Inoculer 1 veau avec 100 doses vaccinales
ZO) =- Inoculer 1 veau awc l/lOOe de la dose vaccinale p garder un
veau temoin. Prendre leur temperature pendant 3 semaines.
3O)
- Inoculer les 3 veaux avec le virus d’épreuve, et continuer à
prendre la température pendant 15 jours apr&s 1’ inoculation d’épreuve. Noter
les r5sul tats.
N.B. *- On peut uti I iser le virus copripestique comme virus d’épreuve
ii
I
. . /
. . . .
Contrôle d'identitk -3 Faire une séroneutralisstion du virus vaccin
avec du sérum de lapin hyparimmun contre la peste bovine, et une autre sera-
neutralisation avec du s8rum normal de lapin. Lire les résultats au bout de
14 jours.
Contrô.le du vide '- Ce contrôle est fait si le vaccin est bouc!% sous
vide. Un appareil, le Spark Tester permet de faire ce contrôle.
Contrôle de I'humiditQ résiduelle - La teneur en eau du vaccin ne doit
pas être supérieure à 0,5 $ du produit lyophilis&, Le dosage de I'humiditk
r&siduelle peut être effectue par la méthode de Karl Fischer.
VACCIN CONÏ-RE LA PERIPNEUMONIE CONTAGIEUSE BOVINE
MILIEU DE CULTUffE
Le milieu de culture de mycoplasmes est celui utilisé au Labora-
tore de Farcha (mii'k& F 66). Quelques modifications dans la composition du
F 66 ont &té apportées afin de diminuer son prix et faciliter sa préparation.
Une Modification de M. DOUTEE consiste à préparer une digestion papalnique
de coeur au lieu de la mac&ration.
PREPARATION DU MILIEU
Coeur hachg ...............................
5 kg
Eau distillé ..............................
10 k$L i-h%
Chauffer à 50°C pendant 1 heure, puis porter à ébullution et filtrer à chaud
Ajouter pour 10 litres de mac6ration :
Bacto tryptose .............................
100 g
Glucose ....................................
20 9
Phosphate disodique ........................
25 9
Glycérol ....................................
39
Acide oléique ..............................
50 g/gttes
Extrait de levure ..........................
50 g
Sérum de cheval dep ........................
1 000 ml
PénicilSine
1000000 UI
...............................
Fi-l 8/81
Clarifier et stériliser par filtration.
(..
/.
.
.
i
-F7-
Ce milcieu convient aussi bien pour la culture des souches Tl et KH3J.
Pour le développement de leurs variantes SR, on ajoute 1 g de streptomycine ,
pour 10 litres de milieu. R%partir dans les ballons.
Préparation de I-vinoculur~ :
1°) -- Préparer 1 litre de milieu de culture qu'on met dans un
erlen meyer de 2 litres : cet erlen-meyer doit avoir 3 sa base une tubulure
montée d'un tube en rhodorcil. Le tube est obturé par une canne de verre
soudee à l'extrémité.
ZO) -' Préparer une gamme de 8 tubes contenant chacun 9 mi de
milieu. A partir d'une ampoule de la banque, 1 ml. de suspension mycoplasmique
est porte dans le ler tube (dilution 10-l). Apres homog&tGisation,
1 ml de
cette dilution est port6 dans le 2e tube (dilution lO=") et ainsi de suite,
jusquQà 10-8 . Boucher les tubes avec du coton carde et les mettre a I'&uve
à +37"C pendant 4 jours. Les deux derniers tubes presentant une culture
serviront à ensemencer 17erlen-meyer.
3O) - L'erlen-meyer est mis en incubation à I'&l-uve à +37OC pen-
dant 3 jours. Faire un contrôle.de pureté de la.culture (coioration de gram.)
Inoculation du ballon : Avec 1 litre d'inoculum (erlen), ensemencer le
ballon. Mettre à t'étuve à +37OC pendant-70 & 72 heures (les premiGres 24
heures sans agitation, p uis sur agitation magne-tique le reste du temps).
Faire un contrôle de puret du bal ton (coloration au gram.).
Distribution et lyophilisation - Pour chaque litre dc culture de myco-
plasmes, on ajoute 45 g de lait écrémé sec. Après dissolution complite du
lait, le vaccin est réparti dans des flacons types pénicilline de 20 ml à
raison de 5 ml par flacon.
Le vaccin est ensuite charge dans l'appareil congele et lyophilisé.
L'appareil à lyophiliser doit être un appareil à etagkt-es et non du type
,centrifuge. A. la fin de la' lyophilisation, les flacons sont bouchés soit
,.. /
. . .
-lO-
sous vide, soit sous azote neutre ; ils sont ensuite etiquettés et conservés
ZJZO*C jusqu'à la fin des tests.
CONTROLE DU PRODUIT FINI
Test de stérilite +m Le contrôle de stérilité est classique. II se fait
-par ensemencement sur mit i-eu a8robie et anaérobie.
Reconstituer 2 flacons avec 10 ml ,eau disfïII&stériIe. Faire un
étalement sur lame et une coloration de Giemsa et de gram. pour contrôler
l'absence de contamination.r
Ensemencer : 10 tubes de bouillon tryptose sérum
2 boîtes de petri de tryptose agar sorum
10'tÙbes de bouillon de thioglycolate'
Garder des témoins pour chaque milieu. Mettre ?I 1 fétuve à +37'C.
Tous les milieux doivent rester stériles après 14 jours d'incubation.
Test d'identité c:l Faire une précipitation sur gélose. Une ligne de
<
~precipitation est observ6e avec l'immun sérum précipitant.
:_
Contrôle de streptomycine rbsistant
- Ce contrôle est fait pour les
souches SR, Ce caractere differencie les souches vaccinales Tl-SR/KH3J-SR
des autres souches de,mycoplasmes pouvant être manipul&s du laboratoire.
Test d'inhibition de croissance -1 C'est un test indispensable pour
l'identification des especes de mycoplasmes. En présence dFun immun sérum
puissant, ies mycoplasmes ont une croissance et une multipl'tcation bloquées
par les anticorps spécifiqees correspondants.
Test d'innocuité -.I Le vaccin est reconstitué dans de l'eau distillée
sterile.
1 6
1°)
- Inoculet 4 cobayes avec 1 ml, par la voie sous cutanée.
. . /. ..*
-1%
ZO) - Inoculer 4 souris avec 0,5 ml par la voie intrap6ritoneale
. .
Mettre les animaux ‘inocules en observation pendant 3 semaines au bout
desquelies ils ne doivent présenter aucun signe de maladie.
Il est conseille de vacciner 10 veaux avec 50 doses vaccinalee et les
observer au laboratoire pendant 4 semaines.
La souche T1/44 provoque parfois des r6akiions post-,vaccinales impor-
tantes (oedeme à tendance envahissante) surtout chez le taurin,
Titrage du vaccin ‘- Reconstituer le vaccin et, prendre 1 ml (1 dose
vaccinale)
F a i r e d e s d i l u t i o n s & ‘r”‘. 3 ‘0-10
Mettre les tubes 3 I*Gtuva à *37’C et lire lac résultats aprbs 1 se-
-7
maine. La dose vaccinale doit titrer au moins 10
organ i smes v iab I es. Toute-,
fois, on s’efforcera de ne pas I ivrer un vaccin dont le titre est inférieur
-8
à 10
par dose vaccinale.
Contrôle de IshumiditB rési.dueIIe - La teneur en .eau ne doit pas être
su@G?ri-eure à 0,5 $ du produit lyophil isé. Ce dosage peut être effectue par
. .
la mkthode de Karl Fischer.
Con-l-rôl e du v i de -- Ce contrôle est essentiel si Ilon a chojsi, le
bouchage des flacons sous vide au lieu d!azote.
Contrôle d1 immunitc -- La méthode de contact mise au point par les
chercheurs austral icns, a permis de savoir que’3 et 7 mois et demi aprk la
vakination, I 1 immu’nit6 est totale (T1/44) ;“ quatorze mois apres la vaccina-
tion, elle est encore de 90 $.
:
Ii est Evident quoi1 nOes-i- pas possible de faire une expét- ience de
contact pour chaque I ot dc vaccin produ ii-.
La valeur de l’immunité de la souche T1/44 étant’ prouvée une fois pour
toute,
ce contrôle se ram?.nc 6 un titrage du nombre de microorgan ismcs via-
bles par dose vaccinale.
. . /. .*.
-2o-
-.
VACCIN MIXTE CONTRE LA PESTE BOVINE ET LA PERIPNEUMONIE
CONTAGIEUSE BOVINE
(BISECI
Le vaccin mixte antibovipestique-antipGripneumonique
est un mélange
en proportionsdéterminées dvune culture atténu6e du virus de la peste
bovine sur culture cellulaire et dqune culture vivante d’une souche atténuoe
de mycoplasma myco?des. (Tl re SR ou KH3J
- SRI, additionné dqun stabil isa-
t e u r , p u i s lyophilise~
I I e s t e s s e n t i e l d ’ u t i l i s e r u n e culture de virus vaccin bovipestique
ayant un titre maximum en unités viru lentes, et une cultut-c de mycoplasmes
Si7 ayant atteint un developpement opt imum.
.-3
L’animal à vacciner doit recevo ir au moins 10
DCF/50 dose peste
bovine, et IO-’ unités viables de mycoplasma myco’idcs, dose peripneumonie.
II est préférable de preparer le.composant bovipestique 3 I ‘avance
:,
et de le conserver a -.70°C jusqu’au moment du melange.
.:.
Mél ange des deux composants - Le composant pesti que est t i tri! d’avan-
ce. Basé sur son titre, on calcule le volume du composant pCt-ipneumonique.
Ajouter au mélange 45 13 de lait écrémé sec par I itre. Distribuer en flacons
et lyophi I iser.
Contrôles du vaccin b isec - Des contrôles sont dk,js. effectubs sur
- - -
chacun des composants avanf le mélange. Neanmoins, un test de stéril ité et
un titrage de chacun dos
composants sont faits apres lyophilisation.
Sur les flacons bouches, on effectue le contrôle de lPhumidité
ksiduelle et un con-l-t-ô-e du vide si les flacons sont bouchés sous vide.
Les flacons sont enfin’ etiquettés et conservés à . 20°C jusqu’au
moment de l’expédition.
--
--
L
L
PB = PESTE BOV INE
F
STP = SOLUTION TAMPON PHOSPHATE
BTP = BOUILLON TRYPTOSE PHOSPHATE
ECP = EFFET CYTOPATHOGENE
S R -. STREPTO T:ES l STANT