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RAWOKT DE 8TAGE : 0CTOkQt.E 1976 : OCTOBRE 1977 ...
RAWOKT DE 8TAGE : 0CTOkQt.E 1976 : OCTOBRE 1977
Pr&3entB par :
Hr. N'DTAtiA I'!'&AYti (1)
* <
CONTRIBUTION A L'ETUDB DU ROLE NUTRITIONNEL DU ZINC
CH82 I&X3 RUJJIJNANTS : EhYliT 9UH LE MJiTABOLIYPl# DU RUi"ll$N
Travail réaliaé B :
la Station de Recherches de Nutrition
Institut National de la Recherche Agronomique
Centre Natlonal de Recherchea Zootechniques
78350 JOUY-en-JOSAS
-.
i’
j> .
.
*
(1) Docteur VétBrinaire. Laboratoire National de 1'Elevage
et de Recherches V6térinaires.
B.P. 2057 DAKAR-?~~ANN
SENEGAL
Notre stage à la Station de Recherches de ll’utritian de Jouy-en-Josa
a été profitab2e d p2u.s d’un titre. En effet, ce sc&jour nous aura pernuis
de faire uno bibliographie qui, sur Ze p2an théorique, nous a beaucoup
appris sur Zes divers métabolismes au niveau du rumen et sur Zes oZigo-
ÉMments en &&a2 et le zinî- c?n yarticu2isr.
Sur lc plan pratiquq, r~os connaissances ont Qt& crrundement
cwrichies , car en p2w des zncubations
in vitro, n.oLts a&ns pu appreridre
divers dosages (.V total ; NH’
u r é e , c e l l u l o s e , minéraux, e t c . . ) qui not4î
seront d’,une grande utiZit& !iG.ns 2c cadre du Laboratoire de Nutrition
dt 1’ ISBA-Hann l
Je remercie Monsieur CUECll8N C!G m’avoir accuei22i dans son
Laboratoire, qu’i2 soit assurt! que le meZ2leu.r profit sera tir6 de mon
séjour,
Je remercie aussi Madame DURAND, en espdrunt un juur, être
animé de la même passion pour 2a recherche qu’e2Ze garde en e22e.
Que Madcmo&e22e DUMAY at Monsieur BEAU!UTlN soient aosurds
de na gratitude.
h’n fin Je souhaite que mon passage Cs Jouy soit 2e dobut d’une
fructueuse coopération scientij’Zqu.e entre nos deux Laboratoires.
INTRODUCTION
Les oligo-éléments OU 84traces-éléments4~ sont des minéraux présents
dans les tissus animaux et végétaux, à des doses tres faibles. Ils font
souvent partie de systemes enzymatiques et éventuellement d'hormones OU de
vitamines. 11s se distinguent en celà des macro41éments qui entrent dans des
G
structures.
Les faibles teneurs dots organismes et des aliments ont pendant long=
temps constitué un frein au développe.ment des recherches sur l'importance et
le rfile de ces éléments. Mais grâce à la mise au point de nouvelles techniques
d'analyse en particulier la spectrophotométrie d'absorption atomique des pro-
gr&s notables sont enregistrés,
Ainsi, on s'est \\r+endu compte que des' carences revetant souvent des
formes graves pouvaient exister aussi bien chez 'l'tiomme que chez les animaux
Apres le fer et l'iode, le cuivre, le zinc, le manganese, le cobalt et le
sélénium sont venus s'ajouter à la liste des oligo+léments indispensables
à un équilibre physiologique.
Chez les ruminants, différentes formes de carences ont eté décrites.
Pour le fer, la carence est rare, sinon exceptionnelle. On estime
què 25 ppm de fer suffisent à l'entretien et au développement d'agneaux
nourris avec un régime partiellement purifie (LAWLOR et al,, 1965)j un défaut
d‘apport se traduit géneralement par des signes d'anemie, accompagnes dllnapl
pétence et de retard de croissance.
Pour le cuivre, le ckfaut d'apport est responsable de llataxie
enzootique ou %waye ack" (UNDERWOOD, 1971 ; LAMAND, 1972).
B
La cbence manganèse a toujours des conséquences graves chez les
ruminants, car en plus des troubles osseux, on rencontre souvent une baisse
de la fécondité (BROCHART, 1971).
Pour le cobalt, les besoins sont faibles, 0.1 mg/kg MS, mais la
carence peut exister et se traduit par un défaut de synthese de la vitamine
B12 par la microf~ore du rumen avec pour conséquence : une diminution de
l'appétit et une chute des productions,
La carence en sélénium est responsable de syndrome "myopathje-
dyspnee" décrit par U1MND (1970). Cet auteur <7! mis au point une prophylaxie
l /.
chez le veau et propose OJ mg/kg MS. Ce taux peut aussi limiter divers effets
dëfavorables de 1 a carence en vitamine,E.
En ce qui concerne le zinc, on a décrit des carences aussi bien
chez 1'Homme que chez l'animal.
PRASSAD et a1 (1963) ont découvert en Egypte des formes de nannisme
et d'hypogonadisme liées à une carence en zinc. Ces m&nes affections sont
retrouvees en Iran sur des populations se'nourrissant presque exclusivement *
de protéines d'origine végétale (RONAGHY et al., 1969).
Chez les animaux et les ruminants en particulier, la parakératose
est l'un des sympt&nes les plus fréquents (TUCKER et SALMDN, 1955 ; LEGG et
SEARS, J960).
Ces exemples montrent l'importance que peut revi%ir les oligo-elé-
ments dans l'alimentation aussi bien des humains que des animaux, De nom-
breux travaux ont permis de préciser leurs differentes fonctions metaboliques.
Il faut, cependant, ajouter que pour les ruminants le probl&ne se complique
par la présence dans le rumen de micro-organismes dont les besoins nutrition-
nels sont souvent mal connus. Le métabolisme bactérien au niveau du rumen
revet une importance économique considérable. Il permet à l'animal de renta-
biliser des rations riches en cellulose et en azote non protéique. On peut
donc réserver aux monogastriques les aliments plus nobles,
Actuellement, les normes établies pour les ruminants sont encore
empiriques car on ne connait pas avec précision l'influence des oligo-élé-
ments sur la croissance de la micropopulation (stimulation ou inhibition).
Ceci nous a amené à nous intéresser au zinc et a son influence sur la degra-
dation de la cellulose et l'utilisation de l'ur6e dans le rumen.
Dans la Premiere partie de ce mémoire, nous présenterons les prin-
cipales donnees bibliographiques sur le rôle du zinc chez les ruminants et
les effets dlrne carence d'une part, et, d'autre part, son influence sur quel-
ques métabolismes au niveau du rumen : cellulolyse, ureolyse et protéosynthese.
Dans une deuxieme partie, nous décrirons une expérimentation à laquelle nous
avons participé et en discuterons les résultats.
1. ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE
A. Rble du zinc et effets d'une carence-'
'
En 1971, UNDERWOOD et SELZE ont fait des revues détaillees des con-
naissances sur le zinc.&.eT$ravaux
nous ont permis de faire le point avant
d'entreprendre
notre étude.'
Déjà en 1869 , RAULIN montrait que le zinc est indispensable à la
croissance de 1'Asperg illus niger. Ensuite, BRICKNER. (cité par UNDEKWOOD)
./a
3
donne les premieres indications sur la fonction du zinc chez les tinimaux.
Après les travaux de TODD (1934), de KEILIN et MANN (1939) montrent que le
zinc est un constituant de l'anhydrase carbonique ; viennent ensuite les
travaux de TUCKER et SALMON (1955) sur le porc, de O'DELL (1958) sur Te
poulet, de LEGd et SEARS (1958) sur le ruminant et enfin de PRASSAD (1963)
et RONAGHY (1969) sur les humains.
Tous les travaux ont contribué à Pr&iser le rble du zinc dans
l'organisme. Cependant, le tour de la question est loin d'&tre fait et des
inconnus demeurent.
Nous allons après une étude clinique rapide de la carence en zinc
rappeler les besoins chez les ruminants.
1. Etude clinigue
..--me--e.-m- --
1.1. E'tiologie
Parmi les causes pouvant entra'lner une carence en zinc, on
distingue des facteurs liés aux apports alimentaires responsables de Ta
. .
carence primaIre, et des facteurs tenant à l'animal et provoquant la carence
i
secondaire.
1.1.1. L._ ,ren~co.~ri~!$~_ree
est due h des facteurs susceptibles
de modifier la tqneur,des fourrages. GW+ralement, on
estime que les fourrages contiennent 15 A 40 mg de zinc/kg.MS, ar la limite
de carence se si tue a 45 mg/kg MS (LAMAND, 1973).
Ce dBft;cit est lié au sol et à la plante, Pour le zinc, les sols
sont en général suffisarment pourvus, mais la fertilisation et l'intensifica-
tion fourragère peuvent avoir des effets 'nbfastes sur l'assimilation des
oligo-éléments par les plantes.
La richesse d'une plante est fonction de l'espece, de la partie
considérée et du stade végétatif. Les légumineuses sont souvent plus riches
que les graminées. Les feuilles sont mieux que les tiges et au cours de la
maturation, Ta teneur diminue regulierement jusqu'à la floraison {KERGUELEN,
1960). Les foins récol tés tardivement, séches dans de mauvaises conditions
sont pauvres.
En dehors de ces effets purement agronomiques, on peut assister à
un développement de carence par une erreur‘de calcul dans la mise au point
d'un complément minéral. Il peut aussi arriver que les apports soient satis-
faisants, mais des perturbations métaboliques provoquent une mauvaise utili-
sation du zinc, ce qui entrafne la carence secondaire.
l /.
e
1.1.2. La carence secondaire
. .._ -._ - .^ .__._.. ._
Différents facteurs capables de modifier la digestïbili-
të et la retention du zinc peuvent provoquer des signes de carence.
On sait, en effet, (LAMAND et DEMARQUILLY, 1975) qu'il existe une
corrélation entre le coefficient d'utilisation digestive (CUD) du zinc et
ceux de la matiere organique et de la matière sèche. Ces auteurs pensent que
pour cet élément, la qualité de l'aliment influe plus que sa teneur.
'
D'autrepart, les contaminations par la terre font baisser le CUD,
d des valeurs négatives maigre l'augmentation de la teneur de la ration.
La prësentation physique de l'aliment peut aussi influer sur l'uti-
lisation digestive du zinc. On sait, en particulier, que le broyage fait
baisser le CUD (PERIGAUD et al., 1972). LAMAND (1975) pense qu'une accéli5ra-
tion du transit intestinal serait responsable de cette baisse observée.
HELLWEGE (1971) a observe sur des enfants une excretion excessive
et une mauvaise absorption du zinc par suite de troubles gastro-intestinaux
dus à une modification de #"intégrité de la muqueuse.
Enfin, il existe des facteurs qui modifient l'utilisation du zinc
en entrant en compétition avec lui au niveau des sites d'absorption ou de
stockage. Il s'agit essentiellement de minéraux et de vitamines.
1.2. SynptSrnea et Idsions
Les signes cliniques observés diffèrent peu d'une espèce à
l'autre. Il existe néanmoins une variation dans la sensibilite à telle ou
telle manifestation de la carence. Depuis les signes aigus jusqu'aux signes
chroniques, on peut rencontrer toutes les formes. Chez l'Homme, l'un des
premiers symptomes est le retard de croissance (HAMBIDGE et al., 1972), qui
est suivi de la perte d'appétit, mais les choses peuvent &tre plus graves et
aller jusqu'au nanisme et à l'hypoganodisme (PRASSAD et al., 1963 ; RONAGHY
et al., 1969). Dans les formes aigues des lésions dermiques sont observées. -
Chez les animaux, on retrouve à peu pri?s la mdme chose: l'inappb
tente, les troubles osseux et la dermite.
Ces symptômes ont été décrits par
CHESTERS et al. (1970) chez
le rat ; J.K. MILLER (1960), BLACKMON (1967) et W.J, MILLER (1970) chez les
bovins au cours de carences expérimentales-: Ils ont en plus observé une
inflammation et une rougeur de la bouche et du muffle, un oedème du boulet',
de l'alopécie accompagnée de lésions de parakératose et d'hyperkératose.
Les pertes économiques sont considérables, car en plus de la bais,se
de l'indice de consommation, on assiste à une diminution de la fertilité et à
une sensibilité plus grande aux diverses infections.
5
1 , 3 . /Jiugnvs ti,! ct [J twt~~;;‘t ic2
Le diagnostic d'crnc~ carence en zinc sera a la fois clinique et
expcrimenta1 .
Le diagnostic clinique est basë s11r 1 'observation de I'aJopécie,
.-...
des dermites associées â un arrêt de la croissance, 11 est indispensable de le
wser nour mieux orienter les analyses éventuelles du laboratoire,
On peut, en effet, doser le zinc dans les aliments, dans Te
Sang;dans le foie et les poils.
L'examen de la ration est obligatoire. Il est nécessaire de
Savoir s'il existe un complëment minëral et de verifier sa compoSition, en
ovitant les contaminations, SurtouL Pr 1~ terre*
Pour les analyses proprement dites, il est intéressant de deman-
tfpr a la fois le zinc, le cuivre c?t I(! manydnése, analysés ti partir d'un mt!me
nrélevement et d'une même prise d'essais.
Le dosage plasmatique peut être effectué dans de bonnes condi-
tions en évitant les contaminations et l'hëmolyse.
BROCMART (1975) pense que le dosage dans les poils est possible
et permet de diagnostiquer une carence profonde, néanmoins pour les echantil-
lons inconnus,
l'interpretation est difficile.
Les teneurs généralement rencontr%es sont :
- pour les aliments : 15 $ 40 mg,'kg MS (LAMAND, 1971)
- pour le plasma : 80 à 120 mg/100 ml avec des valeurs de 150 mg lors de
*
contamination ou de 80 mg au moins lors d'une inflammation
- pour les poils : 115 mg/g.
Enfin, il faudra compléter le diagnostic clinique et expérimental
par un diagnostic différentiel. On peut, en effet, confondre 'ia carence en
zinc et une intoxication chronique par le sélénium ou par le thallium, à une
avitaminose A, à une infestation parasitaire ou a une photosensibilisatiorl.
POUr l'intoxication par le sélénium, la difficulté de la demar-
che et les douleurs articulaires sont assez specifiques.
Pour le thallium, la dyspnée,les convulsions et parfois la cecité
sont assez caractéristiques.
L'avitaminose A est caractërisee par la xérophtalmie.
Lors des gales ou de phtiriqse, le prurit est toujours important,
Enfin, il n'y a que les parties du corps dépigmentëes qui sont
;ttteinteS lors d'une photoscinsil~~~ 1 is<it~on.
Le pronostic n'est pas grave lorsque le diagnostic est pose
aSSf?z 'tôt. Une complëmentation retab'lit rapidement les différentes fonctions
perturbées.
Avant d'envisager le traitement, il faut tenir compte du fait
qu'il est coûteux en main d'oeuvre et reste fugace.. 11 existe malgré tout
des possibilités, ri savoir : ici !,,ulJl)Ienlentation
de la ration, les solutions
buvables et les formes injectables.
BLHCKMON et a1 (1967) obtiennent avec un apport de 260 pprn de
Zn une disparition des symptômes en quatre jours.
3.K. MILLkH et.W.3. MILLER (1964) ont obtenu les mêmes résultats
avec 250 ppm,
OTT et ai (1965) ont, en diminuant la dose et en la portant à
100 ppm, traité des veaux et des agneaux ; alors que MILLS (1965) avait obtenu
des r+sultats plus lents avec 20 ppro.
LAMAND (1971) a utilise une solution buvable apportant 4 g de
SO4 Zn penddnt dix jours d des bovirls adultes et a observe une regression
des symptômes. Cet auteur a mis au point des suspensions injectables à effet
retard permettant d'apporter 600 mg de Zn à un bovin adulte. La rémanençe du
produit est de deux mois et demi environ.
Ces resultats sont certes encourageants, mais il faut dire que
la voie la plus sGre reste la prophylaxie, maigre les incertitudes liées à
la connaissance imparfaite des besoins des animaux.
2. Couverture des besoins : eroehylaxie
-_-"I_-__---"-"-_---I____
"W I a.---m.
La prophylaxie consiste à assurer la couverture des besoins de
l'animal en zinc. Nous rappellerons quelques moyens à mettre en oeuvre pour
prëvenir une carence en cet élëment.
2.1. Prophykxie par qport direct aux an2maux
LAMAND (1975) propose pour une vache à haute production laitiere
et ingërant 12 kg de MS par jour, le mode de calcul suivant :
- teneur moyenne
25 mg/kg MS
- besoins
50 mg/kg MS
- déficit a couvrir
300 mg/j
soit pour un complément minéral distribué à des bovins à raison
de 100 g/j : 1,2 g de SO4 Zn, 7 H20 par jour. Le complément peut être distri-
bué soit à l'auge en mélange avec les aliments, soit au p%turage sous forme de
pierre à lécher, en s'assurant évidemment que la composition du bloc permet
de couvrir le déficit en oligo-cléments.
2.2. .i+ophyZarcie
pu crtrrichissement
des fourrages sur pied
Il s'agit d'apporter le zinc directement au sol ou à la plante
en pulvérisation. L'apport de 25 a 50 kg de SO4 Zn en couverture sur la prairit
./.
en fin d'hiver peut être suffi!;dnt,
t+n outre il n'y a pas de risques de toxi-
cité pour les animaux (PLRIGAUD et al., 1915). Ces mêmes auteurs pensent que
la pulvérisation foliaire permet aussi un enrichissement convenable de la
prairie quatre à dix jours apres l'intervention. Les oxydes semblent donner
de meilleurs résultats, les sels solubles étant lessivés par les pluies.
Cette étude clinique permet de mesurer l'importance du zinc
dans l'alimentation des animaux. D'autre part, on a pu voir qu'il est ,possi=
bic d'intervenir sur l'animal pour éviter une carence, mais on ne connaft pas
.
encore tous les processus métaboliques qui nécessitent la participation du
zinc. Dans les chapitres qui suivent, nous essayerons de donner un aperçu
sur quelques métabolismes du rumen et sur le tilt du zinc à ces différents
niveaux.
3. Métabolisme au niveau du rumen
1. Cellulolyse
.."-I.m--e .."
1.1. Schéma de c&radaLion
La cellulose konstitue une part importante de la ration des
ruminants et represqnte souvent la seule source d'énergie. Au niveau du rumen
- les bactéries et prQozoaires posnedent un equipement enzymatique qui leur
6"
permet de dégrader 'la cellulose en acides gras volatils (AGV) qui sont absor-
bés à travers la paroi du rumen et apportent à l'animal hôte les nutriments
énergétiques nécessaires au fonctionnement des divers appareils.
Le schema de dégradation est donne d la page suivante,
1.2, Bactbies respansat,L~s de 2a ce22uZoZyse
On classe les bactéries suivant l'activité qu'elles exercent
au niveau du rumen (WNGATE, 1966). On distingue ainsi, les bactéries amilo-
lytiques, les protéolytiques, les lipolytiques, les cellulolytiques, etc...
Pour l'énumération, on utilise généralement trois méthodes
. le comptage direct
la densité optique
: la mlthode des cultures
Les batteries cellulolytiques sont largement représentées et
les espèces le plus souvent rencontrées sot& : BacteroTdes
succinogenes,
Ruminococcus albusI Ruminococcus llave-faciens et Butyrivibrio f ibrisolvens
(BRYANT, 1959, 1965, 1973 ; HUNGATE, 1950, 1956 ; KISTNER, 1965 ; cités par
PRINS, 1975).
KITTS et UNDERKOFFEK (1954, cités par STANLEY, 1959) ont etudie
l'activité cellulolytique du jus de rumen. La même année CONCHIE (cité par
l /.
‘;@
194 Carbohydrate Fermentation
Hem~celluloses
Cellulose
Storch
Pectins
Fructons
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J * .-.-
-3
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Xylobio,s, etc.
I
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\\ Microblal
Amvloorctin
acid
_ P y r u v i c acid
o r Amilore
M(IIIC acla
Lactic acid
‘%
11
---bAcetic 8 Formic
Ftamnric nrid
o c i d r
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A c r y l i c acid
YY
Al\\
S u c c i n i c - Propiokic acid< /
\\
acid
Tricarboxylic
Energy
1 acid cycle
-!-----
+ cog 30
Cooroic
acid
ac’dr +--+ Kotonri
Figure 12-I. Commonly accepted metabolic pathways of carbohydrate metabolism in the rumen.
.
$6
. n “,
Y
STANLEY, 1959) a retrouvé unie activité $-glucosidasique
sur une prëparation
de microorganismes de rumen 'de mouton.
Par la suite, de nombreux travaux ont permis de prcciser l'ac-
tivite cellulolytique des microbes clu rumen. On a ainsi isolé et localisé
l'enzyme responsable de cette hydrolyse de la cellulose.
La centrifugation a grande vitesse a permis de préciser que les
bactéries et protozoaires sont bien responsables de la cellulolyse (STANLEY,
1959 ; PRINS, 1975) d'une part, et que, d'autre part, l'enzyme est extracel-
lulaire (KING, 1956 cité par HUNGATE, 1966).
LEATHERWOOD (1969, 1973 cités par PRINS, 1975) a étudié le
mécanisme d'action de la cellulqse et a émis l'hypothese que l'enzyme est
constituée de deux entitées :
- un facteur Cl responsable de l'affinité pour la molécule de cellulose ;
- un facteur Cx,,actif et assurant l'hydrolyse,
L'efficacité de l'enzyme dépend de la nature du substrat, c'est-
à-dire de la longueur de la chaîne de cellulose, et de sa concentration dans
le milieu (FESTENSTEIN, 1959).
*
Le pH d'activité optimum se situe vers 7 (STEWART C.S., 1977).
En ce qui concerne les minéraux, leur r61e a éte peu étudié
in vivo. KING (1959) pense que le fer et le cobalt activent la cellulase. In
Vitro, les oligo-éléments peuvent être soit inhibiteurs, soit activateurs*-
pourl'influence particulière du zinctV@us y reviendrons.
P.Qréolyse
m--w --
2.1. Mi~e en évic.!ence
L'hydrolyse de 1 'urC?e dans le ruraen n'est possible que grdce a
l'existence d'une enzyme. PEARSON ttt SMITH (1943) par des expériences in vivo
et. in vitro ont montre ld realitch 'I'* cette enzyme et emis l'hypothese quklle
est élaborée par les nlicroorganismr's.
GIBBONS et a1 (1957) ont pu, grSce à des centrifugations diff&
rentielles, isoler une importante fraction bactérienne responsable de cette
hydrolyse de l'urée. Quelques années après, JONES et a1 (1964 a) par des techni-
qucs de sédimentation ou de centrifugation,.ont montré que l'urease est intra-
cellulaire. BRENT (1967) a d'ailleurs emis .le même hypothèse.
Il convient cependant d'etre prudeut car les espèces bactWennes
possédant une uréase sont nombreuses et il n'est pas sbire que l'enzyme a la
même localisation ou la même nature lkirtout.
D' ailleurs REITHEL (1971) signale
que l'uréase de Uaroina .urb%st urw exoenzyme, Néanmoins, depuis les travaux
-
AO
de MAHAWAN (19X), la lumière commence à être faite. L'auteur a, en effet,
extrait et purifié l'enzyme. Et il est intéressant de savoir qu'en dépit du
grand nombre de bactéries capables de produire l'urkase, cette dernière a la
même mobilité électrophorétique et le même poids moléculaire dans chacune
de ces essais. Mais il n'est pas évident qu'il s'agit de la seule enzyme qui
existe et qui soit capable d'hydrolyser l'urée,
La plupart des auteurs qui se sont intéresses au tile et à la
nature des microorganismes capables de produire l'uréase sont d'accord pour
dire qu'il s'agit de bactéries. Mais, comme le rappelle COOK (1976h il n'y a
aucune preuve qui permette d'affirmer que ces batteries sont nombreuses dans
le rumen ou que l'une d'elles a la plus forte activité. L'activité du runten
serait Id somme de petites activites de nombreuses especes bacteriennes.
Certaines de ces bactéries ont éte isolées et leurs caractères étudiés.
Ainsi, GIBBONS et a1 (1960) ont etudie une anaerobie stricte
a partir du jus de rumen de bovin, et I'ontc1atiaée dan&famille des Lac-
tobacillaceae et dans le genre Lactibacillus. -
SLYTER (1968), à partir du jus de rumen de bovins nourris avec
un régime synthetique, a isolé des streptocoques et des lactobacilles capa-
bles de produire l'uréase.
COOK (1976) a isolé sur différents milieux des bactkries possé-
dant cette propriété et appartenant aux genres Lactobacill us casei Var.casei
et Klebsiella aerogenes.
Chez les monogastriques, RAIBAUD et a1 (1962) ont retrouvé des
uréases produites par les Lactobacilles, des Actinobacilles et Staphylocoques.
Ils ont cependant remarque que certaines espëces ne sont activj$$ que lors-
qu'elles se developpent in vive. Ils pensent que la propriété d'hydrolyser
l'urée est plus un caractère de souche que de type.
1.1 apparaît que les espèces le plus souvent rencontrées dans. -
l'ktude des bactéries uréolytiques sont : les lactobacilles, les streptoco-
ques et les staphylocoques. Mais il est certain qu'il doit en exister d’autres.
2.3. Activité dç? 1 ‘tpwyrne
L'Union Internationale des Biochimistes recommande d'exprimer
l'activité de l'uréase en millilitre de jus de rumen ou de milieu de culture
(U.I.) capable d'hydrolyser 0,5 PM d'urée et de libérer 1 ?M d'NH3 en une
minute'a 38OC. Mais pour des études sur les ruminants, nous pensons qu'il
est prudent de l'exprimer en grammes d'urée hydrolysés pour 100 ml de jus
de rumen par heure., ceci presentti l'avantage de tenir compte de l'activité
totale du rumrri sans distinction dan-, la nature de l'enzyme ou des especes
microbiennes intervenant.
L'hydrolyse de 1 '\\ir<!-te
se ferait; en deux étapes (KtITHEL, 1971) :
O H
ONH4+
/NH2
.
.A
/
i
O=C
t HOH-- O-C
tNH3e- 0 =C
\\
i
'k
NH2
NH2
' NH2 /
t HOH
H2C03
t +2 NH3
1
H*O + CO2
l'intermédiaire serait donc le~wbamatesur
lequel l'enzyme
se fixe pour former le complexe carbarmyl : t12N - C - Em.
. 6
L'enzyme possederait trois sites : un groupe histidine, un
groupe ammonium et un groupe sulfhydryl. Mais seuls les deux derniers seraient
actifs et participeraient à la formation du complexe carbamoyl,
2.4, Facteurs d 'ac8iuicC dtr Z 'u.r&ase
De nombreux travaux ont été effectués en vue de déterminer
les facteurs pouvant influencer l'hydrolyse de l'uree, le but ëtant de trouver
les moyens de retarder sa dégradation dans le rumen afin de permettre une
meilleure utilisation de 1'NH3 produit d'une part et, d'autre part d'éviter
les risques d'intoxication par une absorption trop importante de I'NH3, Parmi
les facteurs pouvant agir sur l'ureolyse, on peut citer : les agents biologi-
ques, physiques et chimiques.
a. les facteur5 bil~lOi~ii{U~S :
L'injection d'un extrait. cristallise d'urease d'origine végë-
talc peut induire la farmdtion d'dntiwrps antiœureases (HARBERS et al, 1965 ;
GLIMP et TILLMAN, 1965, cités par &XJRNET, 1975).
Ces anticorps sont retrouves bans la salive et la bile (SIDHU
et ai., 1968).
Ces travaux rn&itent d'&re entrepris avec des hases bactérien-
nes surtout maintenant quel'ont sait qu'il n'y a pas de grandes différences
physico-chimiques entre l'uréase bactérienne et le "Jack bean" (S. MAHADEVAN
et a1 ,,1976),
b. les f’acteurs physiques :
L'hydrolyse de l'urée par le contenu du rumen est favorisé par
une température comprise entre 39OC ct 41°C et des pH se situant entre 7 et 9
(PEAKSON et SMITH, 1943). Si pour la température le rumen satisfait à cette
condition, pour le pH, le rëgirne est: primordial. Il est d'ailleurs important
de ne pas atteindre un pH aussi élevé car les risques d'intoxication à
l'NH3 se trouveraient augmentes (BAKTLEY et al., 1976). Mais d'autre part .
il n'est pas établi qu'un pP
,soit compatible avec un métablisme normal dans
le rumen et on ne connaît pas exactement le rôle du pH sur l'uréolyse in vive.
Enfin divers procédés technologiques ont été utilisés afin de
retarder l'hydrolyse de l'urée (JOURNET, 1975).
c. les facteurs chimiques :
- les antibiotiques, sulfamides et autres produits :
in vitro : la hacitracine et le sulfate de néomycine ralen-
tissent la degradation de l'urée (LOPER, 1967).
De même la sulfamethazine agit dans le même sens ; cependant,
son action est moins sensible,
Ces effets nei'sont pas retrouvés *in vivo (LOPER, 1967 ; JOURNET,
1975).
D'autres produits comme les dérivés des quinones ou de l'acide
barbiturique se sont revélés capables d'inhiber l'ukase (PEARSON et SMITH,
1943 ; HARBERS, 1962).
- l'acide acetohydroxamique (A.H.A.) et dérivés
in vitro :
- - -
l'hydrolyse de l'urée est reduite de 50 p.100 en
prcsence de II <I 15 ug d'A.I-I.A. pllr ml de milieu (BRENT, 1971), alors que
i'utilisation de la cellulose'eLt stimulëe (MOORE et al,, 1968).
*in vivo : 1'A.H.A. et ses derives se sont r@vélës efficaces
pour prévenir une intoxication a 1'Nti3 (BAINTNER et al., 1964). En France,
l'A1imentatiw-1 Equilibrëe de Conuwntry (A.E.C.) produit un dérivé de l'A.H*A.,
le HS 40 capable de réduire l'hydrul,yse de l'urée dans l'intestin des mono-
gastriques (MIChEL et JOURNET, cités par JOURNET, 1975).
.
- l'effet des mineraux sera étudié dans un autre chapitre,
avec l'intervention du zinc.
.
3. Utilisation de l'NH3 cour la erotéosynthèse bactérienne
~..~~..-~-"~~-"~--..1-
..-..a"-- ----..w ..-----I---mm-"m"-"
3.1. &?n6?mZit;t?a
L'NH3 issue de la dégradation de l'urée peut avoir trois des-
tinées : une partie est utilisée par les bactéries pour la synthèse de leurs
constituants cellulaires, une autre peut traverser la paroi du rumen et péné-
trer par la veine porte dans la circulation sanguine ; enfin la dernière peut
./*
,jbilt~r le rumen par la voie digestive.
L'NI-$, qui diffuse :i travers le rumen arrive au foie où se pro-
duit un recyclage en uree dont une psrtie est éliminée par l'urine, alors
que l'autre revient au rumen pdr IU voie salivaire. HUNGAYE (1969) estime
que cette voie apporte à l'animal 1,5 g d'N par jour.
La synthese de protëines microbiennes se fait par des mécanis-
mes d'amination et de transamination à partir de l'acide glutamique et des
corps cétoniques issus du métabolisme glucidique. Ces réactions sont possibles
grâce à la présence de glutamine-dcshydrogénase
et sont catalysées par le
NA0 ou le NADP,
L'efficacite de la protéosynthese dépend de la prt?sence dans le
régime d'une source d'énergie rapidement assimilable par les bacteries et de
minéraux qui ont un rôle mëtabolique important.
3.2. Rôle de l’énergie
La degradation des glucides fournit l'energie necessaire a la
synthese de protëines microbiennes. On estime qu'un YATP égal 10,5 est une
valeur courante (YATP = quantite de cellules produites en g par mole d'ATP,
d'après BUTTERY, 1975).
Dans le rumen, les microorganismes produisent de grandes quan-
tités d'AGV à courte chaîne, principalement, l'acide acétique (70 %), l'acide
propionique (20 %) et l'acide butyrique (10 %) (ANNISON et ARMSTRONG, 1970).
Cette production d'AGV abaisse le pH du rumen et diminue les
fuites d'NH3. Elle permet donc une meilleure synthèse protëique (COMBE et al.,
1960). Cependant, si une petite quantité de glucide rapidement fermentesci-
ble est nécessaire, un taux élevti peut avoir un effet dépressif sur la diges-
tion de la cellulose, bien qu'il accroisse l'utilisation de l'urëe (ARIAS,
1951).
3.3. Rôle du soujke
L'action du soufre semble se traduire par une amëlioration de
la proteosynthèse. HUME et a1 (1970 c) ont montré qu'un rëgime contenant
(1,61 'J de S/jour permet la synttwc de 82 g de proteines microbiennes, Si on
porte ce taux a 1,95 y, la production quotidienne de protéines atteint 24 g.
Il est cependant un seuil qu'il ne faut pas. franchir, car au-delà, la diges-
tibilitë de certains o'ligo-elements est perturbée.
BRAY et HEMSLEY (1969) proposent un rapport N/S = 10 pour obte-
nir une bonne utilisation de‘ I'NPN.
./.
4. Role du zinc sur les divers métabolismes étudiés
_---_"_-___---"-----________I___________"-------
4.1. Zinc f3t act-13Zté enzynatiqw
Les travaux de KEILIN et MANN (1939) soulignent l'importance
du zinc comme cofacteur de l'anhydrase carbonique, enzyme essentielle dans
le transport et l'élimination du CO?.
Le zinc est aussi un constituant de la carboxypeptidase pancréa-
tique (VALLEE et NEVRATH, 1950). Une carence en zinc peut baisser l'activité
de cette enzyme de 40 à 75 p.100 (MILLS et al, 1967 b).
La phosphatase alcaline fut aussi reconnue comme une zinc mé-
tdllo-enzyme (PLOCKE et al., 1962) chez Escherichia coli. Cette activite
fut retrouve chez le dindon (STARCHCR et al, 1963, cites par SELZE, 1973.) et
chez le veau carencé en zinc, on a noté une baisse de son efficacité (W.J.
MILLER et al., 1965 b).
Le zinc peut aussi se lier au NAD pour former l'alcool-déshydro-
génase (J.F. RIORDAN et al., 1971). Cette enzyme a été isolée chez 1'Homme
(Um WARBURG et al., 1964) et chez le cheval (DRUM et al., 1967).
Outre l'anhydrase carbonique, lawcarboxypeptidase, la phospha-
tase alcaline et l'alcool déshydrogénase, plus de vingt zinc métallo-enzymes
ont été découvertes. La part que le zinc occupe dans ces différents systèmes
lui fait jouer un tile important dans l'organisme animal.
Chez les ruminants, il semble qu'il existe une action du zinc
sur les cellulases et les uréases, mais les travaux effectués jusqu'à p&ent
ne permettent pas de dire à quel niveau se situe cette intervention. Est-ce
sur les enzymes ou sur les microortJanismes qui les produisent ? Dans les
chapitres qui suivent, nous traiterons le rôle du zinc,
4.2:1. effet sur Id cellulolyse
L'effet du zinc sur la cellulolyse dépend des doses -
présentes, Pour certains auteurs, cet élément est un stimulant, pour d'autres
il serait inhibiteur. Quelques travaux sur le rôle du zinc sont résumés dans
le tableau de la page 13
Il apparaît qu'il y a une grande diversité dans les
l
résultats, et MARTINE2 (1972) pense que les differences tiennent aux rtigimes
d'une part et, d'autre part, aux interactions existant entre les oligoél&nents.
4.2.2, effet sur l'uréolyse et la grotéosynthèse
. .-.-... ._
L'effet du zinc sur les uréases a été très peu étudié.
Parmi les travaux connus, on peut citer ceux de SHAW (1954) qui a étudié le
r9le des métaux sur l'activité des uréases d'origine végétale. Il a trouve
A5
il 111.
I:I plir:;
part.des c,Ltionv peuv~l~t muuifier l'activité riplcifique
: tu 1 ' enzyme.
l?our ce ,lui concerne les w-bases bactériennes,
les seuls travaux que nous tivon:j L'(:(:ensés
sont ceux de lk. NAUGHT (1950)
,J ul,t:h; ( 1 C~L,', j , CJUd ( 1 yi’6) , bi.A&,iJb;Vi\\h ( 1 ‘j’(t) . Leurs r6sultatr-i s o n t résu-
.III::: :L .ki J)LL y s u i v a n t e :
Pour JüNr;~ , l'effet stimulant ou inhibiteur,
.it:pt-,!:l de 1:~ vi tc:sse ::.rec lüquellt: l'élement traverse la paroi de la.
b:it:t,éri.e.
(Jorl(:(!r*r,arlt
l
u

zinc c\\! td :tutcrur penr;t! qut: dcy dose:j ull.anl; de
rj,C il lb rl~g-;/L peuvent ~3timulor I';~~t~vit& des urt$ases. COOK, lui i;~ trou-
~6 un effet favorable avec 3-4 mg/l. iWhAUtiVAI1, par contre trouve un
ef'I't>t inhibiteur de 93 $ :tvec 1 ,j m~;/lO(i ml et de 100 $ avec lr3 mg/lOOm
C e t tt: t:-tuclt: t.Ji.tJ~~O~r~~hi.()Ue n o u s aurw pe.rmia
tj ‘ItK,ol’lltlr lé Z.ilJ(: YOW deux üspÇ’C!LLi
: didque
e
t

nUtritioriIifd.
‘1
iiou:;
:tvu113 p
u

uI.pklf3 rendiYJ
compte 11~2 1.’ importance de cet t!!Jement chez
les animaux en général t2-t chez les ruminants en particulier. Les tra-
V:LUX men&s en vue d'accroître 11,:; cohnaiswnces sur le zinc, permettent
ut: prLvt5riir et de pluerir lès troubles dueS 2: une carence en cet élément,
:rli.lj :-: ri' ont pas iqqJ0lrté toute la :1 uInii:rc~
.;ur r;ies rôles méttiboliques. Il
rit ('3 '
, " que dt+ VcJ.ir le peu d'etude rklisé sur le r6le du zinc Sur les
ur&ases. C'est pourquoi nous nous sommes intéressés B cet élément et à
son influence SU~ la digestion de la cellulose et 1'utilisatiOh de l’U-
ree chez les ruminants.
.
Effet des mineraux sur l'utilisation de l"h'Plt'
Minéraux
Auteurs
Critères etudiés
Nature de
Effet
Effet
l'inocutum
stimulant
inhibiteur
I
CU
McNAUGHT (1950)
preteosynthèse
jus filtre
f +
50 mg/1
croissance
bactérienne.
jus filtré
centrifugé
dégradation des
protéines
1000 !Kg/?
JC?z.FS [1965)
ureolyse
suspension lavée
non determine
à toutes
de jus de rumen
concentrations
pas d'effet signi-
ficatif observe
McHAUGHT (1950)
protéosynthèse
suspension lavée
-doses non déter-
suspension lavee
suspention lavé
II - / '$RAVAUX YERSONNELS
Notre travail fait suite à celui effectue
pur A. KUMAREYAN (1976) au laboratoire de Nutrition du C.N.K.Z. de
JtiUY-en-JOSAS,
PR-. KUPlAiti13AI\\I, dans le cadre d'une thèse a
&tudi& les 11 Intdractions'1
entre le zinc et 1~:; micro-organismes du'
ltumen chez le mouton recevant (le l'uree comme source unique d'azote.
Pour eff'ecttuer son travail, ii a eu a mettre
:tu point un " régime purifié"
sali prott5ine contenant de L'urOe com-
me source b'azote.
Ceci lui a permis outre l'étude du métabolisme de ce régime de recher-
cher le taux de zinc permettant d'assurer une croissance optimum de
1:~ micropulatiop du rumen pour l'uti.lis~~tion de l'urde.
Cette methode permet surtout de faire varier
les doses de zinc afin de disposer de plusieurs milieux pour les in-
cubations In Vitro et pour les études In Vivo ; et de mesurer la protéo-
synthèse microbienne sans interférence des protéines alimentaires,
Ainsi, A. KUMARIGAN a pu montrer que le zinc
est peu so&uble dans le rumen, plus de 60 $ du zinc total dtant fixés
à la fraction "résidus alimentaires + protozoaires" pour tous les
régimes ; 16 $ à 20 :io sont liés aux bactéries tandis que 9 a/, a 17 $4
cpour les rlgimes riches) sont a l'État soluble.
U'au.tre part, la comparaison de deux régimes
pauvres en zinc (1Op.p.m.) et riche (60 p.p.m.) a permis de voir
qu'uvec le rCSg,irno pauvre s'il y u urit: inappCtence,
il n'y a pas réduc-
tion de l'intensité de la protéosynthèse bactérienne. Avec le régime
riche (60 p.p.m.) une inhibition pCwtiellu des uréases microbiennes .
fut observée.
Si cet effet se verifiait, il serait intéres-
sant de pouvoir retarder l'uréolyse en élevant la teneur en zinc du
rdgime. Cependant, le zinc pourrait avoir.un effet inhibiteur sur
l'activité cellulolytique.
Notre travail a donc pour but de vérifier
l'effet du zinc sur l'activité ureasique du contenu du rumen d'une
iJ!irt et d'autre part de préciser l'influence du taux de zinc de
l'aliment sur la protéosynthèse et l'activité cellulolytique des
I
microbes du rumen.
1) Matériel Animal
Le trr-+vail est effectué sur cinq moutons de
rwze Ile - de - France agés de plus de deux ans, munis de canules
de rumen depuis l'âge d'lirl an,
2) HkEimes expérimentaux
Nous avons utili& l'aliment purifié mis au
point par KUl%A,MBAN et avons constitué a partir de cet aliment de
buse trois régimes :
- 10 ppm de zinc
-1UU pprn du zinc
- 200 ppm de zinc
L'aliment e8t ainsi constitué :
- Amidon de maXs
s7,9 %
- Cellulose colmac'el
26,o %
*
- CQrélose
23,9 %
- Urée (46 u/I N)
4,0 %
- Complèment minéral
5,o %
- Chlorure de choline
0,l $
- Polyéthylène-glycol
(PEG)
1,o $J
- Huile de ma33
3,o %
- Vitamine A (50.000 U.I/g)
W g o/o kg
- Vitamine U3 (100.000 M/g 1,O g % kg
- Vitamine Bl
‘,
W tz % kg
Les animaux reçoivent 800 g d'aliment par jour en dem repas (ah et
16heurs).
I
3.1) Celluiolyst2
Inoculum
I
10
-3 00
Taux de zinc
de substrat
10
10
60
100
200
400
1000
3.2) Prot&u;;.ynth&se microbienne
T
llll~cululll
adapté à
10
(en pprn de zinc)
Taux de zinc
du substrat
10
60
100
200
Ce / lvlOdLlli Lt?::; Expérimentales
1) Teneur en zinc des contenus du rumen
I.l),Plode de prélevement
'
Les animaux sont prélevés au temps 0 avant
le repas du matin.
Les prélèvements sont faits par la canule
Cr l'aide de tuyau plastique bratriche sur une pompe aspirante dirigé
r~~ur~uellemer~t
duna tous les compurti.ments du rumen afin d'obtenir un
Echantillonnage à peu pres homogène.
1.2) Fractionnement
Le but de,l'opération est d'obtenir des
echantillons du Jus Total d'une part et d'autre part du surnageant
de jus filtré 'centrifugé contenant le zinc soluble.
Une partie du Jus Total bien agitée (25 g exac-
a
tement peses) est s6ch6e sur bain de sable dans une capsule de silice
tarse puis mise au four à 5500~ afin d'effectuer un dosage du zinc
.
a
dans le jus total.
250 g environ du jus total sont préssés a
travers six epaisseurs de gaze pour ob-tenir,le jus filtre debarrasse
des particules alimentaires.
Une partie de ce jus filtré est centrifugé. Le zinc est dosk sur le
surnageant obtenu,
PHOTO 1
A L I M E N T S D I S T R I B U E S
.
I GRANULES D’ALIMENT
FIBRES
PLASTIQUES
P U R I F I E
PHOTO 2
P O M P A G E D E C O N T E N U T O T A L
Ta-’
. ~2.u
.‘<
4 .
EÉzazitulation des essais effectués.
REGINE P LJ R 1 F 1 E (PI
REGIME
I‘laIs
- Manioc - Urée
Taux de Zn de Régime
[ mm 1
- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
-----------------__ - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -----------------_____
IWl
7-’
115
35
10
60
Etude in vitm de la
Etude in vitm de la
composition minérale
composition minérale
du milieu de dilution
du milieu de dilution
du rumen in vitro
du rumen in vitro
.
in vivo
i n viwa
.,
Répartition du zinc
RÉpartition du zinc
Répartition du zinc
Répartition du zinc
dans les différentes
dans les diffhentes
dans les différentes
dans les diffh-entes
fractions du contenu
fractions du contenu
fractions du contenu
fractions du contenu
de rumen
de rumen
de rumen
de rumen
Digestibilité
Oigestfbilfté
Teneur en zinc du
Teneur en zinc du
plasma
plasma
4.d .- 0 C
-. m c .w
2) Incubation in vitro : Etude de l'influence
du zinc sur le métabolisme des micrd-
organisme in vitro.
Cette technique cherche a reproduire in vitro
les fermentations ayant lieu au niveau du rumen. l31le consiste a
incuber un aliment en présence du contenu du rumen (inoculum) pré-
levé sur les moutons adaptes aux différents régimes,
L'expérilnen-tation in vitro, est effectuée au
moins deux fois avec chaque rtliyi me : deux journées non consécutives,
2.1) Méthode de p&lèvement de,l'inoculum
La technique est identique à celle du
fractionnement. Afin d'avoir un jus dé rumen représentatif, un
échantillon moyen proportionnel est réalisé sur les,moutons recevant
le même régime, le facteur animal étant ainsi partiellement supprimé
Apres le pompa:le,
les inoculum transportés
cri bouteilles thermos à température voisine de celle du rumen,sont
immediatement utilisés.
2.2) Méthodes d'incubation
a) Etude de la cellulolgse en présence de
jus ,total filtre
On incube 1g de substrat + 20 ml de
salive artificielle et 20 ml de jus de rumen filtré sur gaze. Le
tout est kjiituré de CO2 et bouCIr]é.
Un laissera une ouvertwce pour la
f'uite des gaz. L'a+:itation est permanen%e et l'incubation dure 24ho
b) ktude de l'utlisation de l'uroe en
présence du contenu total du rumen
l,,' 4i.Ypositil‘ 4opté est r*epdsentd sur la photo de la page suivante
Un erlenmeycr de 500 ml dont le bouchon étanche est mwii de trois
tubules :
* L'une permet le passage bulle à bulle d'un
courant CO2 qui assure lVanacSrobiose.et uwléger brassage du milieu.
+ La deuxième fermée hermétiquement par une
pince de YiOflK sert au prélèvement de 1'échanWllon au fins d'analyse:
* Enfin un microréfrigérant ii reflux sur la
sortie de gaz permet d'eviter les pertes en substances volatiles.
Les erlenmeyers so-.t alimentés individuellement en CO2, ce qui évite
un entrainement d'un flacon à. l'autre par le courant de gaz,
Aux 10 grammes de substrat exactement pesés,
introduits dans l'erlenmeyer,
sont ajoutés 200 ml de salive artifi-
cielle dont la composition est donnée ci-après et 200 ml de jus de
rumen total ou filtré sur gaze.
Les fioles une fois bouchées et agitées, sont
immergées dans un bain-marie thermostatique à une température de 39Qc
( +OU- 5). Les branchements pour .barbotage de-CO2 et circulation
d'eau des microréfrig&ants
sont immédiatement effectués. Les essais
in vitro sont faits en triple.
Les prelèvements pour analyses sont faits d'heure en heure jusqu'a 5 1
COIQOSITION CHIMIQUE DE LA SALIVE ARTIFICIELLE
(Pl. g!AlVIPON : TISSERAND et ZELTER, 19651
Nacl
0,470 g/litse
KCl
0,450 g/l
I$$!l2 anhydre
0,047 g/l
CaC12 anhydre
0,055 g/l
NaHC03
9,240 dl
Na2HP04 12Hk0
7,125 g/l
c) Etude de l'utilisation de l‘urée par les
batteries du rumen isolées, broyées ou non
Le but est de vérifier que les uréases bactériennes sont endocellu-
laires et de,voir si le zinc est oui ou non capable inhiber l'activité
d e l'enzyne, v
c-1) Préparation du culot bactérien (intact ou
:broyé)
La méthode utilisée s'inspire de celle de blUNT et al. ( 1971).
Elle consiste à filtrer 200 g de jus de rumen que l'on centrifuge
ensuite a 22.000 g pour obtenir un culot contenant les bactéries.
La centrifugation se fait à O0c et pendant 15 minutes. Le culot est
remis en suspention dans 100 ml de salive artificielle. 35 ml de la
suspension seront gardés sous froid (-:~QC) en vue d'un 'broyage au
%ibrogen" sous courant froid,
La technique de broyage est cellti des microbilles de verre, le temps
de l'opération pouvant varier entre 5 mn et 10 mn.
Après le broyage Ffiltre sur "Buchner" et on
lave avec 35 ml de.salive. Le filtrat obtenu constituera l'inoculum
contenant l'uréase. Une partie du centrifugat remis en suspension
et constituera la fraction l*Bactéries non 'broyées@t.
c-2) Incubation
On fait l'incubation dans des tubes a
essais. Latempérature sera de 39*c + ou - 5. L8inoculum sera soit la
suspension de bactéries broyées, soit celle des bactéries non broyées.
On prend 10 ml; le substrat est constitué par une solution d'urée 8‘
1 g par 50 ml, dont on prendra O,? ml.
Les prélèvements ss font aux temps 1,2 et 3h
l'agitation est permanente et les échantillons sont recueillis dans
dw tubes contunmt du chlorure mer~:uriyue et on opke le dosage de
l'urée.
2-3) Les substrats et la composition du milieu
Nous avons utilise comme substrat, les
aliments synthétiques distribuks journellement aux animaux, préala-
blement broyés, pour l'étude des activités uréolytiques et cellulo-
‘lytiyues du rumen.
Mais par 1~. suite nous avons été amené h.
reconstituer les régimes à partir de leurs divers constituants, pour
l'étude de la cellulolyse,et à, incuber, en plus de la cellulose pure,
Pour l'activite des bactéries isolées, nous
avons utilisé comme substrat,yne solution d'uree a 1 g /50 ml.
A partir dos régimes h 10~1U.I et 200 ppm de
zinc, nous avons constitue differents milieux en apportant du zinc en
surcharge, sous forme de sulfate. Nous avons ainsi eu des milieux
d'incubation à : 10, 60, 100, 200, 400, et 1000 ppm de zinc,
2-4) Les crit&rerJ retenus
a) Cellulolyse
Aux temps O.et.24.heures, on dose.&.'
cellulose. Lu difference entre la quantité introduite et la quanti-& ;
residuelle représente la consommation de la cellulose,
b) ~ltilisation de l'urée Par le contenu
J;ota1 du-rumen.
I~ux temps 0, 1, 2, 3 et 5 un prélève-
ment est effectué aprés agitation de la fiole et lBéchautillon est
prés& sur six épaisseurs de gaze au dessus d'un flacon contenant
quelques gouttes de chlorure mercurique qui bloque les fermentations.
Sur le filtrat obtenu, les dosages suivants sont faits :
- Détermination des acides gras volatils (AGV)
dans certains cas.
On calcule la consommation de ltN4?H3 et de
l'N-urée par la microflore en faisant la difference entre 1'N-NH3 et
llN-urée introduits et l'N-11115 et l'N-urée résiduels aux différents
temps.
9
c) Activité uréolytiyue du culot bactérien
Les prélèvements se font $S 1, 2 et 3 heurss,
On opere un dosage d'urée.
C./ N.LTliOD~J aNALYTI6;UEY
1) pH : est mesuré sit8t le prélèvement à
l'aide d'un pH-metre a l'électrode combiné.
2) N-NH3 :
L'ammoniac est dose par la methode de
berthelot
adaptée à l'auto-analyseur qui permet des analyses en série
avec un risque d’erreur inférieur à 5 9. Cette méthode est basée sur
laréaction de l'ammoniac en milieu alcalin avec le phénol et l'hypo-
chlorite de Na. Le produit formé a une coloration bleue dont le pouvoir
d'absorption est maximum à 625 nmO
Le contenu du rumen est d'abord débarrassé
des protéines par précipitation de celle-ci dans de l'acide trichlora-
cétique (ATC) à 2,T $ puis centrifugé juste avant analyse.
La solution obtenue est introduite dans le circuit de l'appareil et
portée jusqu'au bain-marie a %Oc où l'ammoniac réagit avec le phénol
et l'hypochlorite introduits au meme débit. La solution colorée est
d0I':> dirigée vers un colorimètse.
La k~~mme de dostige se situe entre i>,cj et 10 mg d'N-NH3 / ,oOml .
3) LIN-Urée
Ltur&t: est do&& par la méthode technicon
lé~;3rement'modifiée et appliquée h l'auto-analyseur. Cette méthode
est basée su14 la réaction directe (te l%ree avec le diacétylmonoxime,
en prcT:üerlce de thiosemcarbqeide t>t Irlilieu cicide.
Le thiosemicarb'&de
permet d'intensifier
la coloration rose dont le pic d'absorption se mesure a 520 nm.
Le liquide à analyser est introduit dans le
circuit-de l’auto-analyseur et subit une opération de dialyse contre la
i
.Q1 tu 3 + 22 .- .-
.-
m
L
a 3 lu c .&a + P :z
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2 E n aJ cil m c
-CT-
.
9
J w
c
---
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5
V-I
C-1
i--
-
’
solution de diacetylmonoxine. ileil ~a-ci tipres w.idition du réactif acide
est dirigée sur le bain-mczrie &. ~>OC puis vers le colorimetre.
4jA.G.V.
La méthode utilisée est celle de la chromo-
tographie en phase gazeuse. 2 ml ue jus'filtré additionnés d'un étalon
interne : acide isoktyrique ou adehyde salicy$que a raison de lmg/ml,
de solution sont acidifiés B pH-4 et wntrifugés à 20.000 g pendant 20
minutes.
Une injection de 0,1 ml environ est faite
Les ctilculs sont faits d'après le rapport de la surface des pics de
chaque acide sur la surface du pic de ltetalon interne puis par réfe-
rente à la courbe d'étalonnage faite à partir des solutions standards
colltt:hwlt des quant it&s croissar;tt:s de chaque acide et une quantité
fixe de 1 mg/ ml d'étalon iriterrz
5) ZIliC
Un écti:lilt,i Lion reprCst:tJ,tatif ciu grutluit tL
analyser (exactement pesé) reste après séchage à l'étuve à 103Oc,
minéralisé au four a 55OOc, puis pesé pour obtenir le poids des ma-
tières minérales de l'échantilloh.
La silice contenue dans le résidu
tJ ' irie.iri~rriti.orI est irrsolubil is&c? ,wr 1 ' acide chlorydrique h sec sur
tain de sable, p&is repris a l'a~iue nitrique a 10 % pour solubilisa-
tion des min&raux. Le dosage du zinc est effectué sur la solution
obtenue après filtration, par spectrophotometrie
d'absorption atomique
k l'aide d'un spectrophotomètre IL 151 dans une flamme air-acétylène.
Le principe de la méthode est le suivanz ;
La solution est puivérise dans la fltimme, créant ainsi un nuage
d'atomes. La flamme est traversée pür un faisceau d'un rayonnement ;
émis par une lampe à cathode creuse et ayant le spectre du zinc.
Les ato:nes de zinc ont la proprii~te d'absorber certaines radiations
du spectre du zinc et notamment 1.1 raie dite de',résonnance. L'absorp-
Lion de cette raie sera proportionnelle à la concentration en atomes
tic zinc de la flamme, et donc de lu teneur en zinc de la solution
pulvdrisée à débit constant.
La loi. de beer-Lzimbert s'applique ii cette
3b~jo~~ptiorl COICU[LC: en t3pectro~t~otométrie mol6culaire.
Les leci~ire;j e:'r'c.:ctuéss
sur galvanomètre sont
C(jrIlfJiirét+S
Lt ceilc-! obtenues à l'aide de solutions étalons contenant
~1~‘ a,~) à 1 ppm de zinc.
6) cs1:1 ul0st-t
aj La mcjzilode de dosage est celle de Van SOI%~T
(@IF)
.
Le principe consiste à purifier le proàuit
à analyser avec un détergent, il reste alors :
Lignine + Cellulose + Matières Minérales.
Ori dissout alors la cellulose par I'H SO. et on filtre. On d6termine
2 oi)
alors le poids de la Lignine + Piatières minérales et par différence,
on obtient la cellulose,
b) Les rkxctifs
- Le d6tergent est un mélange de :
Céthyl-triméthyl r;tm.moni.um bromitle (CTAB) et d'acide sulfurique
(H2S04,1N) soit, 200 g de CTAb pour un litre de H2304,1N ,,
- Acetone R.P. incolore et'ne laissant pas
de résidus à l'évaporation.
c) Node Opératoire .
Il s'agit d'abord de purifier l'échantillon
à analyser afin d'obtenir l'AlU = Lignine + Cellulose + Matières
minérales + un,peu dtN et éventuellemept de l'amiante.
Le produit de l'incubtition rMt dorée centrifugb h 500 g pendtint 10 à 15
minutes. Le surnageant est élimiri& et le culot repris avec 100 ml de
CTAB + H2S04. La suspension est portée à l'ébulition une heure à partir
du début.
On filtre ensuite sur creuset de verre
fritté, avec un faible vide, en prenunt aoin de casser les fibres sur
le creuset avec un agitateur en verre. On lave avec de l'eau à gO*c ,,,y
et on rince à l'acétone jusqu'a ce que le filtrat ne soit plus coloré,
On ~ieche à l'étude à 1000~ huit heures ou
la nuit. On pèse ainsi la li~wi.rw I- ktieres minérales,par différence
on.,obtient la cellulose résiduelle.
.
Aliment
. -
=-
ortier
i x.
1cI
60
40,7 g 3,tl
bi ta\\
-4
I
40,s i 2,l
1
20’
I
;
38,O ; 2,F!
400
33,7
3,3
lOOc!
34,2 ; - 1,l
I
kliment
reconstitd
,*
1
10
75,7
0,9
1
Yef 1 üf ose
i
6 0
l
i
74,e 1; 0,9
i
1%
100
,74,9 ; 1,o
I
C:?e
PFrr:
209
71,9
2,n
403
71,7 3 l,?
1000
I
62,O T - 3,r,
NS = non significatif
a+bfc
(b#c) Ps(O,%
= siçnificatif
HS = hautement significatif
!. Inf.luctice CII: la teneur w ‘7'ii.i
i. rQ(:iw 5ur sa repartjtion Uri:, le cantcnu
------ -- -..---- -.. .-.--..- _ -.
. . ------.-lll
du rwrr .
-.-.-
Nous avons cffectuu? dc': i'rc;(.tionnttlrerit~ avec If3 rénirws 10 et 100 ppm
t.,t ,*vons observ? Ia répartition sl~ivrlnt'p :
--.. -- - - -
- - . . " - - - -
Aliment
AT iment
10 ppm
l -
100 ppm
Jus total
mg/kq de contenu
frais
3
13,B
-
-
^--
--
Surnageant
rrtg/kg de contenu
frais
0,57
1,28
Jus total
X Zn contenu frais
1 9
993
w-m
Au pH du rumen, il semble que le zinc est peu soluble dans le milieu, La
plus qrandc partie reste lice aux iIIir~~c?rits ou est prcicitec.
Nos rësultats diffèrent de ceux rencontres dans la bibliographie.
MARTINE2 (1972) trouve 0 ,lG mg/litre et ZHEREBTSON et a1 (1970) 0,lO mg/litt
ces auteurs ayant traviillé sur des bovins. KUMARESAN,sur du jus de mouton, trouve
quant à lui 2,4 2 4,6 contre 0,57 et 1,28 dans n$otre cas. On remarquera QIU'~:
toutes ces valeurs sont comprise: entre 5 et 20 p.100 du zinc du Jus total:
- 10 P.100 pour KM?ARCSI\\N
- 5,9 p.100 ct 4,5 p.100 pour BREMNER avec des régimes pauvres
ou riches. Les différences semblent ten%r aux origines des jus (bovins pour BREMNEF
et aux teneurs en matières sectw do C(:I, jus, Quoi qu'il en soit, il n'y a que peu
dft zinc disponible pour l'animal hote. Lc zinc est en grande partie complexe sous
forme de sulfure OU lie aux aliments, uu encore fixe par les microorganismes.
2. Influence du zinc sur le rnctabolisme des microorganismes "in vitro"
2.1. Effet du zinc sur la ccl'lulol~se : incuhntion de lonque durees--
--"-----I-""--;--,,,,,,,_,,,,
---_c-----_---,------"-"-------"-
L'étude dela dicpstion (le la cellulose, par la microflore, révele que,
la ccllulcse pure est mieux digërée yw lorsqu'elle est incorporée dans l'aliment
ou amene en mC1ange avec les autres tiltiscnts. La dëgradation de la cellulose pure
est supérieure à 50 p. .lOO quelle que tait la teneur du milieu en zinc. Elle n'est
que de 30 à 49 p.100 dans l'aliment entier et n'est plus que de 17 j 23 p.100 dans
1 'rl? iM!nt rocfJnstitue.
Cette étude.a permi s d'observer une inhibition partielle de la cellulolyse
par l'incorporation de zinc dans le milieu d'incubation (voir table.aup.33*)'
A partir de 400 ppm, soit 0,9 mg p.100 ml, 1 'inhibition est partout observëe
v aJ
--
,.--e-e
-w--.-

-.--
---
-
-
mm
II II
et dovient hautement significative (P 4 0,Ol) à 1000 ppm soit 2,4 mg 13.100 quand
on incube de la cel1ul0sc pure.
Nos résultats ne different pas de ceux rencontrés dans la littérature, En
effet, HUBBERT et a1 (1958) trouvent que 0,5 mg de Zn p.100 ml inhibe la cellulo-
lyse ; TARTINEZ trouve une inhihition avec 2 à 3 mg p.100 ml, tandis que WOODS,
cité par MARTINEZ (1970) freine la dégradation avec une dose de 5 mg p.100 ml.
Les différences tiennent à la nature des inoculum : suspension lavée pour
HUBBERT et MARTINEZ ; jus filtré pour k!OODS et nous.
2.2.1.' EYo'lution du pH
Nous avons étudié le pH avec les régimes .lO, 100 et 200 ppm, En
apportant du zinc, nous avons constitué plusieurs milieux :
- 10 ppm : aliment sans surcharge
60 PP~ : soit OJ387 mg/100 ml
100 ppm : soit 0,2523 mg/100 ml
200 ppm : soit CI,4797 q-j/100 ml
2 0 0 ppltl
sous forme d'acétate : soit 0,497 mg/100 ml
400 ppm : soit 0,99 mg/100 ml
1000 ppm : soit 2,46 rng/lOO ml
Au cours des essais 1, 11 et III, nous n'avons pas observe un effet de la
..- .
. . .-.
.,
.-
.-.._ "_ .,-..-I
dose sur 1'ElvoluMon du pH,-alors quo‘KUMARESAN remarquait qu'avec un régime pauvre
le pH s'abaissait moins rapidement. Cependant entre deux essais, il y a une évolu-
tion due certainement a une modification de la population du rumen, les animaux
étant adaptés à des *régimes variables. En particulier, entre les essais 1 et III,
le pH qui atteint en moyenne 5,8 à 5 heures dans 1 estde 5,5 à 3 heures dans III.
1’
2.2.2. Influence, du zinc par l'uréolyse et la protéosynthèse bactérienne
les différentes doses du zinc n'ont eu un effet ni sur l'hydrolyse
d e l'urée, ni sur la protéosynthèse bactérienne. Nous avons cependant observé un
effet période au cours des trois essais réalisés. L'activitle du jus de rumen est
croissante quand on passe du régime 10 à 100 et 200 ppm. A 100 et 200 ppm, il n'y
a pratiquement plus d'urée à 2 heures.
D'autre part, avec le régime 200, la confommati'on d'NH3 est supérieur à
3 heures quelle que soit la surcharge en zinc. L',activité du rumen semble varier
en fonction du temps, ceci étant sans doute lié a la variation de la micropopula-
tion '; variation due a l'adaptation des animaux a des regimes differents.
Les expériences ont montré que le zinc même à dose élevée n'a pas altéré
la capscitë de protéosynthèse des microbes du rumen. Nos essais n'ont pas permis
--~~~~~- ~-
a!iP
oe retrouver les résultats de KURARESAY. Pourtant rtkemment FlAHADEVAN et a1 (1976)
ont montré un effet& zinc sur les ureases bactérienneadu rumen. Nous avons alors
pensé que l'absence d'effet du zinc dans nos essais pouvait être dû à la n'atbre
endocellaire de l'uréase et à l'absence de plnétration du zinc S, l'intërieur de la
bactérie, Nous avons alors repris les essais en les réalisant avec des bactéries
isolées intactes ou broyées.
2.2.3. Influence du zinc sur les urGases bacteriennes
<L
a) cl'ftzt: du brwwt!cxs ~cw~dtio::
Nous avons observe que le broyage des bactéries leur fait *
;:crdrc jusqu'a 50 p.100 de leur activttë. MAHADEVAN (1976) et I3IIEEJT(1971)
ont
rewaryue qu'une bri-ve exposition de l'enzyme mêmes à 4"C, lui fait perdre toute
dctivité.
Aussi MAHADEVAN a utilisé un protecteur de l'enzyme le Dithiothtiitol (DTT)
ct a pu conserver l'activité de l'enzyme 6 ,? v semaines a -20°C. Il semble que le DT
firc les liaisons Jlf. Au mOnic:nt dc l'utilisation, on 1 ifJ&e 1 'ut-case par une dja-
lYW.
Dans nos essais, la seule prlcsution consiste à travailler sous froid (frac-
t icknrictwtit , Ilroys~lc) jusç]u'Ju mownt (1~ I ' inr:ut)dLioA.
D'autre part, nous avons a ussi obscrvë un effet du temps de broyage.Quand on
opibrc pendant 5 minutes , on conserve 49 P.100 de l'activité de 1 ‘uréase, cependant
qu'un broyage de 10 minutes ne garde plus que 38 p. 100 de cette activité.
1,) l!fj;!L L/U #ill<' :::<r !* *: ul'c~cI:J,::j
Sur les bactërics non broyecs, on a observé un effet inhibi-
tcur de 46 p.100 II 1 heure, mais 10 p. 100 seulement à 2 et 3 heures. Cependant,
cette inhibition par une même dose (18,1 mq p.100 ml) n'est pas toujours retrouvé
avec du jus de rumen des mEmes moutons. Ceci nous laisse croire qu'entre deux
expériences, la population du rurt-en a pu varier.
Sur les bactéries broyées pendant 5 a 10 mn, l'inhibition des uréases par
le zinc est observee. Avec la même dose que précédemment (18,4 mg/100 ml), on
observe une inhibition de 62 p.100 à 1 heure et 70 p.100 à 3 heures pour un broyage
de 5 minutes contre 64 et 63 p, 100 pour un broyage de 10 minutes.
(I
Nos résultats ne diffèrent pas beaucoup de MHADEVAN (1976) qui avec 1,3 mg
p.100 ml obtient une inhibition de 93 p.100 et de 100 p.100 avec 13,07 mg p.lOt) ml.
Les différences observées entre bactérie‘s broyêes ou non s'explique si on
admet comme JONES (1964) que les uréases sont endocellulaires et qu'il faut un temps
de latente pour que l'inhibiteur, quel qu'il soit, puisse pénétrer dans la cellule.
Le broyage permet par contre une libllbration dc l'enzyme et une action directe du
zinc.
.l.
.- .
fvolutiorl du pH en fonction dc la concentration
t?n zinc
ESSAI 1
---1. --_..
1
.--- -
6,66
60
6,66
100
6966
16,44 6,19 5 $3
6,45
6,lR
5 ,PO
200
6,66
6,43
6,19
5,80
200
6,66
6,48
6,22
5,86
(acétate)
-.
ESSAI II
100
’ 6,70
6,58
6,51
6,15
5,70
200
6,53
6,48
6,16
5,70
400
6,53
6,50
6,15
5,73
1000
6,55
6,52
6,18
5,73
1000
6,55
Ci.51
6.20
5,75
(soufre)
ESSAI III
/
-
- 4
--
100
6,92
6,60 1 6,15
200
6,61 ’ 6,13
400
6,61
G,16
. . .
1000
6,58 1 6,13
4
-
- I
.
EF!FET D U ZINC S U R
l
L A
DEGRADATION DE L’ UREE
.
1
t
3
39
Effet du zinc sur l'uréase : cellules brgyék ou non:
*
inhibition en T!I Grqoin sans zinc
.
.-eV..-- - -- - -- -----~-. .
. -.-.-...IW
I
1
1 Cellules broyëes 1
I heure
1
. 1
62
6 4
/
2
6
.
5 7
6 2
/
3
5
7 0
6 3
.
E. CONCLUSION
Nous avons effectué ce travail on utilisant uniquement la méthode d'incuba-
tion in vitro et l'étude de l'évolution de divers paramètres : ptl, N-NH3, N-urée,
cellulose. L'interët de cette nkthodc est de pouvoir effectuer des bilans plus
exacts, des fermentations puisque les facteurs "absorption" et "transit" sont
supprimés. Il serait intéressant de faire une étude cinétique des mt?mes paramëtres
in vivo, mais le temps qui nous était imparti ne l'a pas permis. Néanmoins, nous
avons essayé de nous rapprocher des conditions in vivo en utilisant du contenu
total de rumen comme inoculum pour l'étude de l'utilisation de l'urée et du jus
filtré pour la cellulolyse. Le substrat est constitue par l'aliment distribue aux
animaux. Pour nos doses de zinc, nous sommes restés dans les limites d'une carence
et d'un excès. Ainsi, il nous a été possible de voir que le zinc joue un r61e
: ,
certain dans la cellulolyse. Pour les essais de retarder l'uréolyse, le zinc ne
semble pas intéressant car nous n'avons obtenu une inhibition qu'en travaillant
sur les extraits de bactéries broyees. Ainsi avec 18,4 mg de zinc p.100 ml de notre
milieu, l'activité de l'urease libre est inhibée de 70 p.100, tandis que la cellu-
lolyse est inhibée elle de 28 p.100.
.
Le travail effectué mériterait d'être poursuivi in vitro et in vivo en
- - -
faisant varier les doscs de zinc d'une pilrt et d'autre pdrt en utilisant des saur-
ces d'energie différentes. .
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