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j/.
REPUBLIQUE DU SENEGAL
. ’
MINISTERE DU DEVELOPPEMENT
RURAL ET DE L'HYDRAULIQUE
INSTITUT SENEGALAIS DE RECHERCHES
AGRICOLES (I.S.R.A.)
DEPARTEMENT DE RECHERCHES SUR LES
PRODUCTIONS ET LA SANTE ANIMALES
LABORATOIRE NATIONAL DE L'ELEVAGE
ET DE RECHERCHES VETERINAIRES
B.P. 2057
DAKAR-HANN‘
RAPPORT DE STAGE SUR LA TECHNIQUE DE CULTURE
IN VITRO DE COWDRIA RUMINANTIUM SUR
CELLULES ENDOTHELIALES BOVINES
DU 5 AVRIL AU 6 MAI 1992
A LA MISSION ANTILLES GUYANE
(GUADELOUPE) - min
Par Mbaye MBENGUE
REF. N"32/PATH0.ANIM.
SEPTEMBRE 1992.
1. INTRODUCTION
Depuis plusieurs années, les tentatives de culture in vitro de Cowdria
ruminantium agent pathogènede la Cowdriose ou heartwater ont été caractérisés
par des échecs.
Cependant,
en 1990, la technique de culture de (C.R.) Cowdria ruminantium
a été mise en application par D. MARTINEZ de la mission Antilles-Guyane de
1'IEMVT.
Le but de notre stage est de maîtriser cette technique de culture afin
de l'appliquer dans notre laboratoire avec la souche sénégalaise de C.R.
II. TECHNIQUE DE CULTURE DE C.R. SUR LES CELLULES YOTHELIALES
A. Cultures des cellules endothéliales
1) Les cellules adaptées à la culture de C.R.
Cellules BUE Bovine Umbilical Endothelium
BBEC Bovine Brain Endothelium Cells
2) Milieu de culture (cf. annexe)
Il est très important et serait la cause de nombreux échecs passés en
matière de culture cellulaire de C.R.
Parmi les différents milieux testés
le seul ayant permis le développement
de C.R. est le suivant :
- M.E.M. modifié Glasgow (BHK 21) 10 x
- + Bicarbonate Na (2,75 g/l)
- + Sérum foetal de veau (SVP )OU sérum de veau nouveau né (SVN) 10 p.100
- + Tryptose phosphate Broth deshydrated (TPB) à 2,95 g/l
- + Penistreptomycine 10 UI/lOO ug/ml et
fungizone (2,5 à 5 pg/ml)
. . ./ . . .
- 2
- + Glutamine 2 mM
- + Gélatine (uniquement pour la culture des BBEC)
- + eau distillée stérile
Le milieu prêt est mis en incubation dans l'étuve à COp (6J = 37" C
5 p.100 CO,).
3) Technique de culture
Ce sont les techniques classiques.
B. Isolement de C.R. sur cellules endothéliales : B.U.E.
1) Inoculum
- Broyat de tiques infectées (Nymphes gorgées)
Désinfecter les tiques à l'alcool et à l'eau de javel, puis rincer
3 fois à l'eau distillée stérile et centrifuger le broyat.
- Sang
Le meilleur inoculum récolté stérilement sur héparine à partir du 2è / 3è
jour d'hyperthermie chez les ruminants.
2) Isolement
Diluer une partie de sang dans une partie de milieu de culture et mettre
; 2 ml dans 1 boîte de 25 cm2
8àlO ml dans 1 boîte de 75 cm2
incuber 1 à 2 heures à l'étuve 37°C
Rien rincer le tapis cellulaire 3 à 4 fois avec du milieu de lavage
(100 ml Glasgow + bicarbonate) jusqu'à ce qu'il n'y ait plus de sang et
ajouter le milieu de culture. Changer le milieu le lendemain, puis tous les
trois jours. '
Remarque
: Quand on inocule avec du sang, les plages apparaissent entre
10 jours à 3 semaines.
- 3
C. Inoculation de cellules BUE saines par des cellules infectées à C.R.
1) Inoculum
- Utiliser le surnageant d'une culture présentant un pourcentage de cellules
infectées compris entre 70 et 80 p.100 et dont les C.R. sont au stade de
corps élémentaires C.E. (coloration rapide R.A.L.).
- Pour une expérimentation, il est nécessaire de centrifuger à 1 000 Rpm pen-
dant 10 mn afin d'éliminer tout débris cellulaire. ainsi, un tel surnageant
ne contient que des C.E. et permet une bonne synchronisation des cultures.
2) Inoculation
Nous disposons d'un flacon de 25 cm2 avec un tapis cellulaire complet :
- jeter le milieu de culture contenu dans le flacon
- inoculer avec 1 à 2 ml de cellules infectées
laisser 2 heures à l'étuve
- compléter avec 6 ml de milieu glasgow et remettre à l'étuve.
Observer tous les jours.
Dans nos conditions de culture, le cycle de Cowdria ruminantium dure 5
à 6 jours. Il se termine par l'éclatement des morula et la libération des :
corps élémentaires entra?nant la mort des cellules hôtes. Au cours des passa-
ges, la destruction du tapis cellulaire est quasi-complète en 1 ou 2 cycles
soit 6 à 12 jours. A ce stade, 90 p.100 des cellules sont infectées quelque
soit le stock.
D. Trypsinisation des cellules
Diluer la trypsine au l/lO. Verser le milieu contenu dans le flacon de
75 cm2 avec un tapis complet de cellules saines.
Mélanger 2 fois les cellules avec 2 ml de trypsine pour enlever le
sérum. Jeter et mettre 2 ml de trypsine en laissant agir 30 secondes.
. . . / . . .
-4
Tapoter la boîte de façon à faire récoller les cellules et rajouter 10 ml
de glasgow avec du sérum de veau pour arrêter l'action de la trypsine puis ré-
partir dans 6 flacons de 25 cm2 à raison de 2 ml/flacon.
Compléter avec 6 ml de milieu glasgow.
Incuber les flacons dans l'étuve à CO2 5 p.100 en prenant la précaution
de les ouvrir légèrement dans le but d'alimenter les cellules en CO2 pendant
2 heures et les refermer.
Observer les boîtes tous les jours en changeant le milieu le lendemain
puis tous les 2 à 3 jours jusqu'à obtention d'un tapis cellulaire complet.
Remarque
La trypsinisation sert à multiplier les cellules pour constituer un
stock de cellules saines.
1 boîte de 25 cm2 ---Y> 2 x 25 cm2
1
de cellules saines ,:
passage
1 boîte de 75 cm2 -> 2 x 75 cm2
. . ./ . . .
-5
III. CONCLUSION
La technique de culture in vitro de C.R. pourra ainsi être appliquée dans
notre laboratoire.
L'infection de nos cellules saines par du sang récolté stérilement sur
héparine au 3è jour d'hyperthermie à partir de ruminants infectés*nous permet-
tra de faire des passages avec notre souche de C.R. sur les cellules endothé-
liales.
Des tests de vaccination des ruminants contre la Cowdriose pourront être
envisagés dans le cadre de notre programme de recherche sur la Cowdriose
Convention DG XII Cowdriose/CEE.
IV. RJ2lERCIEMENTS
Nous adressons nos remerciements les plus chers :
- au Pr. Gerrit UILENBERG, Directeur Scientifique de 1'IFMVT et à Mme Glady
le responsable de la formation de l'Institut sans qui la formation ne serait
pas réalisable,
- au Dr D. MARTINEZ, responsable du laboratoire de Microbiologie de la Mission
Antilles-Guyane pour la parfaite organisation du stage et par l'assistance
continue qu'il a toujours manifesté pour nous assurer une bonne compréhension
des essais de culture,
- aux Drs E. CAMUS et Ni BARRE pour leur disponibilité,
- Messieurs Stephane COISNE et Christian SHEIKBOHDOU par l'excellente assistant
technique qui nous a facilité la mise en application des tests de culture
- au Directeur Général de 1'ISRA et au Directeur des Recherches sur la Sant
et les Productions animales de nous avoir autorisé à participer à cett
étude.
. . . / . . .
- 6
A N N E X E
1. Congélation des cellules endothéliales
- Trypsiner les cellules dans une boîte de.75 cm2.
- Mettre dans un tube conique et centrifuger à 300 g (1 200 tours/mn
pendant 10 mn.
- Jeter le surnageant et reprendre le culot dans 1 ml de milieu de congélation
composé de : (moitié Milieu Glasgow + moitié SVF + 10 p.100 de DMSO). Ce
milieu doit être gardé au frais à l'avance. Le culot est mis dans des tubes
de Nunc et enroylé avec du coton et bien fermé.
Les tubes sont places dans une boîte en polystyrène et incubés à - 80°C
(Numéroter les tubes BUE -t passage + date).
Au bout de 24 heures, ils sont trempés dans l'azote liquide.
2. Décongélation des cellules endothéliales
- Sortir les tubes de l'azote liquide et les placer au bain-marie à 37°C
en procédant le plus rapidement possible et en agitant.
- Bien désinfecter les tubes à l'alcool sous la hotte.
- Diluer au moins 10 fois l'aliquot dans un milieu Glasgow et le mettre
dans un flacon de 75 cm2.
- Incuber dans l'étuve à Cos. Après 24 heures, changer le milieu.
Remarque : Ne jamais décongeler toutes les cellules en même temps.
3. Congélation des Cowdria
- Gratter le tapis cellulaire et (bien mettre en suspension les Cowdria dans le
cas d'un passage);
- Centrifuger le tout à 2 500 tours pendant 15 mn à 25°C.
- Réduire le surnageant (garder 2 ml)
. . ./ . . .
- 7
- Bien mettre en suspension le culot + le reste du surnageant (2 ml) +
10 p.100 de CMSO dans 1 tube stérile de NUNC en marquant la souche 1::
daté et passer dans l'azote liquide.
4. Tampons
- Bicarbonate de Na (Hydrogénocarbonate de Sodium NaHCOs)
5,5 p-100
Peser 5,5 g de bicarbonate, mettre dans un récipient et rajouter 100 ml
d'eau distillée. Agiter pour bien mélanger (dissoudre) et passer à la filtra-
tion sur filtre
millipore 0,22 )-I dans des flacons de 100 ml stériles (sous
la hotte). Conserver à + 4°C.
- Sérum foetal de veau ou sérum de veau nouveau-né SVF ou SVN 10 p.100
Quand on décongèle 1 flacon de 500 ml, congeler 4 x 100 ml et travailler
avec les 100 ml.
Tryptose Phosphate Broth deshydrated (100 x,29,5 g/lOO ml)
Peser 29,5 g et mettre dans un bécher puis rajouter 100 ml d'eau distillé1
Répartir 10 ml/flacon et dévisser légèrement les flacons et les passer à l'aut!
clave 15 mn. Refermer les flacons (sous la hotte), mettre du parafilm et mar-
quer TH31DO -t date..
- Pénicilline - Streptomycine Lyophilized en poudre 100 x
Mettre 20 ml d'eau distillée stérile (sous la hotte) et répartir en
flacons de 5 ml puis congeler à - 20°C.
- Fungizone 100 x Conservation
- 20°C
- Glutamine
100 x 2 MM soit 292,3 g/l
Peser 2,923 g et mettre dans un flacon, rajouter 100 ml d'eau distillée
et bien dissoudre puis filtrer sur Millipore 0,22. Répartir 10 ml/tube stérile
recouvrir les bouchons de parafilm et les maintenir incliné.
Conservation à - 20°C.
. . . / . . .
- 7
- Bien mettre en suspension le culot + le reste du surnageant (2 ml) +
10 p.100 de CMSO dans 1 tube stérile de NUNC en marquant la souche 1;:
date et passer dans l'azote liquide.
4. Tampons
- Bicarbonate de Na (Hydrogénocarbonate de Sodium NaHCOs)
5,5 p.100
Peser 5,5 g de bicarbonate, mettre dans un récipient et rajouter 100 ml
d'eau distillée. Agiter pour bien mélanger (dissoudre) et passer à la filtra-
tion sur filtre
millipore 0,22 1-1 dans des flacons de 100 ml stériles (sous
la hotte). Conserver à + 4°C.
- Sérum foetal de veau ou sérum de veau nouveau-né SVF ou SVN 10 p-100
Quand on décongèle 1 flacon de 500 ml, congeler 4 x 100 ml et travailler
avec les 100 ml.
Tryptose Phosphate Broth deshydrated (100 x,29,5 g/lOO ml)
Peser 29,5 g et mettre dans un bécher puis rajouter 100 ml d'eau distillée
Répartir 10 ml/flacon et dévisser légèrement les flacons et les passer à l'autc
clave 15 mn. Refermer les flacons (sous la hotte), mettre du parafilm et mar-
quer TH3100 + date..
- Pénicilline - Streptomycine Lyophilized en poudre 100 x
Mettre 20 ml d'eau distillée stérile (sous la hotte) et répartir en
flacons de 5 ml puis congeler à - 20°C.
- Fungizone 100 x Conservation
- 20°C
- Glutamine
100 x 2 MM soit 292,3 g/l
Peser 2,923 g et mettre dans un flacon, rajouter 100 ml d'eau distillée
et bien dissoudre puis filtrer sur Millipore 0,22. Répartir 10 ml/tube stérile
recouvrir les bouchons de parafZlm et les maintenir incliné.
Conservation à - 20°C.
. . . / . . .
- 8
- Gélatine 0,2 p.100
Peser 200 mg et mettre dans un flacon puis rajouter 100 ml d'eau
distillée et passer à l'autoclave.
Conserver à +4'C.
- Trypsine / EDTA 10 x (pour 1 litre)
Nacl ....................
80
g/l (ajuster à pH 7,8)/avecNAOH 1Ngoute à g.
Kcl .....................
2
dl
Na2HP0
.................
11.5 g/l
KHâPO
..................
2
dl
EDTA Naz ................
2
811
Trypsine
................
5
g/l (à conserver à - 2O'C)
Laisser bien mélanger pendant 2 heures et mettre 2 ml de rouge de phénol
à 1 % (sous la hotte) puis filtrersur Millipore 0,22 JJ dans 1 grand flacon
stérile et répartir dans des flacons stériles de 10 ml. Boucher bien et
mettre du parafilm. Etiquetter Trypsine 10x + date et congeler en inclinant
les flacons.
I
i0, L-THREONINE
11
47,60
'b, L-TRYPTOPHAN
I
8,OO
I
I
36,20
,121 L-TYROSIME
I
/
:i13) L-VALINE
I
93,60
1
t*
1
I
':VITAKINS
5
I
/
; 1) CHOLINE Cl '
I
2,00
I
:2) CZ-D-PANTOTHENATE
I
2.00
i
3) FOLIC ACID
,
i_
2,00
U) NICOTINAl~IDE
1
2-00
I
5) PYRIDOXAL HC1
I
2,00
i
I
I
6) RIBOFLAVINE
!
0,20
I
7) THIA-IINIUM ài C1
I
2,00
/
t
4
1) GLUCOSE H 0
I 4950,oo
,
2) INOSITOL
i
3,60
3) PHENOL RZD
I
10,oo
1
l
4) TRYPTOSE PSOSPHATE BROTH
I
(CLFCO)
1 2950,OO [
1
I
rntikap =fF
-9
Quantité de NaHCOJlitre
mM
ml
9 ’
Réf. cat.
Réf. cat.
M i l i e u x *
i 6-883
1 O-001
%!I~,I debase de Eagle !msdiliel avec sels de Earie
20 ou 10
220u 11
1.68 ou 0.85
1 O-031
hl~~~~~~.clrzfi)~se dn Eagle (modlllél. &ec Sels de HankS
4..
-5
0.35
1 o-941
'vl~heu debase de Eagle peur cellules diploides
2c
22
1.68
10-101
Ml:,eu ess~~n~~~l minimum de Eagle (modiliel sels de Earfe
24 :,a 10
270~ I?
2 00 OU 0.85
10-131
M~I,~U es&ntiet mrnrmum de Eagle (modifié) sels de Hanks
4
5
0.35
10-171
Mtl~?u essenliel mrnrmum de Eagle pour cuiIures en SusPenSIor
24
27
2.00
1 O-201
Milieu 199
26 5
29
2.20
JO-231
blli#eil 199
4
5
0.35
1 O-250
,ac~alt)umlne de Earle
26 5
29
2.20
1 O-260
idclahIl~lrle de Hanks
4
5
0.35
)( 10-301
V,IW; dsfagle modif~car~on de Glasgow
-
33
37
2.75
10-311
\\d,l+eu de Eagle modlficarion Alpha
24
27
-
200
1 o-323
\\I,;,~z;I essenllet minimum de Eagle modlfrcatlon de Joklik
-
-
1 o-33 1
l\\,l~e~ d.e Eagle modifical~on de Dtilbecco
44 j
49
3.70
10-411
\\.II!,I:u Harn F 10
14.5
15
1.20
10-431
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1C
16
1.18
10-521
blt!~t::; deWaymourh MG752!1
27
30
2.24
1 o-551
\\1tl1~,1 :VI;C~~ 5A mod~f~car:or de iwakata ei Grace
26.5
29
2.2C
1 O-601
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24
27
2.00
10-661
\\lr!Te!, ,C:VRL 1066
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29
2.25
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13.5
1x.I
1.12
1 o-91 1
\\l,!leiA NClC i 35
26.5
29
2.20
‘5,.
POUR LA COLORATION RAPIDE DES FibiT-IS
.
Le coffret RAL 555 permet, par une methode
rapide, la coloration diffkentielle des cellules.
II est composé de 3 solutions :
0 solution I
125 ml mdthanol, à renouveler reguliérement dans
les pays à degré hygrometrique eleve
0 solution II
125 ml solution aqueuse éosine RAL, STABLE 1 an a
temperature ambiante
,
l solution III
125 ml solution aqueuse, bleu de methylène RAL,
.
STABLE 6 mois B tempkrature ambiante en stock,
:.
.
2 mois à partir de’I’uti1isatiot-t.
FORMULE SANGUINE
Plonger le frottis
Plonger le frottis
.Plonger l e f r o t t i s
5 fois 1 seconde
5 fois 1 seconde
5 fois 1 seconde
dans la solution I
dans la solution II
dans la solution III
dgoutter l’excédent sur
bien égoutter I’excedent,
laver rapidement
papier filtre.
ne pas laver.
2 l’eau deminéralisée.
b?nterprétation est identique 3 celle des colorations classiques.
PALUDISME - PIROPLASMOSE
Ptonger le frottis
Plonger le frottis
Plonger le frottis
7 minute
-
2 fois 7 seconde
2 fois 1 seconde
dans la solution I
dans la solution Il
dans la solution Ill
rincer a l’eau *..
rincer rapidement B
laver a l’eau courante.
l’eau
FILARIOSE
Plonger le frottis
Plongèi le frottis
P l o n g e r l e f r o t t i s ’
10 fois 1 seconde
10 fois 7 seconde
10 A 20 fois 1 seconde
dans la solution I
dans la solution II
dans’ la’solution. Ill
egoutter l’excédent sur
bien egoutter l’excédent.
laver a l’eau courante.
papier filtre.
ne pas laver.
< TRKHOMONASE
Plonger le frottis
Plonger le frottis
Plonger le frottis
15 secondes
1 minute
1 minute
dans la solution 1.
dans la solution II
dans la solution III
essorer sur papier filtre.
laver a l’eau déminéralisee.
’ :$
S&5ét& Chimique POINTET-GIRARD, Département Réactifs .+
35, Avenue Jean - Jaurés 92390 VILLENEUVE - LA - GARENNE
Té[. 7 9 8 . 1 7 . 1 7 .- T é l e x 6 1 0 7 1 9 P G C H I M I
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PRODUCTIONS ET LA SANTE ANIMALES
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ET DE RECHERCHES VETERINAIRES
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RAPPORT DE STAGE SUR LA TECHNIQUE DE CULTURE
IN VITRO DE COWDRIA RUMINANTIUM SUR
CELLULES ENDOTHELIALES BOVINES
DU 5 AVRIL AU 6 MAI 1992
A LA MISSION ANTILLES GUYANE
(GUADELOUPE) - min
Par Mbaye MBENGUE
REF. N"32/PATH0.ANIM.
SEPTEMBRE 1992.
1. INTRODUCTION
Depuis plusieurs années, les tentatives de culture in vitro de Cowdria
ruminantium agent pathogènede la Cowdriose ou heartwater ont été caractérisés
par des échecs.
Cependant,
en 1990, la technique de culture de (C.R.) Cowdria ruminantium
a été mise en application par D. MARTINEZ de la mission Antilles-Guyane de
1'IEMVT.
Le but de notre stage est de maîtriser cette technique de culture afin
de l'appliquer dans notre laboratoire avec la souche sénégalaise de C.R.
II. TECHNIQUE DE CULTURE DE C.R. SUR LES CELLULES YOTHELIALES
A. Cultures des cellules endothéliales
1) Les cellules adaptées à la culture de C.R.
Cellules BUE Bovine Umbilical Endothelium
BBEC Bovine Brain Endothelium Cells
2) Milieu de culture (cf. annexe)
Il est très important et serait la cause de nombreux échecs passés en
matière de culture cellulaire de C.R.
Parmi les différents milieux testés
le seul ayant permis le développement
de C.R. est le suivant :
- M.E.M. modifié Glasgow (BHK 21) 10 x
- + Bicarbonate Na (2,75 g/l)
- + Sérum foetal de veau (SVP )OU sérum de veau nouveau né (SVN) 10 p.100
- + Tryptose phosphate Broth deshydrated (TPB) à 2,95 g/l
- + Penistreptomycine 10 UI/lOO ug/ml et
fungizone (2,5 à 5 pg/ml)
. . ./ . . .
- 2
- + Glutamine 2 mM
- + Gélatine (uniquement pour la culture des BBEC)
- + eau distillée stérile
Le milieu prêt est mis en incubation dans l'étuve à COp (6J = 37" C
5 p.100 CO,).
3) Technique de culture
Ce sont les techniques classiques.
B. Isolement de C.R. sur cellules endothéliales : B.U.E.
1) Inoculum
- Broyat de tiques infectées (Nymphes gorgées)
Désinfecter les tiques à l'alcool et à l'eau de javel, puis rincer
3 fois à l'eau distillée stérile et centrifuger le broyat.
- Sang
Le meilleur inoculum récolté stérilement sur héparine à partir du 2è / 3è
jour d'hyperthermie chez les ruminants.
2) Isolement
Diluer une partie de sang dans une partie de milieu de culture et mettre
; 2 ml dans 1 boîte de 25 cm2
8àlO ml dans 1 boîte de 75 cm2
incuber 1 à 2 heures à l'étuve 37°C
Rien rincer le tapis cellulaire 3 à 4 fois avec du milieu de lavage
(100 ml Glasgow + bicarbonate) jusqu'à ce qu'il n'y ait plus de sang et
ajouter le milieu de culture. Changer le milieu le lendemain, puis tous les
trois jours. '
Remarque
: Quand on inocule avec du sang, les plages apparaissent entre
10 jours à 3 semaines.
- 3
C. Inoculation de cellules BUE saines par des cellules infectées à C.R.
1) Inoculum
- Utiliser le surnageant d'une culture présentant un pourcentage de cellules
infectées compris entre 70 et 80 p.100 et dont les C.R. sont au stade de
corps élémentaires C.E. (coloration rapide R.A.L.).
- Pour une expérimentation, il est nécessaire de centrifuger à 1 000 Rpm pen-
dant 10 mn afin d'éliminer tout débris cellulaire. ainsi, un tel surnageant
ne contient que des C.E. et permet une bonne synchronisation des cultures.
2) Inoculation
Nous disposons d'un flacon de 25 cm2 avec un tapis cellulaire complet :
- jeter le milieu de culture contenu dans le flacon
- inoculer avec 1 à 2 ml de cellules infectées
laisser 2 heures à l'étuve
- compléter avec 6 ml de milieu glasgow et remettre à l'étuve.
Observer tous les jours.
Dans nos conditions de culture, le cycle de Cowdria ruminantium dure 5
à 6 jours. Il se termine par l'éclatement des morula et la libération des :
corps élémentaires entra?nant la mort des cellules hôtes. Au cours des passa-
ges, la destruction du tapis cellulaire est quasi-complète en 1 ou 2 cycles
soit 6 à 12 jours. A ce stade, 90 p.100 des cellules sont infectées quelque
soit le stock.
D. Trypsinisation des cellules
Diluer la trypsine au l/lO. Verser le milieu contenu dans le flacon de
75 cm2 avec un tapis complet de cellules saines.
Mélanger 2 fois les cellules avec 2 ml de trypsine pour enlever le
sérum. Jeter et mettre 2 ml de trypsine en laissant agir 30 secondes.
. . . / . . .
-4
Tapoter la boîte de façon à faire récoller les cellules et rajouter 10 ml
de glasgow avec du sérum de veau pour arrêter l'action de la trypsine puis ré-
partir dans 6 flacons de 25 cm2 à raison de 2 ml/flacon.
Compléter avec 6 ml de milieu glasgow.
Incuber les flacons dans l'étuve à CO2 5 p.100 en prenant la précaution
de les ouvrir légèrement dans le but d'alimenter les cellules en CO2 pendant
2 heures et les refermer.
Observer les boîtes tous les jours en changeant le milieu le lendemain
puis tous les 2 à 3 jours jusqu'à obtention d'un tapis cellulaire complet.
Remarque
La trypsinisation sert à multiplier les cellules pour constituer un
stock de cellules saines.
1 boîte de 25 cm2 ---Y> 2 x 25 cm2
1
de cellules saines ,:
passage
1 boîte de 75 cm2 -> 2 x 75 cm2
. . ./ . . .
-5
III. CONCLUSION
La technique de culture in vitro de C.R. pourra ainsi être appliquée dans
notre laboratoire.
L'infection de nos cellules saines par du sang récolté stérilement sur
héparine au 3è jour d'hyperthermie à partir de ruminants infectés*nous permet-
tra de faire des passages avec notre souche de C.R. sur les cellules endothé-
liales.
Des tests de vaccination des ruminants contre la Cowdriose pourront être
envisagés dans le cadre de notre programme de recherche sur la Cowdriose
Convention DG XII Cowdriose/CEE.
IV. RJ2lERCIEMENTS
Nous adressons nos remerciements les plus chers :
- au Pr. Gerrit UILENBERG, Directeur Scientifique de 1'IFMVT et à Mme Glady
le responsable de la formation de l'Institut sans qui la formation ne serait
pas réalisable,
- au Dr D. MARTINEZ, responsable du laboratoire de Microbiologie de la Mission
Antilles-Guyane pour la parfaite organisation du stage et par l'assistance
continue qu'il a toujours manifesté pour nous assurer une bonne compréhension
des essais de culture,
- aux Drs E. CAMUS et Ni BARRE pour leur disponibilité,
- Messieurs Stephane COISNE et Christian SHEIKBOHDOU par l'excellente assistant
technique qui nous a facilité la mise en application des tests de culture
- au Directeur Général de 1'ISRA et au Directeur des Recherches sur la Sant
et les Productions animales de nous avoir autorisé à participer à cett
étude.
. . . / . . .
- 6
A N N E X E
1. Congélation des cellules endothéliales
- Trypsiner les cellules dans une boîte de.75 cm2.
- Mettre dans un tube conique et centrifuger à 300 g (1 200 tours/mn
pendant 10 mn.
- Jeter le surnageant et reprendre le culot dans 1 ml de milieu de congélation
composé de : (moitié Milieu Glasgow + moitié SVF + 10 p.100 de DMSO). Ce
milieu doit être gardé au frais à l'avance. Le culot est mis dans des tubes
de Nunc et enroylé avec du coton et bien fermé.
Les tubes sont places dans une boîte en polystyrène et incubés à - 80°C
(Numéroter les tubes BUE -t passage + date).
Au bout de 24 heures, ils sont trempés dans l'azote liquide.
2. Décongélation des cellules endothéliales
- Sortir les tubes de l'azote liquide et les placer au bain-marie à 37°C
en procédant le plus rapidement possible et en agitant.
- Bien désinfecter les tubes à l'alcool sous la hotte.
- Diluer au moins 10 fois l'aliquot dans un milieu Glasgow et le mettre
dans un flacon de 75 cm2.
- Incuber dans l'étuve à Cos. Après 24 heures, changer le milieu.
Remarque : Ne jamais décongeler toutes les cellules en même temps.
3. Congélation des Cowdria
- Gratter le tapis cellulaire et (bien mettre en suspension les Cowdria dans le
cas d'un passage);
- Centrifuger le tout à 2 500 tours pendant 15 mn à 25°C.
- Réduire le surnageant (garder 2 ml)
. . ./ . . .
- 7
- Bien mettre en suspension le culot + le reste du surnageant (2 ml) +
10 p.100 de CMSO dans 1 tube stérile de NUNC en marquant la souche 1::
daté et passer dans l'azote liquide.
4. Tampons
- Bicarbonate de Na (Hydrogénocarbonate de Sodium NaHCOs)
5,5 p-100
Peser 5,5 g de bicarbonate, mettre dans un récipient et rajouter 100 ml
d'eau distillée. Agiter pour bien mélanger (dissoudre) et passer à la filtra-
tion sur filtre
millipore 0,22 )-I dans des flacons de 100 ml stériles (sous
la hotte). Conserver à + 4°C.
- Sérum foetal de veau ou sérum de veau nouveau-né SVF ou SVN 10 p.100
Quand on décongèle 1 flacon de 500 ml, congeler 4 x 100 ml et travailler
avec les 100 ml.
Tryptose Phosphate Broth deshydrated (100 x,29,5 g/lOO ml)
Peser 29,5 g et mettre dans un bécher puis rajouter 100 ml d'eau distillé1
Répartir 10 ml/flacon et dévisser légèrement les flacons et les passer à l'aut!
clave 15 mn. Refermer les flacons (sous la hotte), mettre du parafilm et mar-
quer TH31DO -t date..
- Pénicilline - Streptomycine Lyophilized en poudre 100 x
Mettre 20 ml d'eau distillée stérile (sous la hotte) et répartir en
flacons de 5 ml puis congeler à - 20°C.
- Fungizone 100 x Conservation
- 20°C
- Glutamine
100 x 2 MM soit 292,3 g/l
Peser 2,923 g et mettre dans un flacon, rajouter 100 ml d'eau distillée
et bien dissoudre puis filtrer sur Millipore 0,22. Répartir 10 ml/tube stérile
recouvrir les bouchons de parafilm et les maintenir incliné.
Conservation à - 20°C.
. . . / . . .
- 7
- Bien mettre en suspension le culot + le reste du surnageant (2 ml) +
10 p.100 de CMSO dans 1 tube stérile de NUNC en marquant la souche 1;:
date et passer dans l'azote liquide.
4. Tampons
- Bicarbonate de Na (Hydrogénocarbonate de Sodium NaHCOs)
5,5 p.100
Peser 5,5 g de bicarbonate, mettre dans un récipient et rajouter 100 ml
d'eau distillée. Agiter pour bien mélanger (dissoudre) et passer à la filtra-
tion sur filtre
millipore 0,22 1-1 dans des flacons de 100 ml stériles (sous
la hotte). Conserver à + 4°C.
- Sérum foetal de veau ou sérum de veau nouveau-né SVF ou SVN 10 p-100
Quand on décongèle 1 flacon de 500 ml, congeler 4 x 100 ml et travailler
avec les 100 ml.
Tryptose Phosphate Broth deshydrated (100 x,29,5 g/lOO ml)
Peser 29,5 g et mettre dans un bécher puis rajouter 100 ml d'eau distillée
Répartir 10 ml/flacon et dévisser légèrement les flacons et les passer à l'autc
clave 15 mn. Refermer les flacons (sous la hotte), mettre du parafilm et mar-
quer TH3100 + date..
- Pénicilline - Streptomycine Lyophilized en poudre 100 x
Mettre 20 ml d'eau distillée stérile (sous la hotte) et répartir en
flacons de 5 ml puis congeler à - 20°C.
- Fungizone 100 x Conservation
- 20°C
- Glutamine
100 x 2 MM soit 292,3 g/l
Peser 2,923 g et mettre dans un flacon, rajouter 100 ml d'eau distillée
et bien dissoudre puis filtrer sur Millipore 0,22. Répartir 10 ml/tube stérile
recouvrir les bouchons de parafZlm et les maintenir incliné.
Conservation à - 20°C.
. . . / . . .
- 8
- Gélatine 0,2 p.100
Peser 200 mg et mettre dans un flacon puis rajouter 100 ml d'eau
distillée et passer à l'autoclave.
Conserver à +4'C.
- Trypsine / EDTA 10 x (pour 1 litre)
Nacl ....................
80
g/l (ajuster à pH 7,8)/avecNAOH 1Ngoute à g.
Kcl .....................
2
dl
Na2HP0
.................
11.5 g/l
KHâPO
..................
2
dl
EDTA Naz ................
2
811
Trypsine
................
5
g/l (à conserver à - 2O'C)
Laisser bien mélanger pendant 2 heures et mettre 2 ml de rouge de phénol
à 1 % (sous la hotte) puis filtrersur Millipore 0,22 JJ dans 1 grand flacon
stérile et répartir dans des flacons stériles de 10 ml. Boucher bien et
mettre du parafilm. Etiquetter Trypsine 10x + date et congeler en inclinant
les flacons.
I
i0, L-THREONINE
11
47,60
'b, L-TRYPTOPHAN
I
8,OO
I
I
36,20
,121 L-TYROSIME
I
/
:i13) L-VALINE
I
93,60
1
t*
1
I
':VITAKINS
5
I
/
; 1) CHOLINE Cl '
I
2,00
I
:2) CZ-D-PANTOTHENATE
I
2.00
i
3) FOLIC ACID
,
i_
2,00
U) NICOTINAl~IDE
1
2-00
I
5) PYRIDOXAL HC1
I
2,00
i
I
I
6) RIBOFLAVINE
!
0,20
I
7) THIA-IINIUM ài C1
I
2,00
/
t
4
1) GLUCOSE H 0
I 4950,oo
,
2) INOSITOL
i
3,60
3) PHENOL RZD
I
10,oo
1
l
4) TRYPTOSE PSOSPHATE BROTH
I
(CLFCO)
1 2950,OO [
1
I
rntikap =fF
-9
Quantité de NaHCOJlitre
mM
ml
9 ’
Réf. cat.
Réf. cat.
M i l i e u x *
i 6-883
1 O-001
%!I~,I debase de Eagle !msdiliel avec sels de Earie
20 ou 10
220u 11
1.68 ou 0.85
1 O-031
hl~~~~~~.clrzfi)~se dn Eagle (modlllél. &ec Sels de HankS
4..
-5
0.35
1 o-941
'vl~heu debase de Eagle peur cellules diploides
2c
22
1.68
10-101
Ml:,eu ess~~n~~~l minimum de Eagle (modiliel sels de Earfe
24 :,a 10
270~ I?
2 00 OU 0.85
10-131
M~I,~U es&ntiet mrnrmum de Eagle (modifié) sels de Hanks
4
5
0.35
10-171
Mtl~?u essenliel mrnrmum de Eagle pour cuiIures en SusPenSIor
24
27
2.00
1 O-201
Milieu 199
26 5
29
2.20
JO-231
blli#eil 199
4
5
0.35
1 O-250
,ac~alt)umlne de Earle
26 5
29
2.20
1 O-260
idclahIl~lrle de Hanks
4
5
0.35
)( 10-301
V,IW; dsfagle modif~car~on de Glasgow
-
33
37
2.75
10-311
\\d,l+eu de Eagle modlficarion Alpha
24
27
-
200
1 o-323
\\I,;,~z;I essenllet minimum de Eagle modlfrcatlon de Joklik
-
-
1 o-33 1
l\\,l~e~ d.e Eagle modifical~on de Dtilbecco
44 j
49
3.70
10-411
\\.II!,I:u Harn F 10
14.5
15
1.20
10-431
\\lar,eu %im Fl 2
1C
16
1.18
10-521
blt!~t::; deWaymourh MG752!1
27
30
2.24
1 o-551
\\1tl1~,1 :VI;C~~ 5A mod~f~car:or de iwakata ei Grace
26.5
29
2.2C
1 O-601
‘It:!%l &ll 1640
24
27
2.00
10-661
\\lr!Te!, ,C:VRL 1066
2ô.E
29
2.25
1 O-821
11 t!teti F&3~C.'
13.5
1x.I
1.12
1 o-91 1
\\l,!leiA NClC i 35
26.5
29
2.20
‘5,.
POUR LA COLORATION RAPIDE DES FibiT-IS
.
Le coffret RAL 555 permet, par une methode
rapide, la coloration diffkentielle des cellules.
II est composé de 3 solutions :
0 solution I
125 ml mdthanol, à renouveler reguliérement dans
les pays à degré hygrometrique eleve
0 solution II
125 ml solution aqueuse éosine RAL, STABLE 1 an a
temperature ambiante
,
l solution III
125 ml solution aqueuse, bleu de methylène RAL,
.
STABLE 6 mois B tempkrature ambiante en stock,
:.
.
2 mois à partir de’I’uti1isatiot-t.
FORMULE SANGUINE
Plonger le frottis
Plonger le frottis
.Plonger l e f r o t t i s
5 fois 1 seconde
5 fois 1 seconde
5 fois 1 seconde
dans la solution I
dans la solution II
dans la solution III
dgoutter l’excédent sur
bien égoutter I’excedent,
laver rapidement
papier filtre.
ne pas laver.
2 l’eau deminéralisée.
b?nterprétation est identique 3 celle des colorations classiques.
PALUDISME - PIROPLASMOSE
Ptonger le frottis
Plonger le frottis
Plonger le frottis
7 minute
-
2 fois 7 seconde
2 fois 1 seconde
dans la solution I
dans la solution Il
dans la solution Ill
rincer a l’eau *..
rincer rapidement B
laver a l’eau courante.
l’eau
FILARIOSE
Plonger le frottis
Plongèi le frottis
P l o n g e r l e f r o t t i s ’
10 fois 1 seconde
10 fois 7 seconde
10 A 20 fois 1 seconde
dans la solution I
dans la solution II
dans’ la’solution. Ill
egoutter l’excédent sur
bien egoutter l’excédent.
laver a l’eau courante.
papier filtre.
ne pas laver.
< TRKHOMONASE
Plonger le frottis
Plonger le frottis
Plonger le frottis
15 secondes
1 minute
1 minute
dans la solution 1.
dans la solution II
dans la solution III
essorer sur papier filtre.
laver a l’eau déminéralisee.
’ :$
S&5ét& Chimique POINTET-GIRARD, Département Réactifs .+
35, Avenue Jean - Jaurés 92390 VILLENEUVE - LA - GARENNE
Té[. 7 9 8 . 1 7 . 1 7 .- T é l e x 6 1 0 7 1 9 P G C H I M I