INSTITUT D’ELEVAGE ET DE MED VETERINAIRE DES PAYS B...
INSTITUT D’ELEVAGE ET DE MED
VETERINAIRE DES PAYS
B
REVUE D’ÉLE+AGE
1,!. i .
ET DE
MÉDECINE VÉTÉ INAIRE
R
DES PAYS TROPIfZAUX
Culture « in vitro »
de cellules hépatiques fœtales de r
par M. RIOCHE
(avec la collaboration de M. S. DTALL b )
*
Tome XXV (nouvelle série)
No 3 - 1972
I
1r: *
VIGOT FRERES, EDITEUF‘S
23, rue de I’Ecole-de-Médecine,
Paris-VI’
Rev. Elev. Méd. vét. Pays trop., 1972, 25 (3) : 367-374
Culture
de cellules hépatiques
de ruminants
par M. RIOCHE (*
(avec la collaboration de M. S.
TALLO)
RESUME
L’auteur décrit les méthodes utilisées pour la culture Nz vitro des
cellules hénatisues fœtales de ruminants (bovin, mouton, chèvre) et les
résultats obtenûs. Les commentaires portent prin ipalement sur 1; carac-
térisation des hépatocytes en culture. L’étude
e la sensibilité de ces
cellules à divers virus est en cours.
t
L’intérêt que peut présenter la culture de
e de 37O C en flacons ou tubes
cellules hépatiques n’est plus à souligner en
ermétiquement bouchés.
raison des nombreux travaux qui s’y rapportent,
Les fo.es utilisés sont récoltés stérilement
en particulier dans les domaines de la biologie
sur des fœtus de ruminants provenant de
cellulaire de la virologie et de la cancérologie
l’abattoir. Lorsque la mise en culture ne peut
expérimentale,
être imm diate, le foie est conservé en boîte
Cependant, la plupart des études publiées
de Pétri jusqu’à 24 heures à + 40 C soit
jusqu’à présent concernent les cultures de foie
entier, SO t broyé.
de poulet ou de rongeurs et peu de recherches
sont consacrées aux grands mammifères. Chez
les ruminants en particulier, les seuls travaux
que nous connaissons sont ceux de PIEK et
ilieux ont été testés :
KUYPER (12) relatifs à l’établissement d’une
supplémenté par 10 p.
lignée épithéliale de foie de veau et de
sérum de veau.
KUYPER et collab. (8) traitant de la biologie
de Hanks selon FRANKLIN et
de cette lignée.
enté par 10 p. 100 de
Ayant la possibilité de disposer facilement
d’embryons, nous nous sommes proposé de
1 .
mettre au point une technique de culture de
cellules hépatiques fœtales de ruminants et d’en
ltures sont faites soit à partir
étudier divers aspects.
à partir de cellules dispersées
*
ine. Selon que l’on désire ou non
ultures en masse, on utilise le foie
1. MATERIEL ET METHODE
de la région du hile ou seulement
un petit ragment prélevé sur le bord d’un
II s’agit de cultures statiques effectuées à la
lobe.
t
1.
(*) Laboratoire national de l’Elevage, B.P. no 2057,
Dakar-Hann, Sénégal.
ent de foie est broyé stérilement
- 367 -
/'
/
au bistouri puis passé à travers un tamis
tampon versène : 4 parties). Le flacon est placé
métallique à mailles de 1 mm. Les explants
à 37” C jusqu’au décollement du tapis. Les
obtenus sont ensuite lavés 2 fois en Hanks
cellules sont dispersées dans un peu de milieu
Balanced Salt Solution (HBSS) puis 1 fois dans
par pipetages successifs, elles sont ensuite mises
le milieu de culture, Le milieu est alors décanté
en suspension dans une quantité de milieu
et les explants sont placés dans le flacon de
double de celIe du flacon dont dles provien-
culture à raison d’une cinquantaine par flacon
nent, réparties dans deux nouveaux flacons
de 60 ml et d’une dizaine par tube à lamelle.
puis mises a l’étuve. Lors des subcultures sui-
On ajoute ensuite le milieu de culture en
vantes, si le taux de multiplication cellulaire
quantité juste suffisante pour recouvrir les
est suffisant, les suspensions sont faites à raison
explants. Les flacons sont alors mis à l’étuve
de 50.000 à 100.000 cellules par ml de milieu.
et examinés chaque jour. Le milieu n’est changé
que lorsque les cellules commencent à se
D. Recherche du glycogène
multiplier. Il est ensuite changé une ou deux
Il est mis en évidence dans le cytoplasme
fois par semaine.
par la coloration au PAS (une Iame témoin
2. Culture de cellules dispersées
négatif est colorée de la même façon après
Le prélèvement est traité comme ci-dessus,
traitement durant 3 heure à 370 C par une
mais les explants sont lavés 3 fois en HBSS
solution à 1 p. 1000 d’amylase).
puis placés dans une solution de trypsine à
3 p. 1000 en HBSS. La dispersion se fait sous
E. Etude du caryotype
agitateur magnétique pendant un quart d’heure
Des cultures de 3 à 4 jours sur lamelle sont
à la température ambiante puis, après renou-
traitées pendant 6 à 12 heures par la colchicine
vellement de la solution de trypsine, à + 40 C
(1 microgramme par ml de milieu). Le milieu
jusqu’à dispersion totale des cellules. La sus-
est ensuite rejeté et les métaphases sont disper-
pension est alors passée à travers une gaze
sées par l’eau distillée à 370 C pendant 7 mn.
stérile puis centrifugée pendant 5 mn à
Puis l’eau est aspirée au papier filtre. Les lames
1.500 t/mn. Le surnageant est rejeté. Le culot
sont séchées à l’étuve et fixées 3 mn à l’alcool
cellulaire est mis en suspension dans le milieu
méthylique. Après rinçage, le cytoplasme est
de culture à raison d’environ 100 ml de milieu
hydrolysé par l’acide chlorhydrique normal
par cm3 de cellules. Après répartition de cette
pendant 7 mn à 600 C. Après rinçage dans une
suspension les flacons sont mis à l’étuve à
solution tamponnée, les lamelles sont colorées
37” c.
au Giemsa lent ou au bleu de Unna et montées
C . SubcuItures
à I’Entellan (Merck). L’analyse chromosomique
se fait sur clichés photographiques.
Lorsque les cellules se sont développées en
une couche monocellulaire continue, le milieu
de culture est rejeté et le tapis cellulaire est
II. RESULTATS
lavé trois fois avec une solution de trypsine-
versène (trypsine à 2,5 p. 1000 : 1 partie;
A. R&ultats généraux
TABLEAU No 1
++ - 3 foieo de bovins et 2 foies de moutons ont ét6 cultivés selon chacune des deux méthodes.
- 368 --
B. Aspect et évolution des cultures
oblastique, se développant co,mme
tes parallèlement à certains axes
1. Cultures primaires
mais en différant par leur forme
Quelle que soit l’espèce dont proviennent
et leur noyau peu allongé, soit
les cellules, les aspects morphologiques et
on mixte formée de travées de
cinétiques des cultures sont les mêmes.
ect fibroblastique enserrant des
a) Cultures d’explants
ins vastes de cellules épithéliales
gonal, à cytoplasme plus ou
Toutes les cultures sont faites en milieu de
eux et dont le noyau rond ou
Earle. L’adhérence des explants au support
t 1 à 3 nucléoles.
est assez longue à s’établir. Le démarrage de
la culture n’intervient qu’entre le 7” et le
éliaux peuvent contenir deux
20” jour. II est signalé par l’apparition de
quelques fibroblastes et macrophages prove-
nant de cellules isolées ou migrant à partir
premier type : cellules à contour
des explants. Environ 48 heures plus tard
cytoplasme assez granuleux, sur-
commence la migration de cellules épithéliales
u noyau qui est rond ou ovalaire
eux, parfois trois nucléoles
à partir des explants. Celle-ci peut revêtir deux
ille régulière. Les cellules
aspects :
- formation d’une membrane monocellulaire
constituée de cellules étroitement juxtapo-
sées, légèrement fusiformes devenant net-
le cytoplasme est nettement
tement polygonales au fur et à mesure que
x et de ce fait la cellule paraît
la membrane s’agrandit;
squ’on l’examine à l’état vivant.
- migration de cellules isolées, adhérant for-
aire est plus fréquemment observé
tement au support mais ne s’étalant pas.
ent et on trouve aussi un certain
Ces cellules qui peuvent migrer assez loin
de I’explant finissent par s’étaler et forment
Earle à 10 p. 100 de sérum de
en se multipliant une membrane monocel-
ppent des cellules épithéliales
lulaire semblable à celle déjà décrite. Cet
u II, en nombre moindre, des
aspect s’observe le plus souvent dans les
blastiques qui disparaissent pro-
cultures de foie de mouton.
après 3 à 4 subcultures.
Quel que soit le type de migration observée,
les membranes de cellules épithéliales devien-
soit le milieu utilisé, la couche
nent confluentes vers la 5” semaine et il est
est complète entre le 10” et
alors possible d’effectuer la première subcul-
le 1”’ transfert peut être alors
ture.
b) Cultures de cellules dispersées
de cultures d’explants ou de
Le démarrage de la culture, plus précoce
es, on observe toujours quel-
que lorsqu’il s’agit d’explants, intervient entre
(( géantes )) de type épithélial
le 5’ et le 10” jour. Il se signale aussi par
à 4 fois la taille d’une cellule
l’apparition de fibroblastes et de macrophages
os noyau dont le ou les nucléoles
qui se multiplient plus ou moins, alors que
les cellules hépatiques adhèrent fortement au
de cellules u dégénérées N.
support sans se multiplier. Puis ces dernières
s’étalent progressivement et se multiplient pour
es et évolution des lignées
former des îlots de cellules étroitement juxta-
posées. Ces îlots deviennent rapidement con-
fluents et sont formés de cellules dont la
morphologie varie en fonction du milieu utilisé.
En milieu de Hanks LA-YE on observe,
orphologiques déjà décrits, tandis
soit une population homogène de cellules
que fibro lastes et macrophages semblent
t
- 369 -
t
disparaître des cultures. Les repiquages sui-
une solution tamponnée contenant 1 p. 1.000
vants sont faits tous les 7 à 15 jours.
de trypsine, 1 p. 1.000 de collagénase et
1 p. 100 de sérum de poulet qui protège les
Après cette phase de culture exponentielle
hépatccytes contre l’action de ces enzymes.
qui peut durer 2 à 3 mois (4 à 6 passages) les
cultures entrent en phase de dégénérescence.
Qu’il s’agisse d’explants ou de cellules dis-
Le cytoplasme devient granuleux, de nombreux
persées, la culture ne présente plus de difficultés
débris cytoplasmiques apparaissent, les cellules
lorsque la multiplication cellulaire a débuté
(( gonflent 1) et les mitoses se raréfient avant de
et le cycle biologique des lignées obtenues
disparaître; puis la culture meurt.
comprend les trois phases décrites par HAY-
FLICK et MOORHEAD (4) :
Cependant, à partir d’une de ces cultures,
- Phase 1
: culture primaire.
s’est développée une lignée comptant actuel-
lement 71 passages et 2 ans de vie (lignde HFB-
- Phase 11 : croissance exponentielle.
RIOCHE) (13).
- Phase III : dégénérescence et mort.
3. Caractérisation des cellules
Comme le montre la plupart des travaux qui
Bien que la morphologie des cellules épi-
concernent la culture des cellules hépatiques
théliales n’évoque pas toujours l’hépatocyte, la
fœtales, celles-ci ne nécessitent pas pour se
présence de glycogène dans le cytoplasme per-
développer in vitro les conditions strictes d’aé-
met d’affirmer qu’il s’agit de cellules du
robiose indispensables à l’hépatocyte adulte.
parenchyme. Nous avons aussi noté la présence
Nos cultures se développent parfaitement à
de glycogène dans les cellules fibroblastoïdes.
l’état immergé et en flacons hermétiquement
clos dans lesquels le rapport volume de l’air
4. Chromosomes
des flacons sur volume de milieu est égal
L’étude des caryotypes n’a pas été faite
à 9/1 environ.
systématiquement mais plusieurs analyses ont
montré que les cellules restaient diploïdes. Seule
La disparition rapide des fibroblastes et
la lignée HFB possède un caryotyp-e anormal.
macrophages dans les cultures paraît due à la
présence d’hydrolysat de lactalbumine dans le
milieu. Cette substance semble favoriser en
COMMENTAIRES
effet le développement des hépatocytes en par-
ticulier (HILLIS et BANG, 5) et des cellules
La culture de cellules hépatiques de mouton
épithéliales en général (MICHL, 11).
est plus difficile que celle du foie de bovin.
Du fait de la disparition de ces cellules, nous
Trois lots différents de sérum de mouton, testés
ne nous sommes pas préoccupés de leur ori-
sur certaines cultures se sont révélés toxiques;
gine (( histologique )) qui est classiquement
c’est le sérum de veau qui donne le, meilleur
rapportée respectivement aux cellules du con-
résultat.
jonctif et aux cellules histiocytaires, encore que
Il est préférable d’instaurer les cultures
FREDERIC (3) ait démontré chez l’embryon
primaires à partir de suspensions de cellules
de poulet la transformation d’hépatocytes en
dispersées plutôt que d’explants. Avec ceux-ci,
macrophages. Le problème de la caractérisa-
en effet, la réussite de la culture est plus aléa-
tion des hépatocytes se pose surtout au sujet
toire et son démarrage est toujours retardé
des cellules épithéliales. En effet, divers auteurs,
par rapport à celui des cellules dispersées. Ceci
notamment SANDSTRoM (14) pensent que
est en accord avec les observations de
du fait de sa variabilité, la morphologie de ces
ZUCKERMAN et collab. (16) relatives aux
cellules ne peut constituer un critère sûr d’iden-
cultures d’hépatocytes fœtaux humains.
tification car celles-ci peuvent provenir du
parenchyme ou de l’endothélium sinusoïde.
L’action de la trypsine doit cependant être
ménagée car les hépatocytes semblent assez
Lorsqu’il est conservé l’aspect général de
sensibles à cette enzyme. Ceci nous a été
l’hépatocyte correspond aux cellules du premier
confirmé par KAIGHN (7) qui utilise dans les
type décrit. Cet aspect souvent observé chez
cultures d’hépatocytes humains ou de primates,
d’autres espèces animales est classiquement
- 370 -
considéré comme caractéristique de l’hépato-
premiers essais nous ont permis
cyte en culture. La présence de glycogène dans
r la sensibilité des hépatocytes
le cytoplasme de nos cellules de type 1 confirme
irus de la peste bovine (PB) et
d’ailleurs leur nature hépatocytaire. Nous avons
ilité au virus de la peste des petits
aussi noté la présence de glycogène dans les
PR). Si cette dernière se confirme
cellules de type II et les cellules fibroblastoïdes.
nouveaux essais, ces cultures pour-
Nous pensons qu’il s’agit aussi d’hépatocytes
er un système utile pour l’étude
dont les caractéristiques morphologiques ont
s dont les parentés antigéniques
été plus ou moins modifiées au cours de
l’adaptation à la vie in vitro.
A la lumière de travaux récents, la caracté-
risation de l’hépatocyte peut aussi être assurée
CONCLUSION
par la mise en évidence de certaines activités
de synthèse, spécifiques de ces cellules, telles
Malgré uelques échecs, la culture des hépa-
que la synthèse des a-fœtoprotéines spécifiques
tocytes fœ aux de ruminants ne présente pas
par I’hépatocyte fœtal (VAN FURTH et collab.,
de
“E
difficult s majeures et permet si on le désire,
15); (LURIA et collab., 10) ou de l’albumine
d’obtenir
ie:s cultures en masse.
par la cellule fœtale et adulte (LE GUILLY
f
et collab., 9); (LURIA et collab., 10); (HULL
L’ évolut n de ces cultures et l’aspect mor-
et collab., 6). Nous avons tenté de mettre en
1
phologique les divers types cellulaires observés
évidence la synthèse d’albumine uniquement
sont camp rables à ceux qui ont été décrits
pour l’identification des cellules de la lignée
chez d’auto ,s espèces animales.
HFB.
L’étude
e la sensibilité de ces cellules à
L’étude in vitro de la sensibilité des hépa-
divers virus nous renseignera sur leur utilisation
tocytes de ruminants à certains virus est en
éventuelle
n virologie.
Photo 1. - Culture primaire d’explants
(bovin). 81~ jour. Migration des cellules
sous forme de membrane
(May-Grünwald-Giemsa).
Objectif: 10 X; Oculaire : 5 X.
Photo 2. - Culture primaire d’explants
(mouton). 21~. jour. Migration de cellules
isolées dont certaines commencent à
s’étaler. Matériel vivant.
Objectif: 10 X; Oculaire: 5 X.
Photo 3. - Même culture que le n0 2.
23’. jour. Certaines cellules commencent
à former une « membrane ». Matériel
vivant.
Objet:tif : 10 X; Oculaire: 8 X.
!hot 4. - Culture de cellules hépatiques
œtales de mouton. lpr passage. 9e jour.
Cellules fibroblastoïdes.
(May-Grünwald-Giemsa).
Objectif: 10 X; Oculaire: 8 X.
Photo 5. - Culture de cellules hépatiques
fœtales de bovin. 2~ passage. l@ jour.
Ilot de cellules épithéliales de type II
entouré de cellules fibroblastoïdes.
(May-Grünwald-Giemsa).
Objectif: 25 X; Oculaire: 5 X.
Photo 6. - Culture de cellules hépatiques
fœtales de bovin. l<‘r passage. 4~ jour.
Ilot de cellules épithéliales de type 1.
(May-Grünwald-Giemsa).
Objectif : 25 X; Oculaire : 8 X.
SUMMARY
Zrz *aitro culture of foetal liver cells of ruminants
The author reports the methods used for the in vitro culture of rumi-
nants foetal liver cells (cattle, sheep and goat) and the results obtained.
Comments are made mainly on characterization of liver cells NI vitro
culture. Study of sensibility of these cells to various virus is in progress.
RESUMEN
Cultiva in vitro de células hepkticas fetales de rumiantes
El autor describe 10s métodos utilizados para el cultiva in vitro de
células hepaticas fetales de rumiantes (bovino, oveja, cabra) y 10s resul-
tados obtenidos. Comenta principalmente la caracterizacion de 10s hepa-
tocitos en cultiva. El estudio de la sensibilidad de dichas células para con
varios virus esta realizandose.
BIBLIOGRAPHIE
1 . EARLE (W. R.). J. nat. Cancer Inst., 1943, 4 :
primocultures de foie humain adulte. C.R. Acad.
165.
Sci., Paris, 1971, série D, 272: 973-976.
2. FRANKLIN (R. M.), RUBIN (H.) et DAVIS 10. LURIA (E. A.). BAKIROV (R. D.), YELISEYE-
(C. A.). The production, purification and proper-
VA (T. À.), ABELEV (G. 1.) èt FRIEDENSTEIN
ties of Newcastle disease virus labelled with radio-
(A. Y.). Differentiation of hepatic and hemato-
phosphorus. Virology, 1957, 3 : 96-114.
poietic cells, and synthesis of- blood serum pro-
3. FREDERIC (J.). La transformation histiocytaire
teins in organ culture of the liver. Exp. CeIl.
des cellules hépatiques cultivées in vitro et son
Res., 1969, 54: 111-117.
déterminisme. Rev. Hematol., 1951, 6: 423-447.
11
MICHL (J.). Metabolism of cells in tissue cul-
4. HAYFLICK (L.) et MOORHEAD (P. S.). The
ture irz
serial cultivation of human diploïd ce11 strains.
vifU0 : II. long term cultivation of ce11
strains and cells isolated directly from animals
Exp. Ml. Ru., 1961, 25: 585-621.
in a stationary culture.
5. HILLIS (W. D.) et BANG (F. B.). The cultivation
Exp. Celf Res., 1962, 26 :
129-135.
of human embryonic liver cells. Exp. Cell. Res.,
12
1962, 26 : 9-36.
PIEK (A. C. M.) et KUYPER (Ch. M. A.). Esta-
6. HULL (E. W.), CARBONE (P. P.), O’CARA
blishment of an epithelial ce11 ‘strain from calf
liver in continuous culture.
(R. W.), MOERTEL (Ch. G.), O’CONOR (G. T.)
Exnerientia. 1961. 17 :
et SMITH (C. F.). (National Cancer Institute,
115-l 16.
Bethesda; Maryland and Mayo Clinic, Rochester,
13. RIOCHE (M.). Etablissement et caractéristiques
Minnesota) Studies of a-fetoprotein (a-FP) in
d’une lignée cellulaire d’hépatocytes fœtaux de
primates. Communication au Centre international
bovin (lignée H.F.B.). (En préparation.)
de Recherches sur le cancer, , iuillet
_
1969. (Non
14. SANDSTROM (B.). Studies of cells from liver
publiée.)
tissue cultivated in vitro. Exp. Ce11 Res., 1965,
7. KAIGHN (E.). (The New-York Blood Cerner)
37 : 552-568.
Communication personnelle.
15. VAN FURTH (R.) et ADIMOLFI (M.). In vitro
8. KUYPER (Ch. M. A.), SMET (L. A.) et PIEK
synthesis of the foetal -globulin in man. Nature,
(A. C. M.). The life cycle of a strain of liver
1969. 222 : 1296-1299.
cells cultivated in vitro. Exn. Crll Ru.. 1962.
16. ZUCKERMANN
(A. J.), TSIQUAYE (K. N.) et
26 (1): 217-219.
FULTON (F.). Tissue culture of human embryo
9. LE GUILLY (Y.), LENOIR (P.) et BOUREL
liver cells and the cytotoxicity of aflatoxin. B1.
(M.). Synthèse de protéines exportables par les
Brit. J. exp. Path., 1967, 48: 20.
.
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ET DE
MÉDECINE VÉTÉ INAIRE
R
DES PAYS TROPIfZAUX
Culture « in vitro »
de cellules hépatiques fœtales de r
par M. RIOCHE
(avec la collaboration de M. S. DTALL b )
*
Tome XXV (nouvelle série)
No 3 - 1972
I
1r: *
VIGOT FRERES, EDITEUF‘S
23, rue de I’Ecole-de-Médecine,
Paris-VI’
Rev. Elev. Méd. vét. Pays trop., 1972, 25 (3) : 367-374
Culture
de cellules hépatiques
de ruminants
par M. RIOCHE (*
(avec la collaboration de M. S.
TALLO)
RESUME
L’auteur décrit les méthodes utilisées pour la culture Nz vitro des
cellules hénatisues fœtales de ruminants (bovin, mouton, chèvre) et les
résultats obtenûs. Les commentaires portent prin ipalement sur 1; carac-
térisation des hépatocytes en culture. L’étude
e la sensibilité de ces
cellules à divers virus est en cours.
t
L’intérêt que peut présenter la culture de
e de 37O C en flacons ou tubes
cellules hépatiques n’est plus à souligner en
ermétiquement bouchés.
raison des nombreux travaux qui s’y rapportent,
Les fo.es utilisés sont récoltés stérilement
en particulier dans les domaines de la biologie
sur des fœtus de ruminants provenant de
cellulaire de la virologie et de la cancérologie
l’abattoir. Lorsque la mise en culture ne peut
expérimentale,
être imm diate, le foie est conservé en boîte
Cependant, la plupart des études publiées
de Pétri jusqu’à 24 heures à + 40 C soit
jusqu’à présent concernent les cultures de foie
entier, SO t broyé.
de poulet ou de rongeurs et peu de recherches
sont consacrées aux grands mammifères. Chez
les ruminants en particulier, les seuls travaux
que nous connaissons sont ceux de PIEK et
ilieux ont été testés :
KUYPER (12) relatifs à l’établissement d’une
supplémenté par 10 p.
lignée épithéliale de foie de veau et de
sérum de veau.
KUYPER et collab. (8) traitant de la biologie
de Hanks selon FRANKLIN et
de cette lignée.
enté par 10 p. 100 de
Ayant la possibilité de disposer facilement
d’embryons, nous nous sommes proposé de
1 .
mettre au point une technique de culture de
cellules hépatiques fœtales de ruminants et d’en
ltures sont faites soit à partir
étudier divers aspects.
à partir de cellules dispersées
*
ine. Selon que l’on désire ou non
ultures en masse, on utilise le foie
1. MATERIEL ET METHODE
de la région du hile ou seulement
un petit ragment prélevé sur le bord d’un
II s’agit de cultures statiques effectuées à la
lobe.
t
1.
(*) Laboratoire national de l’Elevage, B.P. no 2057,
Dakar-Hann, Sénégal.
ent de foie est broyé stérilement
- 367 -
/'
/
au bistouri puis passé à travers un tamis
tampon versène : 4 parties). Le flacon est placé
métallique à mailles de 1 mm. Les explants
à 37” C jusqu’au décollement du tapis. Les
obtenus sont ensuite lavés 2 fois en Hanks
cellules sont dispersées dans un peu de milieu
Balanced Salt Solution (HBSS) puis 1 fois dans
par pipetages successifs, elles sont ensuite mises
le milieu de culture, Le milieu est alors décanté
en suspension dans une quantité de milieu
et les explants sont placés dans le flacon de
double de celIe du flacon dont dles provien-
culture à raison d’une cinquantaine par flacon
nent, réparties dans deux nouveaux flacons
de 60 ml et d’une dizaine par tube à lamelle.
puis mises a l’étuve. Lors des subcultures sui-
On ajoute ensuite le milieu de culture en
vantes, si le taux de multiplication cellulaire
quantité juste suffisante pour recouvrir les
est suffisant, les suspensions sont faites à raison
explants. Les flacons sont alors mis à l’étuve
de 50.000 à 100.000 cellules par ml de milieu.
et examinés chaque jour. Le milieu n’est changé
que lorsque les cellules commencent à se
D. Recherche du glycogène
multiplier. Il est ensuite changé une ou deux
Il est mis en évidence dans le cytoplasme
fois par semaine.
par la coloration au PAS (une Iame témoin
2. Culture de cellules dispersées
négatif est colorée de la même façon après
Le prélèvement est traité comme ci-dessus,
traitement durant 3 heure à 370 C par une
mais les explants sont lavés 3 fois en HBSS
solution à 1 p. 1000 d’amylase).
puis placés dans une solution de trypsine à
3 p. 1000 en HBSS. La dispersion se fait sous
E. Etude du caryotype
agitateur magnétique pendant un quart d’heure
Des cultures de 3 à 4 jours sur lamelle sont
à la température ambiante puis, après renou-
traitées pendant 6 à 12 heures par la colchicine
vellement de la solution de trypsine, à + 40 C
(1 microgramme par ml de milieu). Le milieu
jusqu’à dispersion totale des cellules. La sus-
est ensuite rejeté et les métaphases sont disper-
pension est alors passée à travers une gaze
sées par l’eau distillée à 370 C pendant 7 mn.
stérile puis centrifugée pendant 5 mn à
Puis l’eau est aspirée au papier filtre. Les lames
1.500 t/mn. Le surnageant est rejeté. Le culot
sont séchées à l’étuve et fixées 3 mn à l’alcool
cellulaire est mis en suspension dans le milieu
méthylique. Après rinçage, le cytoplasme est
de culture à raison d’environ 100 ml de milieu
hydrolysé par l’acide chlorhydrique normal
par cm3 de cellules. Après répartition de cette
pendant 7 mn à 600 C. Après rinçage dans une
suspension les flacons sont mis à l’étuve à
solution tamponnée, les lamelles sont colorées
37” c.
au Giemsa lent ou au bleu de Unna et montées
C . SubcuItures
à I’Entellan (Merck). L’analyse chromosomique
se fait sur clichés photographiques.
Lorsque les cellules se sont développées en
une couche monocellulaire continue, le milieu
de culture est rejeté et le tapis cellulaire est
II. RESULTATS
lavé trois fois avec une solution de trypsine-
versène (trypsine à 2,5 p. 1000 : 1 partie;
A. R&ultats généraux
TABLEAU No 1
++ - 3 foieo de bovins et 2 foies de moutons ont ét6 cultivés selon chacune des deux méthodes.
- 368 --
B. Aspect et évolution des cultures
oblastique, se développant co,mme
tes parallèlement à certains axes
1. Cultures primaires
mais en différant par leur forme
Quelle que soit l’espèce dont proviennent
et leur noyau peu allongé, soit
les cellules, les aspects morphologiques et
on mixte formée de travées de
cinétiques des cultures sont les mêmes.
ect fibroblastique enserrant des
a) Cultures d’explants
ins vastes de cellules épithéliales
gonal, à cytoplasme plus ou
Toutes les cultures sont faites en milieu de
eux et dont le noyau rond ou
Earle. L’adhérence des explants au support
t 1 à 3 nucléoles.
est assez longue à s’établir. Le démarrage de
la culture n’intervient qu’entre le 7” et le
éliaux peuvent contenir deux
20” jour. II est signalé par l’apparition de
quelques fibroblastes et macrophages prove-
nant de cellules isolées ou migrant à partir
premier type : cellules à contour
des explants. Environ 48 heures plus tard
cytoplasme assez granuleux, sur-
commence la migration de cellules épithéliales
u noyau qui est rond ou ovalaire
eux, parfois trois nucléoles
à partir des explants. Celle-ci peut revêtir deux
ille régulière. Les cellules
aspects :
- formation d’une membrane monocellulaire
constituée de cellules étroitement juxtapo-
sées, légèrement fusiformes devenant net-
le cytoplasme est nettement
tement polygonales au fur et à mesure que
x et de ce fait la cellule paraît
la membrane s’agrandit;
squ’on l’examine à l’état vivant.
- migration de cellules isolées, adhérant for-
aire est plus fréquemment observé
tement au support mais ne s’étalant pas.
ent et on trouve aussi un certain
Ces cellules qui peuvent migrer assez loin
de I’explant finissent par s’étaler et forment
Earle à 10 p. 100 de sérum de
en se multipliant une membrane monocel-
ppent des cellules épithéliales
lulaire semblable à celle déjà décrite. Cet
u II, en nombre moindre, des
aspect s’observe le plus souvent dans les
blastiques qui disparaissent pro-
cultures de foie de mouton.
après 3 à 4 subcultures.
Quel que soit le type de migration observée,
les membranes de cellules épithéliales devien-
soit le milieu utilisé, la couche
nent confluentes vers la 5” semaine et il est
est complète entre le 10” et
alors possible d’effectuer la première subcul-
le 1”’ transfert peut être alors
ture.
b) Cultures de cellules dispersées
de cultures d’explants ou de
Le démarrage de la culture, plus précoce
es, on observe toujours quel-
que lorsqu’il s’agit d’explants, intervient entre
(( géantes )) de type épithélial
le 5’ et le 10” jour. Il se signale aussi par
à 4 fois la taille d’une cellule
l’apparition de fibroblastes et de macrophages
os noyau dont le ou les nucléoles
qui se multiplient plus ou moins, alors que
les cellules hépatiques adhèrent fortement au
de cellules u dégénérées N.
support sans se multiplier. Puis ces dernières
s’étalent progressivement et se multiplient pour
es et évolution des lignées
former des îlots de cellules étroitement juxta-
posées. Ces îlots deviennent rapidement con-
fluents et sont formés de cellules dont la
morphologie varie en fonction du milieu utilisé.
En milieu de Hanks LA-YE on observe,
orphologiques déjà décrits, tandis
soit une population homogène de cellules
que fibro lastes et macrophages semblent
t
- 369 -
t
disparaître des cultures. Les repiquages sui-
une solution tamponnée contenant 1 p. 1.000
vants sont faits tous les 7 à 15 jours.
de trypsine, 1 p. 1.000 de collagénase et
1 p. 100 de sérum de poulet qui protège les
Après cette phase de culture exponentielle
hépatccytes contre l’action de ces enzymes.
qui peut durer 2 à 3 mois (4 à 6 passages) les
cultures entrent en phase de dégénérescence.
Qu’il s’agisse d’explants ou de cellules dis-
Le cytoplasme devient granuleux, de nombreux
persées, la culture ne présente plus de difficultés
débris cytoplasmiques apparaissent, les cellules
lorsque la multiplication cellulaire a débuté
(( gonflent 1) et les mitoses se raréfient avant de
et le cycle biologique des lignées obtenues
disparaître; puis la culture meurt.
comprend les trois phases décrites par HAY-
FLICK et MOORHEAD (4) :
Cependant, à partir d’une de ces cultures,
- Phase 1
: culture primaire.
s’est développée une lignée comptant actuel-
lement 71 passages et 2 ans de vie (lignde HFB-
- Phase 11 : croissance exponentielle.
RIOCHE) (13).
- Phase III : dégénérescence et mort.
3. Caractérisation des cellules
Comme le montre la plupart des travaux qui
Bien que la morphologie des cellules épi-
concernent la culture des cellules hépatiques
théliales n’évoque pas toujours l’hépatocyte, la
fœtales, celles-ci ne nécessitent pas pour se
présence de glycogène dans le cytoplasme per-
développer in vitro les conditions strictes d’aé-
met d’affirmer qu’il s’agit de cellules du
robiose indispensables à l’hépatocyte adulte.
parenchyme. Nous avons aussi noté la présence
Nos cultures se développent parfaitement à
de glycogène dans les cellules fibroblastoïdes.
l’état immergé et en flacons hermétiquement
clos dans lesquels le rapport volume de l’air
4. Chromosomes
des flacons sur volume de milieu est égal
L’étude des caryotypes n’a pas été faite
à 9/1 environ.
systématiquement mais plusieurs analyses ont
montré que les cellules restaient diploïdes. Seule
La disparition rapide des fibroblastes et
la lignée HFB possède un caryotyp-e anormal.
macrophages dans les cultures paraît due à la
présence d’hydrolysat de lactalbumine dans le
milieu. Cette substance semble favoriser en
COMMENTAIRES
effet le développement des hépatocytes en par-
ticulier (HILLIS et BANG, 5) et des cellules
La culture de cellules hépatiques de mouton
épithéliales en général (MICHL, 11).
est plus difficile que celle du foie de bovin.
Du fait de la disparition de ces cellules, nous
Trois lots différents de sérum de mouton, testés
ne nous sommes pas préoccupés de leur ori-
sur certaines cultures se sont révélés toxiques;
gine (( histologique )) qui est classiquement
c’est le sérum de veau qui donne le, meilleur
rapportée respectivement aux cellules du con-
résultat.
jonctif et aux cellules histiocytaires, encore que
Il est préférable d’instaurer les cultures
FREDERIC (3) ait démontré chez l’embryon
primaires à partir de suspensions de cellules
de poulet la transformation d’hépatocytes en
dispersées plutôt que d’explants. Avec ceux-ci,
macrophages. Le problème de la caractérisa-
en effet, la réussite de la culture est plus aléa-
tion des hépatocytes se pose surtout au sujet
toire et son démarrage est toujours retardé
des cellules épithéliales. En effet, divers auteurs,
par rapport à celui des cellules dispersées. Ceci
notamment SANDSTRoM (14) pensent que
est en accord avec les observations de
du fait de sa variabilité, la morphologie de ces
ZUCKERMAN et collab. (16) relatives aux
cellules ne peut constituer un critère sûr d’iden-
cultures d’hépatocytes fœtaux humains.
tification car celles-ci peuvent provenir du
parenchyme ou de l’endothélium sinusoïde.
L’action de la trypsine doit cependant être
ménagée car les hépatocytes semblent assez
Lorsqu’il est conservé l’aspect général de
sensibles à cette enzyme. Ceci nous a été
l’hépatocyte correspond aux cellules du premier
confirmé par KAIGHN (7) qui utilise dans les
type décrit. Cet aspect souvent observé chez
cultures d’hépatocytes humains ou de primates,
d’autres espèces animales est classiquement
- 370 -
considéré comme caractéristique de l’hépato-
premiers essais nous ont permis
cyte en culture. La présence de glycogène dans
r la sensibilité des hépatocytes
le cytoplasme de nos cellules de type 1 confirme
irus de la peste bovine (PB) et
d’ailleurs leur nature hépatocytaire. Nous avons
ilité au virus de la peste des petits
aussi noté la présence de glycogène dans les
PR). Si cette dernière se confirme
cellules de type II et les cellules fibroblastoïdes.
nouveaux essais, ces cultures pour-
Nous pensons qu’il s’agit aussi d’hépatocytes
er un système utile pour l’étude
dont les caractéristiques morphologiques ont
s dont les parentés antigéniques
été plus ou moins modifiées au cours de
l’adaptation à la vie in vitro.
A la lumière de travaux récents, la caracté-
risation de l’hépatocyte peut aussi être assurée
CONCLUSION
par la mise en évidence de certaines activités
de synthèse, spécifiques de ces cellules, telles
Malgré uelques échecs, la culture des hépa-
que la synthèse des a-fœtoprotéines spécifiques
tocytes fœ aux de ruminants ne présente pas
par I’hépatocyte fœtal (VAN FURTH et collab.,
de
“E
difficult s majeures et permet si on le désire,
15); (LURIA et collab., 10) ou de l’albumine
d’obtenir
ie:s cultures en masse.
par la cellule fœtale et adulte (LE GUILLY
f
et collab., 9); (LURIA et collab., 10); (HULL
L’ évolut n de ces cultures et l’aspect mor-
et collab., 6). Nous avons tenté de mettre en
1
phologique les divers types cellulaires observés
évidence la synthèse d’albumine uniquement
sont camp rables à ceux qui ont été décrits
pour l’identification des cellules de la lignée
chez d’auto ,s espèces animales.
HFB.
L’étude
e la sensibilité de ces cellules à
L’étude in vitro de la sensibilité des hépa-
divers virus nous renseignera sur leur utilisation
tocytes de ruminants à certains virus est en
éventuelle
n virologie.
Photo 1. - Culture primaire d’explants
(bovin). 81~ jour. Migration des cellules
sous forme de membrane
(May-Grünwald-Giemsa).
Objectif: 10 X; Oculaire : 5 X.
Photo 2. - Culture primaire d’explants
(mouton). 21~. jour. Migration de cellules
isolées dont certaines commencent à
s’étaler. Matériel vivant.
Objectif: 10 X; Oculaire: 5 X.
Photo 3. - Même culture que le n0 2.
23’. jour. Certaines cellules commencent
à former une « membrane ». Matériel
vivant.
Objet:tif : 10 X; Oculaire: 8 X.
!hot 4. - Culture de cellules hépatiques
œtales de mouton. lpr passage. 9e jour.
Cellules fibroblastoïdes.
(May-Grünwald-Giemsa).
Objectif: 10 X; Oculaire: 8 X.
Photo 5. - Culture de cellules hépatiques
fœtales de bovin. 2~ passage. l@ jour.
Ilot de cellules épithéliales de type II
entouré de cellules fibroblastoïdes.
(May-Grünwald-Giemsa).
Objectif: 25 X; Oculaire: 5 X.
Photo 6. - Culture de cellules hépatiques
fœtales de bovin. l<‘r passage. 4~ jour.
Ilot de cellules épithéliales de type 1.
(May-Grünwald-Giemsa).
Objectif : 25 X; Oculaire : 8 X.
SUMMARY
Zrz *aitro culture of foetal liver cells of ruminants
The author reports the methods used for the in vitro culture of rumi-
nants foetal liver cells (cattle, sheep and goat) and the results obtained.
Comments are made mainly on characterization of liver cells NI vitro
culture. Study of sensibility of these cells to various virus is in progress.
RESUMEN
Cultiva in vitro de células hepkticas fetales de rumiantes
El autor describe 10s métodos utilizados para el cultiva in vitro de
células hepaticas fetales de rumiantes (bovino, oveja, cabra) y 10s resul-
tados obtenidos. Comenta principalmente la caracterizacion de 10s hepa-
tocitos en cultiva. El estudio de la sensibilidad de dichas células para con
varios virus esta realizandose.
BIBLIOGRAPHIE
1 . EARLE (W. R.). J. nat. Cancer Inst., 1943, 4 :
primocultures de foie humain adulte. C.R. Acad.
165.
Sci., Paris, 1971, série D, 272: 973-976.
2. FRANKLIN (R. M.), RUBIN (H.) et DAVIS 10. LURIA (E. A.). BAKIROV (R. D.), YELISEYE-
(C. A.). The production, purification and proper-
VA (T. À.), ABELEV (G. 1.) èt FRIEDENSTEIN
ties of Newcastle disease virus labelled with radio-
(A. Y.). Differentiation of hepatic and hemato-
phosphorus. Virology, 1957, 3 : 96-114.
poietic cells, and synthesis of- blood serum pro-
3. FREDERIC (J.). La transformation histiocytaire
teins in organ culture of the liver. Exp. CeIl.
des cellules hépatiques cultivées in vitro et son
Res., 1969, 54: 111-117.
déterminisme. Rev. Hematol., 1951, 6: 423-447.
11
MICHL (J.). Metabolism of cells in tissue cul-
4. HAYFLICK (L.) et MOORHEAD (P. S.). The
ture irz
serial cultivation of human diploïd ce11 strains.
vifU0 : II. long term cultivation of ce11
strains and cells isolated directly from animals
Exp. Ml. Ru., 1961, 25: 585-621.
in a stationary culture.
5. HILLIS (W. D.) et BANG (F. B.). The cultivation
Exp. Celf Res., 1962, 26 :
129-135.
of human embryonic liver cells. Exp. Cell. Res.,
12
1962, 26 : 9-36.
PIEK (A. C. M.) et KUYPER (Ch. M. A.). Esta-
6. HULL (E. W.), CARBONE (P. P.), O’CARA
blishment of an epithelial ce11 ‘strain from calf
liver in continuous culture.
(R. W.), MOERTEL (Ch. G.), O’CONOR (G. T.)
Exnerientia. 1961. 17 :
et SMITH (C. F.). (National Cancer Institute,
115-l 16.
Bethesda; Maryland and Mayo Clinic, Rochester,
13. RIOCHE (M.). Etablissement et caractéristiques
Minnesota) Studies of a-fetoprotein (a-FP) in
d’une lignée cellulaire d’hépatocytes fœtaux de
primates. Communication au Centre international
bovin (lignée H.F.B.). (En préparation.)
de Recherches sur le cancer, , iuillet
_
1969. (Non
14. SANDSTROM (B.). Studies of cells from liver
publiée.)
tissue cultivated in vitro. Exp. Ce11 Res., 1965,
7. KAIGHN (E.). (The New-York Blood Cerner)
37 : 552-568.
Communication personnelle.
15. VAN FURTH (R.) et ADIMOLFI (M.). In vitro
8. KUYPER (Ch. M. A.), SMET (L. A.) et PIEK
synthesis of the foetal -globulin in man. Nature,
(A. C. M.). The life cycle of a strain of liver
1969. 222 : 1296-1299.
cells cultivated in vitro. Exn. Crll Ru.. 1962.
16. ZUCKERMANN
(A. J.), TSIQUAYE (K. N.) et
26 (1): 217-219.
FULTON (F.). Tissue culture of human embryo
9. LE GUILLY (Y.), LENOIR (P.) et BOUREL
liver cells and the cytotoxicity of aflatoxin. B1.
(M.). Synthèse de protéines exportables par les
Brit. J. exp. Path., 1967, 48: 20.
.
-.
.
i :
- 374 -