I IWUBLIQUE DTj SENEGiX DEPARTEMENT DE ...
I
IWUBLIQUE DTj SENEGiX
DEPARTEMENT DE RE?CHERCHES SUR LES
__---_m-----
PRODUCTIONS ET LA SANTE &3ltvULES
MINISTERE DE L’AGRICULTURE
---_____----
___-___--
LABORATOIRE NATIONAL DE L’ELEVAGE
INs~~‘I’I‘I3‘ SENEGAL.=VS DE RJXHERCHES
ET DE REXHERCHES
VETERINAIRES
.4GRJCOLES (I.S.R.A.)
B.P 2057, DAKAR-HANN
RAPPORT N”rta& PATHO. ANIM.
Janvier 1994
* : Assistant de Recherches, Laboratoire de Parasitologie.
lL\\PPol<‘r DK ST.4GE SUR IA l1wi:PARATION
El’ L’EVAI,liAï’IC)N DES ANTICORPS MONOCLONA us
EFFECTUE Afi C:IRAD-EMVT, MAISONS-ALFORT, FRANCE,
I)l! 1 cr )\\IJ 28 DECEMBRE 1773
Par Mamadou SEYE*
(Janvier 1994)
INTRODUCTION
Les techniques modernes d’analyse sérologique utilisent de plus en plus des anticorps
monoclonaux. Ces anticorps, plus que les polyclonaux, ofZient une haute spécificité et
permettent d’obtenir des résultats sérologiques plus précis et souvent plus fiables. Cependant,
de tels anticorps, outre qu’ils coûtent cher sur le marché, sont fi-agiles et requièrent des
conditions de transport appropriées pour garder leurs propriétés séro-immunologiques.
De
plus, il est toujours difficile de faire venir de l’extérieur les réactifs que l’on désire dans les
délais voulus. Le mieux est d’être en mesure de les préparer sur place, avec le double
avantage d’en avoir une connaissance précise et de pouvoir leur assurer une conservation
adéquate afin d’en disposer à tout moment. C’est à cette fin que nous avons effectué un stage
d’initiation aux techniques de production et d’évaluation des anticorps monoclonaux au
Laboratoire de “PATMOTROP” du Département Elevage et Médecine Vétérinaire Tropicale
du Centre de Coopération internationale en Recherche Agronomique pour le Développement
(CIRAD/EMVT) à Maisons-Alfort, du ler au 28 décembre 1993. Le stage a eu lieu à
l’initiative du Directeur des Recherches sur les Productions et la Santé animales de l’Institut
Sénégalais de Recherches Agricoles (ISRABRPSA), avec une allocation de stage attribuée
par le CIRAD.
L’objet de ce rapport est de rendre compte de ce stage. Dans un premier temps, un bref
rappel sera fait sur les caractéristiques immunobiologiques qui expliquent la spécificité des
anticorps monoclonaux et justifient leur mode de production; dans un deuxième temps, les
techniques que nous avons apprises au cours du stage seront résumées avant d’en tirer les
principales conclusions.
1. FONDEMENTS IMMUNOBIOLOGIQUES DE: LA PRODUCTION DES
ANTICORPS MONOCLONAUX
L’organisme d’un etre vivant immuno-compétent renferme toute une population de
cellules sécrétrices d’anticorps élaborés pour réagir avec des antigènes ou des épitopes
différents. C’est pourquoi, dans un sérum donné, les types d’anticorps circulants spécifiques
d’un même antigène sont extrêmement rares (de l’ordre de l/lO). De tels anticorps, dits
polyclonaux, offrent donc une spécificité souvent insufGsante et peuvent de ce fait donner des
résultats sérologiques difficiles à interpréter.
Par contre, les anticorps monoclonaux sont des immunoglobulines exclusivement
spécifiques d’un immunogène donné ou d’un épitope précis. Ils sont sécrétés à perpétuité par
une cellule unique (et ses descendants), laquelle cellule ayant été sélectionnée et entretenue
in \\)ifro en raison de cette aptitude particulière.
* : Assistant de Recherches, ISRA/DRpSA/LNERV, B.P. 2057, Dakar, Sénégal
Ces définitions tr& sommaires dissimulent cependant la complexit& des phénomcnes
immunobiologiques
qui entrent en jeu et les multiples manipulations requises, qu’il faut
maîtriser et intégrer dans un syst?me cohcrent pour obtenir les anticorps désirés. L’on sait en
efI& que la production des immunoglobulines
est du domaine de l’immunité de type
humorale, et qu’elle incombe aux lymphocytes de la lignée B. Ces cellules, générées à partir
de la moelle osseuse. sont présentes en grand nombre dans les organes lymphoïdes (rate et
ganglions lymphatiques chez les mammifères). Elles se mobilisent à la suite de l’introduction
répétée d’un immunogène dans l’organisme, avec cette importante particularité que chaque
cellule reconnaîtra et réagira avec un antigène et un seul. Malheureusement, ces lymphocytes
sont à durée de vie très limitée (3à 4 jours) après leur différentiation en plasmocytes
sécréteurs d’anticorps. De plus, on ne peut pas les cultiver seules in vitro. Il a fallu recourir à
des artifices biochimiques pour contourner ces difficultés. L’option ici est de fusionner ces
cellules sécrétrices avec des myélomes non sécréteurs mais pouvant être multipliés par
culture. La production des anticorps monoclonaux résulte finalement de la mise au point et
de la combinaison réussie de techniques performantes en vue des résultats ci-dessous:
- induction d’une immunité humorale de niveau satisfaisant chez des animaux de
laboratoire;
- identification de la nature de la réponse immunitaire;
- fusion des cellules sécrétrices d’anticorps avec des myélomes, puis culture cellulaire
in vitro assurant la survie des cellules fusionnées ainsi qu’une sécrétion pérenne;
- élimination des cellules non fusionnées;
- évaluation de la spécificité des anticorps produits;
- sélection et maintien en vie de cellules individuelles sécrétrices d’anticorps
spécifiques;
- purification éventuelle de ces anticorps;
- enfin, stockage adéquat des réactifs finaux ainsi obtenus.
Le paragraphe qui suit décrit les méthodes et techniques apprises à cette fin au cours
de ce stage.
II. PRODUCTION ET EVALUATION DES ANTICORPS MONOCLONAUX
Le principe de base de la production des anticorps monoclonaux se résume comme
suit: après sensibilisation d’un animal de laboratoire avec un antigène donné et s’être
assuré par criblage sérologique que l’animal a donné une réponse immunitaire à cette
sensibilisation, prélever la rate, libérer et recueillir les lymphocytes censés sécréter les
anticorps désirés. Fusionner ces cellules de rate avec des myélomes non sécréteurs.
Ainsi on obtient des hybrides capables de se multiplier in vitro (gène de multiplication
apporté par le myélome) tout en continuant leur sécretion (gène de sécrétion du lymphocyte
de souris immunisée). Les myélomes non fusionnés seront éliminés par un milieu de sélection
approprié. Après identification sérologique des hybrides sécréteurs d’anticorps
spécifiques de l’antigène de sensibilisation, effectuer un clonage permettant d’obtenir des
cellules individuelles. IA sécrétion de chaque clone est alors testée avant d’être
Èventuellement retenue et conservée comme anticorps monoclonal spécifique.
2.1- Immunisation d’animaux de laboratoire
11 s’agit de sensibiliser un animal immuno-compétent avec l’antigène contre lequel on
souhaite qu’il élabore des anticorps spécifiques. Ici s’opère un choix concernant l’espèce
animale à immuniser, selon des critères déterminés (immuno-compktence
bien connue, bonne
santé, etc.). A I’EMVT, des souris BALB/CBY .JICO élevées dans de bonnes conditions
sanitaires et hygiéniques sont utilisées pour ce type de travail et ont presque toujours donné
satisfaction. Le protocole d’immunisation appliquk est le suivant:
- Jour 0 : Injection intra-péritonéale (I.P.) de 0,3 ml d’une émulsion à parties
égales de l’antigène et d’adjuvant complet de Freund, l’antigène devant renfermer 40 à 50 pg
de protéines.
- Jour 0 + 30 : Irjection en sous-cutané (S.C.) de la même quantité de
protéines antigéniques mais contenue dans 0,2 ml d’une émulsion à parties égales de
l’antigène et d’adjuvant incomplet de Freund.
- Jour 0 + 60 : Injection intraveineuse (I.V.) de 0,l ml d’antigène renfermant
20 pg de protéines, mais sans adjuvant. A noter que la voie veineuse, bien que préférable,
n’est pas impérative: en cas de difficulté, injecter en I.P. En outre, cette injection de rappel
final est faite 3 à 5 jours avant l’étape suivante: la fusion. Enfii il est important de surveiller
de temps à autre la souris dans les heures qui suivent l’injection pour s’assurer qu’elle n’est
pas morte d’un choc anaphylactique.
2.2- Fusion
Comme indiqué plus haut, les cellules de rate sécrétrices d’anticorps ont une durée de
vie très limitée et elles ne peuvent pas être cultivées seules in vitro. Il est nécessaire de les
coupler avec d’autres cellules qui, elles, peuvent se :multiplier en culture, pour obtenir des
hybrides capables de se multiplier et de sécréter. Ce couplage est appelé fùsion. Les étapes de
la fusion sont indiquées ci-dessous.
2.2.1- Préparadon des myélomes partenaires de filsion
On utilise ici de cellules NS1 générées par des souris BALB/C à la suite
d’injection d’huiles minérales dans le péritoine. Ces cellules ont été reconnues non sécrétrices
et capables de fusionner avec des lymphocytes sécréteurs d’anticorps.
Quatre à cinq jours avant la fùsion, le tube de NS1 congelé dans l’azote liquide
en est sorti et décongelé rapidement dans un bain d’eau chauffée à 37*C environ. Reprendre
les cellules dans du milieu essentiel minimum (MEM) préparé la veille et additionné
d’tlzaguadine et de sérum de veau foetal (SVF). Centrifuger pour éliminer le DMSO qui
avait servi de milieu de conservation dans l’azote, puis transfker les cellules dans une petite
boîte de culture cellulaire. Ajouter quelques ml de milieu. Placer à l’étuve réglée à 37°C et
5% de C02. Contrôler tous les jours la multiplication des cellules, en effectuant plusieurs
repiquages.
La veille de la fksion, repiquer mais en utilisant du MEM additionné
d’Hypoxanthine-Thymidine (HT), de SVF et d’une solution antibiotique.
2.2.2- Préparalion des celiiiks deratedesor4risUnmunisée
La souris immunisée est sacrifiée et la rate prélevée stérilement et lavée 3 fois
dans des boîtes de Pétri contenant une petite quantité de MEM. A l’aide d’aiguilles à
injection stériles montées sur deux seringues, dilacérer la rate pour en libérer les cellules qui
sont ensuite déposées dans de la glace pilee pour la.isser sédimenter les grosses particules
tissulaires non désirées.
Après sédimentation, prélever la suspension de cellules de rate et la déposer
délicatement dans un tube à centrifùger conique, sur un coussin de 2 ml de SVF. Laver les
cellules à deux reprises par centrifugations successives, en reprenant à chaque fois le culot
dans du MEM.
Ces manipulations sont faites le jour même de la fusion; il est nécessaire de
travailler assez vite en raison de la fragilité des cellules de rate.
2.2.3- Réah&n de la fusion
Le produit chimique utilisé ici pour fusionner les NS1 avec les cellules de rate
est le Polyéthylène glycol 1500 (PEG) en solution à 50% dans de 1’Hépes.
- Sortir les boîtes de culture de myélomes, décoller à la pipette les cellules
adhérantes, transférer dans des tubes coniques et centrifuger. Reprendre le culot dans du
MEM sans SVF’; conserver ce premier surnageant. Laver à deux reprises les NS1 dans le
milieu MEM sans additif Le culot de la dernière centrifugation est repris dans le même
milieu MEM.
- Effectuer un comptage du nombre de NS1 contenues dans la préparation, en
utilisant une cellule de Malassez et en tenant compte du volume total de la suspension
cellulaire, ainsi que de la dilution éventuellement faite pour faciliter le comptage. Faire un
dtkompte identique pour les cellules de rate de la souris immunisée.
- Une fois les nombres de NS1 et de cellules de rate connus, calculer le volume
à prélever dans chaque suspension cellulaire pour que le nombre de cellules de rate soit 5 à 6
fois celui des NS 1. Mélanger les deux préparations en respectant ces proportions, centrifuger
la mixture, puis écarter soigneusement le surnageant en égouttant parfaitement.
- Homogénéiser le culot par petites secousses ou par glissement de l’extrémité
du tube sur une surface rugueuse, puis y déposer goutte à goutte, en 30 secondes, 0,5 ml de
solution de PEG. La durée totale du contact avec le PEG est de 2 minutes. Au bout de ce
temps, stopper la réaction avec du MEM additionné de 5% de SVF. Déposer le milieu goutte
à goutte, puis ml par ml, en agitant doucement. Compléter avec le même milieu pour obtenir
une quantité égale à celle du premier surnageant de NS 1. Ajouter ce surnageant après avoir
mis du SVF de manière à en obtenir une concentration finale de 20%. Enfin compléter avec
la solution antibiotique.
- Répartir dans des plaques de culture cellulaire à 96 cupules à fond plat, à
raison de 100 ~1 par cupule. Incuber à 37°C et 5% de CO2 jusqu’au soir ou au plus tard le
lendemain matin.
2.3. Sélection et culture des cellules fusionnées
1,~s manipulations pr&zédentss (2.2.3) permettent en principe d’obtenir la fusion des
NS 1 avec les cellules de rate de la souris immunisée. En réalité, il existe toujours un nombre
plus ou moins important des unes et des autres qui n’auront pas fusionné. Les cellules de rate,
OII l’a vu, ne peuvent pas vivre seules in vitro. Quant aux NS1 non fusionnés, ils n’offrent
plus d’intérêt et doivent Etre tYiminés. Un milieu spécial est nécessaire pour cela. Ce milieu
est à base de MEM à 20?+I de SVF? additionné de 2% de HT contenant cette fois de
1’Aminoptérine (HAT), de 1% d’Oxaloacétate Pyruvate Insuline (OPI), de 0,5 ng/ml
dkterleukine (IL6), sans oublier la solution antibiotique (1%).
Prélever en partie le surnageant des cupules des plaques incubées le matin ou la veille
et le remplacer par 200 ~1 par cupule du milieu spécial ci-dessus indiqué. Incuber à nouveau
dans les mêmes conditions, en changeant le milieu tous les quatre à cinq jours, en fonction de
l’aspect des cellules. Identifier au fur et à mesure,, par des numéros, les cupules où
apparaissent des hybrides et surveiller la croissance de ceux-ci.
2.4. Caractérisation des hybrides matures
Cette étape, réalisée lorsque l’évolution des colonies dans les cupules est jugée
suffisante (à partir d’une semaine après la fusion), consiste à identifier les hybrides qui
sécrètent des anticorps spécifiques de l’antigène de sensibilisation injecté à la souris.
Plusieurs techniques sérologiques sont disponibles à cette fin, et le choix dépendra des
performances respectives des systèmes d’analyse sérologique implantés au laboratoire.
Signalons pour mémoire qu’à I’EMVT nous avons effectué ce criblage par la technique
ELISA de détection des ‘anticorps sur micro plaques. Dans tous les cas, le test inclura un
anticorps monoclonal reconnu spécifique de l’antigène, ainsi qu’un témoin négatif, qui
permettront d’apprécier les réactions des surnagea& testés.
2.5. Clonage des hybrides sécréteurs.
Là il s’agit d’obtenir des cupules à hybride unique, par dilutions successives. La
méthode de dilution est variable et dépend des indications fournies par la littkrature
scientifique sur la question ainsi que de l’expérience personnelle du technicien. Le principe
est de prélever une colonie d’hybrides à la fois, à partir des cupules à résultat sérologique
satisfaisant et de cultiver chacun dans 1 ml de milieu spécial, dans une cupule d’une plaque
de 24 puits. Chaque colonie ciblée sera ensuite déposée dans la cupule Al d’une plaque de
culture à 96 cupules contenant le milieu spécial. Le système de dilution adopté est alors
appliqué de manière à obtenir une cellule (un clone) dans chaque cupule de la rangée
horizontale infkieure de la plaque (rangée H). Le calcul des quantités respectives de
suspension cellulaire et de milieu spécial par cupule dépendra du nombre de cellules
comptées par ml. Ces plaques de clonage sont ensuite incubées à 37°C et 5% de CO2 et sont
examinées régulièrement pour apprécier l’état des clones éventuels.
6
2.6. Identification des clones sécréteurs et caractérisation des sécrétions.
Cette manipulation vise à obtenir des réact:ions antigène-anticorps spécifiques en
utilisant l’antigène de sensibilisation de la souris dune pa& les sumageants des clones d’autre
part. Une étude plus poussée permet de déterminer les sous-chasses d’immunoglobulines
sécrétées par chaque clone. Dans ce cas compléter la réaction Ag-Ac avec des anti sous-
classes (ami IgM, anti IgGl, IgG2a, IgG2b, etc.) Cette étape est alors suivie de l’adjonction
d’un conjugué specifique pour chaque anti sous-classe avant la révélation. Là aussi, les
techniques sérologiques appliquées varient d’un laboratoire à un autre. A l’EMVT, la
technique ELISA sur membrane nitrocellulose est utilisée avec succés.
A l’issue de ce test, la nature de chaque anticorps monoclonal obtenu est connue. La
production proprement dite est terminée. Les étapes suivantes comportent l’entretien des
clones, la collecte des surnageants renfermant les anticorps, la purification éventuelle et la
conservation. Nous n’avons pas eu l’occasion de suivre ces étapes, le stage étant arrivé à sa fin.
CONCLUSIONS
Il faut dire d’emblée que ce stage s’est déroulé dans d’excellentes conditions
d’encadrement et a débouché sur d’importantes acquisitions.
Pour ce qui est de l’application des techniques apprises, il y a lieu de souligner que les
dXFérents protocoles exécutés font appel à de nombreux réactifs biochimiques pour préparer
les tampons de travail et autres milieux de culture. Ces produits coûtent cher et la plupart ne
sont pas commercialisés sur le marché local. Une planification précoce est nécessaire pour en
disposer en temps voulu. L’expression anticipée des besoins en prévision des recherches
envisagées dans ce domaine aiderait beaucoup à lever cette contrainte.
Concernant le matériel et la verrerie, les équipements habituellement utilisés en
Microbiologie et en Virologie sont requis (hotte à flux laminaire, pompe à air, flacons et
plaques de culture, pipettes sous emballage individuel stérile, etc.).
Par ailleurs, un soin particulier est requis quant à l’entretien de l’animalerie qui abrite
les souris à immuniser. Faute de quoi, il y aurait le risque de manipuler des animaux malades
et ayant déjà développé des anticorps autres que ceux que l’on désire.
Pour terminer, rappelons que l’usage des anticorps monoclonaux dans les tests
sérologiques représente aujourd’hui une option largement répandue. Cela s’explique par la
qualité des résultats qu’ils permettent d’obtenir et le type d’information scientifique que l’on
peut en tirer. En outre, une fois le réactif fmal préparé, de très petites quantités (quelques
microlitres) en sont souvent suflïsantes pour tester plusieurs centaines de sérums. Le temps et
les coûts de production des anticorps monoclonaux sont donc finalement amortis par leur
extrême économie et leurs remarquables pe&ormances.
REMERCIEMENTS
- Les autorites du CIRAD/EMVT ont bien voulu prendre en charge la
totalité du furancement de ce stage, et le Centre international des Etudiants et Stagiaires
(CIES) en a assuré la gestion;
- M. Le Directeur de 1’EMVT a accepté que son Institut abrite le stage;
- M. Le Directeur général de I’ISRA a bien voulu donner son autorisation
pour effectuer ce stage
- M. Le Directeur des Recherches sur les Productions et la Santé animales
de 1’ISR.A a pris I?nitiative du stage et a déployé beaucoup d’efforts pour sa réalisation;
- M. le docteur P.C. LEFEBVRE, alors chef du Laboratoire de
PATHOTROP de I’EMVT, m’a aimablement accueilli dans son service;
- Les docteurs Geneviève LIBEAU et Cbristbian LE G-OFF m’ont encadré
à la perfection et m’ont intégré avec courtoisie dans leur équipe de travail;
- Madame Martine GLADY, chargée des stages à l’EMVT, a abattu un
travail opiniâtre pour l’aboutissement de ce stage et, avec son personnel, en a assuré une
parfaite organisation;
- Madame SOHAKHA, Secrétaire au Laboratoire de PATHOTROP,
ainsi que le personnel du Secrétariat et l’ensemble des techniciens du Laboratoire, m’ont
offert une hospitalité constante.
Je tiens à transmettre aux uns et aux autres mes sincères et chaleureux
remerciements.
IWUBLIQUE DTj SENEGiX
DEPARTEMENT DE RE?CHERCHES SUR LES
__---_m-----
PRODUCTIONS ET LA SANTE &3ltvULES
MINISTERE DE L’AGRICULTURE
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___-___--
LABORATOIRE NATIONAL DE L’ELEVAGE
INs~~‘I’I‘I3‘ SENEGAL.=VS DE RJXHERCHES
ET DE REXHERCHES
VETERINAIRES
.4GRJCOLES (I.S.R.A.)
B.P 2057, DAKAR-HANN
RAPPORT N”rta& PATHO. ANIM.
Janvier 1994
* : Assistant de Recherches, Laboratoire de Parasitologie.
lL\\PPol<‘r DK ST.4GE SUR IA l1wi:PARATION
El’ L’EVAI,liAï’IC)N DES ANTICORPS MONOCLONA us
EFFECTUE Afi C:IRAD-EMVT, MAISONS-ALFORT, FRANCE,
I)l! 1 cr )\\IJ 28 DECEMBRE 1773
Par Mamadou SEYE*
(Janvier 1994)
INTRODUCTION
Les techniques modernes d’analyse sérologique utilisent de plus en plus des anticorps
monoclonaux. Ces anticorps, plus que les polyclonaux, ofZient une haute spécificité et
permettent d’obtenir des résultats sérologiques plus précis et souvent plus fiables. Cependant,
de tels anticorps, outre qu’ils coûtent cher sur le marché, sont fi-agiles et requièrent des
conditions de transport appropriées pour garder leurs propriétés séro-immunologiques.
De
plus, il est toujours difficile de faire venir de l’extérieur les réactifs que l’on désire dans les
délais voulus. Le mieux est d’être en mesure de les préparer sur place, avec le double
avantage d’en avoir une connaissance précise et de pouvoir leur assurer une conservation
adéquate afin d’en disposer à tout moment. C’est à cette fin que nous avons effectué un stage
d’initiation aux techniques de production et d’évaluation des anticorps monoclonaux au
Laboratoire de “PATMOTROP” du Département Elevage et Médecine Vétérinaire Tropicale
du Centre de Coopération internationale en Recherche Agronomique pour le Développement
(CIRAD/EMVT) à Maisons-Alfort, du ler au 28 décembre 1993. Le stage a eu lieu à
l’initiative du Directeur des Recherches sur les Productions et la Santé animales de l’Institut
Sénégalais de Recherches Agricoles (ISRABRPSA), avec une allocation de stage attribuée
par le CIRAD.
L’objet de ce rapport est de rendre compte de ce stage. Dans un premier temps, un bref
rappel sera fait sur les caractéristiques immunobiologiques qui expliquent la spécificité des
anticorps monoclonaux et justifient leur mode de production; dans un deuxième temps, les
techniques que nous avons apprises au cours du stage seront résumées avant d’en tirer les
principales conclusions.
1. FONDEMENTS IMMUNOBIOLOGIQUES DE: LA PRODUCTION DES
ANTICORPS MONOCLONAUX
L’organisme d’un etre vivant immuno-compétent renferme toute une population de
cellules sécrétrices d’anticorps élaborés pour réagir avec des antigènes ou des épitopes
différents. C’est pourquoi, dans un sérum donné, les types d’anticorps circulants spécifiques
d’un même antigène sont extrêmement rares (de l’ordre de l/lO). De tels anticorps, dits
polyclonaux, offrent donc une spécificité souvent insufGsante et peuvent de ce fait donner des
résultats sérologiques difficiles à interpréter.
Par contre, les anticorps monoclonaux sont des immunoglobulines exclusivement
spécifiques d’un immunogène donné ou d’un épitope précis. Ils sont sécrétés à perpétuité par
une cellule unique (et ses descendants), laquelle cellule ayant été sélectionnée et entretenue
in \\)ifro en raison de cette aptitude particulière.
* : Assistant de Recherches, ISRA/DRpSA/LNERV, B.P. 2057, Dakar, Sénégal
Ces définitions tr& sommaires dissimulent cependant la complexit& des phénomcnes
immunobiologiques
qui entrent en jeu et les multiples manipulations requises, qu’il faut
maîtriser et intégrer dans un syst?me cohcrent pour obtenir les anticorps désirés. L’on sait en
efI& que la production des immunoglobulines
est du domaine de l’immunité de type
humorale, et qu’elle incombe aux lymphocytes de la lignée B. Ces cellules, générées à partir
de la moelle osseuse. sont présentes en grand nombre dans les organes lymphoïdes (rate et
ganglions lymphatiques chez les mammifères). Elles se mobilisent à la suite de l’introduction
répétée d’un immunogène dans l’organisme, avec cette importante particularité que chaque
cellule reconnaîtra et réagira avec un antigène et un seul. Malheureusement, ces lymphocytes
sont à durée de vie très limitée (3à 4 jours) après leur différentiation en plasmocytes
sécréteurs d’anticorps. De plus, on ne peut pas les cultiver seules in vitro. Il a fallu recourir à
des artifices biochimiques pour contourner ces difficultés. L’option ici est de fusionner ces
cellules sécrétrices avec des myélomes non sécréteurs mais pouvant être multipliés par
culture. La production des anticorps monoclonaux résulte finalement de la mise au point et
de la combinaison réussie de techniques performantes en vue des résultats ci-dessous:
- induction d’une immunité humorale de niveau satisfaisant chez des animaux de
laboratoire;
- identification de la nature de la réponse immunitaire;
- fusion des cellules sécrétrices d’anticorps avec des myélomes, puis culture cellulaire
in vitro assurant la survie des cellules fusionnées ainsi qu’une sécrétion pérenne;
- élimination des cellules non fusionnées;
- évaluation de la spécificité des anticorps produits;
- sélection et maintien en vie de cellules individuelles sécrétrices d’anticorps
spécifiques;
- purification éventuelle de ces anticorps;
- enfin, stockage adéquat des réactifs finaux ainsi obtenus.
Le paragraphe qui suit décrit les méthodes et techniques apprises à cette fin au cours
de ce stage.
II. PRODUCTION ET EVALUATION DES ANTICORPS MONOCLONAUX
Le principe de base de la production des anticorps monoclonaux se résume comme
suit: après sensibilisation d’un animal de laboratoire avec un antigène donné et s’être
assuré par criblage sérologique que l’animal a donné une réponse immunitaire à cette
sensibilisation, prélever la rate, libérer et recueillir les lymphocytes censés sécréter les
anticorps désirés. Fusionner ces cellules de rate avec des myélomes non sécréteurs.
Ainsi on obtient des hybrides capables de se multiplier in vitro (gène de multiplication
apporté par le myélome) tout en continuant leur sécretion (gène de sécrétion du lymphocyte
de souris immunisée). Les myélomes non fusionnés seront éliminés par un milieu de sélection
approprié. Après identification sérologique des hybrides sécréteurs d’anticorps
spécifiques de l’antigène de sensibilisation, effectuer un clonage permettant d’obtenir des
cellules individuelles. IA sécrétion de chaque clone est alors testée avant d’être
Èventuellement retenue et conservée comme anticorps monoclonal spécifique.
2.1- Immunisation d’animaux de laboratoire
11 s’agit de sensibiliser un animal immuno-compétent avec l’antigène contre lequel on
souhaite qu’il élabore des anticorps spécifiques. Ici s’opère un choix concernant l’espèce
animale à immuniser, selon des critères déterminés (immuno-compktence
bien connue, bonne
santé, etc.). A I’EMVT, des souris BALB/CBY .JICO élevées dans de bonnes conditions
sanitaires et hygiéniques sont utilisées pour ce type de travail et ont presque toujours donné
satisfaction. Le protocole d’immunisation appliquk est le suivant:
- Jour 0 : Injection intra-péritonéale (I.P.) de 0,3 ml d’une émulsion à parties
égales de l’antigène et d’adjuvant complet de Freund, l’antigène devant renfermer 40 à 50 pg
de protéines.
- Jour 0 + 30 : Irjection en sous-cutané (S.C.) de la même quantité de
protéines antigéniques mais contenue dans 0,2 ml d’une émulsion à parties égales de
l’antigène et d’adjuvant incomplet de Freund.
- Jour 0 + 60 : Injection intraveineuse (I.V.) de 0,l ml d’antigène renfermant
20 pg de protéines, mais sans adjuvant. A noter que la voie veineuse, bien que préférable,
n’est pas impérative: en cas de difficulté, injecter en I.P. En outre, cette injection de rappel
final est faite 3 à 5 jours avant l’étape suivante: la fusion. Enfii il est important de surveiller
de temps à autre la souris dans les heures qui suivent l’injection pour s’assurer qu’elle n’est
pas morte d’un choc anaphylactique.
2.2- Fusion
Comme indiqué plus haut, les cellules de rate sécrétrices d’anticorps ont une durée de
vie très limitée et elles ne peuvent pas être cultivées seules in vitro. Il est nécessaire de les
coupler avec d’autres cellules qui, elles, peuvent se :multiplier en culture, pour obtenir des
hybrides capables de se multiplier et de sécréter. Ce couplage est appelé fùsion. Les étapes de
la fusion sont indiquées ci-dessous.
2.2.1- Préparadon des myélomes partenaires de filsion
On utilise ici de cellules NS1 générées par des souris BALB/C à la suite
d’injection d’huiles minérales dans le péritoine. Ces cellules ont été reconnues non sécrétrices
et capables de fusionner avec des lymphocytes sécréteurs d’anticorps.
Quatre à cinq jours avant la fùsion, le tube de NS1 congelé dans l’azote liquide
en est sorti et décongelé rapidement dans un bain d’eau chauffée à 37*C environ. Reprendre
les cellules dans du milieu essentiel minimum (MEM) préparé la veille et additionné
d’tlzaguadine et de sérum de veau foetal (SVF). Centrifuger pour éliminer le DMSO qui
avait servi de milieu de conservation dans l’azote, puis transfker les cellules dans une petite
boîte de culture cellulaire. Ajouter quelques ml de milieu. Placer à l’étuve réglée à 37°C et
5% de C02. Contrôler tous les jours la multiplication des cellules, en effectuant plusieurs
repiquages.
La veille de la fksion, repiquer mais en utilisant du MEM additionné
d’Hypoxanthine-Thymidine (HT), de SVF et d’une solution antibiotique.
2.2.2- Préparalion des celiiiks deratedesor4risUnmunisée
La souris immunisée est sacrifiée et la rate prélevée stérilement et lavée 3 fois
dans des boîtes de Pétri contenant une petite quantité de MEM. A l’aide d’aiguilles à
injection stériles montées sur deux seringues, dilacérer la rate pour en libérer les cellules qui
sont ensuite déposées dans de la glace pilee pour la.isser sédimenter les grosses particules
tissulaires non désirées.
Après sédimentation, prélever la suspension de cellules de rate et la déposer
délicatement dans un tube à centrifùger conique, sur un coussin de 2 ml de SVF. Laver les
cellules à deux reprises par centrifugations successives, en reprenant à chaque fois le culot
dans du MEM.
Ces manipulations sont faites le jour même de la fusion; il est nécessaire de
travailler assez vite en raison de la fragilité des cellules de rate.
2.2.3- Réah&n de la fusion
Le produit chimique utilisé ici pour fusionner les NS1 avec les cellules de rate
est le Polyéthylène glycol 1500 (PEG) en solution à 50% dans de 1’Hépes.
- Sortir les boîtes de culture de myélomes, décoller à la pipette les cellules
adhérantes, transférer dans des tubes coniques et centrifuger. Reprendre le culot dans du
MEM sans SVF’; conserver ce premier surnageant. Laver à deux reprises les NS1 dans le
milieu MEM sans additif Le culot de la dernière centrifugation est repris dans le même
milieu MEM.
- Effectuer un comptage du nombre de NS1 contenues dans la préparation, en
utilisant une cellule de Malassez et en tenant compte du volume total de la suspension
cellulaire, ainsi que de la dilution éventuellement faite pour faciliter le comptage. Faire un
dtkompte identique pour les cellules de rate de la souris immunisée.
- Une fois les nombres de NS1 et de cellules de rate connus, calculer le volume
à prélever dans chaque suspension cellulaire pour que le nombre de cellules de rate soit 5 à 6
fois celui des NS 1. Mélanger les deux préparations en respectant ces proportions, centrifuger
la mixture, puis écarter soigneusement le surnageant en égouttant parfaitement.
- Homogénéiser le culot par petites secousses ou par glissement de l’extrémité
du tube sur une surface rugueuse, puis y déposer goutte à goutte, en 30 secondes, 0,5 ml de
solution de PEG. La durée totale du contact avec le PEG est de 2 minutes. Au bout de ce
temps, stopper la réaction avec du MEM additionné de 5% de SVF. Déposer le milieu goutte
à goutte, puis ml par ml, en agitant doucement. Compléter avec le même milieu pour obtenir
une quantité égale à celle du premier surnageant de NS 1. Ajouter ce surnageant après avoir
mis du SVF de manière à en obtenir une concentration finale de 20%. Enfin compléter avec
la solution antibiotique.
- Répartir dans des plaques de culture cellulaire à 96 cupules à fond plat, à
raison de 100 ~1 par cupule. Incuber à 37°C et 5% de CO2 jusqu’au soir ou au plus tard le
lendemain matin.
2.3. Sélection et culture des cellules fusionnées
1,~s manipulations pr&zédentss (2.2.3) permettent en principe d’obtenir la fusion des
NS 1 avec les cellules de rate de la souris immunisée. En réalité, il existe toujours un nombre
plus ou moins important des unes et des autres qui n’auront pas fusionné. Les cellules de rate,
OII l’a vu, ne peuvent pas vivre seules in vitro. Quant aux NS1 non fusionnés, ils n’offrent
plus d’intérêt et doivent Etre tYiminés. Un milieu spécial est nécessaire pour cela. Ce milieu
est à base de MEM à 20?+I de SVF? additionné de 2% de HT contenant cette fois de
1’Aminoptérine (HAT), de 1% d’Oxaloacétate Pyruvate Insuline (OPI), de 0,5 ng/ml
dkterleukine (IL6), sans oublier la solution antibiotique (1%).
Prélever en partie le surnageant des cupules des plaques incubées le matin ou la veille
et le remplacer par 200 ~1 par cupule du milieu spécial ci-dessus indiqué. Incuber à nouveau
dans les mêmes conditions, en changeant le milieu tous les quatre à cinq jours, en fonction de
l’aspect des cellules. Identifier au fur et à mesure,, par des numéros, les cupules où
apparaissent des hybrides et surveiller la croissance de ceux-ci.
2.4. Caractérisation des hybrides matures
Cette étape, réalisée lorsque l’évolution des colonies dans les cupules est jugée
suffisante (à partir d’une semaine après la fusion), consiste à identifier les hybrides qui
sécrètent des anticorps spécifiques de l’antigène de sensibilisation injecté à la souris.
Plusieurs techniques sérologiques sont disponibles à cette fin, et le choix dépendra des
performances respectives des systèmes d’analyse sérologique implantés au laboratoire.
Signalons pour mémoire qu’à I’EMVT nous avons effectué ce criblage par la technique
ELISA de détection des ‘anticorps sur micro plaques. Dans tous les cas, le test inclura un
anticorps monoclonal reconnu spécifique de l’antigène, ainsi qu’un témoin négatif, qui
permettront d’apprécier les réactions des surnagea& testés.
2.5. Clonage des hybrides sécréteurs.
Là il s’agit d’obtenir des cupules à hybride unique, par dilutions successives. La
méthode de dilution est variable et dépend des indications fournies par la littkrature
scientifique sur la question ainsi que de l’expérience personnelle du technicien. Le principe
est de prélever une colonie d’hybrides à la fois, à partir des cupules à résultat sérologique
satisfaisant et de cultiver chacun dans 1 ml de milieu spécial, dans une cupule d’une plaque
de 24 puits. Chaque colonie ciblée sera ensuite déposée dans la cupule Al d’une plaque de
culture à 96 cupules contenant le milieu spécial. Le système de dilution adopté est alors
appliqué de manière à obtenir une cellule (un clone) dans chaque cupule de la rangée
horizontale infkieure de la plaque (rangée H). Le calcul des quantités respectives de
suspension cellulaire et de milieu spécial par cupule dépendra du nombre de cellules
comptées par ml. Ces plaques de clonage sont ensuite incubées à 37°C et 5% de CO2 et sont
examinées régulièrement pour apprécier l’état des clones éventuels.
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2.6. Identification des clones sécréteurs et caractérisation des sécrétions.
Cette manipulation vise à obtenir des réact:ions antigène-anticorps spécifiques en
utilisant l’antigène de sensibilisation de la souris dune pa& les sumageants des clones d’autre
part. Une étude plus poussée permet de déterminer les sous-chasses d’immunoglobulines
sécrétées par chaque clone. Dans ce cas compléter la réaction Ag-Ac avec des anti sous-
classes (ami IgM, anti IgGl, IgG2a, IgG2b, etc.) Cette étape est alors suivie de l’adjonction
d’un conjugué specifique pour chaque anti sous-classe avant la révélation. Là aussi, les
techniques sérologiques appliquées varient d’un laboratoire à un autre. A l’EMVT, la
technique ELISA sur membrane nitrocellulose est utilisée avec succés.
A l’issue de ce test, la nature de chaque anticorps monoclonal obtenu est connue. La
production proprement dite est terminée. Les étapes suivantes comportent l’entretien des
clones, la collecte des surnageants renfermant les anticorps, la purification éventuelle et la
conservation. Nous n’avons pas eu l’occasion de suivre ces étapes, le stage étant arrivé à sa fin.
CONCLUSIONS
Il faut dire d’emblée que ce stage s’est déroulé dans d’excellentes conditions
d’encadrement et a débouché sur d’importantes acquisitions.
Pour ce qui est de l’application des techniques apprises, il y a lieu de souligner que les
dXFérents protocoles exécutés font appel à de nombreux réactifs biochimiques pour préparer
les tampons de travail et autres milieux de culture. Ces produits coûtent cher et la plupart ne
sont pas commercialisés sur le marché local. Une planification précoce est nécessaire pour en
disposer en temps voulu. L’expression anticipée des besoins en prévision des recherches
envisagées dans ce domaine aiderait beaucoup à lever cette contrainte.
Concernant le matériel et la verrerie, les équipements habituellement utilisés en
Microbiologie et en Virologie sont requis (hotte à flux laminaire, pompe à air, flacons et
plaques de culture, pipettes sous emballage individuel stérile, etc.).
Par ailleurs, un soin particulier est requis quant à l’entretien de l’animalerie qui abrite
les souris à immuniser. Faute de quoi, il y aurait le risque de manipuler des animaux malades
et ayant déjà développé des anticorps autres que ceux que l’on désire.
Pour terminer, rappelons que l’usage des anticorps monoclonaux dans les tests
sérologiques représente aujourd’hui une option largement répandue. Cela s’explique par la
qualité des résultats qu’ils permettent d’obtenir et le type d’information scientifique que l’on
peut en tirer. En outre, une fois le réactif fmal préparé, de très petites quantités (quelques
microlitres) en sont souvent suflïsantes pour tester plusieurs centaines de sérums. Le temps et
les coûts de production des anticorps monoclonaux sont donc finalement amortis par leur
extrême économie et leurs remarquables pe&ormances.
REMERCIEMENTS
- Les autorites du CIRAD/EMVT ont bien voulu prendre en charge la
totalité du furancement de ce stage, et le Centre international des Etudiants et Stagiaires
(CIES) en a assuré la gestion;
- M. Le Directeur de 1’EMVT a accepté que son Institut abrite le stage;
- M. Le Directeur général de I’ISRA a bien voulu donner son autorisation
pour effectuer ce stage
- M. Le Directeur des Recherches sur les Productions et la Santé animales
de 1’ISR.A a pris I?nitiative du stage et a déployé beaucoup d’efforts pour sa réalisation;
- M. le docteur P.C. LEFEBVRE, alors chef du Laboratoire de
PATHOTROP de I’EMVT, m’a aimablement accueilli dans son service;
- Les docteurs Geneviève LIBEAU et Cbristbian LE G-OFF m’ont encadré
à la perfection et m’ont intégré avec courtoisie dans leur équipe de travail;
- Madame Martine GLADY, chargée des stages à l’EMVT, a abattu un
travail opiniâtre pour l’aboutissement de ce stage et, avec son personnel, en a assuré une
parfaite organisation;
- Madame SOHAKHA, Secrétaire au Laboratoire de PATHOTROP,
ainsi que le personnel du Secrétariat et l’ensemble des techniciens du Laboratoire, m’ont
offert une hospitalité constante.
Je tiens à transmettre aux uns et aux autres mes sincères et chaleureux
remerciements.