REPUBLIQUE DU SENEGAL I NST I TUT SENEGALAI S DE...
REPUBLIQUE DU SENEGAL
I NST I TUT SENEGALAI S DE RECHERCHES
- - - a - - - - -
AGRICOLES (i .S.R.h, 1
B”INlSTERE DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE
w-w.--“-“-
ET TECHN I QUE
LABORATOIRE NATIONAL DE LQELEVAGE
- - - a - - - - -
ET DE RECHERCHES VETER I NAI RES
53*
PREPARAT t ON DU VACC I N . CONTRE LE
CHARBON SYMPTOMAT t QUE
R E F . No 37/MICROBIO.
M A I 1 9 8 3 .
PREPARATION DU VACCIN CONTRE LE
WARBON SYMPTOMATIQUE
M.P. DOUTRE
Chef de service au L.N.E.R.V.
(I.S.R.A.)
PLAN GENERAL
1 - Définition
2 - Souche vaccinale
3- Préparation du milleu de culture
4- Technique de fabricat Ion du vacc i n
41 - Généralités
42 - Préparation des Inoculums
43 - Ensemencement d'une série de flacons
44 - Mise en culture à l'étuve
45 - Contrôle de pureté et formolage
46 - Précipitation par l'alun de potassium et test d'innocuité sur cobayes
47 - Répartition du vaccin
5 - Test dqimmunité.
PREPARAT1 ON DU VACCIN CONTRE LE
CHARBON SYMPTOMATIQUE
h4 . P . DOIJTRE
;..
‘Chef de service de Bactériologie
-.., . .
au L.N.E.R.V. (ISRA)
. _.
DEFINITION .
“’
Le, vaccin contre le charbon symtomatique, préparé au Laboratoire de Dakar,
est une anaculture totale de Clostridium chauvei, obtenue sur mi I ieu vlande-
fote glucosé à 10 p.1000, formolée à 5 p.1000 et alunée à 10 p.1000.
S0UCH.E. VACC I NALE
2.1 i. f)rigif&
.
.,
Cette souche sauvage, pleinement virulente, a été Isolée dgun bovin mort
:
de charbon symptomatique, près de Sangalkam en 1982.
2.2’ i’ Enj-tëfleh I’ ‘Fabrlcatlon dvüne banque
d
e
seüches
Pour conserver le pouvoir Immunogène de la souche, à chaque préparation
d’ u,n nouveau lot de semence, i I est nécessai re de passer 1 a souche sur bovi:n.
.
.”
2.2.1 - R e v i vlscence d e l a s o u c h e
_-------------------_____
Prendre des tubes du précédent lot de se,mence,- et repiquer 0,5 ml, ,de :
cette semence sur boul I Ion V-F (viande- foie), glucosé à 10 p.1000, sous
huile, en tube de 22, immédlatement apres la régénération de ce dernier.
Après 15 h, dvétuve à 37OC,
la cul turc sera en phase ,exponentieI le. Trois ml.
de, cette primocu I ture sont réensemencés en boul I.Ion V-F gl ucosé, régenéré dans
un Erlenmeyer de 1 litre. Après. 15 à 20 h. d’étuve à 37OC, cette culture
seconde servira à inoculer un bovin.
-,
..
2.2.2 - &I%I~~~ sur bovin
-------y-...
Le bovi ri cho i’s i- sera n.on vacc 1 né et bgé de 20 à 30 mo.1 s.
L’inoculation se fera par voie intra-musculaire dans les musc’les anc&nés
de I ‘épaule. L7inoculum sera constitué à parties egales de 2,5 ml de la culture
. . .
. . . / l . .
- 2
seconde de 15 h en Erlen et 2,5 ml dvune solution de chlorure de csiciuy a
5 p.100 destiGe 2 favoriser 163 réveil des spores et la multiplication du
clos-trfdium.
.
‘
.,
,<
,a..
2.2.3 - f?&clte du sang A la nhaso se@i&mique
---m.-m.-----..--
-,--.w-L-m.,-m.,,
p--.s-- WI
15 .A 20 h apres l'inoculation, ivanimal est en phase prB-agoniquû. : il..
est couch6 sur un.cet6, les 4 membres en extension, avec un oedèmc3 voItip:ineux,
.tocalisQ à la .zone d'inoculation. La prise de.temp6rature rectale révèle un
_,
.
début d8hypot$wmie.
On prél&vera alors s-t&-ilement du sang à la veine jugulaire dans ~1'; flgcon
de 500 ml avec billes de verre et citrat@ de sodium à 5 p.1000.
<.
L'animal ayant succombé, proc6der à Iqautopsie, et apr6s avoir 'ligctur~
les vaisseaux sangufns afférents et eff&ents, pr6lever le coeur.. Prsndi-e aussi
un os long. Ces prél@vements sont destinés à effectuer des hémo et m&dulIc
cultur3s.
2.2.4 - Ensemencements des bouillons V-F ~lwosér sous huile, condii-ion-
----"""---,'-,--,-,-,,-,~~,----~~---"~.
,-,-F--RF ~-.am-c.v.~"Ic-. --y--------
nés en tube de 22
"
w-~-w-e.---c------
Aussi-i-O-t apres la rBcolte, on snsemensera'avec I.e sang, une quarantaine
de bouillons V-F, glucos6, sous huila, en tube de 22, préalablement réç6nGrés
pendant 20 minutes. Par tube de 22, la dose tnoculum de sang ne sera.pas infé-
.
.<.
L.
_
rleure ?I 2 ml si l,'on veut ohtenlr une bonne culture à dém?rrage rapide. Vettre
à Itétuve 2 37OC, pendant 72 h,
2.2.5 - R&clte et stockage
----7------..-..-..-
.
Chaqua jour, les tubes sont,observés. Qn ne retiendra que les tubos ayant
pr6sent6 une croisTance rapide -(rejetsr les cultures qoi n'ont.pas déiriarr6
dans les 24 h)- avec trouble intense, asGension du.broyat'de v'rand~~. et ,frrf
d6gagement de gaz (visible p-?r les bulles emprisonn6es dans Ivhuilc de vssetine).
S1 les contr6les lndiqu6 s cl-après sont satisfalsan-ls, les bouchons do wtc:n
. . ,..
sont flambes, enfoncés 3 I'intérleur du tube dont on protégera
. . .
IPouverture par
un capuchon de Cacutchcuc. Numéro-te'r chaque tube, et les inscrire sur ie t-egis-
t&.'des s0uches. Stocker c1 + 4*C.
.'
.,
i
'I
l *. /
. . .
- 3
2.2.5 - Contrôle de Furet&
-.,--m.-w----- ---em
2.2.6.1 - Ce contrôle est important pour d&plstzr les contamina-
ti&~s (par exemple germes des Mserwi rs .gastriques âyan+’ framchi fa barrière
<
intestinale durant la phase agonique de 19animal 1. Ce con+r%le sè fait b’deux
niv,eaux :
.
;
a) au niveau du flacon- rQcoi te de sang :de rrkme que I ‘on ensemence dos bou i I-
.,
.<
:
I
Ions V-F g I ucose, on ensemencera aussi 3 à 4 b9ui I ions nutritifs ordinaires
pour bien s’assurer que.‘le sang prélevé ne contient que des batteries anaéro-
bles str’ictes ;
b) au niveau’ des tubes.souches : après 24 h de cul turc à 37OC, dans chaque
tube sache (Dow 1 I I on V-F g I ucosé, sous hui le, en tube de 221, on prél5ve
stérl I ement, à la :p Ipette Pasteur, 9 uel q.ues gout‘tes de cul tut-e Qu<: I ‘on
ensemence ai ns i :
- 3 gouttes dans un bou i I Ion nul-r tif aerobie,
”
- 3 gouttes sur I a pente d’une gh ose nutr!tive, .
:
enfin un& gouttè est deposge sur iame~pour confection d’un frcttis et colo-
ratton. de grati.
. .
.’
_:.,:
2,2.6.2 - I nterprhtatîon des résultats
Les cultures en’ boul ! Ion et sur gélose nutr-i.tive ..seronf’..su.ivies pendant
--..
7 jours. Elle& doivent demeurer ‘st&iles.
LO a.s pect morp)o I og i&e des bactêr 1 es
. .
vues au Gram doit correspondre a& caractériSflques de Cl. chauvei.
III - PREPAPATION DU MI Cl EU IX CULTURE
’ .
t..,,...,
.:.,.
IV,.
*.._.
--
.
.
.
..<
.
.
3.1 - G&-&raf i.tés
.
.
+
:
’
,.
.
,‘.
., ., . . - .
Le ml I ieu uti I isé pour la cuJ t?r& de Cl. chauvei, au Laboratoire de Dakar,
est une digestion papaTnique d’un melange de viande ii de foie de boeuf, glu-
cos&e à 10 p.1000 et filtréa sur filtre Seltz EKS 1.
.*. / . . .
- 4
Cortains~laboratoires
(FARCHA, Tchad) Ùtilt sent une djgestion chIw!~ydro-
pe~sfque à 48%. La'diwstion
-
pâpslnique offre l'avantage appr&ciable dY;3tke
beaucoui> plus raiids.
Pour les besoins de la fabrication, ce milieu est conditionnS de ? façons :
^ en flacons.de 1cI litres : miiieu filtr& sur filtre Seitz EKS 1, glucc^sk 2
lO'p.lOOO'av&t la fabric6tiQn (voir sch6ma A),
- en fioles Erlenmeyer de 2 litres (1,5 1 de milieu environ) : milieu fil-k6
sur EKS 1, gluccs6 à 13 p.1000 avant ia fabrfcation,Lasfiol:js
Erlenmeyer
utilisées ont eté pourvues d'un tube de verre soud6 à la base, long de 7 cm
environ (travail du verre dans un ateliw spécialisé), sur lequel est fixti:
un tube en rhodordll portant une pince clamp et terminé par une .r,ffiiu,rc de
verre (voir scGma 61,
- en tubes de 220 mm x 22 mm :..le milieu est cette fois non filtré sur C!<C; 1,
mals prkipité, fil-l-t-6 sur, papier, reparti en tubes puis autoclav6. :%vant
I 9autoclavage, on recouvre le mllieu d*une couche d'huile dv vaseiiw, de
plus on y ajoute des fragments da viande et de foie cuits, ces tissus Jouant
le rôle dvagents réducteurs (rti bas). Milieu glucosé à 10 p.1000.
3.2 - Composition du milieu
Les chiffres donnk ci-dessous correspondent 2 la fabrication d'crrl& sEris
da 12 flacons de 10 litres contenant chatun au moment de 19ensomoncomcnt 9 Il-
j-ras de m'i.b.i.&j :., '.
Viande de bwuf, par&, hachba . . . . . . . . ..*....*......
16 k9
Foie de boeuf , par&, haché .*..**........**......*...
4 kg
-.
PapaTne
.,QO
g
_
-
i
‘...
. . .-. . . . . . . . l
*. . l . . . . .
*. l . . . . . .
.; i ;‘;; :;.;-r-. .; ;‘.
Eau distillée . . . . . . . . . . . ..*............*..*......... 100 litres ,
._.
.
. . . . . .
?
f
- 5
3.3 - Technique de préparation
'.
: .,.
3.3.1 - Déccupe-< de Ja carcasse de"bov.iti et parage* de la viande. Hachage
de cette dernière et du foie. Corkervation en <bacs de plast!que
a + 4OC.
<
. .
3.3.2 - Conduite de la digestion
- le digosteur contenant les 100 litres dgeau distillée, la temp~ratut-c est
portée à 5OOG. On ajoute alors la viande et le fole et l'on homog6niise 13
suspension à l'aide d'une pagaie de bois, La papatne est alors introduite
Iles' 100 9 de 'pap&Vne sont mis en su9p&sion dans 200 mi d'eau distillée,
et I'homogénéi'sation peut être-facilité@!en utilisant un super-mixer
wTurmix" pendant' 1 à 2 minutes) ;
<.
- porter la temp&-ature du mélanqe à 70°C en une heure. Au bout de ce temps,
la dt'gestion est pratiquement achevk ;
- Qlever alors la température à 85’C, pour dktr,uire la papal’ne ;
- vérifier le pH ;
- filtrer sur papier filtre ;
- ajouter du gluccse pour obtenir la concentration finale de,10 ~~1000.
,..
- ^ . ‘ _.. . ._.. ~.. ."^ <.. ,....
. . . ..-. _ _
:
~
.
_
_
_
.
-.,.
. _
- .
3.3.3 - Filtration du digestat glucosé sur filtres Seltz de 10 litres
._
EKS 1 (!@)
*. .
']"
2 filtres Seitz de 10 litres, pourvus chacun d'une membrane EKS 1, sont
<suffisants pour assurer la filtration du digestat obtenu (série do l%flacons
de 10 litres contenant chacun 9 litres de milieu fIltré)~;à~condi-i-ion de.proce-
der à une clarification prealable sur un filtre Seitz de 10 litres Squipé d'une
membrane AS. Donc, il est lndlspensable de disposer au total de 3 filtrés S&itz
da 10 litres.
"
/
. . . . . . I
(*t) Remarque : i%mploi de mllku filtré, au lieu de milleu‘pr&ip/te; filtré
sur papier, puis autoclavé, assure une croissance bien meilleure de Cl
-*
chauvei et permet un gain de temps considérable.
.
- 6
Le branchement filtre Seltz da 10 litres (membrane EKS 1) _ flacw de
'l-(Iol'tres se fait grâce ?i I1utillsatlnn de tuba de jonction ?I rodage normalisé,
': i
'mâle: femeile, SOVIREL (14/23) embottes sous la flamme d'un bec Necker. Le
filtre porte I'élsment mâle, le flacon de 10 litres 1~n61&nent
femelle et un
tube de verre cwde par oh sera introduit Ivinoculum (voir schêma A et C).
Filtres Soit,- et flacons de 10 litres vi'des et equipés sont stériiis& 3 l'auto-
clave (45 mn & 1X%).
.
3.3.4 -' Fiitratiorï du milieu 'destine 21 l'inoculum
1,-i à 2 litres du digestat glucose ci-dessus sont filtres selon le même
processus dans 2 Erlenmeyer
de 2 litres pourvus 5 la base d'un tube de verre
soude fvoir ci-dessus), Cette fois, c'est IvErlenmeyer qui porte le tube de
jonction 2 roctage normails femelfe SOVIREL (voir sch6ma 8).
Les flacnns contenant chacun 9 litres de mtlieu filtre et les Ertenmeyar
destines à la eu Iture de I"inoculum sont conservés en attente 21 la chambre
etuve 2 37*C.
_’
!V - TECHNIQUBDE FAGRICATION DU VACCIN
4.1,. - Généralités
L'obtention d'une culture tres riche en formes veg&tatlves, spores et
toxines reclame certaines precautions'
La courbe de croissance commenc& dans
un tube de 22, poursuivie en Erlenmayer de, 2 1, doit continuer dans les flacons
de 10 I, sans accuser de paIier,:cvest-à-d.ire de ralentissement, voire dqarr&t.
Pour ce faire, ii importe.:
.<
- que chaque passage se fasse alors que Ivinoculum est en plaine croissance '.
(phase de croissance exponentiel te).
Une telle culture est opaque, avec un
fort degegement gazeux qut entraîne à ta surface les particules de viande-
. .---M-e, Tout ensemencementtardif, avec une.'cuIture'~1U!“~om~&'nCo a"‘ sêdimeri?er
%I'
ne donnera qu'une croissance lente; pauvre en bactêrles ;
_ . .-. -.
. . . / . . .
- 7
- que les clostridies trouvent des conditions optimales de culture :
a) présence de tous les éléments nutritifs tkessaires, aux doses pr%citées.
En ce sens, la filtration du mllieu constitue un net avantage sur l’an-
cienne précipitation suivie d’un autociavage ;
. ..i ,
._
b ) pH convenab le : de 7,6’%+7$,8 ;
.
‘4 . .._ ,,,. _, *. . , ,_
cl une temp6rature de 37*C : survei t ier regul i èrement la température de la
c h a m b r e 6twve ;’
d> enf.in:un pH suffisamment bas,. Pour cela, en principe, dès que les flacons
ont nttei n-t la temperature de 37*C, .i 1s doivent être ensemencés.
4.2 - Preparation des 1 nocul ums
4.2.1’ -: Cut-turcs en tubes de 22
---------‘-r-----------
.:. _._ ___ ,L,
.:
“
Deux souches (au cas-où l’une des’ souches redémarrerait mal 1 sont ense-
mencées,
en boui 1 Ion V-F; g I ucos6, sous hui I e ; tubes de 22 regénérés. La dose
. .
lnoculum sera.do 0,5 ml.
‘.
4 . 2 . 2 - -Culture en Erlenmeyer de 2 I itres
--------au-r------
--w-D...e----C---
Après 10 à 12 heures d’&-uve,
les tubes .de .22 présentent une.cul turc en
pleine croissance, ils permettent Ivensemencement de 2 Erienmeyer contenant
près de 2 litres de boui I Ion +F.g’l,,ucosé ii 10 p.lOCG.
. . -. __ II -. . . .._..,~ .
Après 10 à 15 h de cuk-ture à 37’C,
. ‘.
I e contenu dos Erl enmeyer
presente
_5
un troub I e homogène dense: .sur toute la’ hauteur~d.u .mi I ieu, avec un fort dégage-
ment de gaz qui se ‘Wadul t par la p&so’nco d” une mousse b Ianche de 1 à 2 cm
d’épa I sseur, au dessus de ‘c$‘g$rf&‘d’u 1 iqujde.
:
._
4.2.3
-
.’
Contrô’l e. de eureta ,des i nocul Gms ‘.
--c-m”-‘----
--m.-...---‘-----.mc----
~ . .
Pour s’assurer de la purete de 4 ‘inoculum,, *a chgque repiquage - tube
1 ,
:. :
souches en tubes de 22, tubes de ‘22. en, .Erlenmeyer , Erl enrneyer
en f I accns de
1 0 Iltres - on ensemencera en même temps que les milieux anaérobies strictes
des milieux aérobies tels que des bouillons nutritifs ordinaires. Cette mesure
.
est jumel& avec ta confection de frottis et coloratlon de Grem de chaque
c u l t u r e .
***/ . . .
-8
j ~ Los bouillons nutritifs doivent rester sterfles, et les Grsm ne.$c:s pr6-
senter de bactêries morphologiquement différentes des clostridies,
,,.
.f
8
.
4.3 - Ensemencement d'une série de flacons de 10 litres (contenant chacun
3 litres de ml!ieu)
.
,,'
Les flacons sont sortis de I 'Gtuve et ense,monciss chacun avec 100 à 1% ml
des cultures en Erlenneyer, introduits gr%e à I 'effilure de verre sous la
.
protection de Is flamme d'un bec Mecker. Le tube de verre COIJ-~~, que pr&sante
s,
chaque'flacon, permet .d e recevoir IPeffilure de verre sans que soit retirs lc
coton qui obture le goulot du f lacon.
4.4 - Mise en culture à l'étuve
Aussitôt l'ensemencement termi&,
les flacons sont port& rj 17Qtuvc 2
37OC. Après 20 h d'Stuve,
1;' culture envahit tout le flacon, le milieu devient
opaque, et une epaisse couche de mousse bl'anche recouvre la surfaca.
Au bout dz 36 h, la sédimentation commence : le mflieu s'éclairclf-, un
cuiot microbien, plus ou moins important, spamasse au fond du flacon,
I
.'
Après 48 h, on procéderi a'iors au contrôl'e de' puretb~
;:
4.5 - Contrale de pureté et formolage
4.5.1 - Contrôle bactérioscopiguc
---1--1--1------11----
WI
On realise un'frottis de"13 culture de chacun des 12 flacons. L'uz&&i se
.,
fait apr&s coloration de Gram.. Cl,. chauve'i sur ces 'cultures de 48 h apparaft
t
plus ou moins Gram négatIf.'Les corps bactér.iens son-t parfols lys&, et la
morphologie classique nqest g&re retrouvée. Cependant les contaminations le
plus souvent rencontrées, coccl ou anthracoTdes, se signalent ais&nent
à Ci?
simp e examen. En cas, de doute, avant de formolar, on peut ensemencer la cul-
ture douteuse..en houil.ion nutritif aérobie. Les flacons soutll& seront
épi n5s.
:
:
:
: -
.
.
.
!
, ,
.
.
.
/
.
.
.
-9
4.5.2 - Addition de formol
--m.----mm---------
Les flacons ayant satisfait au test de pureté sont alors formoles S la
concentration finale de 5 p.1000. On uti iisera' le formol technique (solution
d'aldehyde formique à 40 p. 001 à la dose de 45 ml par flacon, à i*a ide d'une
éprouvette graduée. En viei 1 Issant, le titre du formo I à tendance à baisser,
II est donc recommande d'en faire le dosage de Pemps"B ' a u t r e .
Cette opération doit êt re réalisée par la même personne, en principe celle
qui dirige la production de ce vaccin ; car i'oubil d'ajouter le.formol aurait
des répercussions fâcheuses,
Après i*addition de formol, 1 es bouchons de gaze qui obturent tes f lacmis
sont remplacés par des bouchons de caoutchouc baignant dans une solution formo-
iée. Les fiaCOnS, après avoir subi une agitation vigoureuse, sont aiors rem!S
à l'étuve pour une durée de 4 Jours. Une anaculture totale est ainsi obtenue
selon le mode classique de production des anatoxines .et des anacuitures par
actton conjuguée du formol et de la chaleur.
4.6 - Prkipitation par iJaiun de p&assium et test d'innocuité sur cobayes
4.6.1 - Addition d'alun de potassium
----v----m---w----.. e---w---
Apres 4 jours d?étuve,
la culture reçoit de l'alun de potassium à la con-
centration finale de 10 p.1000, soit 900 ml d'une solution stérile d*alun 2
10 p.100 par flacon de 10 litres. Cette solution est prgpafée de la façon
sulvante :
- composition :
- alun de potassium.
..
l *............*........
1 000 g
(potassium-aluminium-sulfate)
- eau dlstiil6e
10 litres
l . . ..***...................
- technique :
.
premler jour :
,. ;
- peser 1 000 g d'alun, bien l'écraser pour le réduire en poudre,
- verser dans 10 litres d'eau distillée,
- faire fondre en agitant te mélange avec une baguette de bois,
- precipiter à l'autoclave, 30 mn à 120°C ;
- 10
_.
.
.
deux'i&w 'Jour %:
.
' - f~litier chaque flacon sur papie'r Laurerrt,
"
I
i r6aufoclaver le fritrat 30 mn à llO°C.
-,.
'
‘4.U.2 - Pr6i6vement d'6chantillcns
flacon témoin de la $rie Et-cduite
l
--~---------------,------"-~----------------------~~~~"-
---mm--
La précIpita+ioti'des p?oféines commence auss'~t6-t apr&s IPintroduc+i~~n de
l'alun. A la pip&te, on $I&v e alors 2 2 3 ml deculture dans chaque flacon.
Ces 6chantillons sont rassemblés au fur et à mesure des &-i:lèvûrnan?-'dans
un
flacon qui sera- conserv6 comme t&moin de la sérfe produite. Ne (sas cubliar
. .
d'inscrire sur le flacon, le numéro de la s&ie et la nature du vaccin prrdutt.
4.6.3 - T&st ti'innocuité sur cotsxcs
'
--1------,-----------_pI__ --
A Fart ir de ce meme flacon témoin, on,p& IBvera 3 la serin2u.e de 5 P~I?
4 ml de culture que Ivon injectera Dar wie sous-cutan6e à '2 cobayes 5 raison
de 2 ml par cobaye,
. . Su1.v 1,s pendant .8. Jtiur~.,. ces cobayes. ne 'do1v.en-l. pr&enter..auc~!-n.
.trouti 1.2.
En attendant les résultats du test dvinnocuité, I~s.flacans d2 10 1 itrtz de
vaccin $Ont stockés à la chambre froide .?I '+' 4'C,.
.
4.7 -'R6partition du vaccin
.
: .
Au Laboratoire de Dakar, le vaccin est rbparti en ampoules de 20 ~1 '(d:::s?
vaccinale : 1 ml) dans un calsson à vide.
Au Laboratoire de Farcha (?&adjp ia”t%pr-i-iti& s'effectue dans des fla-
cons (250 ml par flacon).
:
.
.
“ .
.,..,.-.,....,
V - TEST D'IMMUNITE
Ce test est 2 ,fa,ire sur bovins, à defaut sur dus moutons. il ne fsui.pas
utiliser ds cobayes où les résultstc3 sont difficiles à interpriter et-difficilo-
men-t' transposables sur bovins,..
;.
.
. . . / . . .
. *
- 11
5.1 - Protocotc
_
_
Epreuve'
RésWats
15 jours apr&s la vac-
tous survivants,
cination,
&se d'épreuve :
Quelquefois boitarie
1
d 4
e
Ivencolure
20 i 4c! CSM en intra-
‘et enflure l&gère
musculaire
de I%paule
T6molns
0
M&m szuche,dvépreuve,
itimeurs dans les
I
I
mais ?I das doses inf&
24 heurts et mort
rieur-es 4 à .O 3SM et
en 24 à 45 heures.
1 à 2 DSM
fi
5.2 - Préparation de la souche d'Épreuve
5.2.1 - Souche utilisée :
--m-------m-w--
Souche Thiès.
5.2.2 - Mode de culture
w---.m----.s-----
La culture qui sert à IYépreuve doit être une culture jeune de 15 à 18 h
en Ertenmeyer. Le boullion V-F glucosé est utilisé comme milleu.
5.2.3 - Conservation
-c----.wI----
La culture en Erlenmeyer btant termin6e, on la distribuera en flacons de
20 ml S raison de 5 ml par flacon. Mise 8 la congilatlon, puis lyophilisation.
5.2.4 - DHermlnation de fa DSM
1-----1----------------
Elle se fait par inkxlation sur bwins ou moutons. 2 ml de culture lyo-
phtlls6e reprise doivent correspondre à 20 A 40 DSM.
..* /
.*.
- 12
. .
. .
5.3 - Réalisai-ion du test
-.
,_.. _. _.
5.3'. 1
.
_.. . . .
- Lvinjection du vaccin se fer?) sous la oeau de l'encolure à raison
.I
-. . . . .<........<.,< . _,
.
de 2 ml par animal.
5.3.2 - Lv inject on de la dosa d!épreuve sera.faite au centre dec muscles
anc&n&s,
Iv6volutlon de la tumeur s'y observant zls6m~:t.
.
. . ._
..-. ._ .
5.3.3 - Les fait, es doses O,,t â O,5 ;ni seront injectées avec une Grinque
3 tub&-culine, Les volumes ne sont pas ramenés 5 1 ml au FI~.??
de riilutions,
de façon à ne pas pdifior la concentra-i-izn
locale
d.e.toxine. .dans..l..e muscle,..En .outre, .l 'eau .disti.l Iée ..cu..le. sh~m
physiologique ne sont pas sans action nocive sur Cl. chsuvai ;
1 ml dPune culture diluQe au .l/fO.nv.a .p.as la m8me vi,rulenc:c~qus
0,i ml de cet-te même culture pure. .
.
.
._.
.
.
”
I NST I TUT SENEGALAI S DE RECHERCHES
- - - a - - - - -
AGRICOLES (i .S.R.h, 1
B”INlSTERE DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE
w-w.--“-“-
ET TECHN I QUE
LABORATOIRE NATIONAL DE LQELEVAGE
- - - a - - - - -
ET DE RECHERCHES VETER I NAI RES
53*
PREPARAT t ON DU VACC I N . CONTRE LE
CHARBON SYMPTOMAT t QUE
R E F . No 37/MICROBIO.
M A I 1 9 8 3 .
PREPARATION DU VACCIN CONTRE LE
WARBON SYMPTOMATIQUE
M.P. DOUTRE
Chef de service au L.N.E.R.V.
(I.S.R.A.)
PLAN GENERAL
1 - Définition
2 - Souche vaccinale
3- Préparation du milleu de culture
4- Technique de fabricat Ion du vacc i n
41 - Généralités
42 - Préparation des Inoculums
43 - Ensemencement d'une série de flacons
44 - Mise en culture à l'étuve
45 - Contrôle de pureté et formolage
46 - Précipitation par l'alun de potassium et test d'innocuité sur cobayes
47 - Répartition du vaccin
5 - Test dqimmunité.
PREPARAT1 ON DU VACCIN CONTRE LE
CHARBON SYMPTOMATIQUE
h4 . P . DOIJTRE
;..
‘Chef de service de Bactériologie
-.., . .
au L.N.E.R.V. (ISRA)
. _.
DEFINITION .
“’
Le, vaccin contre le charbon symtomatique, préparé au Laboratoire de Dakar,
est une anaculture totale de Clostridium chauvei, obtenue sur mi I ieu vlande-
fote glucosé à 10 p.1000, formolée à 5 p.1000 et alunée à 10 p.1000.
S0UCH.E. VACC I NALE
2.1 i. f)rigif&
.
.,
Cette souche sauvage, pleinement virulente, a été Isolée dgun bovin mort
:
de charbon symptomatique, près de Sangalkam en 1982.
2.2’ i’ Enj-tëfleh I’ ‘Fabrlcatlon dvüne banque
d
e
seüches
Pour conserver le pouvoir Immunogène de la souche, à chaque préparation
d’ u,n nouveau lot de semence, i I est nécessai re de passer 1 a souche sur bovi:n.
.
.”
2.2.1 - R e v i vlscence d e l a s o u c h e
_-------------------_____
Prendre des tubes du précédent lot de se,mence,- et repiquer 0,5 ml, ,de :
cette semence sur boul I Ion V-F (viande- foie), glucosé à 10 p.1000, sous
huile, en tube de 22, immédlatement apres la régénération de ce dernier.
Après 15 h, dvétuve à 37OC,
la cul turc sera en phase ,exponentieI le. Trois ml.
de, cette primocu I ture sont réensemencés en boul I.Ion V-F gl ucosé, régenéré dans
un Erlenmeyer de 1 litre. Après. 15 à 20 h. d’étuve à 37OC, cette culture
seconde servira à inoculer un bovin.
-,
..
2.2.2 - &I%I~~~ sur bovin
-------y-...
Le bovi ri cho i’s i- sera n.on vacc 1 né et bgé de 20 à 30 mo.1 s.
L’inoculation se fera par voie intra-musculaire dans les musc’les anc&nés
de I ‘épaule. L7inoculum sera constitué à parties egales de 2,5 ml de la culture
. . .
. . . / l . .
- 2
seconde de 15 h en Erlen et 2,5 ml dvune solution de chlorure de csiciuy a
5 p.100 destiGe 2 favoriser 163 réveil des spores et la multiplication du
clos-trfdium.
.
‘
.,
,<
,a..
2.2.3 - f?&clte du sang A la nhaso se@i&mique
---m.-m.-----..--
-,--.w-L-m.,-m.,,
p--.s-- WI
15 .A 20 h apres l'inoculation, ivanimal est en phase prB-agoniquû. : il..
est couch6 sur un.cet6, les 4 membres en extension, avec un oedèmc3 voItip:ineux,
.tocalisQ à la .zone d'inoculation. La prise de.temp6rature rectale révèle un
_,
.
début d8hypot$wmie.
On prél&vera alors s-t&-ilement du sang à la veine jugulaire dans ~1'; flgcon
de 500 ml avec billes de verre et citrat@ de sodium à 5 p.1000.
<.
L'animal ayant succombé, proc6der à Iqautopsie, et apr6s avoir 'ligctur~
les vaisseaux sangufns afférents et eff&ents, pr6lever le coeur.. Prsndi-e aussi
un os long. Ces prél@vements sont destinés à effectuer des hémo et m&dulIc
cultur3s.
2.2.4 - Ensemencements des bouillons V-F ~lwosér sous huile, condii-ion-
----"""---,'-,--,-,-,,-,~~,----~~---"~.
,-,-F--RF ~-.am-c.v.~"Ic-. --y--------
nés en tube de 22
"
w-~-w-e.---c------
Aussi-i-O-t apres la rBcolte, on snsemensera'avec I.e sang, une quarantaine
de bouillons V-F, glucos6, sous huila, en tube de 22, préalablement réç6nGrés
pendant 20 minutes. Par tube de 22, la dose tnoculum de sang ne sera.pas infé-
.
.<.
L.
_
rleure ?I 2 ml si l,'on veut ohtenlr une bonne culture à dém?rrage rapide. Vettre
à Itétuve 2 37OC, pendant 72 h,
2.2.5 - R&clte et stockage
----7------..-..-..-
.
Chaqua jour, les tubes sont,observés. Qn ne retiendra que les tubos ayant
pr6sent6 une croisTance rapide -(rejetsr les cultures qoi n'ont.pas déiriarr6
dans les 24 h)- avec trouble intense, asGension du.broyat'de v'rand~~. et ,frrf
d6gagement de gaz (visible p-?r les bulles emprisonn6es dans Ivhuilc de vssetine).
S1 les contr6les lndiqu6 s cl-après sont satisfalsan-ls, les bouchons do wtc:n
. . ,..
sont flambes, enfoncés 3 I'intérleur du tube dont on protégera
. . .
IPouverture par
un capuchon de Cacutchcuc. Numéro-te'r chaque tube, et les inscrire sur ie t-egis-
t&.'des s0uches. Stocker c1 + 4*C.
.'
.,
i
'I
l *. /
. . .
- 3
2.2.5 - Contrôle de Furet&
-.,--m.-w----- ---em
2.2.6.1 - Ce contrôle est important pour d&plstzr les contamina-
ti&~s (par exemple germes des Mserwi rs .gastriques âyan+’ framchi fa barrière
<
intestinale durant la phase agonique de 19animal 1. Ce con+r%le sè fait b’deux
niv,eaux :
.
;
a) au niveau du flacon- rQcoi te de sang :de rrkme que I ‘on ensemence dos bou i I-
.,
.<
:
I
Ions V-F g I ucose, on ensemencera aussi 3 à 4 b9ui I ions nutritifs ordinaires
pour bien s’assurer que.‘le sang prélevé ne contient que des batteries anaéro-
bles str’ictes ;
b) au niveau’ des tubes.souches : après 24 h de cul turc à 37OC, dans chaque
tube sache (Dow 1 I I on V-F g I ucosé, sous hui le, en tube de 221, on prél5ve
stérl I ement, à la :p Ipette Pasteur, 9 uel q.ues gout‘tes de cul tut-e Qu<: I ‘on
ensemence ai ns i :
- 3 gouttes dans un bou i I Ion nul-r tif aerobie,
”
- 3 gouttes sur I a pente d’une gh ose nutr!tive, .
:
enfin un& gouttè est deposge sur iame~pour confection d’un frcttis et colo-
ratton. de grati.
. .
.’
_:.,:
2,2.6.2 - I nterprhtatîon des résultats
Les cultures en’ boul ! Ion et sur gélose nutr-i.tive ..seronf’..su.ivies pendant
--..
7 jours. Elle& doivent demeurer ‘st&iles.
LO a.s pect morp)o I og i&e des bactêr 1 es
. .
vues au Gram doit correspondre a& caractériSflques de Cl. chauvei.
III - PREPAPATION DU MI Cl EU IX CULTURE
’ .
t..,,...,
.:.,.
IV,.
*.._.
--
.
.
.
..<
.
.
3.1 - G&-&raf i.tés
.
.
+
:
’
,.
.
,‘.
., ., . . - .
Le ml I ieu uti I isé pour la cuJ t?r& de Cl. chauvei, au Laboratoire de Dakar,
est une digestion papaTnique d’un melange de viande ii de foie de boeuf, glu-
cos&e à 10 p.1000 et filtréa sur filtre Seltz EKS 1.
.*. / . . .
- 4
Cortains~laboratoires
(FARCHA, Tchad) Ùtilt sent une djgestion chIw!~ydro-
pe~sfque à 48%. La'diwstion
-
pâpslnique offre l'avantage appr&ciable dY;3tke
beaucoui> plus raiids.
Pour les besoins de la fabrication, ce milieu est conditionnS de ? façons :
^ en flacons.de 1cI litres : miiieu filtr& sur filtre Seitz EKS 1, glucc^sk 2
lO'p.lOOO'av&t la fabric6tiQn (voir sch6ma A),
- en fioles Erlenmeyer de 2 litres (1,5 1 de milieu environ) : milieu fil-k6
sur EKS 1, gluccs6 à 13 p.1000 avant ia fabrfcation,Lasfiol:js
Erlenmeyer
utilisées ont eté pourvues d'un tube de verre soud6 à la base, long de 7 cm
environ (travail du verre dans un ateliw spécialisé), sur lequel est fixti:
un tube en rhodordll portant une pince clamp et terminé par une .r,ffiiu,rc de
verre (voir scGma 61,
- en tubes de 220 mm x 22 mm :..le milieu est cette fois non filtré sur C!<C; 1,
mals prkipité, fil-l-t-6 sur, papier, reparti en tubes puis autoclav6. :%vant
I 9autoclavage, on recouvre le mllieu d*une couche d'huile dv vaseiiw, de
plus on y ajoute des fragments da viande et de foie cuits, ces tissus Jouant
le rôle dvagents réducteurs (rti bas). Milieu glucosé à 10 p.1000.
3.2 - Composition du milieu
Les chiffres donnk ci-dessous correspondent 2 la fabrication d'crrl& sEris
da 12 flacons de 10 litres contenant chatun au moment de 19ensomoncomcnt 9 Il-
j-ras de m'i.b.i.&j :., '.
Viande de bwuf, par&, hachba . . . . . . . . ..*....*......
16 k9
Foie de boeuf , par&, haché .*..**........**......*...
4 kg
-.
PapaTne
.,QO
g
_
-
i
‘...
. . .-. . . . . . . . l
*. . l . . . . .
*. l . . . . . .
.; i ;‘;; :;.;-r-. .; ;‘.
Eau distillée . . . . . . . . . . . ..*............*..*......... 100 litres ,
._.
.
. . . . . .
?
f
- 5
3.3 - Technique de préparation
'.
: .,.
3.3.1 - Déccupe-< de Ja carcasse de"bov.iti et parage* de la viande. Hachage
de cette dernière et du foie. Corkervation en <bacs de plast!que
a + 4OC.
<
. .
3.3.2 - Conduite de la digestion
- le digosteur contenant les 100 litres dgeau distillée, la temp~ratut-c est
portée à 5OOG. On ajoute alors la viande et le fole et l'on homog6niise 13
suspension à l'aide d'une pagaie de bois, La papatne est alors introduite
Iles' 100 9 de 'pap&Vne sont mis en su9p&sion dans 200 mi d'eau distillée,
et I'homogénéi'sation peut être-facilité@!en utilisant un super-mixer
wTurmix" pendant' 1 à 2 minutes) ;
<.
- porter la temp&-ature du mélanqe à 70°C en une heure. Au bout de ce temps,
la dt'gestion est pratiquement achevk ;
- Qlever alors la température à 85’C, pour dktr,uire la papal’ne ;
- vérifier le pH ;
- filtrer sur papier filtre ;
- ajouter du gluccse pour obtenir la concentration finale de,10 ~~1000.
,..
- ^ . ‘ _.. . ._.. ~.. ."^ <.. ,....
. . . ..-. _ _
:
~
.
_
_
_
.
-.,.
. _
- .
3.3.3 - Filtration du digestat glucosé sur filtres Seltz de 10 litres
._
EKS 1 (!@)
*. .
']"
2 filtres Seitz de 10 litres, pourvus chacun d'une membrane EKS 1, sont
<suffisants pour assurer la filtration du digestat obtenu (série do l%flacons
de 10 litres contenant chacun 9 litres de milieu fIltré)~;à~condi-i-ion de.proce-
der à une clarification prealable sur un filtre Seitz de 10 litres Squipé d'une
membrane AS. Donc, il est lndlspensable de disposer au total de 3 filtrés S&itz
da 10 litres.
"
/
. . . . . . I
(*t) Remarque : i%mploi de mllku filtré, au lieu de milleu‘pr&ip/te; filtré
sur papier, puis autoclavé, assure une croissance bien meilleure de Cl
-*
chauvei et permet un gain de temps considérable.
.
- 6
Le branchement filtre Seltz da 10 litres (membrane EKS 1) _ flacw de
'l-(Iol'tres se fait grâce ?i I1utillsatlnn de tuba de jonction ?I rodage normalisé,
': i
'mâle: femeile, SOVIREL (14/23) embottes sous la flamme d'un bec Necker. Le
filtre porte I'élsment mâle, le flacon de 10 litres 1~n61&nent
femelle et un
tube de verre cwde par oh sera introduit Ivinoculum (voir schêma A et C).
Filtres Soit,- et flacons de 10 litres vi'des et equipés sont stériiis& 3 l'auto-
clave (45 mn & 1X%).
.
3.3.4 -' Fiitratiorï du milieu 'destine 21 l'inoculum
1,-i à 2 litres du digestat glucose ci-dessus sont filtres selon le même
processus dans 2 Erlenmeyer
de 2 litres pourvus 5 la base d'un tube de verre
soude fvoir ci-dessus), Cette fois, c'est IvErlenmeyer qui porte le tube de
jonction 2 roctage normails femelfe SOVIREL (voir sch6ma 8).
Les flacnns contenant chacun 9 litres de mtlieu filtre et les Ertenmeyar
destines à la eu Iture de I"inoculum sont conservés en attente 21 la chambre
etuve 2 37*C.
_’
!V - TECHNIQUBDE FAGRICATION DU VACCIN
4.1,. - Généralités
L'obtention d'une culture tres riche en formes veg&tatlves, spores et
toxines reclame certaines precautions'
La courbe de croissance commenc& dans
un tube de 22, poursuivie en Erlenmayer de, 2 1, doit continuer dans les flacons
de 10 I, sans accuser de paIier,:cvest-à-d.ire de ralentissement, voire dqarr&t.
Pour ce faire, ii importe.:
.<
- que chaque passage se fasse alors que Ivinoculum est en plaine croissance '.
(phase de croissance exponentiel te).
Une telle culture est opaque, avec un
fort degegement gazeux qut entraîne à ta surface les particules de viande-
. .---M-e, Tout ensemencementtardif, avec une.'cuIture'~1U!“~om~&'nCo a"‘ sêdimeri?er
%I'
ne donnera qu'une croissance lente; pauvre en bactêrles ;
_ . .-. -.
. . . / . . .
- 7
- que les clostridies trouvent des conditions optimales de culture :
a) présence de tous les éléments nutritifs tkessaires, aux doses pr%citées.
En ce sens, la filtration du mllieu constitue un net avantage sur l’an-
cienne précipitation suivie d’un autociavage ;
. ..i ,
._
b ) pH convenab le : de 7,6’%+7$,8 ;
.
‘4 . .._ ,,,. _, *. . , ,_
cl une temp6rature de 37*C : survei t ier regul i èrement la température de la
c h a m b r e 6twve ;’
d> enf.in:un pH suffisamment bas,. Pour cela, en principe, dès que les flacons
ont nttei n-t la temperature de 37*C, .i 1s doivent être ensemencés.
4.2 - Preparation des 1 nocul ums
4.2.1’ -: Cut-turcs en tubes de 22
---------‘-r-----------
.:. _._ ___ ,L,
.:
“
Deux souches (au cas-où l’une des’ souches redémarrerait mal 1 sont ense-
mencées,
en boui 1 Ion V-F; g I ucos6, sous hui I e ; tubes de 22 regénérés. La dose
. .
lnoculum sera.do 0,5 ml.
‘.
4 . 2 . 2 - -Culture en Erlenmeyer de 2 I itres
--------au-r------
--w-D...e----C---
Après 10 à 12 heures d’&-uve,
les tubes .de .22 présentent une.cul turc en
pleine croissance, ils permettent Ivensemencement de 2 Erienmeyer contenant
près de 2 litres de boui I Ion +F.g’l,,ucosé ii 10 p.lOCG.
. . -. __ II -. . . .._..,~ .
Après 10 à 15 h de cuk-ture à 37’C,
. ‘.
I e contenu dos Erl enmeyer
presente
_5
un troub I e homogène dense: .sur toute la’ hauteur~d.u .mi I ieu, avec un fort dégage-
ment de gaz qui se ‘Wadul t par la p&so’nco d” une mousse b Ianche de 1 à 2 cm
d’épa I sseur, au dessus de ‘c$‘g$rf&‘d’u 1 iqujde.
:
._
4.2.3
-
.’
Contrô’l e. de eureta ,des i nocul Gms ‘.
--c-m”-‘----
--m.-...---‘-----.mc----
~ . .
Pour s’assurer de la purete de 4 ‘inoculum,, *a chgque repiquage - tube
1 ,
:. :
souches en tubes de 22, tubes de ‘22. en, .Erlenmeyer , Erl enrneyer
en f I accns de
1 0 Iltres - on ensemencera en même temps que les milieux anaérobies strictes
des milieux aérobies tels que des bouillons nutritifs ordinaires. Cette mesure
.
est jumel& avec ta confection de frottis et coloratlon de Grem de chaque
c u l t u r e .
***/ . . .
-8
j ~ Los bouillons nutritifs doivent rester sterfles, et les Grsm ne.$c:s pr6-
senter de bactêries morphologiquement différentes des clostridies,
,,.
.f
8
.
4.3 - Ensemencement d'une série de flacons de 10 litres (contenant chacun
3 litres de ml!ieu)
.
,,'
Les flacons sont sortis de I 'Gtuve et ense,monciss chacun avec 100 à 1% ml
des cultures en Erlenneyer, introduits gr%e à I 'effilure de verre sous la
.
protection de Is flamme d'un bec Mecker. Le tube de verre COIJ-~~, que pr&sante
s,
chaque'flacon, permet .d e recevoir IPeffilure de verre sans que soit retirs lc
coton qui obture le goulot du f lacon.
4.4 - Mise en culture à l'étuve
Aussitôt l'ensemencement termi&,
les flacons sont port& rj 17Qtuvc 2
37OC. Après 20 h d'Stuve,
1;' culture envahit tout le flacon, le milieu devient
opaque, et une epaisse couche de mousse bl'anche recouvre la surfaca.
Au bout dz 36 h, la sédimentation commence : le mflieu s'éclairclf-, un
cuiot microbien, plus ou moins important, spamasse au fond du flacon,
I
.'
Après 48 h, on procéderi a'iors au contrôl'e de' puretb~
;:
4.5 - Contrale de pureté et formolage
4.5.1 - Contrôle bactérioscopiguc
---1--1--1------11----
WI
On realise un'frottis de"13 culture de chacun des 12 flacons. L'uz&&i se
.,
fait apr&s coloration de Gram.. Cl,. chauve'i sur ces 'cultures de 48 h apparaft
t
plus ou moins Gram négatIf.'Les corps bactér.iens son-t parfols lys&, et la
morphologie classique nqest g&re retrouvée. Cependant les contaminations le
plus souvent rencontrées, coccl ou anthracoTdes, se signalent ais&nent
à Ci?
simp e examen. En cas, de doute, avant de formolar, on peut ensemencer la cul-
ture douteuse..en houil.ion nutritif aérobie. Les flacons soutll& seront
épi n5s.
:
:
:
: -
.
.
.
!
, ,
.
.
.
/
.
.
.
-9
4.5.2 - Addition de formol
--m.----mm---------
Les flacons ayant satisfait au test de pureté sont alors formoles S la
concentration finale de 5 p.1000. On uti iisera' le formol technique (solution
d'aldehyde formique à 40 p. 001 à la dose de 45 ml par flacon, à i*a ide d'une
éprouvette graduée. En viei 1 Issant, le titre du formo I à tendance à baisser,
II est donc recommande d'en faire le dosage de Pemps"B ' a u t r e .
Cette opération doit êt re réalisée par la même personne, en principe celle
qui dirige la production de ce vaccin ; car i'oubil d'ajouter le.formol aurait
des répercussions fâcheuses,
Après i*addition de formol, 1 es bouchons de gaze qui obturent tes f lacmis
sont remplacés par des bouchons de caoutchouc baignant dans une solution formo-
iée. Les fiaCOnS, après avoir subi une agitation vigoureuse, sont aiors rem!S
à l'étuve pour une durée de 4 Jours. Une anaculture totale est ainsi obtenue
selon le mode classique de production des anatoxines .et des anacuitures par
actton conjuguée du formol et de la chaleur.
4.6 - Prkipitation par iJaiun de p&assium et test d'innocuité sur cobayes
4.6.1 - Addition d'alun de potassium
----v----m---w----.. e---w---
Apres 4 jours d?étuve,
la culture reçoit de l'alun de potassium à la con-
centration finale de 10 p.1000, soit 900 ml d'une solution stérile d*alun 2
10 p.100 par flacon de 10 litres. Cette solution est prgpafée de la façon
sulvante :
- composition :
- alun de potassium.
..
l *............*........
1 000 g
(potassium-aluminium-sulfate)
- eau dlstiil6e
10 litres
l . . ..***...................
- technique :
.
premler jour :
,. ;
- peser 1 000 g d'alun, bien l'écraser pour le réduire en poudre,
- verser dans 10 litres d'eau distillée,
- faire fondre en agitant te mélange avec une baguette de bois,
- precipiter à l'autoclave, 30 mn à 120°C ;
- 10
_.
.
.
deux'i&w 'Jour %:
.
' - f~litier chaque flacon sur papie'r Laurerrt,
"
I
i r6aufoclaver le fritrat 30 mn à llO°C.
-,.
'
‘4.U.2 - Pr6i6vement d'6chantillcns
flacon témoin de la $rie Et-cduite
l
--~---------------,------"-~----------------------~~~~"-
---mm--
La précIpita+ioti'des p?oféines commence auss'~t6-t apr&s IPintroduc+i~~n de
l'alun. A la pip&te, on $I&v e alors 2 2 3 ml deculture dans chaque flacon.
Ces 6chantillons sont rassemblés au fur et à mesure des &-i:lèvûrnan?-'dans
un
flacon qui sera- conserv6 comme t&moin de la sérfe produite. Ne (sas cubliar
. .
d'inscrire sur le flacon, le numéro de la s&ie et la nature du vaccin prrdutt.
4.6.3 - T&st ti'innocuité sur cotsxcs
'
--1------,-----------_pI__ --
A Fart ir de ce meme flacon témoin, on,p& IBvera 3 la serin2u.e de 5 P~I?
4 ml de culture que Ivon injectera Dar wie sous-cutan6e à '2 cobayes 5 raison
de 2 ml par cobaye,
. . Su1.v 1,s pendant .8. Jtiur~.,. ces cobayes. ne 'do1v.en-l. pr&enter..auc~!-n.
.trouti 1.2.
En attendant les résultats du test dvinnocuité, I~s.flacans d2 10 1 itrtz de
vaccin $Ont stockés à la chambre froide .?I '+' 4'C,.
.
4.7 -'R6partition du vaccin
.
: .
Au Laboratoire de Dakar, le vaccin est rbparti en ampoules de 20 ~1 '(d:::s?
vaccinale : 1 ml) dans un calsson à vide.
Au Laboratoire de Farcha (?&adjp ia”t%pr-i-iti& s'effectue dans des fla-
cons (250 ml par flacon).
:
.
.
“ .
.,..,.-.,....,
V - TEST D'IMMUNITE
Ce test est 2 ,fa,ire sur bovins, à defaut sur dus moutons. il ne fsui.pas
utiliser ds cobayes où les résultstc3 sont difficiles à interpriter et-difficilo-
men-t' transposables sur bovins,..
;.
.
. . . / . . .
. *
- 11
5.1 - Protocotc
_
_
Epreuve'
RésWats
15 jours apr&s la vac-
tous survivants,
cination,
&se d'épreuve :
Quelquefois boitarie
1
d 4
e
Ivencolure
20 i 4c! CSM en intra-
‘et enflure l&gère
musculaire
de I%paule
T6molns
0
M&m szuche,dvépreuve,
itimeurs dans les
I
I
mais ?I das doses inf&
24 heurts et mort
rieur-es 4 à .O 3SM et
en 24 à 45 heures.
1 à 2 DSM
fi
5.2 - Préparation de la souche d'Épreuve
5.2.1 - Souche utilisée :
--m-------m-w--
Souche Thiès.
5.2.2 - Mode de culture
w---.m----.s-----
La culture qui sert à IYépreuve doit être une culture jeune de 15 à 18 h
en Ertenmeyer. Le boullion V-F glucosé est utilisé comme milleu.
5.2.3 - Conservation
-c----.wI----
La culture en Erlenmeyer btant termin6e, on la distribuera en flacons de
20 ml S raison de 5 ml par flacon. Mise 8 la congilatlon, puis lyophilisation.
5.2.4 - DHermlnation de fa DSM
1-----1----------------
Elle se fait par inkxlation sur bwins ou moutons. 2 ml de culture lyo-
phtlls6e reprise doivent correspondre à 20 A 40 DSM.
..* /
.*.
- 12
. .
. .
5.3 - Réalisai-ion du test
-.
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5.3'. 1
.
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- Lvinjection du vaccin se fer?) sous la oeau de l'encolure à raison
.I
-. . . . .<........<.,< . _,
.
de 2 ml par animal.
5.3.2 - Lv inject on de la dosa d!épreuve sera.faite au centre dec muscles
anc&n&s,
Iv6volutlon de la tumeur s'y observant zls6m~:t.
.
. . ._
..-. ._ .
5.3.3 - Les fait, es doses O,,t â O,5 ;ni seront injectées avec une Grinque
3 tub&-culine, Les volumes ne sont pas ramenés 5 1 ml au FI~.??
de riilutions,
de façon à ne pas pdifior la concentra-i-izn
locale
d.e.toxine. .dans..l..e muscle,..En .outre, .l 'eau .disti.l Iée ..cu..le. sh~m
physiologique ne sont pas sans action nocive sur Cl. chsuvai ;
1 ml dPune culture diluQe au .l/fO.nv.a .p.as la m8me vi,rulenc:c~qus
0,i ml de cet-te même culture pure. .
.
.
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.
.
”