RAPPORT DE CONSULTATION FAO PREVENTION DE LA PESTE ...
RAPPORT DE CONSULTATION FAO
PREVENTION DE LA PESTE
EQUINE EN ALGERIE
4 juin - 5 juillet 1990
Par
J. SARR
TABLE DES MATIERE3
pages
. . . . . . . . ..B
I. INTRODUCTION ,..............“...“................
1
I 1. PERSONNES RENCONTREES . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
3
III. SITU’ATION GENERALE DES LABORATOIRES D’ACCUEIL . . . . . . . .
._
4
A. Laboratoire de Microbiologie vétérinaire (Institut Pasteur) d’Alger.
4
1. Personnel de production . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
.
2. Equipements . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
a) Gros matériel existant . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
..M . . . . .
b) Petit matériel existant . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
c) Matériel de lyophilisation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
3. Maintenance des équipements . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
5
4. Financement . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
5
5. Problèmes liés au fonctionnement . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
B. Laboratoire vétérinaire régional de Tlemsen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
1. Personnel de diagnostic et de séro-surveillance . , . . . . . . . . . . . . . .
5
2. Equipements . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
a) Gros matériel existant . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
b) Petit matériel . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
c) Locaux . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
.
d) Elevage de souris . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
3. Maintenance . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
4. Financement . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . * . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
5. Problèmes liés au fonctionnement *.................
. . . . . . . . . . . .
I
. . . . . .
- II
IV. VACCIWS COMTRE LA PESTE EQUINE . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
9
A. Origine des souches vaccinales . . . . . . . . . ..*...............*.......
9
B. Production du lot de semence sérotype 9 (S,)
. . . . . . . . . . . . . . . . . . .
9
1. Les cellules . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
9
2. Milieu de croissance des cellules . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
.
9
3. La souche virale Tg (S,)
l
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
9
4. Lot de semence Tg (S,) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
10
a) Tests avant lyophilisation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
10
b) Contrôle après lyophi lisation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
12
C. Production du lot de semence, sérotype 4 (VRY) . . . . . . . . . . . . . . . .
1U
1. Les celiules . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
14
2. Milieu de croissance . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
14
3. La souche virale T4 (VRY) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
14
4. Lot de semence VRY . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
14
a) Tests avant lyophilisation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
15
b) Contrôle de qualité après lyophilisation . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
16
D. Tests d’innocuité et d’efficacité . . . . . . . . . . . . . . . . . ..I..............
le,
E. Stocks d’urgence (vaccins)
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
19
V. DIAGNOSTIC ET SERO-SURVEILLANCE DE LA PESTE EQUINE . . .
2ij
A. Localisation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..*..............................
2 0
B. Plan de travail . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
2 0
1. Isolement de virus sur souris . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
2c
2. Isolement de virus sur cultures cellulaires . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
20
3. Séro-surveillance . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
2r
... / ...
- III
4. Identification des souches virales isolées . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
.
5. Synthèse des résultats . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
.
VI. CONCLUSION GENERALE . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ...”
-..
VII. RECOIWAAWDATIONS
Sl
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..“........ . . . . . . . .
_-
_ f,
A. Secteur production vaccins . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..*.........
- -
B. Laboratoire de diagnostic de Tlemsen
- ,
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . ...‘.....
-?
ANNEXE 1
- Matériel complémentaire. Institut Pasteur (à acquérir)
ANNEXE 2
- Laboratoire de Tlemsen
matériel i ndispensable pour le diagnostic
1. Gros équipement
2.. Petit matériel
3. Petits animaux de laboratoire
4. Produits chimiques et milieux de cultures
ANNIEXE 3
- Milieu HBSSS
- Conditions de lyophilisation.
1. INTRODUCTION
La peste équine est une maladie virale des équidés, caractérisée par des
symptômes hémorragiques, pulmonaires et cardiaques.
Le virus responsable est transmise par des arthropodes hématophages du
genre CuIiaGks.
Les climats chauds et humides favorables à la multiplication
des insectes vecteurs contribuent considérablement au maintien et à Id très
rapide et large diffusion du virus chez les équidés vivant dans une région.
II existe 8 sérotypes du virus peste équine dont 7 semblent uniquement loca-
lisés dans la zone intertropicale sud.
Le sérotype le plus fréquemment rencontré dans la zone intertropicale nord
est le type 9.
Il a été retrouvé dans le sud Algérien en 1965.
Mais en 1987, le sérotype 4 est apparue en Espagne où il a été introduit par
des zébres importés d’Afrique Australe.
En octobre 1989, ce même sérotype est signalé au Maroc. Tout le Maghreb se
trouve donc aujourd’hui menacé par ce sérotype jusque-là inconnu dans la
région.
La peste équine à sérotype 9 et/ou 4 peut être combattue par des mesures
de police sanitaire mais surtout par la vaccination avec les sérotypes corres-
pondan ts.
C’est dans ce cadre que la FAO, à la demande du Gouvernement Algérien, a
mis en place un projet d’assistance TCP/ALG/0051 (T) pour la prévention de
la peste équine en Algérie.
. . ./ . . .
- 2
Cette mission, qui s’est déroulée du 4 juin au 5 juillet, visait les objectifs
suivants :
- démarrage d’un programme de production de vaccins type 9 et type 4, y
compris le contrôle de qualité,
- la formation du personnel du laboratoire chargé de cette production,
- faire des recommandations pour l’amélioration de cette production.
L’ensemble de ces points fait l’objet de ce rapport.
. . . / . . .
- 3
I 1. PERSONNES RENCONTREES
Dr Benaïssa Rachid
: Directeur Général services vétérinaires (Algérie)
Pr Abadi Mohamed
: Directeur Général Institut Pasteur Alger
Dr Benguedda Ahmed
: Directeur Production Institut Pasteur Alger
Dr Brahimi Mahfoud
: Responsable Laboratoire Rage Institut Pasteur Alger
Dr Cher-if Aoumeur
: Directeur Laooratoire Centrai Vétérinaire Alger
Dr Hamza Chérif Reda
: Directeur Laboratoire régional vétérinaire Tlemsen
Dr Benelmouffok Ahmed : Chef du Laboratoire de microbiologie vétérinaire,
Institut Pasteur Alger
D r Boudlimi Benabdallah : INSA (Tlemsenl
Dr Abda Ali
: D i r e c t e u r INSA
Dr Taibi Fadela
: Service Virologie Laboratoire central vétérinaire
Alger
Dr Achour Hamid
: Directeur Laboratoire régional de Draa-Ben Khedar.
Ce travail a été réalisé avec :
Dr Tari1 Hamid : Institut Pasteur (vaccins peste équine)
Dr Nadjib Chalabi : INSA (diagnostic) Tlemsen)
REERCIEENTS
Tous mes remerciements à toutes ces personnes ainsi qu’à leurs collaborateur-~
pour leur accueil et leur appui sans lesquels ce travail n’eut été possible.
. . . / . . .
I Ii. SITILIIATION GEWERALE DES LABORATOIRES D’ACCUEIL
Deux laboratoires ont été choisis pour travailler sur la peste équine :
- Laboratoire de microbiologie vétérinaire qui relève de l’Institut Pasteur
d’Alger pour le programme production de vaccins,
- Laboratoire vétérinaire de Tlemsen (environ 500 km d’Alger) relevant de
l’institut national de la Santé animale (INSA), Direction des services vétéri-
naires pour le diagnostic et la séro-surveillance.
A . L A B O R A T O I R E D E M I C R O B I O L O G I E V E T E R I N A I R E ( I N S T I T U T P A S T E U R ]
1. Personnel de production
- 1 Docteur vétérinaire
- 2 techniciens
- 1 garçon de laboratoire (laverie et stérilisation du matériel).
Ce personnel sera responsable de la production et du contrôle de qualité
des vaccins peste équine, mais aussi des vaccins aviaires comme le
vaccin
contre la maladie de Newcastle (programme en cours d’études).
La laverie et la stérilisation sont communes avec les laboratoires de sérologie
sur la brucellose et le diagnostic de la rage qui sont dans le même bâtiment.
2. Equipements
Le laboratoire est bien équipé dans t’esemble, et les locaux sont fonctionnels.
a) Gros
matériel existant
- Hotte
à flux laminaire vertical . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
1
- Etuve à CO, . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
1
- Congélateur à -2OOC . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
1
. . . / . . .
- 5
- Congélateur à -7OOC
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
1 (en panne)
- Autoclave (grande capacité) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
1
- Couveuses . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
3
- Etuve bactériologique . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
1
- Matériel filtration milieux cultures cellulaires . . . . . . . . .
4 (capacités 2 litres
chacun)
- Réfrigérateur . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
1
- Chambre froide (3 m3) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
- Appareil à eau distillée 4 I/heure
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
- Centrifugeuse Bekman (20 000 trs/mm)
. . . . . . . . . . . . . . .
- Centrfugeuse de paillasse . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
- Microscope ordinaire . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
- Microscope à fluorescence . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
- Microscope inversé . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
- Bain-marie (27 - 1 OOOC)
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
- Balance de précision . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
b) Petit matériel existant
- pH-mètre . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..a.................
- Micro-pipette (50 - 200 ul) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
- Verrerie (éprouvettes, flacons, pipettes) ]
- Matériel usage
(boÎtes/cultures
Quantités insuffisantes
cellulaires, micro?
pointes pour
micro-pipettes,
c) Matériel de lyophilisation
Les capacités de lyophilisation du service central sont insuffisantes pour
les besoins des secteurs de la production.
3. Maintenance des équipements
L’Institut Pasteur s’est doté d’une solide équipe de maintenance et répond
ainsi à l’essentiel des demandes des laboratoires.
. . . / . . .
- 6
4. Financement
II existe un service d’approvisionnement central pour tout l’Institut Pasteur
disposant d’un budget propre.
Ce service possède une grande expérience dans les commandes de materiel
de laboratoire et fonctionne bien.
5. Problèmes liés au fonctionnement
- Ruptures périodiques pour l’approvisionnement en petit matériel, en particL,-
lier pour le matériel importé (disponibilité des devises)
- Insuffisance des capacités de lyophilisation.
6. Laboratoire vétérinaire régional de Tlemsen
1. Personnel de diagnostic et de séro-surveillance
- 1 Docteur vétérinaire
- 1 technicienne supérieure
- 1 garçon de laboratoire (verrerie et stérilisation)
Ce personnel est chargé de la mise en place du laboratoire de diagnostic et
de séro- surveillance de la peste équine, mais aussi de certaines autres malc-
dies d’origine virale comme I’IBR, la Blue Tongue, la maladie de Newcastle,
e t c . . .
2. Equipements
Contrairement au Laboratoire de production de vaccins, le laboratoire Tlemse-:
connaît beaucoup de problèmes pour son démarrage pour le diagnostic et la
séro-surveillance de la peste équine.
. . . I . . .
- 7
a) Gros matériel existant
- Autoclave . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
1
Matériel partagé avec
- Four Pasteur . . . . . ‘ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
1
le laboratoire de
- Appareil à eau distillée (vétuste) 2 I/heure . 1
bactériologie
- Etuve . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..&................
1
- Microscope inversé . . . . . . . . . . . . . . . . . ..I......
1
- Réfrigérateur . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
1
- Balance . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . , . . . . . .
1
b) Petit matériel
- Verrerie (existe en quantité suffisante)
- Matériel usage unique (inexistant).
c) L o c a u x
Constitué de deux salies ayant chacune une paillasse, le Laboratoire n’est
pas fonctionnel.
Cependant,
une permutation avec la bactériologie devrait permettre de
résoudre ce problème.
d) Elevage souris
Inexistant.
3. Maintenance des équipements
II n’existe pas de service de maintenance au laboratoire de Tlemsen.
. . . I . . .
- 8
4. Financement
Aucune trésorerie n’est disponible au Laboratoire.
Toutes les opérations ayant une incidence financière relève de la direction
générale de I’INSA (Institut national de la santé animale) à Alger.
Cette situation crée de nombreux blocages dans le fonctionnement de ce
laboratoire.
5. Problèmes liés au fonctionnement
Ce laboratoire n’est pas opérationnel dans son état actuel.
_ Voir en annexe liste équipement complémentaire indispensable.
. . . I . . .
- 9
IV. VACCINS CONTRE LA I’ESTE EQUINE
A. Origine des souches vaccinales
Les deux souches vaccinales sérotype 9 (S,) et sérotype 4 (VRY) utilisées,
proviennent de la banque du Laboratoire de référence FAO pour l’Afrique :
au Laboratoire national d’Elevage et de Recherches vétérinaires, BP 2057 -
Dakar-Hann au Sénégal.
Elles sont parfaitement adaptées à la lignée de cellules Véro en vue de la
production de vaccins contre la peste équine.
B. Production du lot de semence sérotype 9 (S,)
1. Les cellules
Des cellules de lignée Véro, fournies par l’Institut Pasteur d’Alger ont étG
utilisées.
2. Milieu de croissance des cellules
- DMEM (Minimum Essential Medium) contenant 10 8 de sérum foetal de VE.ZU
pour la croissance des cellules
3. La souche virale Tg (S,)
La CTIoO de la souche virale est déterminée par titrage en cinétique.
II s’agit de la dilution limite donnant un effet cytopathogène (destruction
totale) 100 p. 100 en 6 jours de culture d’une suspension cellulaire contens?;
100.000 cellules/ml.
Souche lyophilisée reconstituée avec 1 ml de DMEM :
j
1 ~TU,,, = 1 O+
.*. /. . .
- 10
4. Lot de semence T9 (S, )
Le virus est utilisé à la dilution d’une CTlo:
pour l’infection de boîtes de
culture dont le tapis cellulaire est confluent.
Les boîtes sont incubées à l’étuve à 37°C et observées chaque jour pour
l’effet cytopathogène.
Lorsque celui-ci arrive à 80 p.100, les boites sont placées à +4cC.
Le contenu de chaque boîte est contrôlé pour sa stérilité bactériologique,
mycoplasmique et fongique.
Ensuite, le contenu de toutes les boîtes dont la stérilité est certaine, est
rassemblé dans un flacon et mélangé à raison de :
- 1 partie de suspension virale,
- 3 parties de support de lyophilisation (HBSSS)
(composition en annexe).
a) Tests avant lyophilisation
-> Contrôle de stérilité
- 3 bouillons nutritifs
Temps d’incubation :
- 3 bouillons Thioglycolate
72 h à 37OC
- 3 géloses sabouraud
7
Incubation
Bouillon
Bouillon
Gélose
i
0,5 ml/tube
n u t r i t i f
Thioglycolate
Sabouraud
1
-
2
-
3
-
Résultats : satisfaisant.
. . . / . . .
- 11
-> Teneur en virus
-1
-7
Titrage en
- 5 cupules par dilution de 10
à 10
microplaque
- 100 ul de virus
- + 100 ul d’une suspension de 100 000 cellules/ml
contenant 10 5 sérum foetal de veau en DMEM
- Incubation à 37OC en étuve à 5 % de CO, pendant
6 jour-s.
Résultat
hltrui r
‘~III d?truit
klrnulés
A
Cumulés
(1))
(N)
(Dl
(N)
D/T
10-l
5
5
0
25
0
25125
101
10-2
5
5
0
2 0
0
20120
10%
10-3
5
5
0
15
0
15115
LO,
10-4
5
5
0
10
0
lO/lO
10,
10-5
5
3
2
5
2
517
71
r
10-6
5
2
3
2
5
215
4::
10-7
5
0
5
0
10
OI10
A = nombre de cupules
D = cupule avec lésion cypathique
N = cupule sans lésion
T = total cumulé (D + N)
Méthode de Reed et Muënch
Supérieur à 50 % - 50 %
Ecart =
Supérieur à 50 % - inférieur à 50 % =
E = 71 - 5o = fi ; 0 7
71
- 40 31
’
-5 r7
CT5(] = 10
/lOO ul
_ 5r7
Titre = 10
CTso /lOO ul
6,7
Avant lyophilisation : T = 10
CT,, /ml
.
.
. /
..I
- 12
b) Contrôle après lyophilisation
Trois flacons sont reconstitués avec 1 ml de DMEM chacun.
Le contenu des flacons est ensuite mélangé.
-> Test de stérilité
- 3 bouillons nutritifs
- 3 bouillons thioglycolate
- 3 géloses sabouraud
Incubation à 37OC, 72 heures.
Incubation
Bouillon
Bouillon
Bouillon
0,5 ml/tube
nutritif
Thioglycolate
Sabouraud
-~
1
-
2
-
3
-
1
-
DMEM
2
Résultat : satisfaisant
+ Teneur en virus
Titrage en microplaque dans les mêmes conditions qu’avant la lyophilisation.
Résultat lot de semence Tg (S,) après lyophiiisation
A
D
N
Cumulés
Cumulés
(Dl
(N)
D/T
% DIT
10-l
5
5
0
23
0
23/23
10;
10-2
5
5
0
18
0
18/18
1Gi
10-3
5
5
0
13
0
13113
1Oi
lo-4
5
5
0
8
0
818
10
10-s
5
2
3
3
3
316
5i
10-6
5
1
4
1
7
118
1:
10-l
5
0
5
0
12
OI12
I
. . . . . .
- 13
E = 100 - 50
100 - 12
OJ6
T = 10- C T , , /l 00 PI
La baisse de titre pendant la lyophilisation est équivalente à 1 ,1 log 1. .
Conclusion
Lot de semence T9 (S,):satisfaisant
Résumé
Lot de semence Tq ou tS,l
Stérilité bactériologique : bonne
CT,,, = 10-4
Titre = 10 576 CT,, /ml
Taille = 460 flacons de 1 ml
. . . i . . .
- 14
C. Production du lot de semence, sérotype 4 (VRY)
1. Les cellules
- Lignée Véro.
2. Milieu de croissance
DMEM -t 10 p. 100 de sérum foetal de veau.
3. La souche virale T4 (VRY)
La CTuJ” est également déterminée par titrage en cinétique sur cellules de
lignée Véro.
Suspension cellulaire : lOO# 000 cellules/ml.
Souche virale lyophilisée reconstituée avec 1 ml de DMEM
CTloo = 10’4
4. Lot de semence (VRY)
Une CTIoO
de viruslml est utilisée pour l’infection de boîtes de culture de
cellules Véro dont le tapis est confluent.
Les boites sont incubées à 37OC.
Lorsque l’effet cytopathogène atteint 80 p, 100, les boîtes sont placées à + 4cC.
Après 24 heures,
le pH qui est généralement acide est réajusté (pH entre
7 et 8) avec une solution de bicarbonate de sodium à 5. p.100.
Puis chaque bolte est testée pour sa stérilité bactériologique, mycoplasmique
et fongique.
. . . / . . .
- 15
Comme précédemment, le contenu des boîtes dont la stérilité est certaine,
est rassemblé dans un flacon et mélangé un support de lyophilisation à
raison de :
- 1 partie suspension virale
- 3 parties support HBSSS.
a) Tests avant lyophilisation
-> Contrôle de stérilité
- 3 bouillons nutritifs
- 3 bouillons thioglycolate
- 3 géloses sabouraud
Temps d’incubation 72 h à 37OC.
/
Inoculum
Bouillon
Bouillon
C%lose
0,5 ml/tube
n u t r i t i f
thioglycolate
sabouraud
iIc82
1
2
-
3
i
Résultat : satisfaisant
.*. I. . .
- 16
-3 Teneur en virus
Titrage en microplaque comme pour le sérotupe 4.
Cumulbs
A
Détruit
Non détruit
Cumulé~
(D)
(N)
(Dl
(N)
L)/T
% D 1.1
I
I
CT,0
= 10 -5y2/1 00 1-11
5,2
Titre = 10
CT5, /700
IJI
Avant lyophilisation T = 106y2 CT,,, /ml
b) Contrôle de qualité après lyophilisation
Trois flacons sont pris au hasard, reconstitué- chacun avec 1 ml de DME.%A
puis mélangés.
. . . / . . .
- 17
--$ Test de stérilité
- 3 bouillons nutritifs
- 3 bouillons thioglycolate
- 3 géloses sabouraud
Incubation à 37OC, 72 heures.
I noculum
Bouillon
Bouillon
Gélose
0,5 ml/tube
n u t r i t i f
thioglycolate
sabouraud
/
I
-
DMEM 1
(milieu de recons:
titution) 2
----i-l -
Résultats : Satisfaisant
-+ Teneur en virus
Titrage en microplaque comme précédemment.
Résultats lot de semence TL, (VRY) après lyophilisation
A
Détruit
ion détruit
Cumulés
Cumulés
D/T
(D)
(N)
(D)
(N)
% DjT
j
5
0
22
0
22/22
1oc
II
5
0
17
0
17117
1oc
/
5
0
12
0
12112
100
/
5
0
7
0
717
100
1
5
4
2
4
216
33
5
4
1
8
119
lï
5
5
0
13
OI13
0
. . . / . . .
- 18
E=100-50 5
0
-
-
100 - 33 - 67 ’ Ot7
CT,() = 10 -4y7/1 00 ul = 105y7 /ml
T i t r e = 105y7 CTSO /ml
Perte pendant la lyophilisation 0,5 log ](,.
Résumé
Lot de semence T4 au VRY
Stérilité : bonne
CT
: 10-4
Titre : 10 5’7 C T , , / m l
Taille du lot : 480 flacons
D. Tests d’innocuité et d’efficacité
Pour des raisons de sécurité, les tests d’innocuité et d’efficacité n’ont pu
être réalisés parce que le pays est encore considéré comme zone indemne,
L’absence de locaux spécialement aménagés pour l’inoculation et I’épreLve,
interdit la conduite de ces tests.
Néanmoins,
l’aspect théorique des tests a été largement discuté avec ies
responsables du secteur production.
. . . / . . .
- 19
E. Stocks d’urgence (vaccins)
Deux lots de stocks d’urgence de vaccins :
- sérotype 9
(S*I
- sérotype 4 (VRY)
ont été réalisés à partir des banques.
Les tests de stérilité sont satisfaisants ainsi que les titres avant
lyophilisation.
Ils sont stockés à +4OC ; en attendant d’être lyophilisés.
Tous les contrôles seront refaits après la lyophilisation comme précédemment.
Lot 1/90 sérotype 9 . . . . . . . . . . .
2 000 flacons d’une dose
Lot 1/90 sérotype 4 . . . . . . . . . . .
2 000 flacons d’une dose.
. . . I . . .
- 20
V .
DIAGlNlOSTIC ET SERO-SURVEILLANCE DE LA PESTE EQUINE
A. Localisation
Laboratoire vétérinaire régional de Tlemsen
Le volet diagnostic et séro-surveillance n’a pu être réalisé pendant le séjour.
Néanmoins,
une visite du laboratoire d’accueil a été faite.
L’unité de virologie qui sera responsable du diagnostic est en cours d’installa-
tion et n’a pas encore l’équipement indispensable pour la réalisation de ce
travail.
Une liste de matériel indispensable est jointe en annexe.
B. Plan de travail
Durée : 2 - 3 semaines environ
1. Isolement de virus sur souris
. prélèvements
: conditionnement, transport
. inoculation souriceau
. récolte cerveaux souriceaux.
2. Isolement de virus sur cultures de cellules
. préparation des prélèvements
. passage sur cellules de lignée Véro (adaptation)
3. Séro-surveillance
. épreuve fixation complément en micro-méthode
. fabrication d’antigène en vue du diagnostic
. . . I . . .
- 21
. titrage d’antigène
. analyse sérums de chavaux
-+ en fixation complément
-> en séroneutralisation.
4. identification de souches virales isolées
. Séroneutralisation croisée sur souris
. Séroneutralisation cinétique sur cellules de lignée Véro.
5. Synthèse des résultats
N . B : Pour des raisons de sécurité (pays encore indemne), seules des sou-
ches vaccinales seront utilisées.
Elles seront fournies par le Laboratoire de Microbiologie Vétérinaire de
l’Institut Pasteur d’Alger (secteur production].
. . . / . . .
- 22
VI. CONCLUSION GENIERALE
Au cours de cette mission, l’objectif essentiel a été atteint :
Démarrage d’un programme de production de vaccins contre la peste équine.
Les lots de semence des sérotypes qui m’enacent la région ont été produits
dans les conditions locales.
Les tests de contrôle montrent également que les lots sont conformes aux
normes internationales quant à leur teneur en virus et à leur stérilité bactério-
logique,
mycoplasmique et fongique.
Les contrôles d’innocuité et d’efficacité n’ont pu être réalisés comme signalés
plus haut uniquement pour des raisons de sécurité ; la zone étant encore
considérée comme indemne.
Deux lots de vaccins représentant les stocks de sécurité ont également été
produits.
Les insuffisances en matière de lyophilisation ont fait qu’ils n’ont pu être
lyophilisés dans les délais. Ils le seront dès que possible.
Ces stocks d’urgence permettront aux services vétérinaires d’intervenir très
rapidement en cas de foyers et permettront aussi au secteur production de
disposer suffisamment de temps pour préparer d’autres lots.
Pour ce qui est de la formation des agents de laboratoire, l’équipe a travaillé
pendant toute la période de la mission à plein temps dans toutes les étapes de
la production et du contrôle de qualité des différents lots.
Aussi, le responsable a déjà effectué un mois de stage au laboratoire de réfé-
rence FAO pour la peste équine.
A notre avis, la production de vaccins c’ontre la peste équine ne devrait plus
poser de problèmes au Laboratoire de Microbiologie vétérinaire de l’Institut
Pasteur d’Alger pour les raisons suivantes :
. . . / . . .
- 23
- le personnel est bien formé,
- l’équipement et le matériel existent du moins pour l’essentiel,
- les locaux sont fonctionnels même si quelques réaménagements (isola-
tion) sont encore nécessaires.
Pour le volet diagnostic, le problèmes reste malheureusement entier.
En cas de foyer, le Laboratoire de Tlemsen ne pourrait pas effectuer le diagnos-
tic dans les conditions actuelles pour les raisons signalées plus haut.
Cependant, des alternatives existent et ont été discutées avec le Directeur
Général des services vétérinaires.
. . . I . . .
- 24
VII . RECOMMANDATIONS
A. Secteur production de vaccins
- Acquisition d’équipements complémentaires (lyophilisateur et accessoires).
- Regrouper pour des raisons d’efficacité et d’économie l’ensemble des projets
de production de vaccins vétérinaires (peste équine, clavelée, vaccins aviaires)
au Laboratoire de Microbiologie vétérinaire et les séparer du diagnostic de
la rage.
- Réorganisation de la laverie et stérilisation pour mieux répondre aux besoins
d’un laboratoire de virologie.
- Aménagement de locaux permettant la C<onduite des tests d’innocuité et d’effica-
cité des vaccins.
- Fourniture par le service d’approvisionnement central de petit matériel
(boites cultures cellulaires, pipettes multicanaux, pointes pour micro-pipette,
microplaques et verrerie diverse.. . ) .
B. Laboratoire de diagnostic (Tlemsen)
- Equiper très rapidement ce Laboratoire,
- le doter d’un élevage souris.
- Aquisition de moyens financiers rapidement mobilisables (caisse d’avance)
pour les urgences.
- Organiser une consultation”spéciaI diagnosticpour une durée de 2 à 3
semaines à Tlemsen ou dans un autre laboratoire vétérinaire mieux. équipé.
Des agents d’autres laboratoires vétérinaires régionaux devraient y participer
pour leur formation.
l
. . . . . .
- 25
Une extension de TCP/ALG/0051 (T) devrait permettre de résoudre ce
problème.
- Création au niveau de I’INSA d’une cellule de coordination et d’information
en matière de séro-surveillance pour la peste équine.
ANNEXE 1
Matériel complémentaire (Institut Pasteur (à acquérir)
Lyophilisateur (type D 01 Edwards) . . . . . . . . . . . . . . . . .
Refroidisseur . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Plateaux (correspondant) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Climatiseur 1,5 CV . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
ANNEXE 2
Laboratoire de Tlemsen
Matériel indispensable pour le diagnostic
1. Gros équipement
- Climatiseur 2 CV . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
- Etuve à CO, . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
- Hotte à flux laminaire vertical . . . . . . . . . . . . . . . . . .
- Centrifugeuse réfrigérée 4 - 10 000 trs/mm . . . . . .
- Bain-marie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
- Congélateur -3OOC . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
- pH mètre . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
- Appareil au eau distillée 4 I/h
. . . . . . . . . . . . . . . . . .
- Matériel filtration milieux 2 x 2 litres . . . . . . . . . . .
2. Petit matériel
- Boîtes de cultures cellulaires (25,75 cm2)
. . . . . . .
200
- Agitateur de plaque . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
1
- Micro-pipettes multicanaux 50 - 200 u( . . . . . . . . . .
1
50 - 5OlJ-11
. . . . . . . . . .
1
- Plaques 96 pour cultures cellulaires . . . . . . . . . . . . .
200
- Plaques 96 fond rond (sérologie) . . . . . . . . . . . . . . .
200
- Pointes pour micro-pipette . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
10 000
- Tubes vacutainer 10 ml . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
1 000
- Tubes vacutainer + anti-coagulant . . . . . . . . . . .
100
-Filtre millipore 0,22 ~1 (1 - 10 ml) . . . . . . . . . . .
100
- Papier Kraft (rouleau) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
1
- Coton cardé (kg) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
5
. . . l . . .
- Gaze (pièce) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
1
- Ficelle (fibre végétale) (rouleau) . . . . . . . . . . . . . . .
2
- Ether (litre) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
1
- Alcool (litre) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
1
- Seringues (1 ml, 5 ml, 10 ml) . . . . . . . . . . . . . . . . . .
100
- Cages à souris . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
20
3. Petits animaux laboratoire
- Elevage souris
4. Produits chimiques et milieux de culture
- Trypsine 11250 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
20 g
- Versène . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
20 cl
- Sérum foetal veau . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
2 I
- DMEM . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
100 1.
ANNEXE 3
Milieu HBSSS
pour 2 litres
Ca CI,
2H,,
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
0,371 g
K c l . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
‘3,8 g
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
on12 g
K H 2 pw+
M g SO4
7 H 20 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
or4 g
Na, H Foi+
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
0,095 g
Glucose
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
2g
N a H C , ,
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
or7 g
Rouge de phénol . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
0,034 g
Saccharose
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
200 g
Hydrolysat Lactalbumine . . . . . . . . . . .
50 !3
Nacl . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
‘6 4
filtrer après dissolution complète.
Conditions de lyophilisation
- Congélation . . . . . . . . . . . . . . .
-4ooc
- Sublimation . . . . . . . . . . . . . . .
-3OOC
- t” finale produit . . . . . . . . . .
28OC
- Chauffage cyclique .*....
1 /20e.
PREVENTION DE LA PESTE
EQUINE EN ALGERIE
4 juin - 5 juillet 1990
Par
J. SARR
TABLE DES MATIERE3
pages
. . . . . . . . ..B
I. INTRODUCTION ,..............“...“................
1
I 1. PERSONNES RENCONTREES . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
3
III. SITU’ATION GENERALE DES LABORATOIRES D’ACCUEIL . . . . . . . .
._
4
A. Laboratoire de Microbiologie vétérinaire (Institut Pasteur) d’Alger.
4
1. Personnel de production . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
.
2. Equipements . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
a) Gros matériel existant . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
..M . . . . .
b) Petit matériel existant . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
c) Matériel de lyophilisation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
3. Maintenance des équipements . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
5
4. Financement . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
5
5. Problèmes liés au fonctionnement . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
B. Laboratoire vétérinaire régional de Tlemsen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
1. Personnel de diagnostic et de séro-surveillance . , . . . . . . . . . . . . . .
5
2. Equipements . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
a) Gros matériel existant . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
b) Petit matériel . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
c) Locaux . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
.
d) Elevage de souris . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
3. Maintenance . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
4. Financement . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . * . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
5. Problèmes liés au fonctionnement *.................
. . . . . . . . . . . .
I
. . . . . .
- II
IV. VACCIWS COMTRE LA PESTE EQUINE . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
9
A. Origine des souches vaccinales . . . . . . . . . ..*...............*.......
9
B. Production du lot de semence sérotype 9 (S,)
. . . . . . . . . . . . . . . . . . .
9
1. Les cellules . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
9
2. Milieu de croissance des cellules . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
.
9
3. La souche virale Tg (S,)
l
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
9
4. Lot de semence Tg (S,) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
10
a) Tests avant lyophilisation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
10
b) Contrôle après lyophi lisation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
12
C. Production du lot de semence, sérotype 4 (VRY) . . . . . . . . . . . . . . . .
1U
1. Les celiules . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
14
2. Milieu de croissance . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
14
3. La souche virale T4 (VRY) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
14
4. Lot de semence VRY . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
14
a) Tests avant lyophilisation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
15
b) Contrôle de qualité après lyophilisation . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
16
D. Tests d’innocuité et d’efficacité . . . . . . . . . . . . . . . . . ..I..............
le,
E. Stocks d’urgence (vaccins)
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
19
V. DIAGNOSTIC ET SERO-SURVEILLANCE DE LA PESTE EQUINE . . .
2ij
A. Localisation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..*..............................
2 0
B. Plan de travail . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
2 0
1. Isolement de virus sur souris . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
2c
2. Isolement de virus sur cultures cellulaires . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
20
3. Séro-surveillance . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
2r
... / ...
- III
4. Identification des souches virales isolées . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
.
5. Synthèse des résultats . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
.
VI. CONCLUSION GENERALE . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ...”
-..
VII. RECOIWAAWDATIONS
Sl
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..“........ . . . . . . . .
_-
_ f,
A. Secteur production vaccins . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..*.........
- -
B. Laboratoire de diagnostic de Tlemsen
- ,
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . ...‘.....
-?
ANNEXE 1
- Matériel complémentaire. Institut Pasteur (à acquérir)
ANNEXE 2
- Laboratoire de Tlemsen
matériel i ndispensable pour le diagnostic
1. Gros équipement
2.. Petit matériel
3. Petits animaux de laboratoire
4. Produits chimiques et milieux de cultures
ANNIEXE 3
- Milieu HBSSS
- Conditions de lyophilisation.
1. INTRODUCTION
La peste équine est une maladie virale des équidés, caractérisée par des
symptômes hémorragiques, pulmonaires et cardiaques.
Le virus responsable est transmise par des arthropodes hématophages du
genre CuIiaGks.
Les climats chauds et humides favorables à la multiplication
des insectes vecteurs contribuent considérablement au maintien et à Id très
rapide et large diffusion du virus chez les équidés vivant dans une région.
II existe 8 sérotypes du virus peste équine dont 7 semblent uniquement loca-
lisés dans la zone intertropicale sud.
Le sérotype le plus fréquemment rencontré dans la zone intertropicale nord
est le type 9.
Il a été retrouvé dans le sud Algérien en 1965.
Mais en 1987, le sérotype 4 est apparue en Espagne où il a été introduit par
des zébres importés d’Afrique Australe.
En octobre 1989, ce même sérotype est signalé au Maroc. Tout le Maghreb se
trouve donc aujourd’hui menacé par ce sérotype jusque-là inconnu dans la
région.
La peste équine à sérotype 9 et/ou 4 peut être combattue par des mesures
de police sanitaire mais surtout par la vaccination avec les sérotypes corres-
pondan ts.
C’est dans ce cadre que la FAO, à la demande du Gouvernement Algérien, a
mis en place un projet d’assistance TCP/ALG/0051 (T) pour la prévention de
la peste équine en Algérie.
. . ./ . . .
- 2
Cette mission, qui s’est déroulée du 4 juin au 5 juillet, visait les objectifs
suivants :
- démarrage d’un programme de production de vaccins type 9 et type 4, y
compris le contrôle de qualité,
- la formation du personnel du laboratoire chargé de cette production,
- faire des recommandations pour l’amélioration de cette production.
L’ensemble de ces points fait l’objet de ce rapport.
. . . / . . .
- 3
I 1. PERSONNES RENCONTREES
Dr Benaïssa Rachid
: Directeur Général services vétérinaires (Algérie)
Pr Abadi Mohamed
: Directeur Général Institut Pasteur Alger
Dr Benguedda Ahmed
: Directeur Production Institut Pasteur Alger
Dr Brahimi Mahfoud
: Responsable Laboratoire Rage Institut Pasteur Alger
Dr Cher-if Aoumeur
: Directeur Laooratoire Centrai Vétérinaire Alger
Dr Hamza Chérif Reda
: Directeur Laboratoire régional vétérinaire Tlemsen
Dr Benelmouffok Ahmed : Chef du Laboratoire de microbiologie vétérinaire,
Institut Pasteur Alger
D r Boudlimi Benabdallah : INSA (Tlemsenl
Dr Abda Ali
: D i r e c t e u r INSA
Dr Taibi Fadela
: Service Virologie Laboratoire central vétérinaire
Alger
Dr Achour Hamid
: Directeur Laboratoire régional de Draa-Ben Khedar.
Ce travail a été réalisé avec :
Dr Tari1 Hamid : Institut Pasteur (vaccins peste équine)
Dr Nadjib Chalabi : INSA (diagnostic) Tlemsen)
REERCIEENTS
Tous mes remerciements à toutes ces personnes ainsi qu’à leurs collaborateur-~
pour leur accueil et leur appui sans lesquels ce travail n’eut été possible.
. . . / . . .
I Ii. SITILIIATION GEWERALE DES LABORATOIRES D’ACCUEIL
Deux laboratoires ont été choisis pour travailler sur la peste équine :
- Laboratoire de microbiologie vétérinaire qui relève de l’Institut Pasteur
d’Alger pour le programme production de vaccins,
- Laboratoire vétérinaire de Tlemsen (environ 500 km d’Alger) relevant de
l’institut national de la Santé animale (INSA), Direction des services vétéri-
naires pour le diagnostic et la séro-surveillance.
A . L A B O R A T O I R E D E M I C R O B I O L O G I E V E T E R I N A I R E ( I N S T I T U T P A S T E U R ]
1. Personnel de production
- 1 Docteur vétérinaire
- 2 techniciens
- 1 garçon de laboratoire (laverie et stérilisation du matériel).
Ce personnel sera responsable de la production et du contrôle de qualité
des vaccins peste équine, mais aussi des vaccins aviaires comme le
vaccin
contre la maladie de Newcastle (programme en cours d’études).
La laverie et la stérilisation sont communes avec les laboratoires de sérologie
sur la brucellose et le diagnostic de la rage qui sont dans le même bâtiment.
2. Equipements
Le laboratoire est bien équipé dans t’esemble, et les locaux sont fonctionnels.
a) Gros
matériel existant
- Hotte
à flux laminaire vertical . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
1
- Etuve à CO, . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
1
- Congélateur à -2OOC . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
1
. . . / . . .
- 5
- Congélateur à -7OOC
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
1 (en panne)
- Autoclave (grande capacité) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
1
- Couveuses . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
3
- Etuve bactériologique . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
1
- Matériel filtration milieux cultures cellulaires . . . . . . . . .
4 (capacités 2 litres
chacun)
- Réfrigérateur . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
1
- Chambre froide (3 m3) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
- Appareil à eau distillée 4 I/heure
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
- Centrifugeuse Bekman (20 000 trs/mm)
. . . . . . . . . . . . . . .
- Centrfugeuse de paillasse . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
- Microscope ordinaire . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
- Microscope à fluorescence . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
- Microscope inversé . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
- Bain-marie (27 - 1 OOOC)
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
- Balance de précision . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
b) Petit matériel existant
- pH-mètre . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..a.................
- Micro-pipette (50 - 200 ul) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
- Verrerie (éprouvettes, flacons, pipettes) ]
- Matériel usage
(boÎtes/cultures
Quantités insuffisantes
cellulaires, micro?
pointes pour
micro-pipettes,
c) Matériel de lyophilisation
Les capacités de lyophilisation du service central sont insuffisantes pour
les besoins des secteurs de la production.
3. Maintenance des équipements
L’Institut Pasteur s’est doté d’une solide équipe de maintenance et répond
ainsi à l’essentiel des demandes des laboratoires.
. . . / . . .
- 6
4. Financement
II existe un service d’approvisionnement central pour tout l’Institut Pasteur
disposant d’un budget propre.
Ce service possède une grande expérience dans les commandes de materiel
de laboratoire et fonctionne bien.
5. Problèmes liés au fonctionnement
- Ruptures périodiques pour l’approvisionnement en petit matériel, en particL,-
lier pour le matériel importé (disponibilité des devises)
- Insuffisance des capacités de lyophilisation.
6. Laboratoire vétérinaire régional de Tlemsen
1. Personnel de diagnostic et de séro-surveillance
- 1 Docteur vétérinaire
- 1 technicienne supérieure
- 1 garçon de laboratoire (verrerie et stérilisation)
Ce personnel est chargé de la mise en place du laboratoire de diagnostic et
de séro- surveillance de la peste équine, mais aussi de certaines autres malc-
dies d’origine virale comme I’IBR, la Blue Tongue, la maladie de Newcastle,
e t c . . .
2. Equipements
Contrairement au Laboratoire de production de vaccins, le laboratoire Tlemse-:
connaît beaucoup de problèmes pour son démarrage pour le diagnostic et la
séro-surveillance de la peste équine.
. . . I . . .
- 7
a) Gros matériel existant
- Autoclave . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
1
Matériel partagé avec
- Four Pasteur . . . . . ‘ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
1
le laboratoire de
- Appareil à eau distillée (vétuste) 2 I/heure . 1
bactériologie
- Etuve . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..&................
1
- Microscope inversé . . . . . . . . . . . . . . . . . ..I......
1
- Réfrigérateur . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
1
- Balance . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . , . . . . . .
1
b) Petit matériel
- Verrerie (existe en quantité suffisante)
- Matériel usage unique (inexistant).
c) L o c a u x
Constitué de deux salies ayant chacune une paillasse, le Laboratoire n’est
pas fonctionnel.
Cependant,
une permutation avec la bactériologie devrait permettre de
résoudre ce problème.
d) Elevage souris
Inexistant.
3. Maintenance des équipements
II n’existe pas de service de maintenance au laboratoire de Tlemsen.
. . . I . . .
- 8
4. Financement
Aucune trésorerie n’est disponible au Laboratoire.
Toutes les opérations ayant une incidence financière relève de la direction
générale de I’INSA (Institut national de la santé animale) à Alger.
Cette situation crée de nombreux blocages dans le fonctionnement de ce
laboratoire.
5. Problèmes liés au fonctionnement
Ce laboratoire n’est pas opérationnel dans son état actuel.
_ Voir en annexe liste équipement complémentaire indispensable.
. . . I . . .
- 9
IV. VACCINS CONTRE LA I’ESTE EQUINE
A. Origine des souches vaccinales
Les deux souches vaccinales sérotype 9 (S,) et sérotype 4 (VRY) utilisées,
proviennent de la banque du Laboratoire de référence FAO pour l’Afrique :
au Laboratoire national d’Elevage et de Recherches vétérinaires, BP 2057 -
Dakar-Hann au Sénégal.
Elles sont parfaitement adaptées à la lignée de cellules Véro en vue de la
production de vaccins contre la peste équine.
B. Production du lot de semence sérotype 9 (S,)
1. Les cellules
Des cellules de lignée Véro, fournies par l’Institut Pasteur d’Alger ont étG
utilisées.
2. Milieu de croissance des cellules
- DMEM (Minimum Essential Medium) contenant 10 8 de sérum foetal de VE.ZU
pour la croissance des cellules
3. La souche virale Tg (S,)
La CTIoO de la souche virale est déterminée par titrage en cinétique.
II s’agit de la dilution limite donnant un effet cytopathogène (destruction
totale) 100 p. 100 en 6 jours de culture d’une suspension cellulaire contens?;
100.000 cellules/ml.
Souche lyophilisée reconstituée avec 1 ml de DMEM :
j
1 ~TU,,, = 1 O+
.*. /. . .
- 10
4. Lot de semence T9 (S, )
Le virus est utilisé à la dilution d’une CTlo:
pour l’infection de boîtes de
culture dont le tapis cellulaire est confluent.
Les boîtes sont incubées à l’étuve à 37°C et observées chaque jour pour
l’effet cytopathogène.
Lorsque celui-ci arrive à 80 p.100, les boites sont placées à +4cC.
Le contenu de chaque boîte est contrôlé pour sa stérilité bactériologique,
mycoplasmique et fongique.
Ensuite, le contenu de toutes les boîtes dont la stérilité est certaine, est
rassemblé dans un flacon et mélangé à raison de :
- 1 partie de suspension virale,
- 3 parties de support de lyophilisation (HBSSS)
(composition en annexe).
a) Tests avant lyophilisation
-> Contrôle de stérilité
- 3 bouillons nutritifs
Temps d’incubation :
- 3 bouillons Thioglycolate
72 h à 37OC
- 3 géloses sabouraud
7
Incubation
Bouillon
Bouillon
Gélose
i
0,5 ml/tube
n u t r i t i f
Thioglycolate
Sabouraud
1
-
2
-
3
-
Résultats : satisfaisant.
. . . / . . .
- 11
-> Teneur en virus
-1
-7
Titrage en
- 5 cupules par dilution de 10
à 10
microplaque
- 100 ul de virus
- + 100 ul d’une suspension de 100 000 cellules/ml
contenant 10 5 sérum foetal de veau en DMEM
- Incubation à 37OC en étuve à 5 % de CO, pendant
6 jour-s.
Résultat
hltrui r
‘~III d?truit
klrnulés
A
Cumulés
(1))
(N)
(Dl
(N)
D/T
10-l
5
5
0
25
0
25125
101
10-2
5
5
0
2 0
0
20120
10%
10-3
5
5
0
15
0
15115
LO,
10-4
5
5
0
10
0
lO/lO
10,
10-5
5
3
2
5
2
517
71
r
10-6
5
2
3
2
5
215
4::
10-7
5
0
5
0
10
OI10
A = nombre de cupules
D = cupule avec lésion cypathique
N = cupule sans lésion
T = total cumulé (D + N)
Méthode de Reed et Muënch
Supérieur à 50 % - 50 %
Ecart =
Supérieur à 50 % - inférieur à 50 % =
E = 71 - 5o = fi ; 0 7
71
- 40 31
’
-5 r7
CT5(] = 10
/lOO ul
_ 5r7
Titre = 10
CTso /lOO ul
6,7
Avant lyophilisation : T = 10
CT,, /ml
.
.
. /
..I
- 12
b) Contrôle après lyophilisation
Trois flacons sont reconstitués avec 1 ml de DMEM chacun.
Le contenu des flacons est ensuite mélangé.
-> Test de stérilité
- 3 bouillons nutritifs
- 3 bouillons thioglycolate
- 3 géloses sabouraud
Incubation à 37OC, 72 heures.
Incubation
Bouillon
Bouillon
Bouillon
0,5 ml/tube
nutritif
Thioglycolate
Sabouraud
-~
1
-
2
-
3
-
1
-
DMEM
2
Résultat : satisfaisant
+ Teneur en virus
Titrage en microplaque dans les mêmes conditions qu’avant la lyophilisation.
Résultat lot de semence Tg (S,) après lyophiiisation
A
D
N
Cumulés
Cumulés
(Dl
(N)
D/T
% DIT
10-l
5
5
0
23
0
23/23
10;
10-2
5
5
0
18
0
18/18
1Gi
10-3
5
5
0
13
0
13113
1Oi
lo-4
5
5
0
8
0
818
10
10-s
5
2
3
3
3
316
5i
10-6
5
1
4
1
7
118
1:
10-l
5
0
5
0
12
OI12
I
. . . . . .
- 13
E = 100 - 50
100 - 12
OJ6
T = 10- C T , , /l 00 PI
La baisse de titre pendant la lyophilisation est équivalente à 1 ,1 log 1. .
Conclusion
Lot de semence T9 (S,):satisfaisant
Résumé
Lot de semence Tq ou tS,l
Stérilité bactériologique : bonne
CT,,, = 10-4
Titre = 10 576 CT,, /ml
Taille = 460 flacons de 1 ml
. . . i . . .
- 14
C. Production du lot de semence, sérotype 4 (VRY)
1. Les cellules
- Lignée Véro.
2. Milieu de croissance
DMEM -t 10 p. 100 de sérum foetal de veau.
3. La souche virale T4 (VRY)
La CTuJ” est également déterminée par titrage en cinétique sur cellules de
lignée Véro.
Suspension cellulaire : lOO# 000 cellules/ml.
Souche virale lyophilisée reconstituée avec 1 ml de DMEM
CTloo = 10’4
4. Lot de semence (VRY)
Une CTIoO
de viruslml est utilisée pour l’infection de boîtes de culture de
cellules Véro dont le tapis est confluent.
Les boites sont incubées à 37OC.
Lorsque l’effet cytopathogène atteint 80 p, 100, les boîtes sont placées à + 4cC.
Après 24 heures,
le pH qui est généralement acide est réajusté (pH entre
7 et 8) avec une solution de bicarbonate de sodium à 5. p.100.
Puis chaque bolte est testée pour sa stérilité bactériologique, mycoplasmique
et fongique.
. . . / . . .
- 15
Comme précédemment, le contenu des boîtes dont la stérilité est certaine,
est rassemblé dans un flacon et mélangé un support de lyophilisation à
raison de :
- 1 partie suspension virale
- 3 parties support HBSSS.
a) Tests avant lyophilisation
-> Contrôle de stérilité
- 3 bouillons nutritifs
- 3 bouillons thioglycolate
- 3 géloses sabouraud
Temps d’incubation 72 h à 37OC.
/
Inoculum
Bouillon
Bouillon
C%lose
0,5 ml/tube
n u t r i t i f
thioglycolate
sabouraud
iIc82
1
2
-
3
i
Résultat : satisfaisant
.*. I. . .
- 16
-3 Teneur en virus
Titrage en microplaque comme pour le sérotupe 4.
Cumulbs
A
Détruit
Non détruit
Cumulé~
(D)
(N)
(Dl
(N)
L)/T
% D 1.1
I
I
CT,0
= 10 -5y2/1 00 1-11
5,2
Titre = 10
CT5, /700
IJI
Avant lyophilisation T = 106y2 CT,,, /ml
b) Contrôle de qualité après lyophilisation
Trois flacons sont pris au hasard, reconstitué- chacun avec 1 ml de DME.%A
puis mélangés.
. . . / . . .
- 17
--$ Test de stérilité
- 3 bouillons nutritifs
- 3 bouillons thioglycolate
- 3 géloses sabouraud
Incubation à 37OC, 72 heures.
I noculum
Bouillon
Bouillon
Gélose
0,5 ml/tube
n u t r i t i f
thioglycolate
sabouraud
/
I
-
DMEM 1
(milieu de recons:
titution) 2
----i-l -
Résultats : Satisfaisant
-+ Teneur en virus
Titrage en microplaque comme précédemment.
Résultats lot de semence TL, (VRY) après lyophilisation
A
Détruit
ion détruit
Cumulés
Cumulés
D/T
(D)
(N)
(D)
(N)
% DjT
j
5
0
22
0
22/22
1oc
II
5
0
17
0
17117
1oc
/
5
0
12
0
12112
100
/
5
0
7
0
717
100
1
5
4
2
4
216
33
5
4
1
8
119
lï
5
5
0
13
OI13
0
. . . / . . .
- 18
E=100-50 5
0
-
-
100 - 33 - 67 ’ Ot7
CT,() = 10 -4y7/1 00 ul = 105y7 /ml
T i t r e = 105y7 CTSO /ml
Perte pendant la lyophilisation 0,5 log ](,.
Résumé
Lot de semence T4 au VRY
Stérilité : bonne
CT
: 10-4
Titre : 10 5’7 C T , , / m l
Taille du lot : 480 flacons
D. Tests d’innocuité et d’efficacité
Pour des raisons de sécurité, les tests d’innocuité et d’efficacité n’ont pu
être réalisés parce que le pays est encore considéré comme zone indemne,
L’absence de locaux spécialement aménagés pour l’inoculation et I’épreLve,
interdit la conduite de ces tests.
Néanmoins,
l’aspect théorique des tests a été largement discuté avec ies
responsables du secteur production.
. . . / . . .
- 19
E. Stocks d’urgence (vaccins)
Deux lots de stocks d’urgence de vaccins :
- sérotype 9
(S*I
- sérotype 4 (VRY)
ont été réalisés à partir des banques.
Les tests de stérilité sont satisfaisants ainsi que les titres avant
lyophilisation.
Ils sont stockés à +4OC ; en attendant d’être lyophilisés.
Tous les contrôles seront refaits après la lyophilisation comme précédemment.
Lot 1/90 sérotype 9 . . . . . . . . . . .
2 000 flacons d’une dose
Lot 1/90 sérotype 4 . . . . . . . . . . .
2 000 flacons d’une dose.
. . . I . . .
- 20
V .
DIAGlNlOSTIC ET SERO-SURVEILLANCE DE LA PESTE EQUINE
A. Localisation
Laboratoire vétérinaire régional de Tlemsen
Le volet diagnostic et séro-surveillance n’a pu être réalisé pendant le séjour.
Néanmoins,
une visite du laboratoire d’accueil a été faite.
L’unité de virologie qui sera responsable du diagnostic est en cours d’installa-
tion et n’a pas encore l’équipement indispensable pour la réalisation de ce
travail.
Une liste de matériel indispensable est jointe en annexe.
B. Plan de travail
Durée : 2 - 3 semaines environ
1. Isolement de virus sur souris
. prélèvements
: conditionnement, transport
. inoculation souriceau
. récolte cerveaux souriceaux.
2. Isolement de virus sur cultures de cellules
. préparation des prélèvements
. passage sur cellules de lignée Véro (adaptation)
3. Séro-surveillance
. épreuve fixation complément en micro-méthode
. fabrication d’antigène en vue du diagnostic
. . . I . . .
- 21
. titrage d’antigène
. analyse sérums de chavaux
-+ en fixation complément
-> en séroneutralisation.
4. identification de souches virales isolées
. Séroneutralisation croisée sur souris
. Séroneutralisation cinétique sur cellules de lignée Véro.
5. Synthèse des résultats
N . B : Pour des raisons de sécurité (pays encore indemne), seules des sou-
ches vaccinales seront utilisées.
Elles seront fournies par le Laboratoire de Microbiologie Vétérinaire de
l’Institut Pasteur d’Alger (secteur production].
. . . / . . .
- 22
VI. CONCLUSION GENIERALE
Au cours de cette mission, l’objectif essentiel a été atteint :
Démarrage d’un programme de production de vaccins contre la peste équine.
Les lots de semence des sérotypes qui m’enacent la région ont été produits
dans les conditions locales.
Les tests de contrôle montrent également que les lots sont conformes aux
normes internationales quant à leur teneur en virus et à leur stérilité bactério-
logique,
mycoplasmique et fongique.
Les contrôles d’innocuité et d’efficacité n’ont pu être réalisés comme signalés
plus haut uniquement pour des raisons de sécurité ; la zone étant encore
considérée comme indemne.
Deux lots de vaccins représentant les stocks de sécurité ont également été
produits.
Les insuffisances en matière de lyophilisation ont fait qu’ils n’ont pu être
lyophilisés dans les délais. Ils le seront dès que possible.
Ces stocks d’urgence permettront aux services vétérinaires d’intervenir très
rapidement en cas de foyers et permettront aussi au secteur production de
disposer suffisamment de temps pour préparer d’autres lots.
Pour ce qui est de la formation des agents de laboratoire, l’équipe a travaillé
pendant toute la période de la mission à plein temps dans toutes les étapes de
la production et du contrôle de qualité des différents lots.
Aussi, le responsable a déjà effectué un mois de stage au laboratoire de réfé-
rence FAO pour la peste équine.
A notre avis, la production de vaccins c’ontre la peste équine ne devrait plus
poser de problèmes au Laboratoire de Microbiologie vétérinaire de l’Institut
Pasteur d’Alger pour les raisons suivantes :
. . . / . . .
- 23
- le personnel est bien formé,
- l’équipement et le matériel existent du moins pour l’essentiel,
- les locaux sont fonctionnels même si quelques réaménagements (isola-
tion) sont encore nécessaires.
Pour le volet diagnostic, le problèmes reste malheureusement entier.
En cas de foyer, le Laboratoire de Tlemsen ne pourrait pas effectuer le diagnos-
tic dans les conditions actuelles pour les raisons signalées plus haut.
Cependant, des alternatives existent et ont été discutées avec le Directeur
Général des services vétérinaires.
. . . I . . .
- 24
VII . RECOMMANDATIONS
A. Secteur production de vaccins
- Acquisition d’équipements complémentaires (lyophilisateur et accessoires).
- Regrouper pour des raisons d’efficacité et d’économie l’ensemble des projets
de production de vaccins vétérinaires (peste équine, clavelée, vaccins aviaires)
au Laboratoire de Microbiologie vétérinaire et les séparer du diagnostic de
la rage.
- Réorganisation de la laverie et stérilisation pour mieux répondre aux besoins
d’un laboratoire de virologie.
- Aménagement de locaux permettant la C<onduite des tests d’innocuité et d’effica-
cité des vaccins.
- Fourniture par le service d’approvisionnement central de petit matériel
(boites cultures cellulaires, pipettes multicanaux, pointes pour micro-pipette,
microplaques et verrerie diverse.. . ) .
B. Laboratoire de diagnostic (Tlemsen)
- Equiper très rapidement ce Laboratoire,
- le doter d’un élevage souris.
- Aquisition de moyens financiers rapidement mobilisables (caisse d’avance)
pour les urgences.
- Organiser une consultation”spéciaI diagnosticpour une durée de 2 à 3
semaines à Tlemsen ou dans un autre laboratoire vétérinaire mieux. équipé.
Des agents d’autres laboratoires vétérinaires régionaux devraient y participer
pour leur formation.
l
. . . . . .
- 25
Une extension de TCP/ALG/0051 (T) devrait permettre de résoudre ce
problème.
- Création au niveau de I’INSA d’une cellule de coordination et d’information
en matière de séro-surveillance pour la peste équine.
ANNEXE 1
Matériel complémentaire (Institut Pasteur (à acquérir)
Lyophilisateur (type D 01 Edwards) . . . . . . . . . . . . . . . . .
Refroidisseur . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Plateaux (correspondant) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Climatiseur 1,5 CV . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
ANNEXE 2
Laboratoire de Tlemsen
Matériel indispensable pour le diagnostic
1. Gros équipement
- Climatiseur 2 CV . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
- Etuve à CO, . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
- Hotte à flux laminaire vertical . . . . . . . . . . . . . . . . . .
- Centrifugeuse réfrigérée 4 - 10 000 trs/mm . . . . . .
- Bain-marie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
- Congélateur -3OOC . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
- pH mètre . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
- Appareil au eau distillée 4 I/h
. . . . . . . . . . . . . . . . . .
- Matériel filtration milieux 2 x 2 litres . . . . . . . . . . .
2. Petit matériel
- Boîtes de cultures cellulaires (25,75 cm2)
. . . . . . .
200
- Agitateur de plaque . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
1
- Micro-pipettes multicanaux 50 - 200 u( . . . . . . . . . .
1
50 - 5OlJ-11
. . . . . . . . . .
1
- Plaques 96 pour cultures cellulaires . . . . . . . . . . . . .
200
- Plaques 96 fond rond (sérologie) . . . . . . . . . . . . . . .
200
- Pointes pour micro-pipette . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
10 000
- Tubes vacutainer 10 ml . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
1 000
- Tubes vacutainer + anti-coagulant . . . . . . . . . . .
100
-Filtre millipore 0,22 ~1 (1 - 10 ml) . . . . . . . . . . .
100
- Papier Kraft (rouleau) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
1
- Coton cardé (kg) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
5
. . . l . . .
- Gaze (pièce) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
1
- Ficelle (fibre végétale) (rouleau) . . . . . . . . . . . . . . .
2
- Ether (litre) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
1
- Alcool (litre) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
1
- Seringues (1 ml, 5 ml, 10 ml) . . . . . . . . . . . . . . . . . .
100
- Cages à souris . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
20
3. Petits animaux laboratoire
- Elevage souris
4. Produits chimiques et milieux de culture
- Trypsine 11250 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
20 g
- Versène . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
20 cl
- Sérum foetal veau . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
2 I
- DMEM . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
100 1.
ANNEXE 3
Milieu HBSSS
pour 2 litres
Ca CI,
2H,,
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
0,371 g
K c l . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
‘3,8 g
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
on12 g
K H 2 pw+
M g SO4
7 H 20 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
or4 g
Na, H Foi+
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
0,095 g
Glucose
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
2g
N a H C , ,
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
or7 g
Rouge de phénol . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
0,034 g
Saccharose
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
200 g
Hydrolysat Lactalbumine . . . . . . . . . . .
50 !3
Nacl . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
‘6 4
filtrer après dissolution complète.
Conditions de lyophilisation
- Congélation . . . . . . . . . . . . . . .
-4ooc
- Sublimation . . . . . . . . . . . . . . .
-3OOC
- t” finale produit . . . . . . . . . .
28OC
- Chauffage cyclique .*....
1 /20e.