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D. E. A. Sciences Naturelles INTERACTION ...
D. E. A.
Sciences Naturelles
INTERACTION
FERTILISATION-NODULATION-MYCORHIZATION
CHEZ L'AULNE
(Alnus incana (L). MOENCH)
Ousmane DIAGNE
Le travail que je présente ici a bénéficié de l'aide de
plusieurs personnes que je voudrais remercier.
A Monsieur BARDIN qui a bien voulu m'accepter dans son
Département de l'Université de Lyon.
A Monsieur BONNEAU, Directeur de la Station de Recherches
sur les Sols forestiers et la Fertilisation, qui m'a ac-
cueilli à sa Station.
A Monsieur LE TACON à qui j'exprime toute ma reconnaissance
pour son aide depuis la proposition du sujet jusqu'au terme
de ce travail.
A Monsieur GARBAYE pour l'aide et l'attention qu'il a portées
à mes travaux.
A Monsieur MAUDINAS avec qui nous avons effectué une partie
de nos manipulations au Laboratoire de Botanique de l'université
de Nancy.
Je présente mes vifs remerciements à D. BOUCHARD, F. BOURGEOIS,
M. ADRIAN, Melle BITSCH, Mme PERRIN pour leur collaboration
technique et à Melle BELGRAND qui s'est intéressée de près à
mes travaux.
PLAN DU MEMOIRE
Pages
r - INTRODUCTION
1
II - ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE
2
2.1 - Etude morphologique et anatomique
-------------13---------------~--
2
-Caractères généraux des principales espèces d'Aulne
2
-Morphologie et anatomie des Ectomycorhizes de 1'Aulne
6%
-Structure des Endomycorhizes
5
-Morphologie et structure des nodules de 1'Aulne
6
2.2 - Etude physiologique
..--m---..-..-----..e--
7
-Mycorhization
7
-Physiologie de la nodulation
a
-Etude comparative entre mycorhization et nodulation
10
2.3 - Ecologie de 1'Aulne
-------------..-----
11
-Intérêt écologique de 1'Aulne
11
-Influence de facteurs externes,
12
2.4 - Importance pratique de 1'Aulne
_-------31_"-_-_--------"-----
13
-Fertilisation des sols
13
-Lutte contre les pathogènes
13
-Utilisation directe en sylviculture
14
III - OBSERVATIONS DES RACINES D'AULNE DANS LA NATURE
14
IV - ESSAIS DE SYNTHESE AXENIQUE
15
4.1 - Inoculation ectomycorhizienne
---_---3------------____3____
15
-Matériel et méthodes de mise en place des essais
15
-Résultat de l'inoculation
17
4.2 - Inoculation de l'actinomycète
"------_-_3-_----------------
17
-Méthode de synthèse in vitro
17
-Résultats
18
v- ETUDE EXPERIMENTALE EN SERRE
18
5.1 - Matériel et méthodes
-.m..-------^---..*----
ia
-Matériel d'étude
18
-Protocole exphrimental
19
5.2 - Résultats
3--------
21
5.2.1 - Influence des traitements sur la croissance en
hauteur
21
5.2.2 - Interaction nodulation-mycorhization-disponibi-
lité du sol en azote et en phosphore
28
VI - CONCLUSION
28
I- INTRODUCTION
L'lnstaliation et le maintien des plants mycorhizés dans des conditions
écologiques souvent exceptionnelles ont été à plusieurs reprises souli-
gn4s. Cependant il est à noter qu'un développement optimal exige que tous
les facteurs physico-chimiques intervenant dans la croissance des plants
soient rkunis et en particulier l'interaction fertilisation-mycorhization.
Nous pouvons considérer une mycorhize comme le résultat d'une symbkose
entre un champignon et les rac&nes d'une plante supérieure. Mais cette
union intime doit être différenciée des simples associations rhizosphéri-
ques où un mycelium fongique coexiste avec les racines des végétaux envi-
ronnants.
11 existe, selon la terminologie de PEYRONEL et &. (1969), trois grou-
pes de mycorhizes :
- les Ectomycorhizes, caractérisées par l'existence d'un manteau fongique
enveloppant la racine et d'où partent des filaments mycéliens, libres
vers l'extérieur et s'insinuant entre les cellules du parenchyme cortical
vers l'intérieur (réseau de Hartig).
- les Endomycorhizes, caractérisées par l'absence de manteau et par la
pénétration des hyphes mycéliens à l'intérieur des cell.ules racinaires,
ce qui exclut la présence de réseau de Hartig.
- ies Ectendomycorhizes, dont l'existence est quelquefois contestée, se
caractérisent par la présence d'un réseau de Hartig et par la pénétration
d'hyphes mycéliens à l'intérieur des cellules.
Les Ectomycorhizes affectent quelques plantes herbacées, mais surtout la
plupart des essences forestières : chez les Gymnospermes, toute la famille
des Pinaceae ; chez les Angiospermes, elles se rencontrent surtout chez les
dicotylédores amentifères : Fagaceae, Betulaceae, mais également chez les
Cesalpinidceae, Myrtaceae, Tiliaceae.-
Les champignons ectomycorhiziens sont surtout des Basidiomycètes (Hyméno-
mycètes ou Gastéromycètes) ou des Ascomycètes mais peuvent également être
des Phycomycètes.
Les Endomycorhizes se rencontrent chez plus de f30 % de taxons végétaux.
I,es arbres intéressés sont des Préphanérogames, des Gymnospermes autres
que les Pinaceae, des Angiospermes particulièrement les arbres fruitiers.
Chez les herbacées nous retrouvons des Gramineae, des Légumineuses, des
Solanaceae, des Hosaceae...
L'associé fongique est ici soit à hyphes septées : Basidiomycètes (Hhizoctonia,
cz1.i tocyk. *. ), soit à hyphes non sept& : Zygomycètes (Endogone, Glomus...).
Les Ectendomycorhizes sont signalées chez des espèces ligneuses
habituelie-
ment porteuses d'Ectomycorhizes : Pins, E:piceas, Sapins.
Si plusieurs auteurs se sont intéressés depuis le siècle dernier aux pro-
hiCmes de fertilisation et de mycorhization,
peu d'études ont été faites
sur la mycorhization de 1'Aulne. Cette essence, pourtant connue depuis
plusieurs centaines d'années,
a été souvent considérée comme un type bio-
lcgique caractéristique des sites humides et de peu de valeur. Mais de-
puis Le début ne ce siècle des auteurs comme HILTNER (18961, puis plus
:drd SCHAEDE (l933), BJORKMAN (19421, BOND et QUISPEL (1954) se sont pen-
ches sur l'emploi de 1'Aulne dans l'économie forestière, dans le même
sens que les légumineuses pour l'agriculture.
Leurs études et de multiples
expériences actuelles indiquent que 1'Aulne contribue efficacement à l’amé-
'icraticn
_j
de notre écosys tème.
Pour notre part nous donnons dans la première partie de cette étude un
aperçu des connaissances actuelles sur la symbiose mycorhizienne, la nodu-
intion et l'écologie de 1'Aulne. Dans la deuxième partie, nous dressons le
bilan de nos études expérimentales en laboratoire, concernant les problè-
mes de mycorhization et de nodulation,
mais également en serre où des es-
sais de fertilisation ont été en plus menés.
Ue choix des espèces d'Aulne utilisées dans nos expériences a porté sur
A I 1'* '3 5
. glutinosa (L.1 GAERTN et Alnus incana (L.) MOENCH, toutes deux de
provenance italienne.
Pasal.!èlement, des observations en laboratoire ont été faites, portant
sur des racines des espèces précitees dans la nature,d'une part en forêt
de Haye sur le terril Solvay et d'autre part autour de l'étang de Brin a
Champenoux.
1.1 - ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE
2.1 - Etude morphologique et anatomique
--_-----_--1-3"---3-_----I-----------
- Caractères généraux des principales espèces d'Aulne
Les Aulnes ont une grande répartition géographique qui couvre
généralement les régions froides et tempérées,
depuis le continent améri-
cain jusqu'en Asie orientale.
On en trouve également au centre de l'Asie
et en Amérique du. Sud. Ilsexistent aussi bien en plaine qu'en montagne,
mais leur biotope de prédilection reste les endroits humides. Contraire-
:r,ents aux autres genres de la famille des Betulaceae à laquelle ils appar-
tiennent, les Aulnes ont un système racinaire pourvu de formations nodu-
!.e::ses qui leur confèrent la capacité de fixer l'azote atmosphérique de
l'air,
Nous signalons principalement ici certains caractères des espèces d'Aulne
que l'on rencontre sur le continent européen. _
- Alnus glutinosa (L.) GAERTN
L'Aulne glutineux, ou encore Aulne noir, le plus connu, est l’objet de
nombreux travaux peut-être du fait de sa croissance particulièrement rapi-
cIep
1 du moins au début de sa période végétative.
C'est un arbre pouvant at-
teindre 30 m de hauteur, qui a peu d'exigences écologiques et ainsi se re-
trollve dans plusieurs habitats naturels.
Mais ses exigences en lumière font
qu’on le rencontre surtout le long des ruisseaux, des étangs et des vallées.
Il peut coloniser aussi d'anciennes terres cultivées pas trop acides ou
s'associer en forêt à diverses essences locales.
Les graines de 1'Aulne glutineux très petites (1 à 2 mm de diamètre) et
pwrvues d'excroissances latérales tubéreuses sont généralement dormantes
ai; mownt de leur dissémination (DETHIOUX, 1974). Un traitement approprie
r-s;t alors nécessaire pour améliorer leur taux de germination.
3
,‘_ J$ ;e ? S‘3 iorte résistance à l'humidité,
le bois de cette essence est très
,tpprécié dans les travaux hydrauliques,
mais il s'altère rapidement sous
ies influences conjuguees de la sécheresse et de l'humidité.
p, c1.1nus incana (L.) MOENCH
-
-
-
-
:::w,re appelé Aulne de montagne,
1'Aulne blanc est reconnaissable par ses
tetits poils qui recouvrent la face inférieure des feuilles. Moins longé-
*/if F?i: de taille inférieure à celle de 1'Aulne glutineux, il peut attein-
-3~ .n&anmoins tine vingtaine de mètres de hauteur. Caractéristique des ré.
;:;:, c 3 YlC
-iibarctiques ou montagnardes, il peut également occuper des espaces
rie f'r%+ble altitude. Nous avons pu remarquer lors de nos prélèvements de
raçirles les groupements phytosociologiques qu'il forme avec d'autres essen-
f:e:: ticiris d'anciennes vallées argilo-calcaires. Selon BOULLARD (1969), sa
(apactte à s'établir et à se maintenir rapidement en sols variés est liée
.,< s e s possibilités de drageonnement et de rejet de souche. Aussi son ims-
:a! lation est indispensable pour fixer les sols squelettiques des terrils.
- Ainus viridis (CHAIX) D.C.
i,'Au!ne vert est un arbuste buissonnant ne dépassant pas 4 m et pouvant
l;onstj.ttler des fourrés denses. On le trouve généralement dans les pays
nordiques et sur les pentes des montagnes bien alimentées en eau. Il re-
cherche en outre les sols bien aérés, sans calcaire actif. Selon RICHARD
119681, les aulnaies vertes s'établissent sur des sols présentant une
gamme etendue de pH, depuis les sols très acides d'origine cristalline
jilsrju'aux sols neutres provenant de la décomposition des sédiments marno-
-.ai iaircr,. Par son port buissonnant, il est apte à fixer les sols squelet-
:.2:4:-e:; et à contribuer ainsi à freiner l'érosion en montagne.
- A ? n u s cordata (Lois) DESF.
En~cre dhsigné sous le nom d'Alnus cordifolia TEN. du fait de la forme du
limbe des feuilles, cette espèce a une répartition surtout méditerranéenne.
C:ependant il a été introduit avec succès plus au Nord, en Lorraine et en
!'harr,pagne du fait de sa grande plasticité (BOULLARD, 1969). Il peut attein-
dre plus de 20 m de hauteur et avoir une grande résistance à certains fléaux
naturels.
2igr:ii~~ns ~riaintenant l'existence d'autres espèces d'Aulne qui ont fait
L'objet de nombreuses études :
- A ~IJS rubra BONG. ou Aulne rouge, très étudié aux U.S.A. où il est sou-
vent en peuplements mixtes avec certains résineux, s'il n'est pas le long
des cours d'eau. Il peut atteindre 30 m de hauteur pour un diamètre de
plus d'un mètre.
., A?nus crispa, petit arbrisseau des pentes sèches des montagnes du Canada.
--..
. .%in% inokumae,
-
-
caractéristique des sols agricoles japonais.
L)'une façon générale, le jeune plant d'Aulne a une croissance radiculaire
très ;-apide.
Sa grande capacité de former des racines verticales solide-
ment fixées au sol lui permet de résister à certains intempéries. Il joue
I;n rôle important dans la stabilisation des sols squelettiques, délaissés
cfes r'jurs d'eau et sujets à l'action érosive de certains agents naturels.
lropriét6s fixatrices d'azote, il contribue à l'amélioration des
Aussi est-il souvent cultivé en taillis en association
‘!:I~;f; :J ’ Tji; t,rfz:;
(r:-;scnces (Epiceas, Peupliers, Douglas, Pins...) même si la
cj1i3.l i t 6 t3.e son txij S est, tr;3S faible à l'exception peut-être d'Alnus rubra.
- Yio:~phologie et ariatomie des Ectomycorhizes de 1'Aulne
1_1
l.es E:-itomycorhizes intéressent seulement 3.0 % des plantes vas-
t:!l : ;; z,
,“ < .:: I L'ami 1f.c
.,
.I Angiospermes, nous retrouvons surtout des dicotylédones
d:lr~y, 3ci:%?.e
iorm6i d ' associ ation. Les Ectomycorhizes des Betulaceae sont lar-
,!'!i;,:.rl t r epr .,.i
~~:a*~ic-ies er, particulier dans le genre Alnus. D'un point de vue
:rw r c.k-1 :; j .,:I ;! .x 41 ii-: ,
1 es Ectomycoiikzes
sont facilement reconnaissables grâce à
. .
.
., ' ].f,!?,,-:l"(~'i!ctl.‘.("
_J
:E:S diff'6rents éléments qui entrent dans l'association.
Y
?~~acromorphologie
^I,..yq----I----.e-
Xaturc de l'associé fong;que
_Y.
!:\\ l*heure actuelle il est très difficile dans les conditions
i i.1 : ,y.;; ;;>.-, i' 'i.den:.ifier avec certitude le champignon impliqué dans les as-
C;i?* : ,
:g: j (‘.IIS mg.c:,rk,i ziennes, Plrtsi.e;ws méthodes sont proposées pour identi-
/ I c-r' IF,: piyc ,.:;-iij zes > dont les cultures axéniques et semi-axéniques (ZAK,
-, I i ',j -,
; t. :
i'"?,-i > 1 97J ) ) la chromatographie (THOEN, 1970) et l'immuno-
P1 .j iiQrr-:SC:t?nCt>.
!'l",f.<~ i : Ai.l;.r]f: I t-f t-Laj.ns aute~tr~ ont ten:;É! la synthèse d'ectom,ycorhizes. De
': ,a* ; Y1.'. 'i;l-:lG3iiX 7 1 découle que .I.es champignons ectomycorhiziens de cet.te
+,<s;:::,.t ,
:'6crl?. ~ s;~rt~oat des Basidiomycètes+
Il s'agit de Lactarius obscuratus
all,i
.
c : c:t<:.;C;C; e :sj* us rubra (FROIDEVAUX, 1973) ; Astraeus pteridis, Alpova
d.ipk2J I e!.s
_--._; -_-. --> S~,lt:roderma hypogaeum qui s'associent à Alnus rubra (MOLINA,
--_
: :.I73: ; Paxi llus involiitus myczhizien d.'Alnus rubra, d'Alnus incana,
.-
:i ' -l.~,::~~~i~r,.inl~)~,~~
et d ' Ainus viridis ( LAIHO, 1970 ) .
- - -
!!?a:i:.~es champignons de la famille des Cortinariaceae (Alnicoia, Inocybe,
I;hlegmaciümj et des Russulaceae (Russula) ont été également
-
rlt?<.~rl: s comiic! ectomycorhiziens d'Alnus viridis par HORAK (1963) cité par
$l$:Jl~'i'!iiK et BETIECKE (1969) qui rapportent en outre les travaux de TRAPPE
( ! ï'.><. j I! t i Ï f)ÿrodorj !Boletaceae) et Cerococcum (Champignon imparfait) asso-
-i--
-
-
-
-
-
t ; és 3 d' tJi.ltres espkes d'Auine.
t;!éments mis en jeu dans l'association
.<-
Kcmme ii a éts déjà prou&, l'infection mycorhizienne affecte
.i,ii ,.:rt:merkt i,'~i:,,. 1. ' Aulne les racines cowtes ou moyennes.
i:e .:r~r>mpign:>r~ met en jeu ses filaments rnycéliens qui forment dans le cas des
:l~sOCiat;i OrIL: a.;:t?l~
Paxi L~US i rkT,olutus un cordon entourant les parties mycor-
}-) i ,J ; ! > ; pI i- . ,- ,.$ ij *,h:i zomnrphes.
riutour de ce.~ ensembl e peuvent émerger aussi des
sel ér.2tes *
; aracteristiyues macroscopiques des Ectomycorhizes
.-..--
!hez 1 'Aiilne les racines courtes et partant les mycorhizes
.:;im t ;' éy1.m ;. ec i~:rkgu.?.i+rement de part et d'autre des racines longues. !,e
'.i;ati~~. gnc-r! t-.~~~~:nlicC7rhizierl
semble contrôler la couleur et l'aspect des rny-
c.c,r!:L;rcjs a.Lors qbe J.eur taille et leur distribution sont liées à la confi-
p,.ÏZ":
,Si'l
CIeS ri*c.ineS.
Tùutefois
l'environnement immédiat des racines peut
,rd i: tx- ce:*t.cli r-r:3
de ces caractères.
I
, ,
' ci:., Fi' c: .i
.':'R
t:r::va.lx de MFJSTHIK et RENECKE (1969!, les jeunes racines cour-
r,eh r;q;'t' c,r-:li7:&,!13 ( racines de .3e ordre} d'Alnus viridis ont une couleur blanc
ocre,
alors que les racines Les plus âgees tirent sur le brun. To@ours
selon ces auteurs, les plus .jeunes parties des racines courtes
portent
souvent de longues racines fines mais non mycorhikes, bien qu'occasion-
nellement les premiers stades de développement d'un manteau mycélien
soient observés. Par endroit ces racines courtes forment des éléments
coraloïdes similaires a ceux observés généralement chez le genre Pinus.
Enfin, ces auteurs classent les ectomycorhizes d'Alnus viridis en 3 sous-
types, selon la classification de DOMINIK (19551, qui sont les sous-types
B, F et K.
* Structure des Ectomycorhizes
-_------_------__-_33__3____
La structure des Ectomycorhizes est liée au processus d'in-
fection de l'associé fongiqtie.
Les études de LAIHO (1970) sur Paxillus
involutus nous permettent de faire une brève description de la structure
des Ectomycorhizes formées par ce champignon avec 1'Aulne.
- Manteau fpi,gi!iue : bien développé en général épais de couleur brun-jaune ;
les hyphes tr&a lâches forment une structure prosenchymenteuse.
- Réseau de Iiar-L:ig : les hyphes pénètrent "timidement" dans la première
couche des cellules corticales,
deviennent rares dans la partie la plus
interne des cwlches et n'atteignent pas en général l'endoderme.
Nous retrouvons ainsi la structure d'ensemble des mycorhizes en général.
Il faut noter a-1ss.i que la capacité des champignons précités a mycor-
hizer
.L'AuLne varie probablement d'un hôte à un autre.
Paxillus involutus, selon les connaissances actuelles, ne forme pas
d'Ectomycorhizes avec 1'Aulne dans la nature ; en plus on n'a pas encore
trouv6 de sporocarpes de ce champignon dans des peuplements d'Aulne purs.
Selon LAIHO (1970), dans les peuplements mixtes ces sporocarpes se retrou-
vent régulièrement autour des racines d'Aulne contiguës à celles du
Bouleail.
Cependant, d'après cet auteur,
HOHAK (1963) a trouvé Paxillus
involutus sous forme de sporocarpes sous Alnus viridis et occasionnellement
ses fruits sous Alnus rubra. Ce champignon est également souvent décrit
comme Paxillus fXlamentosus,
un autre associé commun aux aulnes.
--1_,
- St;ructure des Endomycorhizes8
-.
La parfaite symbiose qui existe chez les Endomycorhizes augmente
les difficultés de: caractérisation de l'endophyte. Chez l'Aulne, très peu de
travaux ont été fi3itS sur la symbiose endomycorhizienne.
D'après DAFT et a1.(1975), Alnus glutinosa peut être infecté par deux cham-
-
pignons endophytes de la famille des Bndogonaceae : Gigaspora gigantea et
Glomus sp. MEJSTRIK ti974 ) décrit l'existence d'Ectomycorhizes, d'Endomy-
corhizes et d'Ectendomycorhizes
chez 1'Aulne. Il observe dhez Alnus
glutinosa la prisence d'hyphes pénétrant les cellules du parenchyme corti-
cal.
Le champignon endomycorhizien pénètre aussi bien par les racines courtes
que directemer*t par les autres parties de l'épiderme. Les hyphes passent
d'une cei2:ii.e à une autre a travers les cloisons intercellulaires et en-
gendrent des vésicules, des arbuscules ou d'autres formations endocellu-
laires. Ainsi se ijropage
l'infection des racines courtes.
- Morphologie et structure des nodules de 1'Aulne
. Présentation des nodositf*s
-----_-1--_----3--1-_-------
E'ormation
Le système racinaire des Aulnes porte généralement, selor
.ine repartition irrégulière, des formations pelotonnées appelées nddosités
!.lui peuvent avoir un diamètre d'une dizaine de centimètres. A l'origine
il s'agit d'une multitude de racines courtes de quelques millimètres de
long, qui se ramifient dichotoniquement,
se pelotonnent pour devenir une
masse plus ou moins compacte.
Ces nodosités peuvent se former sur les racines principales ou secondaires,
:nais aussi sur les très jeunes racines.
Morphologie
Les sujets jeunes présentent de simples nodules ayant Les
caractères d'une racine courte dont la croissance est interrompue et dont
l'aper, dépourvu de coiffe, est hypertrophié.
En outre les nodules ne por-
tent pas de poils absorbants. Au cours de leur évolution les nodules se
divisent en piusieurs lobes,
avec à leur sommet de petites dépressions.
Ils se subérifient, prennent une teinte brune qui devient de plus en plds
noire avec l'âge.
. Etude structurale des nodules
_-----1-----_-----3-__I______
Isolement et nature de l'endophyte
11 est maintenant admis par pratiquement tous les auteurs
que l'endophyte des nodules d'Aulne est un actinomycète du genre Frankia.
Mais l'étude détaillée de ce symbiote a rencontré de nombreuses difficul-
tes inhérentes aux problèmes de son isolement. En effet, la vulnérabilité
de l'endophyte qui limite La desinfection des nodules, la présence d'une
microflore nodulaire endogène et les difficultés de recréer les conditions
de milieu propices au développement du symbiote sont autant de barrières
iiLi> s'opposent a cet isolement.
Structure des nodules
Certains auteurs sont néanmoins parvenus à isoler l'actino-
mycète. Parmi eux citons LALONDE et FGHTLN (1972), dont les travaux ont
porté en culture pure sur une méthode microbiologique de suspension-diiution.
i,'(,bsrrvation anatomique et histologique des jaunes nodules d'Ainus crispa
FI permis 5 ces auteurs de distinguer trois formes prises par 1 'endophyte
dans les cellules de l'hôte :
- i'hyphe, forme primaire de l'endophyte, dans les cellules
jeunes
- les vésicules résultant de la dilatation du sommet de
l'hyphe
- les corps bactériformes, qui dériveraient de la fragmenta-
tion de l'hyphe dans les parties vieilles du nodule.
<:ignalons
./
aussi que ces trois formes se retrouvent chez les autres espèces
ci'
Alnus et que i'endophyte est situé uniquement dans Le parenchyme corticai
des nodules racinaires.
Sa localisation permet de distinguer, du sommet a
!a base, les regions suivantes (VAN DSJK et MEHKUS, 1976) :
- une région apicale de cellules méristématiques, indemne
d'infection
- une région juvénile dont les cellules sont envahies par
des hyphes fines et des hyphes plus épaisses
- une région de développement important de l'endophyte,
comportant de nombreux vésicules et corps granuliformes
- enfin une région basal.e caractérisée par une densité
importante de restes de vésicules et d'hyphes.
Ultrastructure
La microscopie électronique a permis de décrire en détail
la structure de l'endophyte modulaire et de préciser ses rapports avec La
cellule-hôte. Mous pouvons observer ainsi, en plus du cloisonnement et de
La ramification des hyphes, des organites cellulaires (nucléoïdes, mésosomes)
et une capsule qui sépare I'hyphe du cytoplasme de l'hôte.
Les corps granuliformes se transforment après maturation en véritables gra-
nales qui, d'après VAN DIJK et MEHKIJS i1976), sont des formes de résistance
au même titre que les spores observées chez les astinomycètes libres. Du
fait des ressemblances ultrastructurales et fonctionnelles entre granules
et spores, ces auteurs proposent de nommer les granules sous le terme de
spores et les co.t-ps granuliformes sous le terme de sporanges.
Spécificité de b'endophyte
L'endophyte des nodulesd'un plant d'Aulne peut servir en
général comme inoculum pour noduler d'autres plants du même genre. Ainsi
CAPELLANO et MOIHOUD (1979) ont reussi à induire la formation de nodules
sur de jeunes plants d'Alnus viridis à partir de broyat de nodules d'Alnus
glutincsa. Mais 1 ' efficience de 1'inoculum varie avec les espèces utilisées.
Si l'actinomycète des nodules d'Alnus glutinosa peut s'associeraux expèces
Ainus incana, A. viridis ou A. cordata, il n'en est pas de même avec Alnus
rubra, l'espéce nord-américaine.
-
-
Ceci a conduit BOULLAHD (1969) à parler
de "spécialisation géographique des associés".
2 . 2 - Etude physiologique
-m-s.---------w-----
Pi existe une certaine relation entre la morphologie et la struc-
ti.xre des mycorhizes et le développement des plantes. En effet, plusieurs
travaux ont confirmé les effets physiologiques bénefiques des mycorhizes sur
1ti vigueur et l'importance de la biomasse des plants.
CC?S effets sont liés à la potentialité d'absorption d'eau et d'autres sub-
stances,
comme le phosphore mais également à la nutrition azotée facilitée
par It-1 complexe mycorhize-nodule.
- Mycorhization
. Processus
--w.---M--
L'Aulne constitue :In exemple intéressant dans l'évolution de
1 a symbiose mÿcorhi zienne. Tl peut former à la fois des Ectomycorbizes et
d e s Endomycorhizes.
Mais si ces dernières sont considérees comme primitives
i?'FTAPPE, 1979;, le type de symbiose intéresse La grande majorité des hôtes
les plus évolués dans la c1.assif‘ication.
8
Le processus de pénétration du partenaire fongique débute par l'envoi
d'hyphes par les points d'infection des racines courtes. Ces hyphes se
ramifient et coloniser-t progressivement les espaces intercellulaires du
parenchyme cortical ou les cellules elles-mêmes suivant le type de my-
corhize.
Chez les Endomycorhizes, l'infection des
cellules commence par les poils
absorbants s' ils existent. Dans le cas contraire, l'hyphe peut pénétrer
à partir de cellules de passage (BOULLARD,
1968). Selon TRAPPE (1979),
les champignons ectomycorhiziens empêchent la formation de jeunes racines
fines ; ils pénètrent entre les cellules épidermiques et corticales.
. Relations mycorhization-nutrition
-----_-_----_33--_-_-------------
Il est généralement admis que les racines longues sont
exp?.cratr-Lces, alors que les racines courtes, appelées encore racines
nourricières,
sont spécialisées dans l'absorption nutritionnelle. C'est
jtlstement ces racines courtes qui sont mycorhizées.
La mycorhization., grâce aux cordons mycéliens formés, augmente la surface
rhizosphérique exploitée, d'oii une activité biologique plus importante,
Hinsi que le diamètre racinaire. En outre, le champignon associé, par ses
propres qualités physiologiques,
assure une meilleure absorption des élé-
ments non assimilables par la plante seule.
Tout ceci a pour conséquence
de faciliter l'utilisation des aliments mis à la disposition de la plante-
hôte. C'est ainsi que MEJS'I'RIK et BENECKE (1969) ont remarqué chez Alnus
viridis que les racines mycorhizées absorbaient le phosphore 5 fois plus
rapidement que les racines non mycorhizées.
- Physiologie de la nodulation
. Etapes de la nodulation
-----------_---Y----___
La formation des nodules est un processus complexe compre-
nant p.l usiecArs phases qui sont, d'après les travaux de QUISPEL (1958) :
- formation de foyers d'infection au niveau des racines
- contact fortuit entre les cellules infectées et ces
foyers préformés
- initiation nodulaire
- croissance des nodules
La nodulation peut être très précoce chez la jeune plante et être influencée
par les facteurs environnants. La pénétration de l'endophyte entraîne des
rhactions de la part de l'hôte et des effets morphogènes sur ce dernier,
comme l'étrangiement du noyau, l'augmentation de mitochondries, l'épaissis-
-errent de la paroi cellulaire,
la réduction du nombre des mésosomes et
l'accroissement de la densité du cytoplasme.
Fixation symbiotique de l'azote
”
_-_3-------3---1_---_-------------
La fixation biologique de l'azote atmosphérique ou azote li-
bre dans ie sol est le fait de plusieurs microorganismes actifs dont les
actinomycetes colonisateurs des nodules d'Auine.
La plante trouve ainsi di-
rectement dans ses nodules l'azote atmosphérique dont elle a besoin tout en
fournissant en échange un milieu nutritif bénéfique à l'endophyte.
Aj outor:s que ces associations synergiques fixatrices peuvent s'établir à
! 'intFrielir
de
m&w des nod;!ies et en particulier l'actinomycète peut s'asso-
c.ier .: des bacciries spécialisees dans la fixation.
9
Dynamique de l'azote
L'azote est imp.Liqué dans un cycle biologique régulier depuis
sa fixation par les germes syrnbiotiques jusqu'à son entrée dans l'architec-
ture des acides aminés de l'hôte.
e Preuves de la fixation symbiotique : plusieurs auteurs ont
essayé de rapprocher l'aptitude des Aulnes à s'établir sur des sols pauvres
et leur qualité améliorante de notre écosystème. En effet, ces plantes
. .
pionnieres, lorqu'elles sont nodulées, arrivent à se développer dans des
endroits dépourvus d'azote.
Depuis les travaux de BOND (1955), plusieurs expériences sont venues confir-
mer la teneur en N plus élevée dans les feuilles d'Aulne par rapport a celles
des autres espèces ligneuses.
Cultivé dans un endroit dépourvu d'N combine
1'Aulne nodulé se développe normalement,alors que les autres plantes non no-
dulées accusent les sympt&nes typiques d'une carence en N.
L'emploi de la méthode isotopj.que à 15N dans les nodules excisés a montré
cliie ces derniers fixent facilement l'azote alors que les autres organes ne
présentent aucun enrichissement (DOMMERGUES et MANGENOT, 1970).
Ces derniers auteurs ont montré que certaines souches d'Actinomycètes iso-
lées des nodosités, et qui représenteraient l'endophyte, ont une activité
fixatrice en culture pure.
TARRANT (1959) a constaté qu'avec l'introduction
d'Alnus sinuata (REG.) RYDB, dans les plantations d'arbustes et d'arbres
préalablement chétifs, ces dernières ont acquis une croissance forte et
bien verticale. Cette augmentation de vigueur est attribuée à l'augmentation
d'azote due à la fixation nodulaire des racines d'llulne.
. Organes impliqués dans la dynamique de l'azote : les méthodes
d'étude du pouvoir fixateur d'azote ont permis de montrer que la fixation
a bien lieu au sein des nodules racinaires.
PIZELLE et THIERY (1977) citant
les travaux d'AKKERMANS (197îl considèrent les vésicules jeunes de l'endo-
phyte comme le siège présumé de la fixation d'azote.
Des nodules, la majeure partie de l'azote passe sous diverses formes &ans
le circuit intérieur de la plante,
par les racines et arrive dans l'appa-
reil ahrien. En effet, des analyses foliaires effectuées sur plusieurs es-
pèces d'Aulne ont confirmé l'apport supplémentaire d'azote dans les feuil-
les, provenant de la fixation symbiotique.
Selon BOULLARD (1X9), il suffit
de quelques heu res pour que cet azote atmosphérique se retrouve dans les
composés protidiques des feuilles des plants nodulés.
. Mécanisme de la fixation : l'azote moléculaire peut être in-
Iroduit dans le cycle du métabolisme général des cellules végétales en pas-
sant par plusieurs étapes qui nécessitent l'intervention de facteurs inté-
rieurs ou extérieurs à la plante.
D'abord des substances réductrices nées de l'activité photosynthétique de
la plante ; une source d'énergie et enfin un complexe enzymatique formé
par une hydrogénase et une nitrogénase.
Ce mécanisme global de fixation chez les Légumineuses présenterait de gran-
des analogies avec celui des non-légumineuses,
en particulier avec celui de
1'Aulne (DOMMERGUES et MANGEN()T, 1970).
10
. Variations de ilactivité fixatriae : l'activité fixatrice des
nodules racinaires varie suivant les stades du cycle végétatif de la plante.
Ainsi plusieurs auteurs ont constaté une fixation plus importante au cours
des premières années de développement.
Elle est plus intense aussi en été
qu'en hiver et ;>our les nodules jeunes que pour les nodules âgés.
cette activite demande egalement une certaine intégrité des nodosités. En
effet, les nodules excisés arrivent à fixer l'azote mais pour une durée li-
mitée. En plus tous ces organes ne sont pas aptes à la fixation. C'est pour-
quoi la littérature utilise les termes d'efficient et d'inefficient pour
caractériser l'aptitude des nodules à fixer l'azote atmosphékique.
Métabolisme azoté
Au cours de son cyc.Le de transformation, l'azote sous forme
de niwatec:UI sicbit pow l'essentiel une série de réduction en acides ami-
nés qui rentrent dans la const.it:ltion des protéines de la plante. Cette
réduction des nitrates débute dans les racines bt les nodules, mais une
partie est également localisée dans les feuilles.
Nutrition azotée : 1'Aulne glutineux est considéré comme
étant capable d'>Atiliser à la fois la forme nitrique et la forme gazeuse
de l'azote dans son alimentation.
L'assimilation de ces formes azotées
exige la présence de deux enzymes :
la nitrogénase qui réduit l'azote mo-
lécul aire en NH 0" et la nitrate réductase qui transforme les ions N03-en
N02-.
D'après AKKERMANS (1971), dans, PIZELLE et THIERY (1977), l'activité nitro-
génase de 1'Aulne glutineux est localisée dans la partie apicale des lobes
nodulaires,
aiors que l'activité nitrate-réductase est présente aussi bien
dans Les organes souterrains que dans les feuilles.
L'activité nitrate-réductase est plus tribukaire de l'alimentation azotée
dans Le cas des racines que dans .Le cas des feuilles. Quant à l'activité
nitrogénase, elle est stimulée par la période de végétation active et varie
au Co):rs des saisons. En outre,
les travaux des auteurs précités ont mon-
tré qu'il r.'y a pas de relation étroite entre les activités des deux enzymes.
PLZELL,E (19781, comparant les activités nitrogénase potentielles d'Alnus
glutinosa, dt@us incana et d'Alnus cordata,
a remarqué des différences au
point de wue quantitatif selon les sujetstestés.
* Activité nitrogénase et photosynthèse : de nombreuses étu-
des ont soul.ignÉ l'absence d'activité nitrogénase en hiver, son apparition
au p-intemps el; :sa diminution au moment de la chute des feuilles. Ceci
pourr;G.t faire penser à une relation entre les activités nitrogénase et
photosynthétique. Cependant les travaux de PIZELLE et THIERY (1976) ont
prouv6 qii'il y a une certaine autonomie entre les deux activités, du moins
chez Les Aulnes adultes. D'ailleurs ces auteurs ont constaté une reprise
temporaire d'une activité nitrogénase chez les nodules d'lllnus incana après
le repos hivernal, a.u moment où les feuilles ne sont pas encore apparues.
En plus pl\\isieurs baisses d'activité nitrogénase ont été observées au maxi-
mum du développement des feuilles.
- Etude comparative entre mycorhization et nodulation
Les racines des plantes à nodules fixateurs d'azote sont géné-
raiement mycorhizées dans leur habitat naturel.
Ces plantes forment plus de
nodules et ont un pouvoir fixateur plus élevé que les plantes non mycorhi-
:<C!es. Mais, si certains carnr,t5res rapprochent les mycorhizes des nodules,
11
plusieurs distinctions sont à faire entre ces deux types de symbiose.
. Caractères communs
-"----------------
Les nodules se rapprochent plus des endomycorhizes que des
ectomycorhizes. Dans les deux premiers cas, l'infection racinaire est en-
dogène. Le degré élevé de symbiose fait que l'endophyte est très difficile
à isoler e.t à cultiver sur milieu artificiel.
Les processus de colonisation qui intéressent les cellules corticales des
racines sont parallèles, de même que les effets morphog&nes des endophytes
sur celles-ci.
Le rôle trophique des deux endophytes rapprochent également les deux types
de syrilbiose, ainsi que leurs réactions vis-à-vis des facteurs écologiques.
. Caractères distinctifs
------3-_--1----------
Les endophytes des mycorhizes sont des champignons tandis
que ceux des nodules sont des actinomycètes souvent associés à des bacté-
ries. (Ce qui implique déjà des différences dans la structure et la forma-
tion des deux types d'association.
I,es nycorhizes sont en effet spécialisées dans l'absorption de fluide et
d'ions, alors que les nodules permettent surtout les échanges gazeux.
ii'autJ-e part, Les besoins minéraux des champignons mycorhiziens sont sa-
tisfaits directement à partir du sol,
alors que les endophytes nodulaires
puisent sur les tissus mêmes de l'hôte leur source de minéraux (MEJSTRIK
et BENECKE, 1969).
Dans ie cas de la nodulation les racines courtes se déforment à l'appro-
che de la penétration de l'endophyte, tandis que dans le cas de la mycor-
hization,
il n'y a pas de véritables déformations.
Il derneure, après cette étude comparative, que plusieurs questions restent
à résoudre quant aux interactions éventuelles entre mycorhization et nodu-
lation, ainsi qu'a.ux modalités de réactions de l'hôte vis-à-vis des deux
types d'association. TRAPPE (1979) souligne, qu'à l'heure actuelle, aucun
antagonisme di:w:t entre les endophytes nodulaire et mycorhizien n'a été
rapporté.
2 . 3 - Ecologie de 1'Aulne
-----..---3----3----
L'i-,,stailation des différents types "de symbiose chez 1'Aulne
i’dit de lui une essence très Flastique. Ses qualit& améliorantes liées
3
L_ son caractère de plante pior..nière augmentent son importance écologique.
NPanmoins son
développement est influencé par plusieurs facteurs externes.
- Intérêt écologique de 1'Aulne
L'Aulne joue un rôle dans la régulation des activités des
r:licroc-)r.garlismes 31~ sol. La dkomposition des feuilles tombées et des raci-
ries mortes favorise la pullulation des microorganismes minéralisateurs,
(i-ii trouvent sous les aulnaies,
un milieu stable et enrichi en azote.
L'excktion de sjlbstanoes racinaires azotées contribue également à la mul-
tiplication de ces microorganismes.
12
La structure du sol est également influencée par l'installation de 1'Aulne.
Selon RICHARD (1968), la structure grumeleuse souvent observée dans l'hori-
:Ton Al de sols d'aulnaies vertes semble liée à la qualité et à l'abondance
de la litière de 1'Aulne.
La colonisation progressive des sols dénudés par
:'Aulne augmente la valeur de leur capacité d'échange et donc l'améliora-
tion des qualités du sol.
k:nfin, l'abondance de litière, rapidement restituée au sol, et l'apport
d'azote atmosphérique tendent à favoriser l'installation de nouvelles es-
pëces végétales.
'Tous ces effets de 1'Aulne sur un milieu préalablement délaissé contribuent
3 la création d'un nouveau biotope favorable au développement de nombreux
$tres vivants.
- Influence de facteurs externes
Les facteurs qui jouent un rôle sur le développement des
iiilnes sont des plus variés. Nous citerons les plus importants :
Facteurs édaphiques
e
----3w--------.33---
pH
La nodulation et la mycorhization se font généralement autour
&s pti proches de la neutraliré.
A l'intérieur de cette gamme de pH il n'y a
;.;a~ tellement de 'différences d'intensité de ces deux phénomènes physiologi-
ques. Par contre, les pH très acides (au-dessous de 4) inhibent la nodula-
tion .
i,'influence du pH est négligeable dans les milieux sans nitrate ; elle sem-
ble s'exercer sur l'endophyte plutôt que sur l'hôte (DOMMERGUES et MANGENOT,
197C).
Azote combiné
L'inhibition de la nodulation par les substances azotées a
attiré i'attention de plusieurs auteurs. QUISPEL (1958) a prouvé que les
différentes phases de la nodulation sont influencées par les nitrates et
plus encore par les sels d'ammonium.
PIZELLE
(19%) a montré que l'action défavorable de 1'N minéral est essentiel-
l e m e n t local;.s5e Hais
d’une façon générale, elle est liée à la grande
richesse de La plante en azote.
Eléments minéraux
L'importance du phosphore sur la nodulation est capitale.
NOL seulement il favorise la phase d'initiation nodulaire, mais en plus
il augmente le nombre des nodules. D'autre part ses effets combinés avec
ceux de l'azote peuvent redresser l'effet inhibiteur de ce dernier.
/

,.. -d najorisk des oligoéléments rentrant 'dans les processus physiologiques
dz la rJ?Lante joJe un rôle dans les phénomènes de nodulation. En particu-
iier les carences en Ca, Co et Cu peuvent entraver ces phénomènes.
. Autres facteurs
3",---3--3------
Lumière
La lumière constitue un facteur essentiel dans les processus
a.:e :n~ -orhization
et de riodulation. En effet, plusieurs travaux ont confirmé
que ie aéveloppement des mycorhizes et des nodules est généralement sous
la dhpendance de la lumière. C'est ainsi que de bonnes conditions d'éclai-
rement peuvent augmenter non seulement le nombre des nodules et leur taille,
mais également leur capacité fixatrice. D'où l'importance d'une photosyn-
thèse active dans ces phénomènes physiologiques.
Oxygène
Ce gaz est nécessaire aux systèmes fixateurs mais à fortes
doses il devient inhibiteur.
H2 et CO
L'assimilation de l'azote atmosphérique est réduite en
présence d'hydrogène et peut être inhibée à un certain taux par ce dernier.
!)e même l'oxyde de carbone arrive à inhiber complétement la fixation.
L'importance propre à chacun de ces facteurs a été certes démontrée,
mais
il est à noter que souverit leurs effets agissent en même temps et peuvent
inflliexicer d'une manière ou d'une autre la physiologie de l'arbre.
y.4 -
Importance pratique de 1'Aulne
__-------3--------------------
Après avoir dressé ce bilan des propriétés physiologiques et éco-
l.ogiques de 1' Aulne, nous donnons maintenant un aperçu de quelques unes des
utilisations de cette essence en sylviculture.
- Fertilisation des sols
Nous avons déja souligné la grande teneur en azote des organes
a&riens de 1'Aulne. Cette richesse en azote fait que le rapport C/N de cet-
ée plante est très réduit. Ce qui lui confère la qualité d'essence amélio-
rante, puisque sa litière foliaire peut augmenter la teneur en composés azo-
tés du :sol sur lequel il se développe au même titre que les engrais artifi-
ciels.
*,---;
~L.IJd.. 1'I,Qlne peut r stituer selon les espèces plusieurs dizaines de kg
et
d'azote par hectare par an au sol. Ainsi,
plusieurs pays ont ehc;ouragé le
reboisement d'anciens terrils par de 1'Aulne afin de fertiliser ces der-
niers.
Lutte contre les pathogènes
D'une façon générale, les Ectomycorhizes contribuent à la dé-
*.oxi iiiation des sols par la sécrétion de substances destructives de toxi-
r,es rkizosphériques.
La défense phytosanitaire est également assurée par
les ChampigncJns ectomycorhiziens qui protègent l.es racines de leur hôte
-.ont!ye
c_
certains pathogènes.
':AkHi\\NT et TRAPPE (1971) ont montré yu'Alnus rubra en association avec le
,Ltlarnpjgnon Lactarius obscuratus peut jouer un rôle dans l'inhibition de
1 'activité de Poria weirrii (MURI~.),
un virulent pathogène racinaire qui
'i?tahl:ie le Sapin-Douglas (Pseudotsuga menziesii). D'autre part, FROIDEVAUX
!î97Zî) apr6s l'isolement de Aureobasidium pullulans (de BARY) ARNAUD, des
r9yc9rhizes de P . rubra + Lactarius obscuratus a montri: 'que ce champignon
t'xerce :me action antibi 0tiqL.e sur Fusarium oxysporum, un parasite des
radi.-el les de 1 (Aulne rouge.
14
- Utilisation directe en sylviculture
. Inoculations
m----w------
La capacité des nodules racinaires d'Aulne à fixer l'azote
atmosphérique autorise à introduire des plants nodulés dans les sites sté-
riles à reboiser. Dans les jeunes aulnaies,
il est possible d'apporter des
broyats de nodules seuls, dilués ou mélangés à de la terre, au contact des
racines d'Aulne pour induire la nodulation.
. Associations avec d'autres essences
----_----------"_------------------
Grâce aux multiples ramifications de ses racines 1'Aulne
peut s'installer à l'intérieur de plusieurs groupements végétaux. Le
pouvoir pérennant de ses nodosités fait qu'il est souvent utilisé en cul-
ture mixte pour augmenter la production de plusieurs essences.
C'est ainsi que des plants de Sapin-Douglas cultivés avec de 1'Aulne rouge
ont montré une croissance et une vigueur supérieures à celles des sujets
témoins (TARRANT, 1959). De nombreuses autres plantes ont pu de même béné-
ficier de l'association avec 1'Aulne. Parmi les arbres forestiers, citons
Fraxinus, Picea, Pinus, Populus, Robinia... et comme arbre fruitier le
pommier (Malus communis).
III - OBSERVATIONS DES RACINES D'AULNE DANS LA NATURE
Nous avons observé des racines d'Aulne dans deux types de milieu, près de
Nancy. Des racines d'Alnus incana d'une quacantaine d’ades installées sur le
terril de Solvay à Maxéville et des racines d'Alnus glutinosa naturel
adulte en forêt domaniale d'Amance.
Dans le premier cas il s'agit d'un substrat artificiel constitué de dé-
bris calcaires à très faible teneur en éléments minéraux, à pH élevé (8,l
à 8,3) et à très faible teneur en matière organique (2 %).
Dans le second cas il s'agit d'un sol lessivé hydromorphe développé sur
limons et argile du lias.
L'humus est un mull mésotrophe à taux de satura-
tion voisin de 5C % et à pH de 5,5.
Sur le terril Solvay de Maxéville nous avons observé les deux types de
mycorhizes : ecto et endomycorhizes.
Les ectomycorhizes semblent d'un seul 'type avec un manteau épais présentant
:3 zones concentriques distinctes et un réseau de Hartig pénétrant profondé-
I
ment dans l'endoderme.
Les endomycorhizes sont caractérisées par la présence de nombreuses vésicu-
les. Nous n'avons pas observé d'arbuscules.
En forêt d'Amance nous avons également observé les deux types de mycorhizes.
Les ectomycorhizes présentent un manteau fongique homogène, lisse, de "type
lactaire".
Le réseau de Hartig pénètre profondément dans le cortex et sem-
ble former des appresoria intracellulaires,
ce qui rapprocherait ce type de
mycorhizes des ectendomycorhizes.
Les endomycorhizes présentent de nombreux hyphes intercellulaires, mais
nous n'avons pu observer ni vésicules, ni arbuscules.
15
IV - ESSAIS DE SYNTHESES AXENIQUES
4.1 - Inoculation ectomycorhizienne
-------------------_---------
- Matériel et méthodes de mise en place des essais
. Matériel végétal
---v-3-------w--
Stérilisation des graines
Les plantations d'Aulne proviennent de la germination soit
de graines d'Alnus glutinosa CL.) GAERZN, soit de graines d'Alnus incana
(L.) MOENCH, stérilisées selon la méthode suivante, inspirée de celle de
NEAL et al. (1967) :
-
- immersion des graines,dans de l'eau déminéralisée,à l'aide d'une boule
à thé, pendant une heure ;
- vide effectué au contact des graines pendant les 15 dernières minutes ;
- immersion des graines dans de l'eau oxygénée CH202 à 30 %) pendant 10 à
30 minutes ;
- rinçage des graines plusieurs fois à l'eau stérile.
Les graines sont ensuite mises à germer dans des boîtes de Pétri sur du
milieu de Pachlewski (tableau 1). Ce milieu est au préalable stérilisé a
l'autoclave pendant 20 minutes à 12OOC.
Après 3 à 4 jours d'incubation dans une étuve à 25OC, les graines contami-
nées sont soustraites aseptiquement du milieu de culture, alors que les
germinations non infectées (radicules de 7 à 10 mm) sont mises en culture
dans des tubes de verre contenant du milieu de Melin-Norkrans modifié Marx
(1909) (MNM) (tableau 1). 11 est à noter que ce milieu est dilué 10 fois.
Remarque :
Le taux de réussite de désinfection,
qui est de l'ordre de 30 % , est faible
comparativement à celui des graines de Pin que nous avons stérilisées paral-
lèlement et qui est de 100 %,
Matériel fongique
Deux champignons Basidiomycètes de l'ordre des Eugaricales
sont utilisés comme origine de l'inoculum employé. Il s'agit de Paxillus
involutus FR. ex BATSCH et de Gyrodon lividus FR.ex BUL.
Pour conserver du matériel jeune
nous avons,à partir de souches en culture
dans du milieu de Pachlewski,
prélevé des rondelles de gélose avec du myce-
lium que nous avons repiquées dans des boîtes aseptiques contenant le même
milieu.
Les deux espèces ont uniformément colonisé les boîtes en quelques semaines,
mais le déveioppement de Paxillus a été plus rapide.
. Matériel accessoire
--3--v--------1---1
Les tubes synthétiques de 25 cm de long sur 2,5 cm de diamè-
tre (petits tubes) ou de 25 cm sur 4 cm (gros tubes) sont remplis au tiers
de leur volume et divisés en deux lots selon la nature du substrat :
- 1oL A : t u b e s f MNM/lo g&O&
- lot B : tubes .t vermiculite + tourbe + MNM/lO - Le mélange tourbe-vermi-
cuiite est fait dans La proportion de 2/3 de vermiculite pour 1/3 de
tourbe.
1 6
COMPOSES
MELIN-NORKRANS
modifié MARX
PACHLEWSKI
Sels minéraux
. ..--3-------3-
Chlorure de calcium
CaC12
0,05 g
Chlorure de sodium
NaCl
0,025 g
Phosphate de potassium
KH2p04
095 g
lg
Phosphate di-ammonium
(NH~)~HP~~
G,25 g
095 g
Sulfate de magnésium
MgS04,7H20
0915 g
Tartrate di-ammonium
C4Hq06(NH4)2
095 g
Citrate ferrique à 1 %
1 ml
0,5 ml
Vitamine
----d--m
Thiamine hydrochloride
100 g
50 g
Glucides
-w-w----
Glucose anhydre
20 g
Saccharose
10 g
Maltose monohydraté
5g
Composés organiques
-3----3---3-3------
Extrait de malt
3g
Gélose
20 g
2.0 g
--m..--
Eau distillée
_------------
1000 ml
1000 ml
TABLEAU 1 - MILIEUX NUTRITIFS UTILISES POUR LES SYNTHESES
AXENIQUES ECTOMYCORHIZIENNES
(le milieu de Melin-Norkrans modifié Marx a été utilisé
dilué 10 fois pour les synthèses axéniques ; le milieu
de Pachlewski a été utilisé uniquement pour les cultu-
res pures de champignon).
Les tubes ont été stérilisés à l'autoclave comme pour le milieu de Pachlewskl
avant le repiquage du matériel végétal.
Les cultures sont ensuite placées sous des lampes à fluorescence-incandescence
de 20 000 lux environ, avec une photopériode de lb h sous une température de
i5OC environ.
. Inoculations
------------
Ces opérations sont effectuées 5 semaines après le début de
germination des graines, durée correspondant au développement des racines
courtes.
Des rondelles de gélose, envahies par du mycelium des champignons utilisés,
sont déposées au fond des tubes et près des racines dans le cas des tubes A,
et à la surface du substrat dans le cas des tubes B.
- Résultat de l'inoculation
Paxillus involutus et Gyrodon lividus se sont d'abord lentement
développés sur la gélose. Après deux mois le mycelium de Paxillus involutus
a brusquement envahi l'ensemble du tube.
Le développement du mycelium a
coincldé avec La formation des premi6res mycorhizes. L'association du cham-
pignon avec la racine de L'hôte a entraîné une stimulation très nette de la
croissance du mycelium.
Des observations au microscope optique ont permis de confirmer le début de
mycorhization avec Paxillus involutus,
en condition totalement axénique.
Ces mycorhizes sont caractérisées par un manteau épais de couleur brun fauve.
De ce manteau part un abondant feutrage mycélien externe.
Cependant,
nous n'avons pas observé la formation de cordon mycélien (rhizomor-
phesj, ni de réseau de Hartig très net : les filaments mycéliens du manteau
n'ont pas bien pénétre l'espace intercellulaire.
Avec Gyrodon lividus, la mycorhization a été très lente. A la fin de l'expérien-
ce nous avons pu observer un manteau mycorhizien autour des racines courtes, de
cou.leur b'lanche,
ainsi qu'un mycelium très touffu colonisant les autres racines.
Ces deux types de mycorhizes n'ont pu être observés que sur milieu gelosé de
Melin-Norkrans modifie Marx dilué 10 fois.
Sur mélange tourbe-vermiculite nous n'avons obtenu aucune mycorhize bien que
Le milieu nutritif ait été identique au milieu utilisé sur gélose.
4.2 - Inoculation de l'actinomycète
-_--^-_----------------------
- Méthode de synthèse in vitro
. Matériel ae base
----..-----------
Nous avons opéré comme dans le cas de la synthèse mycorhizien-
ne sur de jeunes plantules d'Alnus glutinosa et d'Alnus incana, âgées de 6
semaines et c\\iLtivées soit sur du milieu gélosé MNM/lO, soit sur un milieu
spécifique gelosé, <carence en azote.
18
. Composition du milieu spécifique
---------_3-------3-_------3
KH2P0
: 1mM
4
; CaC12, 2H20 : 2,5 mM ; MgSO 4>7H20 : 0,5 mM ;
KS04 : 1,25 mM ; Fe(EDTA) ; 36pM ; BO H : 46pM ;
3 3
MnC124H20 : y" i
&L
: 0,7
M ; CuSO
2
r
4>5H20
: 0,3
M ; CoS04,7H20 : 0,2
M ; pH ajusté à
?
Y
6,Z avec KOH; IJrée O,5 mM.
. Inoculation
-------33--
Deux lots de souches de Frankia ont été utilisés :
- un lot provenant de souches isolées par B. MAUDINAS
- un lot résultant de cultures en milieu liquide, à partir de colonies de
souches isolées par M. LALONDE.
11 s'agit des souches suivantes :
AGNlg
)\\
BM )
ARbN4b
) MAUDINAS
LALONDE
BM0 )
AGNlAG.AC )
Un volume de quelques cm3 d'inoculum pouvant immerger les terminaisons des
racines longues a été introduit dans chaque tube expérimental, sous une
atmosphère stérile.
Le matériel est ensuite incubé dans une chambre de culture où règne une
température de 25OC sous des lampes dont l'éclairement avoisine les
20 000 lux avec une photopériode de 16 h.
- Résultats
Que ce soit sur milieu MNM/lO ou sur milieu spécifique carencé
en azote nous n'avons pu obtenir
de nodulation.
v - ETUDE EXPEHIMENTALE EN SEKRE
5.1 - Matériel et Méthodes
------1-w------"-.3--
- Matériel d'étude
. Préparation du sol expérimental
---_----------------__3________
.
Il s'agit de sol provenant d'une rendzine grise, pauvre en
phosphore, prélevé en forêt domaniale de Vauhalaise à Sompuis (Marne). Le
preièvement a et6 fait sur les 15 premiers cm (horizon Al).
Recouvert de toile en plastique,
le sol est au préalable désinfecté au
bromure de méthyle. Débâché au bout de 3 jours et laissé à l'air libre
pendant une semaine, il est ensuite mis dans des pots en plastique de 5 1,
21 raison de 5 kg de terre sèche par pot.
Les pots sont percés à leur fond
et l'ûrrosage se fait régulièrement à l'eau osmosée.
Un volume de 200 cm.3 d'un mélange de tourbe et
de vermiculite,dans les pro-
portions décrites précédemment,est ajouté à chaque pot, mélangé aux 5 pre-
miers cm d;i sol.
. Matériel végétal
-.-3----3-----"--
Matériel fongique
Champignon ectomycorhizien : Paxillus involutus
Des bocaux de verre de 1,6 1 sont remplis aux 3/4 du mélange
tourbe-vermiculite.
Ce substrat est inhibé de 750 cm3 de milieu nutritif
de Pachlewski et les bocaux sont fermés par un couvercle muni d'une ouver-
ture par où passe un tube de verre (8 x 1 cm) bouché par du
coton cardé
permettant les échanges gazeux.
L'ensemble est stérilisé à l'autoclave, après refroidissement des morceaux
de gélose envahis par du mycelium de Paxillus involutus sont déposés sous
atmosphère stérile, à la surface du substrat.
l!ne semaine après repiquage le champignon a commencé à pousser et à colo-
niser progressivement quelques bocaux qui seront utilisés comme source
d'inoculum au bout de 3 mois.
Champignon endomycorhizien : Glomus mosseae
Nous avons prélevé des racines de Ray Grass infectées par
Clomus mosseae et soustraites de tous corps étrangers (sable, débris végé-
taux.. . ). Ce matériel est utilisé comme inoculum dans certains traitements.
ActinomJcète : Frankia
Ce matériel est obtenu à partir de broyats de nodules d'Alnus
i.ncana âgés de 4 ans et prélevés à la pépinière du C.N.R.F.
ilne autre inoculation a été effectuée plus tard à partir de broyats de
nodules de la même espèce, prélevés en forêt.
Semence utilisée
Il s'agit de graines d'Alnus incana de provenance italienne.
- Protocole expérimental
Nous avons introduit; dans cette expérience 5 groupes de traite-
ments désignés par les lettres A,
B, C, D et E avec dans chaque groupe 10
traitements secondaires dus à un apport d'engrais minéraux, à raison de
4 répétitions par traitement (tableau 2).
Nous àonnons ici certaines précisions sur les traitements :
A z sot désinfecté + différents niveaux de phosphore (PI et d'azote IN)
Le phosphore est apporté sous forme de phosphate monocalcique
(Ca(p0 H
4 2 ) ;z,H20) et l'a zote sous forme de nitrate d'ammonium (NH4N03).
Le phosphate est mélangé au sol avant sa mise en pot. Quant au nitrate
d'ammonium,
très soluble, il est dissous dans de l'eau osmosée et ap-
port?? une fois le sol mis en pot,
selon les stades de germination sui-
vants :
- JO ppm, un mois apres levée, dans tous les pots avec N
- E:O ppm, 2 mois après levée, dans tous les pots avec N100 ou N200
- iilt~ ppm, .3 mois après levée, dans tous les pots avec NLoU
20
i
Traitements
Témoins
Apports d'engrais (en ppm)
P25
P50
P EOO
N50
A
T
NlOO
N200
P25 N50
P50 NlOO
PlOO N2UO
P25
P50
PlOO
B
T Pax.
N50
NlOO
N200
Paxillus
P25 N50
P50 NlOO
PlOO N200
P25
P50
PlOû
C
N50
NlOO
N200
T Gl.
G l o m u s
P25 N50
P50 NI00
PlOO N200
P25
P5O
PlùO
I)
T Fr.
N50
NlOü
N2 Ut.3
Frankia
P25 N50
P5ü NlOCI
PlOO N200
P25
P50
PlOO
E
T Gl. + Fr.
N50
N100
N2011
Glomus +
Erankia
Pi'5 N50
P50 NlOO
P100 NLW
TABLEAU 2 - LES TRAITEMENTS
21
B = A + Ectomycorhize (Paxillus involutus)
L'inoculum est apporté sous forme de mycelium mélangé au substrat
tourbe + vermiculite, rincé à l'eau osmosée. Un volume de 200 cm3
d'inoculum est mélangé aux dix premiers cm supérieurs du sol.
c, = A + Endomycorhize (Glomus mosseae)
Les racines de Ray-Grass infectées par Glomus mosseae sont introdui-
tes directement dans les trous où sont semées les graines, à raison
de 1 g environ de racines Cra?ches par pot.
D = A + Frankia
Les broyats des nodules sont mélangés aux dix premiers cm supérieurs
du sol avant les semis.
De l'inoculum a été également apporté au con-
tact des racines 3 mois après la levée.
E: = A + Glomus + Frankia
Dans ce traitement, les inoculums ont été apportés comme précédemment.
5.2 - Résultats
---m-3--..
5.2.1 - Influence des traitements sur la croissance en hauteur
La levée a été assez irrégulière, ce qui nous a conduit
a resemé certains pots.
Dans les pots où la levée a ét6 très bonne nous avons ramené progressive-
ment le nombre de semis à 7 au maximum.
Le nombre de semis par pot en fin
d'expérience a cependant varié de 1 à 7,
ce qui évidemment introduit une
variation non contrôlée nuisant a la précision de l'essai.
Les résultats sont présentés sans calcul statistique en raison du manque
de temps. Ils seront bien évidemment effectués ultérieurement.
L,'inoculation par Paxillus involutus a totalement échoué. Aucune mycorhi-
ze n'a été obtenue et aucun effet n'a été observé sur la croissance.
Nous ne présenterons donc pas de résultats relatifs à l'irifluence éventuel-
le des champignons ectomycorhiziens.
L'inoculation par Frankia
a été excellente,mais l'effet de cette inocula-
tion ne s'est fait sentir qu'après la deuxième quinzaine d'août. Nous ne
donnerons donc les résultats de cette inoculation que pour 1~ mesures du 14.9.
L'inoculation par Glornus mosseae a &té excellente. Nous n'aurorscependant
pas les résultats des mesures du taux d'infection, car ces mesures deman-
dent un travail de plusieurs mois.
Les témoins non inoculés par Frankia ou les traitements inoculés par
Glomus mosseae sont restés libres de contamination par E'rankia jusqu'au
10 août.. A partir de fin août un certain nombre de pots a commencé à se
contaminer,
ce qui &.ridemment a introduit des perturbations. Ces pertur-
bations sont restees assez limitées, mais nous preférons raisonner pour
ces deux traitements sur ies résultats du I4 aont et non sur ceux du 11
septembre.
AL1 14 août, ia croissance était arrêtée pour l'ensemole des pots de ces
de!ix traitements. Si elle a repris ultérieurement dans certains pots,
22
c'est uniquement en raison de l'effet descontaminations
oar Frankia.
Par contre dans les traitements où nous avons inoculé Frankia, la croissance
n'etait pas terminée au 11 septembre.
Il est donc probable que si nous
avions attendu un mois de plus les effets dus à l'inoculation par Frankia
auraient été plus importants.
. Croissance en hauteur en l'absence d'inoculation (fig. 1) -
----------------3-_-___3___1_3__________--------
Résultats au 14 août 1.981
-------_---_-----3--___3_
La fertilisation azotée n'a aucun effet sur la croissance de
IlAulne blanc.
L'effet d'un apport de phosphore est proportionnel à la dose de phosphore
apporté.
L'effet d'un apport combiné phosphore-azote se traduit par un léger effet
positif de l'azote.
Ces risultats sont parfaitement classiques.
I,e phosphore étant probablement limitant dans le sol, l'azote seul ne peut
avoir aucun effet. Lorsque la disponibilité en phosphore augmente, c'est
l'azote qui devient limitant,
d'où un effet de l'azote lorsqu'il est com-
biné 0. un apport de phosphore.
. Croissance en hauteur avec inoculation par Glomus mosseae
_3___------------_--------------”---------------------~--
(fig. 2) - Résultats au 14 août 1981
------3-_---3_----13_------
L'inoculation par Glomus mosseae se traduit par une modifica-
tion t0tal.e de la réponse de 1'Aulne à des apports croissants de phosphore
et d’azote.
L'augmentation de la disponibilitg en phosphore du sol n'a plus aucun ef-
fet. La croissance est maximale des le niveau 0, c'est-à-dire en l'absence
de totit appert de phosphore.
Un apport combiné azote-phosphore améliore nettement la croissance de
1 'Aulne . Cet effet de l'azote est obtenu même avec l'apport le plus Eaible
(25 ppm).
l.'azote seul a un effet extrêmement marqué dès la dose de 25 ppm.
L'effet de l'endophyte est considérablement amélioré par un faible apport
d'azote seul.
Il est difficile d'expliquer les différences d'effets entre un apport
com-
biné d'azote (NF') et un apport d'azote seul.
. <roissance en hauteur avec inoculation par Frankia (fig. 31 -
___---_-------------------------------------------
Résultats au 11 septembre 1981
--------------------___3______
L'inoculation par Frankia n'a pas d",effet à faible niveau d:?
phosphore (pas d'apport ou apport de 25 ppm).
A partir de 50 ppm il y a manifestement effet de l'inoculation.
Ces rhsultats sont logiques. La fixation symbiotique exige des quantités
importantes de phosphore que l'arbre seul ne peut fournir
2 l'actinomycète
& faible niveau de fertilité ou en l'absence d'endophyte endomycorhizien.
lin apport d'azote seul ne peut évidemment avoir d'effet. *
:'n apport combine d'azote (NF) semble avoir :In eft'et dépressif à niveau
;n!eV;.
2 3
Mes!ires
d u 1.1/8/-tg81
r-
/
/
MESURES DU 11/8/1981
2
Np4 - 4-c CC-
------+ge- #.C---
l//
25
auteur moyenne
par pot. imm~
Mesures au 14/9/1981
Apport d’a.
ZOLF
e t d e
phosphore
ippm)
26
Apport de N
.
et de
PL03
P (ppm)
! ! g$:Ice .1 - Et f‘e t dt doseL>
croissantes d'azote (ff) et de phosphore (PJ
.,.
,
-. ____- ._-.-.-- .-
P25 ppm
P5O ppm
PI00 ppm
/
N50 ppm
/
N?.OO ppm 1 N200 ppm /
i$ p:i
TABLEAU 3 - PWM33HE DE NODULES PAH PLANT il1 septembre 1981)
28
. Crcissance en hauteur avec double inoculation actinomycète-
____-__-I___-----------------------------"----------------
champignon endomycorhizien <fig. 4j
----1---3___-3_-----------
- Résultats au 11 seot. 1981
~-.---4--~-------r---------
Par double inoculation il n'y a plus aucun effet de la ferti-
lisrit:; on. A r:iveau très faible de phosphore et d’azote dans le sol l'endo-
phyte mycorhizien permet seul une alimentation optimale en phosphore et
i'a~titlomycète illlC? alimentation optimale en azote.
5.2.2 - Interaction nodulation-mycorhization-disponibilité du
sol en azote et en phosphore itableau 3)
Nous avons estimé la nodulation par comptage du nombre
de nodules par plant. Nous aurions pu également prendre en compte le poids
de nodule ; mais par manque de moyens nous avons adopté la premike solu-
tion.
XI: l'absence d'endomycorhize,
il n'y a pas nodulation s'il n'y a pas d'ap-
port; de phosphore. L'apport d'azote seul induit une légère nodulation.
lin apport de phosphore améliore nettement la nodulation quelle que soit la
dose. i!n apport d'azote combiné à un apport de phosphore semble légèrement
diminuer
La nodu1ation.
En présence d'un champignon endomycorhizien,
il y a nodulation sans apport
dr? phosphore. Avec apport de phosphore seul,
la nodulation ne semble pas
amGliorGe,
si on excepte les résultats obtenus avec 100 ppm de P que l'on
pect considérer comme aberrants.
Un apport d'azote seul OU combin6 au phosphore améliore très nettement la
no:!\\,lation comparativement -5 ce que l'on observe sans endomycorhize.
VI - CONCLUSION
i,'Ai;lne estune des rares essences forestières capables de fixer l'azote
atmosphérique en région tempérée.
~a caoacité de fixation est élevée et semble, d'après la littérature,
osciller entre 1CKl et 300 kg d'azote à l'hectare.
Cette caractGris tiq:ie tout à fait remarquable n'est ptis exploitée ac-
t,iellement. Le coût de plais en plus Gievé des engrais azotés de synthèse
et l'interêt manifesté depliis peu pour la production de biomasse fores-
tii-i-e justifient les travaux qui sont actuellement développés sur 1'Aulne
dans différents pays.
!j
LI ' ',i!.:tre part, d'un point de vue scientifique 1'Aulne est une espèce tout
ii f‘ait, remarqilable puisqu'elle est associée à trois types d'organismes
sycbiC~tiqi?eS :
1 des ch‘impignons ectomycorhiziens
. des champignons endomycorhiziens
. iii? ac tinomycète
:,'Gt!i?e des interrelations entre
ces trois organismes symbiotiques et leur
hOte constit,ue UT. sujet de choix.
i,c:c Gii1li,~~3:ts obtenus XII~ COIII"s de ce travail, bLer1 qu'incomplétement dépouil-
1i.r; ,:>y exp:oitS&î
apporter,t ;Il>e certaine .lumière 8ur ces interactions symbio-
t i ,q: JC::< .
29
Dans nos conditions d'expérience,
il apparaît difficile de maintenir
IfAulne exempt de Frankia aA-delà de 4 à 5 mois. Pour la poursuite
d'expériences ulterieures,
ii serait particulièrement intéressant de
déterminer l'origine de ces contaminations (eau d'arrosage, air, insectes,
mauvaise désinfection...!.
~Nous avons échoué dans l'inoculation d'un champignon ectomycorhizien,
P'üxillus
invoiutus,
en conditions de serre alors que nous avons réussi
cette synthèse en conditions axéniques.
I\\I~I;~ avons montre expérimentalement qu'Alnus incana était endomycorhizien.
E;n l'absence de symbiote, la réponse d'Alnus incana à une fertilisation
azotée et phosphatée est tout à fait classique. Seul l'azote n'a aucun
eff‘et en raison de la faible disponibilité du sol en phosphore. Le phos-
phore est le facteur limitant principal.
L'amélioration de la croissance de 1'Aulne est proportionnelle à la dose
do phosphore apporte. Lorsque le phosphore n'est plus le facteur limitant,
c'est l.'azote qui le devient d'où un effet d'un apport d'azote combiné à
un apport de phosphore.
Avec I'endophyte mycorhizien la réponse de 1'Aulne est complètement mo-
difiée.
Le phosphore n'est plus limitant ;
sans apport de phosphore la croissance
de I'Aulne est maximale et elle n'est pas améliorée par des apports crois-
sants de phosphore.
L'effet de l'endophyte mycorhizien est très nettement amélioré par ferti-
lisation azotée, même à niveau faible (25 ppm).
II est difficile d'expliquer pourquoi l'effet de N seul est supérieur à
,r:elui de N combiné à P.
L'endophyte améliore considérablement l'efficacité de la fertilisation
azotée sans que l'on puisse dire si cet effet est dû à une amélioration de
l'absorption de l'azote minéral ou à une intervention dans le métabolksme
azoté.
L'inoc~laticrl par Frankia seu.l ne modifie pas fondamentalement la réponse
de 1'Aulne.
li n'y a aucun effet de l'azote seul. L'effet du phosphore
semble nul jusqu'à 25 ppn: environ. Au-delà de cette dose, l'alimentation
en phosphore de 1'AuLne devient suffisante.
L'actinomycète peut commencer à fixer l'azote puis à le transférer à
l'arbre,d'où une amelioration de la croissance.
!,;;i double inoculation Frankia-endophyte
permet une croissance maximale,
sans apport azoté ou phosphaté.
Naus avons pu mettre en évidence Iine interaction nodul&endomycorhize-
l~rtilisa:ic:ri.
GlobaLement la nodul<ation est meilleure lorsqu'il y a pré-
sence du champignon endomycorhizien.
Cette amélioration de la nodulation
sous L'effet. de l'endophyte mycorhizien est surtout perceptible en pré-
sence d ' azote, que l'azote soit apporté seul ou en combinaison avec le
phosphore.
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