REPUBLIQUE DU SENEGAL MINISTERE DE LA RECHERCHE ...
REPUBLIQUE DU SENEGAL
MINISTERE DE LA RECHERCHE
INSTITUT SENEGA:LAIS
SCIENTIFIQUE ET TECHNIQUE
DE RECHERCHES AGRICOLES
OFFICE DE LA RECHERCHE
DEPARTEMENT DE RECHERCHES
SCIENTIFI\\UE ET TECHNIQUE
SUR LES PRODUCTIONS VEGETALES
OUTRE MER. O.R.S.T.O.M.
(BEL AIR)
--w-m
ETABLISSEMENT DU CENTRE DE RESSOURCES
MICROBIOLOGIQUES (MIRCEN) DE
L'AFRIQUE DE L'OUEST
RAPPORT DE TITULARISATION DE M. Mamadou GUEPE
Septembre 1983
Centre National de Recherches Agronomiques
de Bambey
REMERCIEMENT
Ce rapport de titularisation a été préoaré au laboratoire de
microbiologie des sols de 1'ORSTOM à Dakar sous la direction de
Monsieur DOMMERGUES, Y., directeur de recherches titulaire CNRS/
ORSTOM. Nous le remercions tout particulierement pour avoir suivi
ce travail et jugé ce rapoort.
Nous remercions également Monsieur DIEM, H.G., maftre de
recherches CNRS/ORSTOM et Monsieur DREYFUS, B., chargé de recherches
ORSTOM pour l'encadrement scientifique et les précieux conseils
qu'ils nous ont prodigués.
Nous remercions aussi Monsieur BORDELEAU, L. Directeur de
recherches au Canada Agriculture qui nous a aidés à mettre en place
le Centre de Ressources Microbiologiques (EIIRCEN) de l'Afrique de
l'Ouest et qui a également jugé ce rapnort.
Nos remerciements s'adressent egalement à tout le personnel du
laboratoire de microbiologie des sols de L'ORSTOhrl. en particulier
Monsieur BOUREAU, Y.,pour ses conseils pratiques et Yonsieur
DIAWARA, I., pour la dactylographie de ce rapport.
Enfin nous remercions tous les responsables de l'Institut
Sénégalais de Recherches Agricoles (ISRA) et Monsieur Edgar J. Da
PIEVA d'avoir pris la ddcision de la création du IUBRCEN de l'Afrique
ire l'Ouest,
ce qui me permet de pouvoir présenter ce rapport aujour-
d'hui.
1
PLAN
-
-
INTRODUCTION GENERALE.
Ière Partie: Constitution d'une collection de souche de 'Rhizobium et
-
-
de champignons endomycorhiziens.
INTRODUCTION
1. Conservation des microorganismes
1. Enumeration des méthodes utilisables
2. Méthodes de conservations des champignons endomycorhi-
ziens à vésicules et d arbuscules
3. Méthodes de conservation utilisées au laboratoire
II. Gestion de la collection de microorganismes
1. Fiche technique d'une souche de microorganisme
2. Traitement informatique
3. Liste des souches
2ème Partie: Recherches preliminaires sur la fixation biologique de
l'azote par Voandzeia subterranea
1. Introduction
2. Matériel et Méthodes
3. Résultats
4. Discussion
5. Conclusion
3ème Partie : Recherches complementaires sur la double inoculation de
Vigna unguiculata par ??hizobium et Glomus mosseae
-
-
1. Introduction
2 . Rappel du matériel et des méthodes utilisées
3. Absorption du zinc
4. Conclusion
Conclusion Générale
Bibliographie
2
INTRODUCTION GENERALE
-
La principale tâche du Centre de Ressources Yicrobiologiques
(MIRCEN) de l'Afrique de l'Ouest est de
mettre en place une collection
régionale de cultures microbiennes. Il centralisera pour leur conser-
vation et leur utilisation des microorganismes d'intéret économique
pour la production d'inoculums biofertilisants de Rhizobium et de
mycorhizes.
Au cours des six mois d'essai, nous avons entrepris de constituer
une collection de culture de Rhizobium, La liste des Rhizobium en col-
-
lection regroupe des souches isolées par les microbiologistes de
1'ORSTOM et des souches provenant d'autres centres de collection de
culture:
USDA à Beltsville (USA), Niftal à Hawaii (USA), Nitraqin
Company (USA).
Le PlIRCEN doit également orienter ses efforts sur le développe-
ment du monde rural avec comme objectifs la ,préservation et l'utilisa-
tion des ressources locales. A ce titre, Voandzeia subterranea,
véritable ressource protéinique pour l'avenir
est une legumineuse
traditionnellement cultivée au Sénégal et qui, maintenant disparait
des surfaces cultivables. Dans l'objectif de l'autosuffisance alimen-
taire, nous avons proposé un programme de recherche sur Voandzeia
subterranea dans le cadre du PlIRCEN.
Nous avons initie ce programme
de recherche au laboratoire de microbiologie des sols de 1'ORSTOM à
Dakar.
Enfin, au cours des six mois d'essai nous avons terminé une
expérience sur l'absorption du zinc par 'cligna unguiculata inoculé avec
un champignon endomycorhizien à vésicules et à arbuscules Glomus mosseae
-
-
Dans ce rapport, nous aborderons donc trois sujets:
1) Constitution d'une collection de souches de Rhizobium et de
mycorhizes.
2) Recherches préliminaires sur la fixation biologique de l'azote
par Voandzeia subterranea.
-
3) Recherches complémentaires sur :La double inoculation de :Vigna
unguiculata par Rhizobium et Glomus mosseae.
-
-
lère Partie
CONSTITUTION D'UNE COLLECTION DE SOUCHES
DE RHIZOBIUM ET DE CHAMPIGNONS ENDOMYCORHIZIENS
;INTRODUCTION
~a constitution d'une collection de souches de microorganismes
est une des principales activités du MIRCEN. Elle a pour but de mettre
$9 la disposition des laboratoires, Instituts de Recherche et industries
ces microorganismes en vue de leur
utilisation. De ce point de vue
:La conservation des cultures de microorganismes revêt une grande
importance pour le maintien d'une collection de cultures stables et
actives.
Au MIRCEN de l'Afrique de l'ouest, nous envisageons de constituer
*une collection de Rhizobium, de Yycorhizes et de Frankia. Actuellement,
-
-
nous avons entrepris une collection de culture de Rhizobium et de
champignons endomycorhiziens à vesicu:Les et à arbuscules (MVA).
La constitution d'une telle collection de culture nécessite la
,tenue d'un fichier pour tous les microorganismes. Chaque souche doit
avoir une fiche technique qui fournit tous les renseignements rela,tifs
à la souche: le numéro de la souche dans la collection, la plante-hôte,
.Le lieu d'origine, le fournisseur et les performances symbiotiqucs de
La souche de Rhizobium (VINCENT, 1970). Chaque centre doit développer
:son propre système d'identification des souches de Rhizobium qu'il
détient.
.r . CONSERVATION DES hlICROORGA?JIS!~ES
1. Enumération des différentes méthodes utilisables pour la conservation
des souches de Rhizobium
1.1. Gélose inclinée (VINCENT, 1970).
---------------
On cultive les glizobium dans des tubes contenant un milieu gélosé
incliné.
Les cultures de Rhizobium peuvent être conservées ainsi 2 ans
;i basse température. C'est une méthode simple qui r>ermet un repiquage
rapide et facile des Rhizobium. Elle n'est cependant pas conseillée pour
les très longues conservations cardes repiquages fréquents aug'mentent
:Les risques de contamination et de verte de la souche. De plus, cette
opération exige beaucoup de temps.
1.2. Gélose couverte d'huile de naraffine (VINCENT, 1970)
__^-------- -----.-----------i-,.------
Elle est très
nroche de la précédente. Les Rhizobium ayant poussé
convenablement sur la gélose inclinée sont recouverte
d'huile de paraf-
fine stérile. En nlus des facilités que nrésente la première mkizhode,
celle-ci a l'avantage de diminuer le risque de dessication de la
culture, donc diminue la fréquence des reoiquaqes.
1.3. "Iéthode desbilles de emrcelaine INJORRIS, 1963)
---------------_----- .m-------.-
Dans une fiole contenant une suspension de Rhizobium, on introduit
des billes de porcelaine stériles. Après agitation, les billes sont
recupérées et réintroduites dans une deuxième fiole contenant du
silica;rgél stérile.
LesRhizobium adsorbéssur les billes de porcelaine sont ainsi
conservés aussi longtemps que dure le silicagel. La durée de conservation
peut atteindre 4 ans.
1.4. Sol stérile
-------s-m-
Du sol stérile peut être utilise pour conserver des Souc:hes de
Rhizobium (NUTMAN, 1946; JENSEN, 196111. Cette methode a l'avantage
d'éviter toute pression de sélection sur les microorganismes c,ar le
sol est un milieu complexe.
1.5. Congélation des Rhizobium (American Society for Yicrobiology,
-------1-1--_---.---------
1981).
La congélation à -8OOC est une bonne méthode conservation.
La durée de vie des Rhizobium est de 1 à 2 ans. Il est cependant
déconseillé d'ouvrir colnstamment le congélateur: les grands écarts de
température sont fatals .aux Rhizobium
1.6. Lyophilisation (VINCENT, 1970)
--a..*----------
Il s'agit d'une congélation des Rhizobium sous vide dans des am-
poules scellées. C'est la meilleure méthode de conservation. Los Rhizo-
bium peuvent être conservés pendant 15 à 20 ans à la température ambiante.
-
-
2. Méthode de conservation des champignons endomycorhiziens
Les champignons endomycorhiziens VA sont des symbiotes obligatoires.
!On ne peut pas les cultiver in vitro. %Iais on peut multiplier ces
champignons dans les racines d'une plante-hôte inoculée avec ces mêmes
champignons: nous faisons prégermer des graines stériles de la plante-
hôte dans du sable stérile. L'inoculation par
un champignon endomy-
corhizicn VA consiste ci apLliquer 1 g de poids frais de racines infec-
tées par ce champignon contre les radicelles de la plantule obtenue que
mous cultivons dans un sol stérile.
13. Méthode de conservation des microorganismes utilisés au laboratoire
3.1. Conservation des souches de Qhizohium
---------------_----___1__11_________
En attendant de pouvoir faire appel à la lyophilisation ,qui est
actuellement une des méthodes les plus sûres, nous utilisons les 2
m&thodes suivantes :
- la conservation sur gélose et la congélation.
3.1.1. Conservation sur gélose
----m-------
Nous avons utilisé à cet effet des boîtes de Pétri et de:; tubes
a vis contenant du milieu YEM gélosé.
Nous avons déposé les Rh.izobium à
:La surface de la gélose, puis entouré les
boîtes et les tubes avec de
ila paraffine. Ensuite, nous les avons mis à incubation à 30°C pendant
lie
temps nécessaire polur une bonne croissance. Puis nous avons rangé
3.es boîtes et les tubes en chambre froide à 4OC.
3.1.2. Congélation des Rhizobium
----w-------...
Nous avons prélevé 2ml de suspension de Rhizobium en croissance
exponentielle que nous avons introduit dans
le même volume de glycérol
stérile contenu dans un pilulier. Nous avons ensuite place tous les
piluliers dans un congélateur à -8OOC.
3.2. Conservation des souches de Champignons endomycorhiziens VA
-----------------------------------------------------
Selon la méthode décrite au paragraphe 2., nous multiplions les
champignons endomycorhiziens à vésicules et à arbuscules dans cies
racines de Vigna unguiculata. Les champignons endomycorhiziens étant
des symbiotes obligatoires, c'est nar ce Frocédé que nous conservons
les deux souches de notre collection Glomus mcsseae et Glomus Tascicu-
latus.
II. GESTION DE LA COLLECTION DE MICROORGANISYES
1. Fiche technique d'une souche de microorganisme
La fiche technique que nous avons adontée pour le YIRCEN est une
variante de la fiche technique internationale proposée par le Centre
Mondial des Données sur les microorganismes (WDC) de Brisbane (VINCENT,
:1982). Elle decrit:
-- des généralités sur le microorganisme:systématique, année d'acquisition
par le MIQCEN, numéro dans la collection MIRCEN, autres références
de souche;
-- une description de la -lante-hote;
-* la composition du sol d'origine:
-. les conditions de croissance et le mode de conservation du microorga-
nisme;
-. le spectre d'hôte du microorganisme.
Chaque souche de microorganisme a une fiche technique comme le
modèle ci-joint et porte le nom de la collection FIA 0 (Mircen Afrique
Ouest) suivi d'un numéro d'ordre. Une fiche technique de Qhizobium pour
chaque espèce de légumineuse est indiquée en annexe, ainsi que les
fiches techniques des deux souches de mycorhizes.
2. Traitement informatique
Pour la gestion de la collection de microorganismes, nous avons
utilisé la méthode BRADS II qui est un logiciel de système de gestion
par base de données. L'objectif princiisal du BRADS II consiste à
définir, à créer et à assurer la maintenance des données permettant
ainsi toutes les applications informatiques possibles sur ces informa-
tions.
Toutes les informations sont actuellement imprimées sur une
disquette simple face, simple densité par un microordinateur IBM5120
disponible au Centre de Recherche Océanoqranhiquc de Thiaraye (CRODT)
et au Centre National de Qecherche nqronomique de Bambey (CWRA).
3. Liste des souches. Nous reportons dans ce paragraphe une liste des
souches de Rhizobium obtenue par le traitement informatique.
8
Exemple de Fiche Technique d'un Microorqanisme
1.
GENRE
2.
ESPECE
3. NUMERO AU YDC
4.
COLLECTION NUMERO SOUCHE
5. ANNEE D'ACQUISITION
6. PREMIERE REFERENCE
7. DEUXIEME REFERENCE
8. ANTICORPS FLUORESCENT DISPONIBLE
9. PLANTE D'ORIGINE
9.1. GENRE
9.2. ESPECE
9.3. CULTIVAR
10. PARTIE DE LA PLANTE
10.1. NODULE
10.2. AUTRE
11. LIEU D'ORIGINE
11.1. PAYS
11.2. REGION
11.3. VILLE
11.4.
ALTITUDE (m)
11.5. LATITUDE
11.6. LONGITUDE
12. COMPOSITION DU SOL D'ORIGINE
12.1. C 'TOTAL
(ppm)
12.2. N TOTAL
PI
12.3. N +lINERALISABLE It
12.4. P TOTAL
II
12.5. P ASSIMILABLE
II
12.6. ARGILE
(%)
12.7.
LIMON
*t
12.8. SABLE
II
12.9. pH KCl
12.10. pH EAU
13. ISOLEMENT EFFECTUE
13.1. AUTEUR
9
13.2. DATE
14. IDENTIFICATION
14.1. AUTEUR
14.2. DATE
15. CONSERVATION DE LA SOUCHE
15.1. MODE DE CONSERVATION
15.2. MILIEU DE SUPPORT
16. MILIEU DE CROISSANCE
17. TEMPERATURE DE CROISSANCE
18. CARACTERISTIQUES
19. TEMPS D'INCUBATION
20. ORGANISME LIBRE
20.1. TOLERANCE AU pH
20.2.
TOLERANCE A LA TEMPERATURE
21. SYMBIOSE RACINAIRE
21.1. TOLERANCE AU pH
21.2. TOLERANCE A LA TE:MPERATURE
22.
INFECTIVE SUR
23. EFFECTIVE SUR
24. LABORATOIRES OU LA S'OUCHE EST DISPONIBLE.
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1, I
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10
III. CONCLUSION
Nous avons vérifié la pureté de toutes les souches et nous les
avons conservées au congélateur et en chambre froide. Nous n'aivons pas
pu lyophiliser ces souches car les accessoires indispensables au
fonctionnement du lyo?hifisateur ne nous étaient pas parvenus,
Le système BRADS II a une canacite limitée. Nous
envisageons
actuellement d'autres ,systèmes de qestion aoplicables sur le mini-ordi-
nateur IBM 5120 pour pouvoir effectuer l'ensemble des opérations
informatiques relatives au fichier.
11
2ème P'artie
RECHERCHES PRELIMINAIRES SUR LA FIXATION
BIOLOGIQUE DE L'AZOTE PAR VOANDZEIA SUBTERRANEA
1 2
1. INTRODUCTION
Dans les pays en ,voie de d6veloppement, il est très important de
développer les cultures de légumineuses riches en nrotdines qui peuvent
contribuer à l'équilibre nutritonnel des populations. De ce point de
vue, Voandzeia subterranea constitue une légumineuse intéressante car
c'est une ressource à ne pas négliger pour les pays de la zone semi-aride
ouest africaine dans l'objectif de l'autosuffisance alimentaire.
'Tableau 1. Com,position nutritionnelle pour 100 g de graines sèches
(rapport BOSTID, 1979)
Calories
412
Protides (9)
17,3
kipides (g)
6,7
Glucides (g)
72,2
A notre connaissance, au Sénégal, il n'y a pas de programme pour
la culture et l'amélioration des rendements de Voandzeia subterranea.
Ce sont les raisons pour lesquelles nous avons proposé dans le
cadre du Centre de Ressources Nicrobiologiques (MIRCEN) de l'Afrique
de l'Ouest un programme de recherche axé principalement sur la fixation
biologique de l'azote par Vogdzeia subterranea.
En effet l'inoculaltion des légumineuses avec des souches {de
Rhizobium efficientes et compétitives permet l'amélioration de leur
rendement sans recourir j l'emploi des enqrais azotés trop coûteux.
Bn ce qui concerne Voandzeia subterranea, nous avons
très peu de
c:onnaissances sur la fixation biologique de l'azote parr
cette légumi-
neuse.
Elles se limitent a quelques souches de Rhizobium isolées lors
des expériences conduites au NifTal project à Hawaii (USA).
Notre programme consiste donc à:
l/ isoler et sélectionner des souches de Rhizobium efficientes
et compétitives pour l'inoculation de Voandzeia subterranea;
2/ étudier le rble des endomycorhizes dans la fixation biologique
par Voandzeia, subterranea. La sélection des cultivars répon-
dant le mieux à la mycorhization permet d'obtenir des variétgs
rustiques et adaptées aux conditions sévères de l'agriculture
en zone semi-aride notamment.
1 3
Nous avons initié ce programme au Laboratoire de Microbiologie
des Sols de 1'ORSTOM à Dakar et nous indiquons dans.ce présent rapport
les résultas préliminaires que nous avons obtenus concernant l'isole-
ment et la caractérisation de souches de Rhizobium à partir de
Voandzeia subterranea.
2. MATERIEL et METHODES
2.1. Piégeage de souches de Rhizobium
m.--s..-
_-----_---------^--------
Dans le sol de la station expérimentai
de 1'ORSTOM ;i Dakar,
Bel-Air dont nous donnons la composition, nous avons semé deux
petites parcelles (2m x 2m) respectivement avec les cultivars 78-1 et
79-l de Voandzeia subterranea fournis par le service de diversifi-
-
cation du CNRA de Bambey par poquet de deux graines. Les paquets
étaient distants de 30cm et les interlignes de 60cm.
Composition du sol dle Bel-Air surface
apm
Granulométrie %
c
N
N minera- P
P assi- Argile
Limon
Sable
pHKC1 pHeau
total total lisable
total milable
I-
-
3900
340
69
206,8 26,4
6‘4
2,7
92,8
6,5
7,2
2.2. Isolement des souches de Rhizobium
-------------.---------------------
VINCENT (1970) a décrit une mé,thode d'isolement de Rhizobium à
partir des nodules de légumineuses. Cependant, nous avons préféré
à la méthode de VINCENT une autre plus ranide que nous décrivons ci-
dessous. Sous une hotte à flux laminaire, nous i3VOIlS soigneusement
cassé un nodule frais convenablement choisi. Nous avons introduit une
oese stérile au centre du nodule pour prélever des Rhizobium. Nous
avons ensuite fait des stries d'épuisement dans des boites 'de Petri
contenant du milieu Y'EM gélosé stérile que nous avons mis à 3O'C.
Nous avons observe les boites de Petri après 7 -jours d'incubation.
2.3. Caractérisation des Rhizobium
-----e-------------
11 existe plusieurs techniques de purification et de caractérisa-
tion des Rhizobium.
1 4
2 . 3 . 1 . Croissanc!e sur milieu YMA (Yeast Mannitol Agar) (VINCENT,
- - .m - WI I - - - - - - c
1 9 7 0 ) .
Ce milieu permet de définir deux groupes de Rhizobium: (i.1 les
fast growing et (ii) les slow growing dont les temps de géneration
sont respectivement'de 3 à 4 heures et de 8 à 12h d'incubation a 28Oc.
Ile rilieu YMA contient par litre: K2HP04: 0,5g; MgS04,7H20: 0,2g; NaCl:
O,lg; mannitaol: 1Og; levure: ig; yélose: 15q. Le pH est ajusté à
6,8 avec HCl&u &&Il.
2.3.1. Test de nodulation
- - - - - - .,. - M
Le test de nodulation est une technique qui permet une caractéri-
sation absolue des Rhizobium. C'est le stade ultime et necessaire de
tout isolement. Si des isolats ne peuvent pas noduler une ou des
légumineuses-hôtes, il ne s'agit pas de Rhizobium. Genéralement dans
beaucoup de laboratoires, on effectue des tests de nodulation sur les
plantes à partir desquelles on a isolé les bactéries et/ou sur des
plantes s'en rapprochant. Nous avons fait un test de nodulation des
isolats Vs2, Vs3 et 'Vs4 sur le cultivar 79-l à partir duquel leur
isolement est effectué.
2 . 3 . 1 . 1 .
Germination des graines
Nous avons stérilisé les graines de Voandzeia subterrane& par
trempage dans &Cl2 O,l% pendant 3mn. Après trois lavages soigneux
avec de l'eau distillée stérile, nous les avons mises à germ,er dans
des boîtes de Petri ccontenant de l'eau gélos&e 0,9% stérile. Les
plantules obtenues sont repiquées dans des tubes de GIBSON,
2.3.1.2. Culture des plantes dans les tubes de GIBSON
(GIBSGN, 1963).
Dans des tubes à essai de 30mm de diamètre, nous avons mis du
milieu de JENSEN contenant par litre d‘eau distillee: CaHPO 4 : lg;
K2HP0 : 2g; MgSO 4,7H,,0:
4
2g; NaCl: 2g; FeC13: 0,lq; solution d'oligo-
éléments: lml; gelos~~:
20q (JENSEN, 1942). 1 litre de solution d'Oli-
go-éléments contient:: HB03: 2,86g; MnS04,4H20: 2,03g; ZnS04,7H20:
0,22g; CuS04,5H20: 0,,08g; Na2Mo04,H20: 0,09g.
Le pH du milieu de JENSEN est ajuste à 6,7 avec NaOH.
1 5
Nous avons stérilisé tous les tubes à l'autoclave 120°C, 20mn.
Apres nous avons repiqué les olantules obtenues comme indiqué au
5 2.3.3.1. dans ces tubes à raison de une ?ar tube. Nous avons ensuite
inoculé les plantules de Voandzeia subterranea cv. 79-l avec lOm1 de
culture des isolats VS~, Vs3 et Vs4 contenant 10 9 bactéries .par ml.
3. RESULTATS
3.1. Isolement de souches de Rhizobium
_-------------------I_____^______
Nous avons récolte des nodules sur les deux parcelles après 1 mois
de culture. Nous avons remarqué pour les deux cultivars 78-l et 79-l
de Voandzeia subterranea que leu cortex des nodules est blan ou rouge.
Il y avait en généraIL 1 nodule "rouge" pour 15 nodules "blancs".
Nous avons obtenu à partir de ces nodules 10 isolats purs que nous
avons dénommés VS~, VS~, VS~..... Vs10 (tableau 2). Aucun de ces
isolats ne réagit avec les anticorps fluorescents disponibles au
laboratoire.
3.2. Caractérisation des souches de Rhizobium
-------------_------________I___________
Lors des repiquages successifs sur milieu YBIA pour la purification
des isolats, nous avalns remarqué qu'ils étaient tous des slow growing.
D'autre part, Voandzeia subterranea se prete tres bien à une culture
hydroponique en tube de GIBSON, et, après 3 semaines de culture en
serre, nous avons remarqué des nodules sur les plantes inocu:Lées avec
les isolats Vs2, Vs3 et Vs4 (tableau 3).
4. DISCUSSION
4.1. Couleur des nodules
__-e---..---------w.-
La couleur du cortex des nodules de Voandzeia subterraneai est un
phénomlrne que nous rencontrons pour
la deuxième fois. Déjà en 1982,
nous avions remarqué que le cortex des nodules de Vigna unguiculata
était beige ou rouge selon la souche? JARA (1981), puis MULONGOY
(Comm. pers.) avaient fait les m&nes remarques sur Vigna unguiculata.
EAGLESHAF? et a1 (1982) observaient des différences de couleur sur les
-e
nodules de Glycine maxI Arachis hypogaea et Vigna unguiculata. Ces
derniers auteurs ont emis l'hypothèse d'un pigment ynthétisé par la
::GUEYE, 198233
1 6
plante, ou par le sizobium, ou nar les deux.
En ce qui ncius concerne, nous pensons qu'il est très important
d'étudier cette pigmentation nodulaire afin de mieux comprendre les
interactions légumineuse-Rhizobium. Ceci nourrait utilisé pour l'dtude
de la compétitivité des Rhizobium.
4.2. Isolement
---w
deg-s~ycb~s-~g
----.3.--
Rhizobium
Nous n'avons isolé du sol de Bel--Air que 10 souches de Rhizobium
à partir des nodules de Voandzeia subterranea. Ceci est relativement
insuffisant si nous voulons sélectionner une ou des souches effectives
et compétitives sur Voandzeia subterranea. Cependant ceci n'est
qu'une initiation du programme sur la fixation biologique de l'azote
par cette légumineuse et l'isolement de souches de Rhizobiuni est loin
d'être achevé. Il se fera sur toute l'étendu du territoire Sénegalais.
D'autre part VS~, Vs3 et Vs4 sont des souches isolées au même
endroit d partir du même cultivar et à la même date. Nous pouvons
penser que Vs2 est différent de Vs3 et de Vs4 car isolés de nodules
à coloration externe différente. Par contre, nous ne pouvons pas
certifier que Vs3 et Vs4 sont identiques ou différents.
1 7
Tableau 2. Rhizobiuni isolés de Voandzeia subterranea cultivé dans
le sol de Bel-Air.
--
~-~~-
Cultivars
Couleur des nodules
Rhizobium isolés
79-1
Blanc
Vs l a::
Blanc
Vs 3. b::
Blanc
vs L!
Rouge
vs 3
Rouge
vs 4
Rouge
vs 5
Blanc
Vs 6
Blanc
vs 7
78-1
Rouge
vs 8
‘1
Rouge
vs 9
Il
Blanc
VslO
::Dans les boltes de Pétri Vs1 , nous avons remarqué deux types de
colonies qui repiquées séparément ont donné Vs la et Vs lb.
1 8
Tableau 3. Test de nodulation de Voandzeia subterranea cv. 79-l
cultivé dans des tubes de GIBSON et inoculé avec les
souches de Rhizobium Vs 2, Vs 3 et Vs 4.
Souches
Nodulation
Nombre de nodules
Témoin
0
vs 2
+
15
vs 3
+
1 4
vs 4
f
1 7
19
5. CONCLUSION
Voandzeia subterranea est une légumineuse tropicale actuellement
-
-
-
sous exploitee au Sénégal. Le département des productions végcstales
de 1'XSRA a propos6 un programme de recherche sur cette légumineuse
à la National Academy of Sciences des Etats Unis d'Amérique. Le finan-
cement requis s'elèvera à 120.012 dollars US, soit 42.004.200 Francs
CFA couvrant une période de 3 ans.
Le travail effectué au laboratoire de microbiologie des sols
de l'ORSTON: est une ébauche de ce programme. Actuellement nous ne
pouvons pas classer les souches isol&es dans la collection de micro-
organismes car des expériences complémentaires doivent permettre de
mioux les caractériser : il nous reste à déterminer le spectre-d&hôte
de ces isolats, à étud.ier leur effectivité à preparer leur anticorps
fluorescents pour l'étude de la compétivité. Nous étudierons enfin
l'association de Voandzeia subterranea avec Glomus mosseae.
Ceci nous permettra (i) d'étudier la fixatio'n réelle de l'azote
au champ par une méthode fiable telle que l'utilisation de 1 5 N et
(ii.1 d'envisager la double inoculation au champ de Voandzeia subter-
" -
ranea avec le rhizobium le plus effectif et le plus compétitif et
i!lVGC GlOXlUS mosseae.
20
3ème Partie
RECHERCHES COMPLEMENTAIRES SUR LA DOUBLE
INOCULATION DE VIGNA UNGUICULATA AVEC
RBIZOBIUM ET GLOMUS YOSSEAE
21
1. INTRODUCTION
Parmi Les microorganismes du sol qui interviennent dans la nutri-
tion des plantes, les mycorhizcs à vésicules et à arbuscules (VA)
occupent une place privilégiee. Ces WA, en s'associant aux olantes,
stimulent leur croissance. La stimulation de la croissance de la
plante est la conséquence d'une amélioration de lsabsorotiort des
éléments minéraux, principalement le phosphore (MOSSE, 1973) et des
oligo-éléments tel q'ue le zinc (GILMORE,
1971) dans les sols' pauvres
en ces éléments.
Lors de la préparation de notre thèse de doctorat 3ème cycle, nous
avons abordé quelques aspects de la nutrition minerale de Vigna ungui-
culata cv. 58-185 doublement inoculé avec la souche de Rhizobium
-
-
ORS 407 et avec la souche de chamnignon endomycorhizien VA; Glomus
mosseae. Dans ce rapport nous présentons des résultats complémentaires
en ce qui concerne la nutrition en zinc.
2. RAPPEL, DU MATERIEL ET DES METHODES UTILISEES.
2.1. Souches de microorganismes
_------_-----_------------
2.1.1.
Souche de Rhizobium
- - - - - - - -
Nous avions utilisé la souche de Rhizobium ORS 407 qui est la
plus effective et la plus compétitive parmi huit souches de Rhizobium
étudiées (GuEYE, 1982bbi.
2.1.2.
Souche de champignon sndomycorhizien VA
- - - - - - --- - --- - ---mm-
Nous avons utilisé une souche de chamnignon endomycorhizien VA,
Glomus mosseae provenant de la station experimentale de Rothamsted
(Angleterre).
2.2. Cultivar de Viqna unauiculata
----.*---------
-r---L--m.-m.---
Nous avons utilisé un cultivar de Vigna wqniculata cv. 58-185
fourni par le Centre de Recherche Agronomique de Bambey.
2.3. Sol
Ve-
Nous avons axé nos études sur un type de sol: le sol Dek prélevé
à Bambey dont les principales cara,ctéristiques v'hysico-chimiques sont
résumées dans le tableau 4.
22
2.4. Culture des plantes
----e---------m.----
2.4.1.
Germination des graines
---- - - - - . I - -
Nous avons stérilisé les graines comme indiqué au 5 2.3.1.1. de
la 2ème partie. Les plantes obtenues sont repiquges dans des pots en
terre cuite de 18cm à raison de 2 nar pot.
2.4.2. Culture d'es plantes dans les oots en terre cuite
--------_------>_----__--
Le sol légèrement humidifié (approximativement 50% de la. capacité
au champ) a été réparti dans des pots en terre cuite de 18cm de
diamètre à raison de 1,s kg de sol par pot. Les pots remplis de sol
et recouverts
de papier "Eraft"
ont été ensuite sterilises à l'auto-
clave pendant 1 heure à 12O'C. Nous avons repiqué les plantules obte-
nues comme indique au 5 2.4.1. dans ces pots à raison de deux plantules
par pot. Nous avons arrosé quotidiennement avec 1OOml d'eau du robinet.
En plus une fois par semaine, nous avons arrosé avec 100 ml de solu-
tion HEWITT sans azote ni phosnhorc contenant par litre YgS04,7H20:
90 g; K2S04: 87g; CaC12,2H20: 147 g; Fe-EDTA: 2g; solution d'oligo-
éléments: lml. La solution d'oligo-éléments renferme oar litre:
MnSO 4 ,4H20: 2,23q; CuSO ,5H20: 0,24g; ZnS06,7H20: 0,2Og; H3190 : 3,lOg;
1
3
Na204Mo,2H20: 0,25 G, ??:Cl: St%. La solution HEWITT employQpour
l'arrosage a été diluée au quart. Tous les pots ont été placds en
plein air sur des t.ables (h = in) pour éviter toute contamination
ultérieure causée généralement par les vents de sable.
2.5. Méthodes d'inoculation
----------------------
2.5.1.
Inoculation avec la souche de Rhizobium
,,-,,,,,,,,,,,,,,,L,
Nous avons inoculé chaque plantule par 2ml d'une suspension de
Rhizobium ORS 407 provenant d'une culture pure agee de 7 jours con-
tenant 10 9 bactéries par ml.
2 3
Tableau 4. CaractBristiques physico-chimiques du sol Dek de Bambey
ppItl
Granulomét.cie %
C
N
N minéra- P
P assi- Argile Limon
Sable
pHKC1
pheau
total total
lisable-
total milable
-e
I- P
5100
380
103,5
74,8
ri,4
6,4
7,3
86,3
7,0
7,8
Toutes ces analyses ont été effectuées au laboratoire de chimie de
1'ORSTOM de Dakar. Les caractéristiques sont identiques aores
st4rilisation.
2.5.2.
Inoculation avec Glomus mosseae
- - - - - - - - - - - - - - - -
Nous avons inoculé chaque plantule avec 1 g de poids frais de
racines infectées par Glomus mosseac selon la meme méthode décrite
au paragraphe 2 de la deuxième partie.
2.6. Détermination de la fréquence et de l'intensité d'infection
_-------------------I_I__I^L_ ----------_-------------------
mycorhizianne.
M--------w---
D'une plante de Yigna unguiculata Bgée de 7 semaines, nous avons
récupéré des fragments du système racinaire que nous avons colorés
au bleu de trypan selon la méthode de PHILLIPS et HAYMAN (1970).
La fréquence (F) et l'i t
n ensite (1) d'infection mycorhizienne
sont déterminées ainsi :
F = nombre de fragments infectés
nombre total de fragments
x 100
observés
1 = longueur infectée du fragment
longueur totale du fragment infecté? x 100
2.7. Dosage de l'azote
-m.....-----------*---
Les parties aericnnes des plsntes sont séchees à l'étuve 6r3*C
pendant 72 heures jusqu'à poids constant ct l'azote total des
parties aériennes des plantes est déterminé par la méthode de
KYELDAHL.
2.8. Dosage du phosmhore
--------------L----
Les plantes sont séchées comme nrecédemment et le phosphore
total de la plante est déterminé par rapport à une gamme étalon à
partir de solutions C\\onnues KH2P04 mélangées à VJO 3 .
2.9. Dosage du zinc
--------------
Le zinc a été dose par absorption atomique au laboratoire des
Services Scientifiques Centraux de L'ORSTOY à Dondy (FRANCE) selon
la méthode d'atomisation électrothernique (PINTA: 1968 et 1973).
2.10. Analyses statistiques
----------------------
2.10.1.
~est-~e_DQNCAN '1-52)
Nous avons utilise le test de DUNCAN au risque de 1% ou 5% pour
la comparaison des moyennes.
25
2.10.2.
Analyse factorielle
- - I - .- - - - - -
Nous avons éqalement fait une expérience factorielle du type
(3m x zn) x r en un seul bloc de k unités dans laquelle:
m désigne le nombre de facteurs à trois niveaux;
n désigne le nombre de facteurs à deux niveaux;
r désigne le nombre de traitements.
L'analyse de cette expérience a été conduite suivant la méthode de
VAN DEN DRIESCHE (BECK et nl., 1969).
26
3. ABSORPTION DU ZINC
Des résultats obtenus lors de la préparation de notre thèse de
doctorat ont montré qu'il existe une interaction entre l'apport de
zinc et celui du phosphore sur le poids sec des parties aeriennes de
Vigna unguiculata, cv. 58-185.
Nous rappelons q'ue nous avions initié une expérience factorielle
à six répétitions pour étudier la réponse de Vigna unguiculas
-
CV. 58-185 cultivé dans le sol Dek de Bambey stérile
à la mycorhi-
zation avec Glomus mosseae en présence de différentes doses de phos-
phore et de zinc. Les différents facteurs Etudies étaient les suivants:
- facteur A (doses de zinc): 0 (ZnC), 2 (Zn2) ou 5 ppm (Zn5);
- facteur B (doses de phosphore): 20 P20) ou 80 ppm (P80);
- facteur C (Clornus niosseae): absence (NM) ou présence (M).
Toutes les plantes ont été inoculées avec la souche de Rhizolbium
ORS 407.
Les résultats recapitulés au tableau 5 ont eté interprétes en
utilisant la méthode statistique de VAN DEN DRIFSSCBE (BECK et al.,
*- -
1969).
Nous rappelons également que les plantes non mycorhizees n’ont
pas été contaminées. Le facteur A (apport de zinc aux doses de 2 et
5 ppm) a exercé un effet favorable sur quatre oaramëtres étudiés;
poids sec des nodules, azote total, phosphore total et zinc total
des parties aériennes. Les résultats indiquent un effet nrincipal
significatif (p = 0,05) libre de toute interaction de l'anoort de
zinc sur ces paramètres (tableau 6), ce qui indique que la faible
concentration du zinc est un facteur limitant dans le sol considéré.
4. CONCLUSION
Nous avions déjà precisé que Glomus mosseae stimulait la crois-
-
-
sance de Vigna unguiculata en ameliorant l'absorotion du phosphore par
la nlante (GUEYE, 1982b).
Par une approche microbiologique, nous avons mis en évidence
la carence en zinc du sol Dek de Bambey. L'inoculation avec Glomus
-
-
mosseae peut permettre
une meilleure exnloration de
cet oligo-élément peu mobile et ainéliorer ainsi son absorption par
Vigna
u n g u i c u l a t a .
27
Enfin, dans les sols du Sénégal, l'inoculation avec les champigons
endomycorhiziens tels que Glomus mosseae neut être un facteur
d'amélioration de la croissance et de la nutrition des plantes. Déjà
des résultats satisfaisants ont 6té obtenus au champ sur la fixation
de l'azote par le soja inoculé avec Glomus mosseae dans les sols de
-II_ .--
la Casamance (GANRY et al., 1982).
-
-
28
Tableau 5. Poids sec des parties aériennes et des nodules, N total.,
P total et Zn total de Vigna unguiculata cultivé sur sol
Dek stérile pendant 54 jours, inoculé (FI) ou non inoculé
(NY) avec Glomus mosseae pour différents niveaux de P et
Zn.
Tr-iitement
Poids sec
Poids sec
N total
P total
Zn total
parties
nodules
(mg/plante)
(mg/plante)
tugi/plante)
a6riennes
(mg/plante)
(g/plantc)
Zn P
0 20 NM
3,40
90100
75,60
2,80
57,80
Zn2P2" NM
4,00
101 ,oo
84,80
2,92
81‘32
Zn5P20 NM
3,Oo
9 4 , 0 0
78,9o
3,lO
99,50
Zn P NM
0 80
4,30
1.08,90
91,52
3,38
70,20
Zn2Pgo NM
5,60
123,oo
103,35
3,77
153,04
Zn P NM
5 80
5,40
113,20
95,03
3,51
1'72,80
ZnP
M
0 20
3,80
123,50
103,74
3,84
'79,80
Zn2P20 M
4,30
126,70
106,40
.3,88
l:L6,10
Zn5P20 M
4,50
137,lO
115,08
4 , 2 5
162,OO
Zn P
0 80 M
4,90
161,90
136,05
5,03
75,ll
Zn2P80 M
6,20
195,80
164,40
6,00
165,29
ZnSP80 M
6,05
197,47
165,75
6,13
189,54
Pour la signification des abréviations, voir texte.
29
Tableau 6. Effet principal de l'apport de 2x-1 sur le poids sec des
nodules Img/plante) et sur N total. (mg/nlante), P total
(mg/plante) et Zn total (ug/olante) des parties ,aériennes
de Vana unguiculata cv.
-
58-185 cultivé dans 3.e sol Dek
de BamIbey stérile.
Apport de zinc
Poids sec des nodules
N total
P total
Zn total
(ppm)
(mg/p.Lante)
(mg/plante) (mg/plante) (Ug/plante)
0
121,07
101,72
3,76
70,72
2-5
136,03
114,21
4,19
142,44
30
CONCLUSION GENERALE
La mise en place du programme YIRCEN au Sénégal nécessitait une
condition primordiale: la constitution d'une collection de culture
de microorqanismes. Nous avons constitué cette collection qui a la
particularité d'être l'unique MSRCEN à disposer de souches de cham-
pignons endomycorhiziens à vésicules et à arbuscules.
Cette collection de Rhizohium et de mycorhizes est actuellement
au laboratoire de microbiologie des sols de 1'ORSTOEI à Dakar. 11
appartiendra aux responsables du MIRCEN de l'Afrique de l'r)uest :
1 - de transferer aet d'entretenir la collection au centre d'accueil
du MIRCEN, actuellement le Centre de Recherche Agronomique de
Bambey;
2 - de demander un numéro de collection au Centre Mondial de Données
sur les microorganismes (WDC) à Brisbanc.
Ainsi le MIRCEN de l'Afrique de 1'0uest fera partie intégrante du
réseau mondial des NIRCENS en tant que centre de collection de
cultures.
Le catalogue des souches de microorganismes sera publié
très prochainement.
Le nrogramme du YIRCEN se poursuivra conformément au calendrier
de travail que nous avons élaboré et que nous avons déposé au
département des produetions végétales. Pour mener à bien ce programme,
il est nécessaire et urgent de lui affecter un personnel satisfaisant
en qualification d'abord, en nombre ensuite. A ce titre nous uroposons
le recrutement d'un technicien supérieur dans le cadre du MIRCEN.
31
B I B L I O G R A P H I E
32
AMERXCAN SOCIETY for MICROBIOLOGY. 1981. Yanual of methods for general
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ANNEXE
FICHE TECHNIDUE DES SOUCHES DE RHIZOBIUM
ET DES CHAMTGNONS ENDO?lYCORHIZIENS
LISTE DES OBSERVATIONS UTILISEES DANS LES FICHES TECHNIQUES
A. alb
: Acacia albida
1_1-
A, biv. : Acacia bivenosa
-
-
A. far
: Acacia farnesiana
A. ho1
: Acacia holosericea
A. hyp
: Arachis %pogaca
A. mea
: Acacia mearnsii
-
-
A, nil
: Acacia nilotica
A. rad
: Acacia raddiana
A. sen
: Acacia senegal
A. sey
: Acacia seyal
A. sie
: Acacia Sieberiana
C .
-80'~: Congélation- à -8O*C
G. max
: Glycine max
-.
L . leu : Leucaena sucocephala
V. uw
: Vigna unguiculata
YEN
: Yeast Extract Xedium
Zkizobium
s p .
MAO 1
1983
ORS 701
NOR
Vigna
unguiculatâ
58-185
oui
Sénégal
Baol
Bambey
0
14"
43 vra
16'
2710
5100
3 80
103,s
74,F
Q_ , 2
r a
0 , .'I
7 -2
I -
86,:
7 , a
?,h
GUEUE, PI.
1981
GUEYE, lt.
1981
c . -8V°C
Glycir01
ï E 2
i; 3 c c
l .y
Rhizobium
i II’1
SP.
1 i
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YAO 2
1 Il
1983
1 ;‘:
ORS 571
I !
l
oui
’
Il
Sesbânia
/ ‘j
rostrata
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’
N 0 n
l $1
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Sénegal
Fleuve
Richard-Toli
0
16" 2O'hJ
15"
45'C
Dreyfus
j:
1981
Dreyfus
1; ‘1
1981
C.-~O"C
Glycérol
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Rhizobium
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Acacia
’
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oui
Sénégal
Sénégal-OrientcI
/
i!
Bakel
0
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50'N
12O 30'0
i
Cornet, F
1981
Cornet, F.
1981
C. -8OOC
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A . ra56i ar.z
ORSTOY-Dakar
Fiche N03'-I
i:
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1
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japonicum
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I
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1983
I
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Glycine
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max
I
I
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Missipi
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G . x1 a x
USDk Beltsville
ORSTOM-Dakar
Fiche ?JO40
I lII”i’iii I
Rhizobium
s p .
MAO 40
1983
TAL 1000
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Arachis
i 11
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c . -80°C
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A. hy-ogaea
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A. hypocraea
unguiculat?
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USDA-Bel~svili~
QRSTOM-Dakar
Fiche N"J?
i II
Rhizobium
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i
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MAO 52
I iî
1983
! 8:
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Balsac
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GM1 813
i
Non
I Ii
Medicago
I 1;
sativa
l’i,
i’
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oui
Canada
Quebec
Bordeieau, :L.
1971
Eordeieau, II.
1971
C. -8OOC
Glycéroi
YEAM
28°C
Fast
,
M .
s a t i v a
/
M .
sativo.
c .R.A. Quebcsa , CNRS-Toiosan
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Fiche No55
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ORSTOY-Dakar
MINISTERE DE LA RECHERCHE
INSTITUT SENEGA:LAIS
SCIENTIFIQUE ET TECHNIQUE
DE RECHERCHES AGRICOLES
OFFICE DE LA RECHERCHE
DEPARTEMENT DE RECHERCHES
SCIENTIFI\\UE ET TECHNIQUE
SUR LES PRODUCTIONS VEGETALES
OUTRE MER. O.R.S.T.O.M.
(BEL AIR)
--w-m
ETABLISSEMENT DU CENTRE DE RESSOURCES
MICROBIOLOGIQUES (MIRCEN) DE
L'AFRIQUE DE L'OUEST
RAPPORT DE TITULARISATION DE M. Mamadou GUEPE
Septembre 1983
Centre National de Recherches Agronomiques
de Bambey
REMERCIEMENT
Ce rapport de titularisation a été préoaré au laboratoire de
microbiologie des sols de 1'ORSTOM à Dakar sous la direction de
Monsieur DOMMERGUES, Y., directeur de recherches titulaire CNRS/
ORSTOM. Nous le remercions tout particulierement pour avoir suivi
ce travail et jugé ce rapoort.
Nous remercions également Monsieur DIEM, H.G., maftre de
recherches CNRS/ORSTOM et Monsieur DREYFUS, B., chargé de recherches
ORSTOM pour l'encadrement scientifique et les précieux conseils
qu'ils nous ont prodigués.
Nous remercions aussi Monsieur BORDELEAU, L. Directeur de
recherches au Canada Agriculture qui nous a aidés à mettre en place
le Centre de Ressources Microbiologiques (EIIRCEN) de l'Afrique de
l'Ouest et qui a également jugé ce rapnort.
Nos remerciements s'adressent egalement à tout le personnel du
laboratoire de microbiologie des sols de L'ORSTOhrl. en particulier
Monsieur BOUREAU, Y.,pour ses conseils pratiques et Yonsieur
DIAWARA, I., pour la dactylographie de ce rapport.
Enfin nous remercions tous les responsables de l'Institut
Sénégalais de Recherches Agricoles (ISRA) et Monsieur Edgar J. Da
PIEVA d'avoir pris la ddcision de la création du IUBRCEN de l'Afrique
ire l'Ouest,
ce qui me permet de pouvoir présenter ce rapport aujour-
d'hui.
1
PLAN
-
-
INTRODUCTION GENERALE.
Ière Partie: Constitution d'une collection de souche de 'Rhizobium et
-
-
de champignons endomycorhiziens.
INTRODUCTION
1. Conservation des microorganismes
1. Enumeration des méthodes utilisables
2. Méthodes de conservations des champignons endomycorhi-
ziens à vésicules et d arbuscules
3. Méthodes de conservation utilisées au laboratoire
II. Gestion de la collection de microorganismes
1. Fiche technique d'une souche de microorganisme
2. Traitement informatique
3. Liste des souches
2ème Partie: Recherches preliminaires sur la fixation biologique de
l'azote par Voandzeia subterranea
1. Introduction
2. Matériel et Méthodes
3. Résultats
4. Discussion
5. Conclusion
3ème Partie : Recherches complementaires sur la double inoculation de
Vigna unguiculata par ??hizobium et Glomus mosseae
-
-
1. Introduction
2 . Rappel du matériel et des méthodes utilisées
3. Absorption du zinc
4. Conclusion
Conclusion Générale
Bibliographie
2
INTRODUCTION GENERALE
-
La principale tâche du Centre de Ressources Yicrobiologiques
(MIRCEN) de l'Afrique de l'Ouest est de
mettre en place une collection
régionale de cultures microbiennes. Il centralisera pour leur conser-
vation et leur utilisation des microorganismes d'intéret économique
pour la production d'inoculums biofertilisants de Rhizobium et de
mycorhizes.
Au cours des six mois d'essai, nous avons entrepris de constituer
une collection de culture de Rhizobium, La liste des Rhizobium en col-
-
lection regroupe des souches isolées par les microbiologistes de
1'ORSTOM et des souches provenant d'autres centres de collection de
culture:
USDA à Beltsville (USA), Niftal à Hawaii (USA), Nitraqin
Company (USA).
Le PlIRCEN doit également orienter ses efforts sur le développe-
ment du monde rural avec comme objectifs la ,préservation et l'utilisa-
tion des ressources locales. A ce titre, Voandzeia subterranea,
véritable ressource protéinique pour l'avenir
est une legumineuse
traditionnellement cultivée au Sénégal et qui, maintenant disparait
des surfaces cultivables. Dans l'objectif de l'autosuffisance alimen-
taire, nous avons proposé un programme de recherche sur Voandzeia
subterranea dans le cadre du PlIRCEN.
Nous avons initie ce programme
de recherche au laboratoire de microbiologie des sols de 1'ORSTOM à
Dakar.
Enfin, au cours des six mois d'essai nous avons terminé une
expérience sur l'absorption du zinc par 'cligna unguiculata inoculé avec
un champignon endomycorhizien à vésicules et à arbuscules Glomus mosseae
-
-
Dans ce rapport, nous aborderons donc trois sujets:
1) Constitution d'une collection de souches de Rhizobium et de
mycorhizes.
2) Recherches préliminaires sur la fixation biologique de l'azote
par Voandzeia subterranea.
-
3) Recherches complémentaires sur :La double inoculation de :Vigna
unguiculata par Rhizobium et Glomus mosseae.
-
-
lère Partie
CONSTITUTION D'UNE COLLECTION DE SOUCHES
DE RHIZOBIUM ET DE CHAMPIGNONS ENDOMYCORHIZIENS
;INTRODUCTION
~a constitution d'une collection de souches de microorganismes
est une des principales activités du MIRCEN. Elle a pour but de mettre
$9 la disposition des laboratoires, Instituts de Recherche et industries
ces microorganismes en vue de leur
utilisation. De ce point de vue
:La conservation des cultures de microorganismes revêt une grande
importance pour le maintien d'une collection de cultures stables et
actives.
Au MIRCEN de l'Afrique de l'ouest, nous envisageons de constituer
*une collection de Rhizobium, de Yycorhizes et de Frankia. Actuellement,
-
-
nous avons entrepris une collection de culture de Rhizobium et de
champignons endomycorhiziens à vesicu:Les et à arbuscules (MVA).
La constitution d'une telle collection de culture nécessite la
,tenue d'un fichier pour tous les microorganismes. Chaque souche doit
avoir une fiche technique qui fournit tous les renseignements rela,tifs
à la souche: le numéro de la souche dans la collection, la plante-hôte,
.Le lieu d'origine, le fournisseur et les performances symbiotiqucs de
La souche de Rhizobium (VINCENT, 1970). Chaque centre doit développer
:son propre système d'identification des souches de Rhizobium qu'il
détient.
.r . CONSERVATION DES hlICROORGA?JIS!~ES
1. Enumération des différentes méthodes utilisables pour la conservation
des souches de Rhizobium
1.1. Gélose inclinée (VINCENT, 1970).
---------------
On cultive les glizobium dans des tubes contenant un milieu gélosé
incliné.
Les cultures de Rhizobium peuvent être conservées ainsi 2 ans
;i basse température. C'est une méthode simple qui r>ermet un repiquage
rapide et facile des Rhizobium. Elle n'est cependant pas conseillée pour
les très longues conservations cardes repiquages fréquents aug'mentent
:Les risques de contamination et de verte de la souche. De plus, cette
opération exige beaucoup de temps.
1.2. Gélose couverte d'huile de naraffine (VINCENT, 1970)
__^-------- -----.-----------i-,.------
Elle est très
nroche de la précédente. Les Rhizobium ayant poussé
convenablement sur la gélose inclinée sont recouverte
d'huile de paraf-
fine stérile. En nlus des facilités que nrésente la première mkizhode,
celle-ci a l'avantage de diminuer le risque de dessication de la
culture, donc diminue la fréquence des reoiquaqes.
1.3. "Iéthode desbilles de emrcelaine INJORRIS, 1963)
---------------_----- .m-------.-
Dans une fiole contenant une suspension de Rhizobium, on introduit
des billes de porcelaine stériles. Après agitation, les billes sont
recupérées et réintroduites dans une deuxième fiole contenant du
silica;rgél stérile.
LesRhizobium adsorbéssur les billes de porcelaine sont ainsi
conservés aussi longtemps que dure le silicagel. La durée de conservation
peut atteindre 4 ans.
1.4. Sol stérile
-------s-m-
Du sol stérile peut être utilise pour conserver des Souc:hes de
Rhizobium (NUTMAN, 1946; JENSEN, 196111. Cette methode a l'avantage
d'éviter toute pression de sélection sur les microorganismes c,ar le
sol est un milieu complexe.
1.5. Congélation des Rhizobium (American Society for Yicrobiology,
-------1-1--_---.---------
1981).
La congélation à -8OOC est une bonne méthode conservation.
La durée de vie des Rhizobium est de 1 à 2 ans. Il est cependant
déconseillé d'ouvrir colnstamment le congélateur: les grands écarts de
température sont fatals .aux Rhizobium
1.6. Lyophilisation (VINCENT, 1970)
--a..*----------
Il s'agit d'une congélation des Rhizobium sous vide dans des am-
poules scellées. C'est la meilleure méthode de conservation. Los Rhizo-
bium peuvent être conservés pendant 15 à 20 ans à la température ambiante.
-
-
2. Méthode de conservation des champignons endomycorhiziens
Les champignons endomycorhiziens VA sont des symbiotes obligatoires.
!On ne peut pas les cultiver in vitro. %Iais on peut multiplier ces
champignons dans les racines d'une plante-hôte inoculée avec ces mêmes
champignons: nous faisons prégermer des graines stériles de la plante-
hôte dans du sable stérile. L'inoculation par
un champignon endomy-
corhizicn VA consiste ci apLliquer 1 g de poids frais de racines infec-
tées par ce champignon contre les radicelles de la plantule obtenue que
mous cultivons dans un sol stérile.
13. Méthode de conservation des microorganismes utilisés au laboratoire
3.1. Conservation des souches de Qhizohium
---------------_----___1__11_________
En attendant de pouvoir faire appel à la lyophilisation ,qui est
actuellement une des méthodes les plus sûres, nous utilisons les 2
m&thodes suivantes :
- la conservation sur gélose et la congélation.
3.1.1. Conservation sur gélose
----m-------
Nous avons utilisé à cet effet des boîtes de Pétri et de:; tubes
a vis contenant du milieu YEM gélosé.
Nous avons déposé les Rh.izobium à
:La surface de la gélose, puis entouré les
boîtes et les tubes avec de
ila paraffine. Ensuite, nous les avons mis à incubation à 30°C pendant
lie
temps nécessaire polur une bonne croissance. Puis nous avons rangé
3.es boîtes et les tubes en chambre froide à 4OC.
3.1.2. Congélation des Rhizobium
----w-------...
Nous avons prélevé 2ml de suspension de Rhizobium en croissance
exponentielle que nous avons introduit dans
le même volume de glycérol
stérile contenu dans un pilulier. Nous avons ensuite place tous les
piluliers dans un congélateur à -8OOC.
3.2. Conservation des souches de Champignons endomycorhiziens VA
-----------------------------------------------------
Selon la méthode décrite au paragraphe 2., nous multiplions les
champignons endomycorhiziens à vésicules et à arbuscules dans cies
racines de Vigna unguiculata. Les champignons endomycorhiziens étant
des symbiotes obligatoires, c'est nar ce Frocédé que nous conservons
les deux souches de notre collection Glomus mcsseae et Glomus Tascicu-
latus.
II. GESTION DE LA COLLECTION DE MICROORGANISYES
1. Fiche technique d'une souche de microorganisme
La fiche technique que nous avons adontée pour le YIRCEN est une
variante de la fiche technique internationale proposée par le Centre
Mondial des Données sur les microorganismes (WDC) de Brisbane (VINCENT,
:1982). Elle decrit:
-- des généralités sur le microorganisme:systématique, année d'acquisition
par le MIQCEN, numéro dans la collection MIRCEN, autres références
de souche;
-- une description de la -lante-hote;
-* la composition du sol d'origine:
-. les conditions de croissance et le mode de conservation du microorga-
nisme;
-. le spectre d'hôte du microorganisme.
Chaque souche de microorganisme a une fiche technique comme le
modèle ci-joint et porte le nom de la collection FIA 0 (Mircen Afrique
Ouest) suivi d'un numéro d'ordre. Une fiche technique de Qhizobium pour
chaque espèce de légumineuse est indiquée en annexe, ainsi que les
fiches techniques des deux souches de mycorhizes.
2. Traitement informatique
Pour la gestion de la collection de microorganismes, nous avons
utilisé la méthode BRADS II qui est un logiciel de système de gestion
par base de données. L'objectif princiisal du BRADS II consiste à
définir, à créer et à assurer la maintenance des données permettant
ainsi toutes les applications informatiques possibles sur ces informa-
tions.
Toutes les informations sont actuellement imprimées sur une
disquette simple face, simple densité par un microordinateur IBM5120
disponible au Centre de Recherche Océanoqranhiquc de Thiaraye (CRODT)
et au Centre National de Qecherche nqronomique de Bambey (CWRA).
3. Liste des souches. Nous reportons dans ce paragraphe une liste des
souches de Rhizobium obtenue par le traitement informatique.
8
Exemple de Fiche Technique d'un Microorqanisme
1.
GENRE
2.
ESPECE
3. NUMERO AU YDC
4.
COLLECTION NUMERO SOUCHE
5. ANNEE D'ACQUISITION
6. PREMIERE REFERENCE
7. DEUXIEME REFERENCE
8. ANTICORPS FLUORESCENT DISPONIBLE
9. PLANTE D'ORIGINE
9.1. GENRE
9.2. ESPECE
9.3. CULTIVAR
10. PARTIE DE LA PLANTE
10.1. NODULE
10.2. AUTRE
11. LIEU D'ORIGINE
11.1. PAYS
11.2. REGION
11.3. VILLE
11.4.
ALTITUDE (m)
11.5. LATITUDE
11.6. LONGITUDE
12. COMPOSITION DU SOL D'ORIGINE
12.1. C 'TOTAL
(ppm)
12.2. N TOTAL
PI
12.3. N +lINERALISABLE It
12.4. P TOTAL
II
12.5. P ASSIMILABLE
II
12.6. ARGILE
(%)
12.7.
LIMON
*t
12.8. SABLE
II
12.9. pH KCl
12.10. pH EAU
13. ISOLEMENT EFFECTUE
13.1. AUTEUR
9
13.2. DATE
14. IDENTIFICATION
14.1. AUTEUR
14.2. DATE
15. CONSERVATION DE LA SOUCHE
15.1. MODE DE CONSERVATION
15.2. MILIEU DE SUPPORT
16. MILIEU DE CROISSANCE
17. TEMPERATURE DE CROISSANCE
18. CARACTERISTIQUES
19. TEMPS D'INCUBATION
20. ORGANISME LIBRE
20.1. TOLERANCE AU pH
20.2.
TOLERANCE A LA TEMPERATURE
21. SYMBIOSE RACINAIRE
21.1. TOLERANCE AU pH
21.2. TOLERANCE A LA TE:MPERATURE
22.
INFECTIVE SUR
23. EFFECTIVE SUR
24. LABORATOIRES OU LA S'OUCHE EST DISPONIBLE.
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10
III. CONCLUSION
Nous avons vérifié la pureté de toutes les souches et nous les
avons conservées au congélateur et en chambre froide. Nous n'aivons pas
pu lyophiliser ces souches car les accessoires indispensables au
fonctionnement du lyo?hifisateur ne nous étaient pas parvenus,
Le système BRADS II a une canacite limitée. Nous
envisageons
actuellement d'autres ,systèmes de qestion aoplicables sur le mini-ordi-
nateur IBM 5120 pour pouvoir effectuer l'ensemble des opérations
informatiques relatives au fichier.
11
2ème P'artie
RECHERCHES PRELIMINAIRES SUR LA FIXATION
BIOLOGIQUE DE L'AZOTE PAR VOANDZEIA SUBTERRANEA
1 2
1. INTRODUCTION
Dans les pays en ,voie de d6veloppement, il est très important de
développer les cultures de légumineuses riches en nrotdines qui peuvent
contribuer à l'équilibre nutritonnel des populations. De ce point de
vue, Voandzeia subterranea constitue une légumineuse intéressante car
c'est une ressource à ne pas négliger pour les pays de la zone semi-aride
ouest africaine dans l'objectif de l'autosuffisance alimentaire.
'Tableau 1. Com,position nutritionnelle pour 100 g de graines sèches
(rapport BOSTID, 1979)
Calories
412
Protides (9)
17,3
kipides (g)
6,7
Glucides (g)
72,2
A notre connaissance, au Sénégal, il n'y a pas de programme pour
la culture et l'amélioration des rendements de Voandzeia subterranea.
Ce sont les raisons pour lesquelles nous avons proposé dans le
cadre du Centre de Ressources Nicrobiologiques (MIRCEN) de l'Afrique
de l'Ouest un programme de recherche axé principalement sur la fixation
biologique de l'azote par Vogdzeia subterranea.
En effet l'inoculaltion des légumineuses avec des souches {de
Rhizobium efficientes et compétitives permet l'amélioration de leur
rendement sans recourir j l'emploi des enqrais azotés trop coûteux.
Bn ce qui concerne Voandzeia subterranea, nous avons
très peu de
c:onnaissances sur la fixation biologique de l'azote parr
cette légumi-
neuse.
Elles se limitent a quelques souches de Rhizobium isolées lors
des expériences conduites au NifTal project à Hawaii (USA).
Notre programme consiste donc à:
l/ isoler et sélectionner des souches de Rhizobium efficientes
et compétitives pour l'inoculation de Voandzeia subterranea;
2/ étudier le rble des endomycorhizes dans la fixation biologique
par Voandzeia, subterranea. La sélection des cultivars répon-
dant le mieux à la mycorhization permet d'obtenir des variétgs
rustiques et adaptées aux conditions sévères de l'agriculture
en zone semi-aride notamment.
1 3
Nous avons initié ce programme au Laboratoire de Microbiologie
des Sols de 1'ORSTOM à Dakar et nous indiquons dans.ce présent rapport
les résultas préliminaires que nous avons obtenus concernant l'isole-
ment et la caractérisation de souches de Rhizobium à partir de
Voandzeia subterranea.
2. MATERIEL et METHODES
2.1. Piégeage de souches de Rhizobium
m.--s..-
_-----_---------^--------
Dans le sol de la station expérimentai
de 1'ORSTOM ;i Dakar,
Bel-Air dont nous donnons la composition, nous avons semé deux
petites parcelles (2m x 2m) respectivement avec les cultivars 78-1 et
79-l de Voandzeia subterranea fournis par le service de diversifi-
-
cation du CNRA de Bambey par poquet de deux graines. Les paquets
étaient distants de 30cm et les interlignes de 60cm.
Composition du sol dle Bel-Air surface
apm
Granulométrie %
c
N
N minera- P
P assi- Argile
Limon
Sable
pHKC1 pHeau
total total lisable
total milable
I-
-
3900
340
69
206,8 26,4
6‘4
2,7
92,8
6,5
7,2
2.2. Isolement des souches de Rhizobium
-------------.---------------------
VINCENT (1970) a décrit une mé,thode d'isolement de Rhizobium à
partir des nodules de légumineuses. Cependant, nous avons préféré
à la méthode de VINCENT une autre plus ranide que nous décrivons ci-
dessous. Sous une hotte à flux laminaire, nous i3VOIlS soigneusement
cassé un nodule frais convenablement choisi. Nous avons introduit une
oese stérile au centre du nodule pour prélever des Rhizobium. Nous
avons ensuite fait des stries d'épuisement dans des boites 'de Petri
contenant du milieu Y'EM gélosé stérile que nous avons mis à 3O'C.
Nous avons observe les boites de Petri après 7 -jours d'incubation.
2.3. Caractérisation des Rhizobium
-----e-------------
11 existe plusieurs techniques de purification et de caractérisa-
tion des Rhizobium.
1 4
2 . 3 . 1 . Croissanc!e sur milieu YMA (Yeast Mannitol Agar) (VINCENT,
- - .m - WI I - - - - - - c
1 9 7 0 ) .
Ce milieu permet de définir deux groupes de Rhizobium: (i.1 les
fast growing et (ii) les slow growing dont les temps de géneration
sont respectivement'de 3 à 4 heures et de 8 à 12h d'incubation a 28Oc.
Ile rilieu YMA contient par litre: K2HP04: 0,5g; MgS04,7H20: 0,2g; NaCl:
O,lg; mannitaol: 1Og; levure: ig; yélose: 15q. Le pH est ajusté à
6,8 avec HCl&u &&Il.
2.3.1. Test de nodulation
- - - - - - .,. - M
Le test de nodulation est une technique qui permet une caractéri-
sation absolue des Rhizobium. C'est le stade ultime et necessaire de
tout isolement. Si des isolats ne peuvent pas noduler une ou des
légumineuses-hôtes, il ne s'agit pas de Rhizobium. Genéralement dans
beaucoup de laboratoires, on effectue des tests de nodulation sur les
plantes à partir desquelles on a isolé les bactéries et/ou sur des
plantes s'en rapprochant. Nous avons fait un test de nodulation des
isolats Vs2, Vs3 et 'Vs4 sur le cultivar 79-l à partir duquel leur
isolement est effectué.
2 . 3 . 1 . 1 .
Germination des graines
Nous avons stérilisé les graines de Voandzeia subterrane& par
trempage dans &Cl2 O,l% pendant 3mn. Après trois lavages soigneux
avec de l'eau distillée stérile, nous les avons mises à germ,er dans
des boîtes de Petri ccontenant de l'eau gélos&e 0,9% stérile. Les
plantules obtenues sont repiquées dans des tubes de GIBSON,
2.3.1.2. Culture des plantes dans les tubes de GIBSON
(GIBSGN, 1963).
Dans des tubes à essai de 30mm de diamètre, nous avons mis du
milieu de JENSEN contenant par litre d‘eau distillee: CaHPO 4 : lg;
K2HP0 : 2g; MgSO 4,7H,,0:
4
2g; NaCl: 2g; FeC13: 0,lq; solution d'oligo-
éléments: lml; gelos~~:
20q (JENSEN, 1942). 1 litre de solution d'Oli-
go-éléments contient:: HB03: 2,86g; MnS04,4H20: 2,03g; ZnS04,7H20:
0,22g; CuS04,5H20: 0,,08g; Na2Mo04,H20: 0,09g.
Le pH du milieu de JENSEN est ajuste à 6,7 avec NaOH.
1 5
Nous avons stérilisé tous les tubes à l'autoclave 120°C, 20mn.
Apres nous avons repiqué les olantules obtenues comme indiqué au
5 2.3.3.1. dans ces tubes à raison de une ?ar tube. Nous avons ensuite
inoculé les plantules de Voandzeia subterranea cv. 79-l avec lOm1 de
culture des isolats VS~, Vs3 et Vs4 contenant 10 9 bactéries .par ml.
3. RESULTATS
3.1. Isolement de souches de Rhizobium
_-------------------I_____^______
Nous avons récolte des nodules sur les deux parcelles après 1 mois
de culture. Nous avons remarqué pour les deux cultivars 78-l et 79-l
de Voandzeia subterranea que leu cortex des nodules est blan ou rouge.
Il y avait en généraIL 1 nodule "rouge" pour 15 nodules "blancs".
Nous avons obtenu à partir de ces nodules 10 isolats purs que nous
avons dénommés VS~, VS~, VS~..... Vs10 (tableau 2). Aucun de ces
isolats ne réagit avec les anticorps fluorescents disponibles au
laboratoire.
3.2. Caractérisation des souches de Rhizobium
-------------_------________I___________
Lors des repiquages successifs sur milieu YBIA pour la purification
des isolats, nous avalns remarqué qu'ils étaient tous des slow growing.
D'autre part, Voandzeia subterranea se prete tres bien à une culture
hydroponique en tube de GIBSON, et, après 3 semaines de culture en
serre, nous avons remarqué des nodules sur les plantes inocu:Lées avec
les isolats Vs2, Vs3 et Vs4 (tableau 3).
4. DISCUSSION
4.1. Couleur des nodules
__-e---..---------w.-
La couleur du cortex des nodules de Voandzeia subterraneai est un
phénomlrne que nous rencontrons pour
la deuxième fois. Déjà en 1982,
nous avions remarqué que le cortex des nodules de Vigna unguiculata
était beige ou rouge selon la souche? JARA (1981), puis MULONGOY
(Comm. pers.) avaient fait les m&nes remarques sur Vigna unguiculata.
EAGLESHAF? et a1 (1982) observaient des différences de couleur sur les
-e
nodules de Glycine maxI Arachis hypogaea et Vigna unguiculata. Ces
derniers auteurs ont emis l'hypothèse d'un pigment ynthétisé par la
::GUEYE, 198233
1 6
plante, ou par le sizobium, ou nar les deux.
En ce qui ncius concerne, nous pensons qu'il est très important
d'étudier cette pigmentation nodulaire afin de mieux comprendre les
interactions légumineuse-Rhizobium. Ceci nourrait utilisé pour l'dtude
de la compétitivité des Rhizobium.
4.2. Isolement
---w
deg-s~ycb~s-~g
----.3.--
Rhizobium
Nous n'avons isolé du sol de Bel--Air que 10 souches de Rhizobium
à partir des nodules de Voandzeia subterranea. Ceci est relativement
insuffisant si nous voulons sélectionner une ou des souches effectives
et compétitives sur Voandzeia subterranea. Cependant ceci n'est
qu'une initiation du programme sur la fixation biologique de l'azote
par cette légumineuse et l'isolement de souches de Rhizobiuni est loin
d'être achevé. Il se fera sur toute l'étendu du territoire Sénegalais.
D'autre part VS~, Vs3 et Vs4 sont des souches isolées au même
endroit d partir du même cultivar et à la même date. Nous pouvons
penser que Vs2 est différent de Vs3 et de Vs4 car isolés de nodules
à coloration externe différente. Par contre, nous ne pouvons pas
certifier que Vs3 et Vs4 sont identiques ou différents.
1 7
Tableau 2. Rhizobiuni isolés de Voandzeia subterranea cultivé dans
le sol de Bel-Air.
--
~-~~-
Cultivars
Couleur des nodules
Rhizobium isolés
79-1
Blanc
Vs l a::
Blanc
Vs 3. b::
Blanc
vs L!
Rouge
vs 3
Rouge
vs 4
Rouge
vs 5
Blanc
Vs 6
Blanc
vs 7
78-1
Rouge
vs 8
‘1
Rouge
vs 9
Il
Blanc
VslO
::Dans les boltes de Pétri Vs1 , nous avons remarqué deux types de
colonies qui repiquées séparément ont donné Vs la et Vs lb.
1 8
Tableau 3. Test de nodulation de Voandzeia subterranea cv. 79-l
cultivé dans des tubes de GIBSON et inoculé avec les
souches de Rhizobium Vs 2, Vs 3 et Vs 4.
Souches
Nodulation
Nombre de nodules
Témoin
0
vs 2
+
15
vs 3
+
1 4
vs 4
f
1 7
19
5. CONCLUSION
Voandzeia subterranea est une légumineuse tropicale actuellement
-
-
-
sous exploitee au Sénégal. Le département des productions végcstales
de 1'XSRA a propos6 un programme de recherche sur cette légumineuse
à la National Academy of Sciences des Etats Unis d'Amérique. Le finan-
cement requis s'elèvera à 120.012 dollars US, soit 42.004.200 Francs
CFA couvrant une période de 3 ans.
Le travail effectué au laboratoire de microbiologie des sols
de l'ORSTON: est une ébauche de ce programme. Actuellement nous ne
pouvons pas classer les souches isol&es dans la collection de micro-
organismes car des expériences complémentaires doivent permettre de
mioux les caractériser : il nous reste à déterminer le spectre-d&hôte
de ces isolats, à étud.ier leur effectivité à preparer leur anticorps
fluorescents pour l'étude de la compétivité. Nous étudierons enfin
l'association de Voandzeia subterranea avec Glomus mosseae.
Ceci nous permettra (i) d'étudier la fixatio'n réelle de l'azote
au champ par une méthode fiable telle que l'utilisation de 1 5 N et
(ii.1 d'envisager la double inoculation au champ de Voandzeia subter-
" -
ranea avec le rhizobium le plus effectif et le plus compétitif et
i!lVGC GlOXlUS mosseae.
20
3ème Partie
RECHERCHES COMPLEMENTAIRES SUR LA DOUBLE
INOCULATION DE VIGNA UNGUICULATA AVEC
RBIZOBIUM ET GLOMUS YOSSEAE
21
1. INTRODUCTION
Parmi Les microorganismes du sol qui interviennent dans la nutri-
tion des plantes, les mycorhizcs à vésicules et à arbuscules (VA)
occupent une place privilégiee. Ces WA, en s'associant aux olantes,
stimulent leur croissance. La stimulation de la croissance de la
plante est la conséquence d'une amélioration de lsabsorotiort des
éléments minéraux, principalement le phosphore (MOSSE, 1973) et des
oligo-éléments tel q'ue le zinc (GILMORE,
1971) dans les sols' pauvres
en ces éléments.
Lors de la préparation de notre thèse de doctorat 3ème cycle, nous
avons abordé quelques aspects de la nutrition minerale de Vigna ungui-
culata cv. 58-185 doublement inoculé avec la souche de Rhizobium
-
-
ORS 407 et avec la souche de chamnignon endomycorhizien VA; Glomus
mosseae. Dans ce rapport nous présentons des résultats complémentaires
en ce qui concerne la nutrition en zinc.
2. RAPPEL, DU MATERIEL ET DES METHODES UTILISEES.
2.1. Souches de microorganismes
_------_-----_------------
2.1.1.
Souche de Rhizobium
- - - - - - - -
Nous avions utilisé la souche de Rhizobium ORS 407 qui est la
plus effective et la plus compétitive parmi huit souches de Rhizobium
étudiées (GuEYE, 1982bbi.
2.1.2.
Souche de champignon sndomycorhizien VA
- - - - - - --- - --- - ---mm-
Nous avons utilisé une souche de chamnignon endomycorhizien VA,
Glomus mosseae provenant de la station experimentale de Rothamsted
(Angleterre).
2.2. Cultivar de Viqna unauiculata
----.*---------
-r---L--m.-m.---
Nous avons utilisé un cultivar de Vigna wqniculata cv. 58-185
fourni par le Centre de Recherche Agronomique de Bambey.
2.3. Sol
Ve-
Nous avons axé nos études sur un type de sol: le sol Dek prélevé
à Bambey dont les principales cara,ctéristiques v'hysico-chimiques sont
résumées dans le tableau 4.
22
2.4. Culture des plantes
----e---------m.----
2.4.1.
Germination des graines
---- - - - - . I - -
Nous avons stérilisé les graines comme indiqué au 5 2.3.1.1. de
la 2ème partie. Les plantes obtenues sont repiquges dans des pots en
terre cuite de 18cm à raison de 2 nar pot.
2.4.2. Culture d'es plantes dans les oots en terre cuite
--------_------>_----__--
Le sol légèrement humidifié (approximativement 50% de la. capacité
au champ) a été réparti dans des pots en terre cuite de 18cm de
diamètre à raison de 1,s kg de sol par pot. Les pots remplis de sol
et recouverts
de papier "Eraft"
ont été ensuite sterilises à l'auto-
clave pendant 1 heure à 12O'C. Nous avons repiqué les plantules obte-
nues comme indique au 5 2.4.1. dans ces pots à raison de deux plantules
par pot. Nous avons arrosé quotidiennement avec 1OOml d'eau du robinet.
En plus une fois par semaine, nous avons arrosé avec 100 ml de solu-
tion HEWITT sans azote ni phosnhorc contenant par litre YgS04,7H20:
90 g; K2S04: 87g; CaC12,2H20: 147 g; Fe-EDTA: 2g; solution d'oligo-
éléments: lml. La solution d'oligo-éléments renferme oar litre:
MnSO 4 ,4H20: 2,23q; CuSO ,5H20: 0,24g; ZnS06,7H20: 0,2Og; H3190 : 3,lOg;
1
3
Na204Mo,2H20: 0,25 G, ??:Cl: St%. La solution HEWITT employQpour
l'arrosage a été diluée au quart. Tous les pots ont été placds en
plein air sur des t.ables (h = in) pour éviter toute contamination
ultérieure causée généralement par les vents de sable.
2.5. Méthodes d'inoculation
----------------------
2.5.1.
Inoculation avec la souche de Rhizobium
,,-,,,,,,,,,,,,,,,L,
Nous avons inoculé chaque plantule par 2ml d'une suspension de
Rhizobium ORS 407 provenant d'une culture pure agee de 7 jours con-
tenant 10 9 bactéries par ml.
2 3
Tableau 4. CaractBristiques physico-chimiques du sol Dek de Bambey
ppItl
Granulomét.cie %
C
N
N minéra- P
P assi- Argile Limon
Sable
pHKC1
pheau
total total
lisable-
total milable
-e
I- P
5100
380
103,5
74,8
ri,4
6,4
7,3
86,3
7,0
7,8
Toutes ces analyses ont été effectuées au laboratoire de chimie de
1'ORSTOM de Dakar. Les caractéristiques sont identiques aores
st4rilisation.
2.5.2.
Inoculation avec Glomus mosseae
- - - - - - - - - - - - - - - -
Nous avons inoculé chaque plantule avec 1 g de poids frais de
racines infectées par Glomus mosseac selon la meme méthode décrite
au paragraphe 2 de la deuxième partie.
2.6. Détermination de la fréquence et de l'intensité d'infection
_-------------------I_I__I^L_ ----------_-------------------
mycorhizianne.
M--------w---
D'une plante de Yigna unguiculata Bgée de 7 semaines, nous avons
récupéré des fragments du système racinaire que nous avons colorés
au bleu de trypan selon la méthode de PHILLIPS et HAYMAN (1970).
La fréquence (F) et l'i t
n ensite (1) d'infection mycorhizienne
sont déterminées ainsi :
F = nombre de fragments infectés
nombre total de fragments
x 100
observés
1 = longueur infectée du fragment
longueur totale du fragment infecté? x 100
2.7. Dosage de l'azote
-m.....-----------*---
Les parties aericnnes des plsntes sont séchees à l'étuve 6r3*C
pendant 72 heures jusqu'à poids constant ct l'azote total des
parties aériennes des plantes est déterminé par la méthode de
KYELDAHL.
2.8. Dosage du phosmhore
--------------L----
Les plantes sont séchées comme nrecédemment et le phosphore
total de la plante est déterminé par rapport à une gamme étalon à
partir de solutions C\\onnues KH2P04 mélangées à VJO 3 .
2.9. Dosage du zinc
--------------
Le zinc a été dose par absorption atomique au laboratoire des
Services Scientifiques Centraux de L'ORSTOY à Dondy (FRANCE) selon
la méthode d'atomisation électrothernique (PINTA: 1968 et 1973).
2.10. Analyses statistiques
----------------------
2.10.1.
~est-~e_DQNCAN '1-52)
Nous avons utilise le test de DUNCAN au risque de 1% ou 5% pour
la comparaison des moyennes.
25
2.10.2.
Analyse factorielle
- - I - .- - - - - -
Nous avons éqalement fait une expérience factorielle du type
(3m x zn) x r en un seul bloc de k unités dans laquelle:
m désigne le nombre de facteurs à trois niveaux;
n désigne le nombre de facteurs à deux niveaux;
r désigne le nombre de traitements.
L'analyse de cette expérience a été conduite suivant la méthode de
VAN DEN DRIESCHE (BECK et nl., 1969).
26
3. ABSORPTION DU ZINC
Des résultats obtenus lors de la préparation de notre thèse de
doctorat ont montré qu'il existe une interaction entre l'apport de
zinc et celui du phosphore sur le poids sec des parties aeriennes de
Vigna unguiculata, cv. 58-185.
Nous rappelons q'ue nous avions initié une expérience factorielle
à six répétitions pour étudier la réponse de Vigna unguiculas
-
CV. 58-185 cultivé dans le sol Dek de Bambey stérile
à la mycorhi-
zation avec Glomus mosseae en présence de différentes doses de phos-
phore et de zinc. Les différents facteurs Etudies étaient les suivants:
- facteur A (doses de zinc): 0 (ZnC), 2 (Zn2) ou 5 ppm (Zn5);
- facteur B (doses de phosphore): 20 P20) ou 80 ppm (P80);
- facteur C (Clornus niosseae): absence (NM) ou présence (M).
Toutes les plantes ont été inoculées avec la souche de Rhizolbium
ORS 407.
Les résultats recapitulés au tableau 5 ont eté interprétes en
utilisant la méthode statistique de VAN DEN DRIFSSCBE (BECK et al.,
*- -
1969).
Nous rappelons également que les plantes non mycorhizees n’ont
pas été contaminées. Le facteur A (apport de zinc aux doses de 2 et
5 ppm) a exercé un effet favorable sur quatre oaramëtres étudiés;
poids sec des nodules, azote total, phosphore total et zinc total
des parties aériennes. Les résultats indiquent un effet nrincipal
significatif (p = 0,05) libre de toute interaction de l'anoort de
zinc sur ces paramètres (tableau 6), ce qui indique que la faible
concentration du zinc est un facteur limitant dans le sol considéré.
4. CONCLUSION
Nous avions déjà precisé que Glomus mosseae stimulait la crois-
-
-
sance de Vigna unguiculata en ameliorant l'absorotion du phosphore par
la nlante (GUEYE, 1982b).
Par une approche microbiologique, nous avons mis en évidence
la carence en zinc du sol Dek de Bambey. L'inoculation avec Glomus
-
-
mosseae peut permettre
une meilleure exnloration de
cet oligo-élément peu mobile et ainéliorer ainsi son absorption par
Vigna
u n g u i c u l a t a .
27
Enfin, dans les sols du Sénégal, l'inoculation avec les champigons
endomycorhiziens tels que Glomus mosseae neut être un facteur
d'amélioration de la croissance et de la nutrition des plantes. Déjà
des résultats satisfaisants ont 6té obtenus au champ sur la fixation
de l'azote par le soja inoculé avec Glomus mosseae dans les sols de
-II_ .--
la Casamance (GANRY et al., 1982).
-
-
28
Tableau 5. Poids sec des parties aériennes et des nodules, N total.,
P total et Zn total de Vigna unguiculata cultivé sur sol
Dek stérile pendant 54 jours, inoculé (FI) ou non inoculé
(NY) avec Glomus mosseae pour différents niveaux de P et
Zn.
Tr-iitement
Poids sec
Poids sec
N total
P total
Zn total
parties
nodules
(mg/plante)
(mg/plante)
tugi/plante)
a6riennes
(mg/plante)
(g/plantc)
Zn P
0 20 NM
3,40
90100
75,60
2,80
57,80
Zn2P2" NM
4,00
101 ,oo
84,80
2,92
81‘32
Zn5P20 NM
3,Oo
9 4 , 0 0
78,9o
3,lO
99,50
Zn P NM
0 80
4,30
1.08,90
91,52
3,38
70,20
Zn2Pgo NM
5,60
123,oo
103,35
3,77
153,04
Zn P NM
5 80
5,40
113,20
95,03
3,51
1'72,80
ZnP
M
0 20
3,80
123,50
103,74
3,84
'79,80
Zn2P20 M
4,30
126,70
106,40
.3,88
l:L6,10
Zn5P20 M
4,50
137,lO
115,08
4 , 2 5
162,OO
Zn P
0 80 M
4,90
161,90
136,05
5,03
75,ll
Zn2P80 M
6,20
195,80
164,40
6,00
165,29
ZnSP80 M
6,05
197,47
165,75
6,13
189,54
Pour la signification des abréviations, voir texte.
29
Tableau 6. Effet principal de l'apport de 2x-1 sur le poids sec des
nodules Img/plante) et sur N total. (mg/nlante), P total
(mg/plante) et Zn total (ug/olante) des parties ,aériennes
de Vana unguiculata cv.
-
58-185 cultivé dans 3.e sol Dek
de BamIbey stérile.
Apport de zinc
Poids sec des nodules
N total
P total
Zn total
(ppm)
(mg/p.Lante)
(mg/plante) (mg/plante) (Ug/plante)
0
121,07
101,72
3,76
70,72
2-5
136,03
114,21
4,19
142,44
30
CONCLUSION GENERALE
La mise en place du programme YIRCEN au Sénégal nécessitait une
condition primordiale: la constitution d'une collection de culture
de microorqanismes. Nous avons constitué cette collection qui a la
particularité d'être l'unique MSRCEN à disposer de souches de cham-
pignons endomycorhiziens à vésicules et à arbuscules.
Cette collection de Rhizohium et de mycorhizes est actuellement
au laboratoire de microbiologie des sols de 1'ORSTOEI à Dakar. 11
appartiendra aux responsables du MIRCEN de l'Afrique de l'r)uest :
1 - de transferer aet d'entretenir la collection au centre d'accueil
du MIRCEN, actuellement le Centre de Recherche Agronomique de
Bambey;
2 - de demander un numéro de collection au Centre Mondial de Données
sur les microorganismes (WDC) à Brisbanc.
Ainsi le MIRCEN de l'Afrique de 1'0uest fera partie intégrante du
réseau mondial des NIRCENS en tant que centre de collection de
cultures.
Le catalogue des souches de microorganismes sera publié
très prochainement.
Le nrogramme du YIRCEN se poursuivra conformément au calendrier
de travail que nous avons élaboré et que nous avons déposé au
département des produetions végétales. Pour mener à bien ce programme,
il est nécessaire et urgent de lui affecter un personnel satisfaisant
en qualification d'abord, en nombre ensuite. A ce titre nous uroposons
le recrutement d'un technicien supérieur dans le cadre du MIRCEN.
31
B I B L I O G R A P H I E
32
AMERXCAN SOCIETY for MICROBIOLOGY. 1981. Yanual of methods for general
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ANNEXE
FICHE TECHNIDUE DES SOUCHES DE RHIZOBIUM
ET DES CHAMTGNONS ENDO?lYCORHIZIENS
LISTE DES OBSERVATIONS UTILISEES DANS LES FICHES TECHNIQUES
A. alb
: Acacia albida
1_1-
A, biv. : Acacia bivenosa
-
-
A. far
: Acacia farnesiana
A. ho1
: Acacia holosericea
A. hyp
: Arachis %pogaca
A. mea
: Acacia mearnsii
-
-
A, nil
: Acacia nilotica
A. rad
: Acacia raddiana
A. sen
: Acacia senegal
A. sey
: Acacia seyal
A. sie
: Acacia Sieberiana
C .
-80'~: Congélation- à -8O*C
G. max
: Glycine max
-.
L . leu : Leucaena sucocephala
V. uw
: Vigna unguiculata
YEN
: Yeast Extract Xedium
Zkizobium
s p .
MAO 1
1983
ORS 701
NOR
Vigna
unguiculatâ
58-185
oui
Sénégal
Baol
Bambey
0
14"
43 vra
16'
2710
5100
3 80
103,s
74,F
Q_ , 2
r a
0 , .'I
7 -2
I -
86,:
7 , a
?,h
GUEUE, PI.
1981
GUEYE, lt.
1981
c . -8V°C
Glycir01
ï E 2
i; 3 c c
l .y
Rhizobium
i II’1
SP.
1 i
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YAO 2
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1983
1 ;‘:
ORS 571
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l
oui
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Il
Sesbânia
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rostrata
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N 0 n
l $1
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Sénegal
Fleuve
Richard-Toli
0
16" 2O'hJ
15"
45'C
Dreyfus
j:
1981
Dreyfus
1; ‘1
1981
C.-~O"C
Glycérol
Y E !Ji
2yc
PG
, 66% GC
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l@
i .
i II
Rhizobium
1
II!I
sp *
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f I(
Acacia
’
‘1
raddiana
oui
Sénégal
Sénégal-OrientcI
/
i!
Bakel
0
14O
50'N
12O 30'0
i
Cornet, F
1981
Cornet, F.
1981
C. -8OOC
Ulycérc?
ijI
y y !~{
f
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28OC
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PA . roddiar:t
/
A . ra56i ar.z
ORSTOY-Dakar
Fiche N03'-I
i:
a.1
”
j
I::f
/,(
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1971
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M .
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c .R.A. Quebcsa , CNRS-Toiosan
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Fiche No55
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