FXW.iBLiQUE DU SENEGAL - -.-__ - .--. - ...
FXW.iBLiQUE DU SENEGAL
- -.-__ - .--. -
INSTITUT SENEGALAIS DE
MTN'TSTERE DU DEVELOPPEMENT RURAL;
RECHERCHES
AGRICOLES
-____--_
_ _._. . ._-
DIRECTION DES RECHERCHES SUR
LES PRODUC'l'IONS
VEGETALES
.- .__ _.- -. - -
PROGilAMME MIRCEN
PRODUCTION D'INOCUUJM DE RHIZOBIUM AU SENEGAL
par
Mamadou GUEYE
dans le cadre du cours régionai FAû/'AIEA ;JU
l'application des isotopes et des rayonnements
s5 l'gtude de la fixation biologique de l'azote
et, des relations sol/r~utri.tion des plantes.
Eambey
Centre National. de Recherches
21 Aozt--15 Septembre 1989
Agronomiques de Bam'bey
. -
.
PRODUCTION D'INOCULUM DE RHIZOBIUM AlJ SENEGAL
Mamadou GUEYE, MIRCEN/CNRA, B.P. 53 13ambey, Sénégal.
1. Introduction-
L'azote,
après l'eau, est le facteur limitant de la production
végétale, et
ceci, bien que la réserve disponible soit quasi infinie
puisqu'il s'agit de l'azote atmosphérique (Burns et Hardy, 1975).
atmosphère
3,9.10"ti.
terre, mers, sédiments marins
24;5.10et
roches sédimentaires et primaires
193,4.1o~t:
Toutefois,
sous sa
forme
moléculaire,
l'azote ne peut être
directement utilisé que par les microorganismes fixateurs, libres ou
vivant en
symbiose
avec
certaines
plantes, légumineuses notamment
(Fig.1).
Ce processus est appel6 fixation biologique de l'azote
(FBA).
Les microorganismes fixateurs , W en particulier, qui
se
trouvent à
l'intérieur des nodules,
tirent de
la plante les
élements
nutritifs et
l'énergie
nécessaires à leur croissance et à
leur
développement; en
retour,
les &j,.znbium f-ixent
l'azote
atmosphérique
qui est alors métabolisé par la plante--hôte. La FBA est
u n
processus
anaérobique; la nitrogénase en est l'enzyme responsable
: il réduit l'azote moleculaire (Nz) en ammoniac (NHa) (Fig.21
La FBA permet donc la croissance des plantes sans recourir à
l'emploi des engrais mineraux azotes trop coûteux : il s'agit d'une
véritable
économie de
l'azote.
Cela explique pourquoi beaucoup de
pays,
particulierement
ceux
développement
fournissent
d'importants efforts pour
la
promz:ion et l'amélioration de la FBA
par la collection des Rhiznbium et la production d'inoculum dans les
laboratoires tels
que
les Centres de
Re ssources Microbiologiques
(MIRCENs).
2. Production d'inoculum de Kb'
*biym .
La première étape de
la production d'inoculum est d'obtenir
une
souche de Bhiz;obium pour la ou les légumineuses à inoculer. Trois
conditions doivent être remplies
pour produire un inoculum avec la
souche de Rh obtenue :
-. la souche de Ehiznbium doit être très effective, c-est &
dire tres apte à fixer l'azote dans le nodule de la légumi-
neuse pour laquelle l'inoculum est recommande.
--. la souche de mobium doit être très compétitive, c-est à
dire, qu'en présence d'autres souches de Rhiznbiutn, elle
doit être très apte à former des nodules sur le système
BIOLOGICAL
F~ATIoN
( i 1
\\
\\
Al IUN
3TBdOSPHER
--.
.--.
-.
s o r t - -
A+i
.IXIVIATION
( 3 ) MINERALIZATION
II(8 I ADSORPTION
I
CURVED
ARROWS
(-)
BIOLOGICAL
PROCE SS
STRAIGHT ARROWS
I-1 CHEMICAL
PROCESS
?-
c
-2-
racinaire de la legumineuse pour laquelle I'inoculum est
recommandé.
- la souche de Ehizobm doit présenter un taux de survie
tres élevé dans le sol.
2-l. Sélection des souches de EUz&ium.
2.1.1. Choix des souches de Rhizo’billm I
Les
souches de W
*FF *
les
plus
performantes
pour
une
légumineuse
poussant dans une zone donnée sont le ~:LUS souvent celles
isolées À
partir de zones ayant des conditions similaires (Chatel et
Greenwood,
1973;
Chatel
et Parker,
1973). Cependant, il n'est pas
exclu de
tester
I'effectivité et
la compétitivite des souches de
isolées dans des zones particulières.
Bien
qu'il n'y
ait pas
de milieu de culture sélectif pour
isoler
les
Ehiznbm,
les methodes d'isolement ont et6 décrites par
plusieurs auteurs (Vincent, 1970).
2.1-z-
Test des
souches de El *a "
en chambre de croissance et en
serre -
Les
premières
étapes de
la sélection des Rhizobium doivent
être
effectuées en
environnemt
contrôlé.
Plusieurs
systèmes sont
employés
pour
étudier les
associations &.i.zobium x légumineuses en
conditions
contrôlées (Vincent,
1970;
Bergensen, 1980) : les tubes
Gibson sont en général
employes pour les petites graines alors que
les
jarres Léonard et les pots
le sont pour les grosses graines.
Quelque soit le systeme,
les solutions utilisées pour la nutrtition
des plantes doivent
être totalement dépourvues d'azote. Dans le cas
des
jarres
Leonard et
des
Pots >
les plantes sont arrosées avec de
l'eau stérile.
Les
plantes
doivent être récoltées quand des différences très
nettes
sont
visibles
entre les plantes inoculées et les plantes non
inoculées.
La FBA est
alors
estimée
par le poids sec des parties
aériennes et/ou l'azote total de ces parties aériennes.
Z-1.3. Test des souches de Rhizobillm au champ.
Les
e s 3 a i s
au
champ destinés à étudier
les
associations
zoblum
x
16gumineuses
représentent
l-étape
ultime pour estimer
l'effectivité
et la competitivité d'une souche de &i.zobium ainsi que
son
aptitude a
survivre
dans :Le sol. Plusieurs precautions doivent
être prises avant de mettre en place l'expérience au champ :
- sélect.ion des sites : le site doit être homogène, pauvre
.
en azote et renfermant une faible population de Rhizobium
( 102 Iih&dbm par gramme e sol).
- application des engrais : la FBA ne s'exprime pas si le sol
est déficient en élémen,ts essentiels pour :La croissance des
plantes.
La FBA est estimée par la nodulation, le poids sec des parties
aériennes, l'azote total et le rendement en grains.
2-Z. Production d'inoculum.
2,2,1. Culture des Rhizobiiim-
Les Rhizobium sont cultivés dans un milieu classique de Yeast
Extract Mannitol (YEK;HP;;i
con;i;;t
par litre d'eau distillée :
mannitol :
1og;
- NaCl :
0, .lg;
MgS04,7HzO :
0,2a; extrait de levure .: lg. Le pH'du'milieu est ajusté à 7,2.
Les &iznbi.um peuvent
être
cultivés dans plusieurs types de
recipients : erlens, ballons, fermenteurs.
2.2-Z. Production en mase.
Pour
avoir une culture de Rh de forte concentration, on
utilise un
fermenteur.
Une
preculture dans un erlen est nécessaire
avant
l'utilisation du
fermenteur.
La préculture est ensuite
transvasée
dans le fermenteur à une proportion de 10%. La culture est
aéree
par un
courant
d'air stérile et la tempéra,ture de croissance
est comprise entre 25 et 32°C.
Il y a
plusieurs
types de
fermenteurs
.allant des grands
prototypes
sophistiques,
stérilisables à
la vapeur aux fermenteurs
très simples et autoclavables (Fig.3).
2-2.3. Conditionnement de l'inoculum.
Un bon support d'inoculum doit avoir un pouvoir absorbant très
élevé et
être
non
toxique
aux Rhizobium facilement sterilisable,
disponible en grande
quantité,
peu coûte;x et po,uvant adhérer très
facilement
aux
graines. Il y a plusieurs types de supports : tourbe,
boue
filrée, argile, lignite, vermiculite et certains polymères comme
l'alginate
très
récemment
introduit
dans
le marché. Cependant, la
tourbe reste le support le plus utilisé.
Au
Sénégal,
deux
types de
support
sont
utilisés
pour
conditionner les inoculums produits : la tourbe et l'alginate.
POINT
A I R OUT L E 1
INLET
--
--
--
- --
--
-. .
--
-
-
--
I
-
-
--
--
-m
-
-m
F E R M E N T E R .-+
- -.
-
--
-
-
-
-
--
-
-
--
h OUT L E T F O R B R O T H
i=
-4-
2.2-3-l- La tourbe,
Il existe
au Sénégal un tres grand gisement de tourbe. Cette
tourbe
est
très
acide et
nécessite
une neutralisation préalable.
Après
séchage au
soleil,
la tourbe prélevée est neutralisée par
addition de chaux vive
dont
la quantité varie
en fonction de
l'acidité de
la tourbe prélevée.
Ensuite,la
tourbe
est finement
broyée,
puis
autoclavée à 120°C pendant 2h et répartie en sachets de
100,
200 et 300g.
A partir du fermenteur,
un volume adéquat de
suspension de Rhizobium est alors introduit dans chaque sachet. Après
cette
opération,
de petits trous
d'aération sont aménagés sur les
sachets
avec
une
aiguille. Les
sachets
sont ensuite laissés à la
température
ambiante
pendant
7 jours. Ils sont ensuite récupérés et
conserves a 4°C jusqu'à utilisation.
Z-2-3.2. L'alginate.
L"alginate
est un polymere de polyacrilamide. La suspension de
j&u&&m est
mélangée
g une solution d"alginate 4% (v/v). Ensuite,
le mélange est
versé goutte à goutte dans une solution de CaClz 2%.
Il se forme des billes d'alginate dans lesquelles les Rhizobium sont
inclus.
Les billes sont
ensuite sechées sous un flux d'air de 20 à
30°C pendant 24h.
2.,2,4, Survie des Rhizobillm dans le support.
Quelque
soit le
support
utilisé, les Rh&&&um doivent
conserver
leur pouvoir infectieux le plus longtemps pos,sible au cours
du
stockage et
même
après
l-application dans
le
sol ou sur les
graines.
Il est necessaire de verifier la survie des bactéries dans
l'inoculum immédiatement avant l'application de celui-ci au champ.
Les
inoculums de
tourbe
produits au
Sénégal présentent en
genéral un
taux de
survie de
l'ordre de
60 à 70%' alors que les
inoculums d'alginate ont un taux de survie de l'ordre de 80%.
3_ Conclusion,
La production d'inoculum comporte de miltiples et variables
aspects :
sélection et culture des souches de RMz&iwn préparation
des
supports et
contrôle des
facteurs
affectant
la' survie
des
RhizobLum dans les supports, contrôle de la qualite de 1"inoculum.
Le
contrôle
de
la qualit des
inoculums
est un
aspect
fondamental
qui doit garantir
l'utilisation des inoculums par les
consommateurs.
C'est
pourquoi,
i 1
doit
être
effectue
par des
laboratoires appartenant
aux pouvoirs publiques en vue d'apporter un
cachet
officiel à
l'u$!tilisation de
tout
inoculum
produit ou
introduit.
-5-
Au Senégal, un programme de
contrôle de
la qualité
des
inoculums de w a été mis en place à l'Institut Sénégalais de
Recherches Agricoles (ISRA), dans le cadre du programme MIRCEN.
Bibliographie.
BERGENBEN, F.J. 1980 Methods for evaluating hiological nitrogen
fixation. John Wiley and Sons, Chichester, U.K.
BURNS, R.C. and HARDY, R.W.F. 1975 Nitrogen fixation in bacteria
and higher plants. Springer Verlag Berlin, Heidelberg, New York
189 p.
C~TE~, D.L. and GREENWOOD, R.M. 1973 Soi1 Biol. Biochem. 5, 809.
CHATEL, D.L. and PARKER, C.A. 1973 Soi1 Biol. Biochem. 5', 425.
DATE, R.A 1974 Legume inoculant production. Proc.INSA. 40, 667-686.
VINCENT, J.M. 1970 A manual for the ,practical of the root--nodule
bacteria. IBP Handbook No. 15 Blackwell Scientific Publications.
Oxford and Edinburg. 164 pp.
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INSTITUT SENEGALAIS DE
MTN'TSTERE DU DEVELOPPEMENT RURAL;
RECHERCHES
AGRICOLES
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DIRECTION DES RECHERCHES SUR
LES PRODUC'l'IONS
VEGETALES
.- .__ _.- -. - -
PROGilAMME MIRCEN
PRODUCTION D'INOCUUJM DE RHIZOBIUM AU SENEGAL
par
Mamadou GUEYE
dans le cadre du cours régionai FAû/'AIEA ;JU
l'application des isotopes et des rayonnements
s5 l'gtude de la fixation biologique de l'azote
et, des relations sol/r~utri.tion des plantes.
Eambey
Centre National. de Recherches
21 Aozt--15 Septembre 1989
Agronomiques de Bam'bey
. -
.
PRODUCTION D'INOCULUM DE RHIZOBIUM AlJ SENEGAL
Mamadou GUEYE, MIRCEN/CNRA, B.P. 53 13ambey, Sénégal.
1. Introduction-
L'azote,
après l'eau, est le facteur limitant de la production
végétale, et
ceci, bien que la réserve disponible soit quasi infinie
puisqu'il s'agit de l'azote atmosphérique (Burns et Hardy, 1975).
atmosphère
3,9.10"ti.
terre, mers, sédiments marins
24;5.10et
roches sédimentaires et primaires
193,4.1o~t:
Toutefois,
sous sa
forme
moléculaire,
l'azote ne peut être
directement utilisé que par les microorganismes fixateurs, libres ou
vivant en
symbiose
avec
certaines
plantes, légumineuses notamment
(Fig.1).
Ce processus est appel6 fixation biologique de l'azote
(FBA).
Les microorganismes fixateurs , W en particulier, qui
se
trouvent à
l'intérieur des nodules,
tirent de
la plante les
élements
nutritifs et
l'énergie
nécessaires à leur croissance et à
leur
développement; en
retour,
les &j,.znbium f-ixent
l'azote
atmosphérique
qui est alors métabolisé par la plante--hôte. La FBA est
u n
processus
anaérobique; la nitrogénase en est l'enzyme responsable
: il réduit l'azote moleculaire (Nz) en ammoniac (NHa) (Fig.21
La FBA permet donc la croissance des plantes sans recourir à
l'emploi des engrais mineraux azotes trop coûteux : il s'agit d'une
véritable
économie de
l'azote.
Cela explique pourquoi beaucoup de
pays,
particulierement
ceux
développement
fournissent
d'importants efforts pour
la
promz:ion et l'amélioration de la FBA
par la collection des Rhiznbium et la production d'inoculum dans les
laboratoires tels
que
les Centres de
Re ssources Microbiologiques
(MIRCENs).
2. Production d'inoculum de Kb'
*biym .
La première étape de
la production d'inoculum est d'obtenir
une
souche de Bhiz;obium pour la ou les légumineuses à inoculer. Trois
conditions doivent être remplies
pour produire un inoculum avec la
souche de Rh obtenue :
-. la souche de Ehiznbium doit être très effective, c-est &
dire tres apte à fixer l'azote dans le nodule de la légumi-
neuse pour laquelle l'inoculum est recommande.
--. la souche de mobium doit être très compétitive, c-est à
dire, qu'en présence d'autres souches de Rhiznbiutn, elle
doit être très apte à former des nodules sur le système
BIOLOGICAL
F~ATIoN
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\\
\\
Al IUN
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( 3 ) MINERALIZATION
II(8 I ADSORPTION
I
CURVED
ARROWS
(-)
BIOLOGICAL
PROCE SS
STRAIGHT ARROWS
I-1 CHEMICAL
PROCESS
?-
c
-2-
racinaire de la legumineuse pour laquelle I'inoculum est
recommandé.
- la souche de Ehizobm doit présenter un taux de survie
tres élevé dans le sol.
2-l. Sélection des souches de EUz&ium.
2.1.1. Choix des souches de Rhizo’billm I
Les
souches de W
*FF *
les
plus
performantes
pour
une
légumineuse
poussant dans une zone donnée sont le ~:LUS souvent celles
isolées À
partir de zones ayant des conditions similaires (Chatel et
Greenwood,
1973;
Chatel
et Parker,
1973). Cependant, il n'est pas
exclu de
tester
I'effectivité et
la compétitivite des souches de
isolées dans des zones particulières.
Bien
qu'il n'y
ait pas
de milieu de culture sélectif pour
isoler
les
Ehiznbm,
les methodes d'isolement ont et6 décrites par
plusieurs auteurs (Vincent, 1970).
2.1-z-
Test des
souches de El *a "
en chambre de croissance et en
serre -
Les
premières
étapes de
la sélection des Rhizobium doivent
être
effectuées en
environnemt
contrôlé.
Plusieurs
systèmes sont
employés
pour
étudier les
associations &.i.zobium x légumineuses en
conditions
contrôlées (Vincent,
1970;
Bergensen, 1980) : les tubes
Gibson sont en général
employes pour les petites graines alors que
les
jarres Léonard et les pots
le sont pour les grosses graines.
Quelque soit le systeme,
les solutions utilisées pour la nutrtition
des plantes doivent
être totalement dépourvues d'azote. Dans le cas
des
jarres
Leonard et
des
Pots >
les plantes sont arrosées avec de
l'eau stérile.
Les
plantes
doivent être récoltées quand des différences très
nettes
sont
visibles
entre les plantes inoculées et les plantes non
inoculées.
La FBA est
alors
estimée
par le poids sec des parties
aériennes et/ou l'azote total de ces parties aériennes.
Z-1.3. Test des souches de Rhizobillm au champ.
Les
e s 3 a i s
au
champ destinés à étudier
les
associations
zoblum
x
16gumineuses
représentent
l-étape
ultime pour estimer
l'effectivité
et la competitivité d'une souche de &i.zobium ainsi que
son
aptitude a
survivre
dans :Le sol. Plusieurs precautions doivent
être prises avant de mettre en place l'expérience au champ :
- sélect.ion des sites : le site doit être homogène, pauvre
.
en azote et renfermant une faible population de Rhizobium
( 102 Iih&dbm par gramme e sol).
- application des engrais : la FBA ne s'exprime pas si le sol
est déficient en élémen,ts essentiels pour :La croissance des
plantes.
La FBA est estimée par la nodulation, le poids sec des parties
aériennes, l'azote total et le rendement en grains.
2-Z. Production d'inoculum.
2,2,1. Culture des Rhizobiiim-
Les Rhizobium sont cultivés dans un milieu classique de Yeast
Extract Mannitol (YEK;HP;;i
con;i;;t
par litre d'eau distillée :
mannitol :
1og;
- NaCl :
0, .lg;
MgS04,7HzO :
0,2a; extrait de levure .: lg. Le pH'du'milieu est ajusté à 7,2.
Les &iznbi.um peuvent
être
cultivés dans plusieurs types de
recipients : erlens, ballons, fermenteurs.
2.2-Z. Production en mase.
Pour
avoir une culture de Rh de forte concentration, on
utilise un
fermenteur.
Une
preculture dans un erlen est nécessaire
avant
l'utilisation du
fermenteur.
La préculture est ensuite
transvasée
dans le fermenteur à une proportion de 10%. La culture est
aéree
par un
courant
d'air stérile et la tempéra,ture de croissance
est comprise entre 25 et 32°C.
Il y a
plusieurs
types de
fermenteurs
.allant des grands
prototypes
sophistiques,
stérilisables à
la vapeur aux fermenteurs
très simples et autoclavables (Fig.3).
2-2.3. Conditionnement de l'inoculum.
Un bon support d'inoculum doit avoir un pouvoir absorbant très
élevé et
être
non
toxique
aux Rhizobium facilement sterilisable,
disponible en grande
quantité,
peu coûte;x et po,uvant adhérer très
facilement
aux
graines. Il y a plusieurs types de supports : tourbe,
boue
filrée, argile, lignite, vermiculite et certains polymères comme
l'alginate
très
récemment
introduit
dans
le marché. Cependant, la
tourbe reste le support le plus utilisé.
Au
Sénégal,
deux
types de
support
sont
utilisés
pour
conditionner les inoculums produits : la tourbe et l'alginate.
POINT
A I R OUT L E 1
INLET
--
--
--
- --
--
-. .
--
-
-
--
I
-
-
--
--
-m
-
-m
F E R M E N T E R .-+
- -.
-
--
-
-
-
-
--
-
-
--
h OUT L E T F O R B R O T H
i=
-4-
2.2-3-l- La tourbe,
Il existe
au Sénégal un tres grand gisement de tourbe. Cette
tourbe
est
très
acide et
nécessite
une neutralisation préalable.
Après
séchage au
soleil,
la tourbe prélevée est neutralisée par
addition de chaux vive
dont
la quantité varie
en fonction de
l'acidité de
la tourbe prélevée.
Ensuite,la
tourbe
est finement
broyée,
puis
autoclavée à 120°C pendant 2h et répartie en sachets de
100,
200 et 300g.
A partir du fermenteur,
un volume adéquat de
suspension de Rhizobium est alors introduit dans chaque sachet. Après
cette
opération,
de petits trous
d'aération sont aménagés sur les
sachets
avec
une
aiguille. Les
sachets
sont ensuite laissés à la
température
ambiante
pendant
7 jours. Ils sont ensuite récupérés et
conserves a 4°C jusqu'à utilisation.
Z-2-3.2. L'alginate.
L"alginate
est un polymere de polyacrilamide. La suspension de
j&u&&m est
mélangée
g une solution d"alginate 4% (v/v). Ensuite,
le mélange est
versé goutte à goutte dans une solution de CaClz 2%.
Il se forme des billes d'alginate dans lesquelles les Rhizobium sont
inclus.
Les billes sont
ensuite sechées sous un flux d'air de 20 à
30°C pendant 24h.
2.,2,4, Survie des Rhizobillm dans le support.
Quelque
soit le
support
utilisé, les Rh&&&um doivent
conserver
leur pouvoir infectieux le plus longtemps pos,sible au cours
du
stockage et
même
après
l-application dans
le
sol ou sur les
graines.
Il est necessaire de verifier la survie des bactéries dans
l'inoculum immédiatement avant l'application de celui-ci au champ.
Les
inoculums de
tourbe
produits au
Sénégal présentent en
genéral un
taux de
survie de
l'ordre de
60 à 70%' alors que les
inoculums d'alginate ont un taux de survie de l'ordre de 80%.
3_ Conclusion,
La production d'inoculum comporte de miltiples et variables
aspects :
sélection et culture des souches de RMz&iwn préparation
des
supports et
contrôle des
facteurs
affectant
la' survie
des
RhizobLum dans les supports, contrôle de la qualite de 1"inoculum.
Le
contrôle
de
la qualit des
inoculums
est un
aspect
fondamental
qui doit garantir
l'utilisation des inoculums par les
consommateurs.
C'est
pourquoi,
i 1
doit
être
effectue
par des
laboratoires appartenant
aux pouvoirs publiques en vue d'apporter un
cachet
officiel à
l'u$!tilisation de
tout
inoculum
produit ou
introduit.
-5-
Au Senégal, un programme de
contrôle de
la qualité
des
inoculums de w a été mis en place à l'Institut Sénégalais de
Recherches Agricoles (ISRA), dans le cadre du programme MIRCEN.
Bibliographie.
BERGENBEN, F.J. 1980 Methods for evaluating hiological nitrogen
fixation. John Wiley and Sons, Chichester, U.K.
BURNS, R.C. and HARDY, R.W.F. 1975 Nitrogen fixation in bacteria
and higher plants. Springer Verlag Berlin, Heidelberg, New York
189 p.
C~TE~, D.L. and GREENWOOD, R.M. 1973 Soi1 Biol. Biochem. 5, 809.
CHATEL, D.L. and PARKER, C.A. 1973 Soi1 Biol. Biochem. 5', 425.
DATE, R.A 1974 Legume inoculant production. Proc.INSA. 40, 667-686.
VINCENT, J.M. 1970 A manual for the ,practical of the root--nodule
bacteria. IBP Handbook No. 15 Blackwell Scientific Publications.
Oxford and Edinburg. 164 pp.